JP2023544165A - 肝臓に向けられた遺伝子補充療法によってｐｋｕを処置するためのヒトｐａｈ発現カセット - Google Patents

肝臓に向けられた遺伝子補充療法によってｐｋｕを処置するためのヒトｐａｈ発現カセット Download PDF

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Abstract

肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードする、前記発現カセットが本明細書で提供される。それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する、および／またはフェニルアラニンのレベルを低減する方法も提供される。さらに、それを必要とする個体においてＰＡＨポリペプチドを発現させるためのベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）、ウイルス粒子、医薬組成物およびキットが本明細書において提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１日に出願された米国仮出願第６３／０８６，５３７号、および２０２０年１２月４日に出願された米国仮出願第６３／１２１，７９７号の優先権の利益を主張し、これらそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：配列表のコンピューター読取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１７８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録した日付：２０２１年９月２２日、サイズ：３１，０２８バイト）。
本発明の開示は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させるための発現カセットに関する。一部の態様において、本開示は、遺伝子治療を使用してフェニルケトン尿症を処置するための組成物および方法に関する。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のチロシン（Ｔｙｒ）への水酸化を触媒する肝臓酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝学的欠損である。この疾患は、北米で１：１０～１５，０００の全体的な発生率を有する最も一般的な先天性アミノ酸代謝異常であり、これは、ほとんどの先進国で新生児スクリーニングプログラムによって検出される。まったく処置を行わないと、ＰＫＵの重度の形態は、神経毒性であり知的障害に関連する高度に上昇した血液Ｐｈｅレベルをもたらす（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。影響を受けたタンパク質であるＰＡＨは、Ｎ末端の調節性（１～１１７）、中央の触媒性（１１８～４１０）およびＣ末端の四量体化ドメイン（４１１～４５２）からなるマルチドメインタンパク質である（非特許文献４）。これまで５６０種を超える疾患を引き起こす突然変異が各ドメインにマッピングされており、触媒領域は、最も高頻度で影響を受ける部位である（非特許文献５）。ホモ多量体酵素は、基質ＰｈｅがＮ末端ドメインに結合することにより、リン酸化およびアロステリック活性化を用いた複雑な制御を受け、これは、酵素の様々な構造および多量体化の状態を変更することによってＰＡＨ酵素活性を微調整する（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
ＰＫＵのための現行の処置は、低タンパク質の食事と液状の医療調合食（ｍｅｄｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａ）を使用した生涯続くＰｈｅの食事制限である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。有効であるにもかかわらず、医療用食品の不十分な味と食品選択に対する厳しい制限が、食品の遵守を難しくしており、および小児期中に服薬不履行は徐々に増大し、十代後半までに患者のほぼ８０％が推奨レベルより高い血液Ｐｈｅレベルを有する（非特許文献９、非特許文献１０）。また、Ｐｈｅ制限食の優れた遵守にもかかわらず、多くの患者は、様々な神経認知および神経精神病学的機能の欠損を経験し、加えて、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）の高い発生率を有するという証拠も出現している。この理由は不明瞭であるが、考えられる説明としては、脳におけるアミノ酸不均衡、特定のビタミンおよび微量元素の栄養不足、加えて、肝臓ＰＡＨ活性によって通常安定に維持される血液Ｐｈｅレベルの変動が挙げられる（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。興味深いことに、ＰＫＵのより軽度の形態を有する患者の補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の合成形態（サプロプテリン二塩酸塩）での処置は、血液Ｐｈｅレベルを低くすることにおいて有効であることが示されただけでなく、ＡＤＨＤ症状の低減などの神経学的転帰における改善も実証した（非特許文献１４）。この療法は、薬理学的なシャペロンとして作用することによって残留したＰＡＨ酵素活性を増加させ、したがって正常なＰｈｅが制御されたＰＡＨ活性を提供することによって遺伝学的欠陥の部分的な修正を提供することができる（非特許文献３）。近年承認された別の療法は、Ｐｈｅをトランス－ケイ皮酸に代謝する細菌フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）のペグ化形態を使用した酵素置換療法からなる。この療法は、血液Ｐｈｅレベルにおける顕著な低減をもたらすが、神経学的なエンドポイントに対する効果はそれほど高くないようである（非特許文献１５）。全身のＰｈｅレベルの調節因子およびＴｙｒのプロデューサーとしてのＰＡＨ機能の修正を行わずに主として血液Ｐｈｅレベルを低くすることに基づく、このまたは他のあらゆる療法が、食事を遵守するＰＫＵ患者でさえも観察される認知および神経精神病学的な問題に対処することができるかどうかは、不明瞭なままである。
遺伝子Ｐａｈの遺伝子移入によってＰＫＵ患者の肝臓にＰｈｅヒドロキシラーゼ活性を復活させることは、疾患を処置するための魅力的なアプローチである。十分なＰＡＨ発現を復活させることができるのであれば、安定した低い血液Ｐｈｅレベルが提供されるはずである。数々の研究が、Ｐａｈｅｎｕ２マウスの肝臓へのＰＡＨをコードするｃＤＮＡのｒＡＡＶ媒介送達が、血液Ｐｈｅレベルを正常な範囲内まで低減し、行動を修正することを示している（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ ２００４；Ｄｉｎｇ ２００６；Ｈａｒｄｉｎｇ ２００６、Ｙａｇｉ ２０１１、Ｗｉｎｎ ２０１８）。平均して、細胞１個当たり１個のｒＡＡＶコピーまたは肝臓における正常なＰＡＨ活性の最低１０％が、肝臓における欠陥を修正するのに十分である（Ｈａｍｍａｎ ２０１０、Ｙａｇｉ ２０１１、Ｖｉｅｃｅｌｌｉ ２０１４）。野生型肝細胞またはヘテロ接合型Ｐａｈｅｎｕ２／＋ドナーからの肝細胞を使用したＰＫＵマウスへの肝細胞再増殖研究は、いずれかの肝細胞での３～１０％の肝臓再増殖が、血液Ｐｈｅレベルを部分的に低減し、１０％の肝臓再増殖で血液Ｐｈｅレベルは完全に修正されたことを示した（Ｈａｍｍａｎ ２０１０）。近年、この概念の証明は、機能的なＰａｈ遺伝子コピーを肝臓に送達する遺伝子療法試験で示されたが、比較的大きいベクター用量が必要であった（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ２０２０）。必要なのは、肝臓への効率的な遺伝子移入、肝臓におけるｈＰＡＨの強力な発現、それに続くＰＫＵ病理の修正のための改善されたｒＡＡＶベクターである。
本明細書において引用される特許出願および広報を含む全ての参考文献は、参照によってそれら全体が本明細書に組み入れられる。
Ｋｏｃｈｈａｒ ＪＳら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ ２０１２、２：２２３～２３７ Ｈｏ Ｇ、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ Ｐｅｄｉａｔｒ ２０１４、４：４９～６２ Ｂｌａｕ Ｎ、Ｌｏｎｇｏ Ｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２０１５、１６：７９１～８００ Ｆｌｙｄａｌ ＭＩ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ａ．ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ２０１３、６５：３４１～３４９ Ｅｒｌａｎｄｓｅｎ Ｈら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２００３、１１２：１５５７～１５６５ Ｋｎａｐｐｓｋｏｇ ＰＭら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６、２４２：８１３～８２１ Ｊａｆｆｅ Ｅら、 Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２０１３、５３０：７３～８２ Ａｒｔｕｒｏ ＥＣら、ＰＮＡＳ ２０１６、１１３：２３９４～２３９９ Ｗａｉｓｂｒｅｎ ＳＥら、Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ２００７、９２：６３～７０ Ｔｈｏｍａｓ Ｊら、Ｊ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ５：１～９ Ｃｌｅａｒｙ Ｍら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｍｅｔａｂ ２０１３、１１０：４１８～４２３ Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＭＪら、ＳｅｍｉｎＰｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１６、２３：３３２～３４０ Ｖｏｇｅｌ ＫＲら、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１７、４０：２２７～２３５ Ｂｕｒｔｏｎ Ｂら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｍｅｔａｂ ２０１５、１１４：４１５～４２４ Ｌｏｎｇｏ Ｎら、Ｌａｎｃｅｔ ２０１４、３８４：３７～４４
本発明は、少なくとも部分的に、本発明者のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードする発現カセットの開発に基づく。この発現カセットは、ヒト細胞培養、ＰＫＵマウスモデルの肝臓、および非ヒト霊長類の肝臓のいずれにおいても肝臓細胞における導入遺伝子発現を駆動させることを可能にした。さらに、発現カセットによって生産された野生型ヒトＰＡＨポリペプチドは酵素的に活性であった。したがって、この発現カセットを有するｒＡＡＶベクターは、低減したベクター用量で効能をもたらすことにより、ＰＫＵ遺伝子療法のへの道を提供することが可能である。
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ｒＡＡＶベクターは、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含み、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーは、１または２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１もしくは２つの改変されたアルファ１－ミクロビクニン（ｍｉｃｒｏｂｉｋｕｎｉｎ）エンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある。
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ｒＡＡＶベクターは、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含み、発現カセットは、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）であり、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置する。
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶベクター、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーは、１もしくは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１もしくは２つの改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み；３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）であり、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている。
上記の態様の一部の実施形態において、発現カセットは、イントロンをさらに含む。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。
上記の態様の一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、ヒトＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列に少なくとも８０％同一である。
上記の態様の一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した発現カセットを含む。一部の実施形態において、請求項１から１８のいずれか１項に記載の発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接している。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補性ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
上記の態様の一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号３に少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号４の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号３に少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号６の核酸配列によってコードされる。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む細胞を提供する。一部の態様において、本発明は、ＰＡＨポリペプチドを生産する方法であって、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で、本明細書に記載される細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＰＡＨポリペプチドを精製する工程をさらに含む。
一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載される組成物を個体に投与することを含む、前記方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、本明細書に記載される細胞を個体に投与することを含む、前記方法を提供する。一部の実施形態において、個体は、ＰＡＨ活性を欠如している。
一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載される組成物を個体に投与することを含む、前記方法を提供する。一部の態様において、本発明は、それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、本明細書に記載される細胞を個体に投与することを含む、前記方法を提供する。一部の実施形態において、処置前の個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹腔内、または皮下に投与される。一部の実施形態において、投与は、別の療法と組み合わされる。一部の実施形態において、別の療法は、テトラヒドロビオプテリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｉｂｉｏｐｔｅｒｉｎ）での処置、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニンが制限された食事である。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶ粒子、組成物、または細胞のいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／またはシリンジをさらに含む。
図１Ａ～１Ｃは、野生型ＰＡＨおよびＰＡＨバリアントのＰＡＨタンパク質および活性レベルのインビトロにおける比較を示す図である。４つの発現プラスミド（ｎ＝２／プラスミド）を、ヒト肝臓細胞株であるＨｕｈ７細胞にトランスフェクトし、７２時間後、細胞を収集して、溶解物を調製した。図１Ａは、ＰＡＨ活性レベルを示す。１３Ｃ－Ｐｈｅを基質として使用し、アッセイを３０分間行った。生成した生成物（１３Ｃ－Ｔｙｒ）の量を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定し、値を総タンパク質に対して正規化した。試料の同一性はｘ軸上に示され、左から右へ、ｍｏｃｋ対照、ｈＰＡＨ／Ｇ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇ、ｈＰＡＨ／Ｅ（野生型ｈＰＡＨ）、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｅ、およびマウスＰＡＨ（ｍＰＡＨ）を含む。ｙ軸は、ＰＡＨ活性のレベル（タンパク質のｍｇに対する１３ＣＴｙｒのμＭ）を示す。 図１Ｂは、ＰＡＨタンパク質レベルを示すウェスタンブロットを示す。細胞溶解物（１５μｇ／レーン）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに泳動し、膜に移行させ、次いでヒトおよびマウスＰＡＨタンパク質の両方に反応性を有する抗ＰＡＨ抗体でプローブ付けした。試料の同一性は、ブロットの上に示され、左から右へ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇ、野生型ｈＰＡＨ／Ｅ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｅ、ｈＰＡＨ／Ｇ、およびｍＰＡＨを含む。 図１Ｃは、ＡｚｕｒｅＳｐｏｔソフトウェアを使用したウェスタンブロットによって決定した場合のＰＡＨタンパク質レベルの定量化を示す。試料の同一性は、ｘ軸上に示され、左から右へ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇ、野生型ｈＰＡＨ／Ｅ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｅ、ｈＰＡＨ／Ｇ、およびｍＰＡＨを含む。図１Ａ～１Ｃにおいて、「ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇ」は、Ｅ１８３Ｇアミノ酸置換を有するヒトＰＡＨバリアント１を示し；「ＷＴ ｈＰＡＨ／Ｅ」は、Ｅ１８３残基を有する野生型ヒトＰＡＨを示し；「ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇ」は、Ｅ１８３残基を有するヒトＰＡＨバリアント１を示し；「ｈＰＡＨ／Ｇ」は、Ｅ１８３Ｇアミノ酸置換を有する突然変異ヒトＰＡＨを示し；「ｍＰＡＨ」は、陽性対照として使用されたＦＬＡＧタグ付きマウスＰＡＨを示す。 図２Ａ～２Ｅは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における肝臓細胞および臓器への遺伝子移入に関してＡＡＶカプシドを比較し、ＮＨＰにおけるＡ１Ｍ２－ｍＴＴＲプロモーターを検証する実験の結果を示す図である。図２Ａは、左から右へ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＸＬ１４、およびＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドベクターを使用した、ＣＢＡ－ＥＧＦＰ発現カセットを含有するＡＡＶベクターで形質導入されたヒト肝臓細胞株（Ｈｕｈ７細胞）におけるＥＧＦＰタンパク質レベルを示す。 図２Ｂは、ＮＨＰ肝臓（濃い灰色）および脾臓（薄い灰色）におけるベクターゲノム／細胞のレベルを示す。５ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＩＶ送達の後、ベクターゲノムコピーを２週間後にｑＰＣＲによって測定した。ベクター投与後１４日の各動物の肝臓および脾臓中のＶＧコピーが示される。肝臓に関する値は、様々な場所から収集された４つの試料の平均を表す。脾臓に関する値は、脾臓の中央セクションから収集された２つの隣接する試料の平均である。 図２Ｃは、ＮＨＰ腎臓（濃い灰色）、筋肉（薄い灰色）、および心臓（中間の灰色）におけるベクターゲノム／細胞のレベルを示す。値は、各組織から収集された２つの隣接する試料の平均を表す。カプシドタンパク質の同一性は、ｘ軸に沿って示され、左から右へ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＸＬ１４、またはＡＡＶ－ＸＬ３２を含む。 図２Ｄは、比較された５つのカプシドのベクターの生体内分布比較の要約を示す。ベクターゲノム／細胞のレベルは、ｘ軸上、左から右へ示される通り、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＸＬ１４、またはＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドベクターを有するベクターが投与されたＮＨＰの肝臓、脾臓、筋肉、心臓、または腎臓に対してｙ軸に示される。 図２Ｅは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＸＬ１４、またはＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドベクターの投与後の右内側葉の３つの部分および左内側葉の１つの部分におけるＥＧＦＰの発現を示す。 図３Ａ～３Ｅは、ＮＨＰ肝臓遺伝子移入のためのＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－－ＥＧＦＰの用量応答を測定する実験の結果を示す図である。図３Ａは、ｘ軸上に示した通りのビヒクルのみの対照、またはＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－の５ｅ１１、２ｅ１２、５ｅ１２および２ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量を投与したＮＨＰにおける、ｙ軸に示した通りのＮＨＰ肝臓におけるベクターゲノムの発生量を示す。下のＸ軸パネルに、平均ベクターゲノムコピー／細胞を示す（ｎ＝３／投与コホート）。Ｍ、雄ＮＨＰ、Ｆ、雌ＮＨＰ（有意性：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）。図３Ｂは、ｘ軸上に示した通りのビヒクルのみの対照、または５ｅ１１、２ｅ１２、５ｅ１２および２ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量のＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＥＧＦＰを投与したＮＨＰにおける、ｙ軸に示した通りのＮＨＰ肝臓におけるベクター由来の転写物のレベルを示す。図３Ｃは、ｘ軸上に示した通りのビヒクルのみの対照、または５ｅ１１、２ｅ１２、５ｅ１２および２ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量のＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＥＧＦＰを投与したＮＨＰにおける、ｙ軸に示した通りのＥＧＦＰタンパク質レベルを示す。図３Ｄは、肝臓ベクターゲノムと、ベクター由来のｍＲＮＡコピーとの間の相関を示す（この分析では高用量の２ｅ１３ｖｇ／ｋｇは省略した）。図３Ｅは、ベクター由来のｍＲＮＡコピーと、肝臓におけるｅＧＦＰタンパク質レベルとの間の相関を示す。 図３－１の続き。 図３－２の続き。 図４Ａ～４Ｃは、ＮＨＰに投与されたＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＥＧＦＰの用量応答研究における肝臓インサイチュハイブリダイゼーション分析の結果を示す図である。図４Ａは、肝臓におけるベクターを検出するための代表的なインサイチュハイブリダイゼーションの画像を示す。一例として、右に動物＃２０３（２ｅ１２ｖｇ／ｋｇグループ）における検出（ｑＰＣＲによる、３ｖｇ／細胞）を示す。 図４Ｂは、ｘ軸上に示した通りのビヒクルのみの対照、または５ｅ１１、２ｅ１２、５ｅ１２および２ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量のＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＥＧＦＰを投与したＮＨＰにおける、ｙ軸に示した通りのインサイチュハイブリダイゼーションによって検出された肝臓におけるＥＧＦＰ－ベクターＤＮＡ陽性細胞のパーセンテージを示す。 図４Ｃは、ｑＰＣＲによって決定した場合のＶＧコピーの平均数（ｙ軸）の、インサイチュハイブリダイゼーションによって決定した場合のＶＧ陽性細胞のパーセンテージ（ｘ軸）に対する相関を示す。 図５Ａ～５Ｂは、ＮＨＰにおけるＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドベクターの生体内分布の比較を示す図である。図５Ａは、肝臓および様々な他の臓器におけるベクターゲノム／細胞のレベルを示す。肝臓に関する値は、各グループにおける３匹の動物の平均を表し（各動物は、右および左内側葉からの１つの試料ごとに試験された）、他の臓器に関する値は、３匹の動物の平均である（動物１匹当たり１つの試料）。 図５Ａ～５Ｂは、ＮＨＰにおけるＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドベクターの生体内分布の比較を示す図である。図５Ｂは、肝臓におけるｍＲＮＡ由来のベクターのレベルを示す。各値は、処置グループ１つ当たりの平均を表す（それぞれ動物はｎ＝２）。 図６Ａ～６Ｄは、Ｐａｈ－ＫＯマウスにおけるＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨの効能を示す図である。図６Ａは、血液Ｐｈｅレベルの時間経過を示す。図６Ｂは、３６日目の血液Ｐｈｅレベルを示す（ＨＯＭは差の観察に含まれない）。図６Ｃは、血液Ｔｙｒレベルの時間経過を示す。図６Ｄは、３６日目の血液Ｔｙｒレベルを示す。ベクター（ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターを有する）を、１ｅ１１、３ｅ１１および１ｅ１２ｖｇ／マウスの用量で成体雄ホモ接合型Ｐａｈ－ＫＯマウスにＩＶ経路によって投与した。ベクター処置コホートは、ｎ＝８～１０匹の動物／グループを含有し、ＨＥＴ、ｎ＝１０およびＣ５７ＢＬ６６、ｎ＝５である。略語：ＨＯＭ、ホモ接合型Ｐａｈ－ＫＯマウス；ＨＥＴ、ヘテロ接合型Ｐａｈ－ＫＯマウス；Ｃ５７ＢＬ／６、野生型マウス。 図７Ａ～７Ｅは、Ｐａｈ－ＫＯマウスの肝臓におけるＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨによる遺伝子移入および形質導入の分析を示す図である。図７Ａは、肝臓におけるベクターＤＮＡコピーを示す。図７Ｂは、試験された全ての組織（肝臓、脾臓、筋肉、腎臓および肺）におけるベクターＤＮＡを示す。図７Ｃは、肝臓におけるベクター由来のｍＲＮＡレベルを示す。図７Ｄは、肝臓における細胞当たりのベクター由来のｍＲＮＡレベルに対するベクターゲノムの相関を示す。図７Ｅは、肝臓におけるベクターゲノムの血液Ｐｈｅレベルに対する相関を示す。各データポイントは、１匹の動物を表す。細胞当たりの正規化は、５ｐｇのＤＮＡ／細胞（ｖｇ／細胞）および３０ｐｇ／細胞（ｍＲＮＡ／細胞）に基づく。略語：ＨＯＭ、ホモ接合型ＰＡＨ－ＫＯマウス。 図７－１の続き。 図８Ａ～８Ｃは、Ｐａｈ－ＫＯマウスの肝臓におけるＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨを用いた送達後のＰＡＨ活性およびタンパク質レベルの分析を示す。図８Ａは、肝臓ホモジネートにおけるＰＡＨ活性を示す。図８Ｂは、ウェスタンブロットによるＰＡＨタンパク質の検出を示す。図８Ｃは、ＰＡＨ免疫組織化学によるＰＡＨ陽性細胞の局在化を示す。ベクター処置コホートは、ｎ＝８～１０匹の動物／グループを含有し、ＨＥＴ、ｎ＝１０およびＣ５７ＢＬ、ｎ＝５である。ウェスタンブロットのために、各コホートにおける３匹の代表的な動物を分析に使用した。それらの等しいタンパク質ローディングは、ｂ－アクチンプロービングによって示される。 図８－１の続き。 図９Ａおよび９Ｂは、脳のアミノ酸および神経伝達物質レベルにおける肝臓へのＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ送達の作用を示す。図９Ａは、脳のＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐレベルを示す。 図９Ａおよび９Ｂは、脳のアミノ酸および神経伝達物質レベルにおける肝臓へのＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ送達の作用を示す。図９Ｂは、脳の神経伝達物質であるドーパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンのレベルを示す。各データポイントは、１匹の動物を表す。脳のアミノ酸分析のために、ベクター処置コホートは、ｎ＝７～１０匹の動物／グループを含有し、ＨＥＴ、ｎ＝９およびＣ５７ＢＬ／６、ｎ＝５である。脳の神経伝達物質分析のために、ベクター処置コホートは、ｎ＝７匹の動物／グループを含有し、ＨＥＴ、ｎ＝６およびＣ５７ＢＬ／６、ｎ＝４である。統計的分析は一元配置ＡＮＯＶＡによる。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ送達後のＰａｈ－ＫＯマウスの行動分析を示す。図１０Ａは、巣の品質の画像を示し、各スコアは、１（低品質）～５（高品質）のただれの範囲である。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ送達後のＰａｈ－ＫＯマウスの行動分析を示す。図１０Ｂは、ｒＡＡＶ－ＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ処置の前および後の動物のスコア付けを示す。各データポイントは、１匹の動物を表す。ベクター処置コホートは、ｎ＝８～１０匹の動物／グループを含有し、ＨＥＴ、ｎ＝１０およびＣ５７ＢＬ／６、ｎ＝５であり、統計的分析は、一元配置ＡＮＯＶＡによる。 図１１Ａ～１１Ｃは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の研究中の動物の成長を示す。図１１Ａは、体重は、処置前のＨＥＴおよびＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスと比較して、Ｐａｈ－ＫＯマウス（ＨＯＭおよび処置コホート）において、有意に異なっていたことを示す。図１１Ｂは、ＷＴ ＰＡＨでの処置の４ヶ月後、未処置のＨＯＭマウスと比較して、２つのより高い用量のコホートで体重が有意に増加したことを示す。図１１Ｃは、処置グループにおける肝臓重量の増加を示し、これらはＨＥＴおよびＷＴ マウスと類似していた。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較により、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１および＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１である。各データポイントは、１匹の動物を表す（１グループ当たりｎ匹、ＨＯＭ＝９；低用量、ｎ＝６；中用量、ｎ＝８、高用量、ｎ＝８、ＨＥＴ、ｎ＝８およびＷＴ、ｎ＝８）。略語：ＨＯＭ、ホモ接合型Ｐａｈ－ＫＯマウス；ＨＥＴ、ヘテロ接合型Ｐａｈ－ＫＯマウス；ＷＴ、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス。用量はｖｇ／マウスである。 図１２Ａ～１２Ｃは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の研究中の血漿Ｐｈｅレベルを示す。図１２Ａは、１２０日にわたる各コホートにおける平均の血液Ｐｈｅレベルを示す。処置後７日（図１２Ｂ）および１２０日（図１２Ｃ）における個々のマウスにおける血液Ｐｈｅレベル。全ての処置グループ（用量ｖｇ／マウス）は、未処置のＨＯＭマウスと比較して、血液Ｐｈｅレベルを有意に低減させた。いずれのタイムポイントでも、ＨＥＴおよびＷＴマウスと比較して、３ｅ１１および１ｅ１２用量でＷＴ ＰＡＨ処置グループ間で有意差はなかった。用量１ｅ１１は、ばらつきを呈示し、ＨＥＴ／ＷＴと同等ではなかった。動物数、統計的分析および略語は図１１Ａ～１１Ｃの凡例で示した通り。 図１２－１の続き。 図１３Ａ～１３Ｅは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与４ヶ月後における肝臓におけるベクターＤＮＡおよびｍＲＮＡを示す。図１３Ａは、肝臓におけるベクターＤＮＡコピーを示し、図１３Ｂは、肝臓におけるベクター由来のｍＲＮＡレベルを示す。両方のエンドポイントは、用量応答性の増加を示した。肝臓における細胞当たりの優れたベクターゲノムのベクター由来のｍＲＮＡレベルに対する相関（図１３Ｃ）および血液Ｐｈｅレベルへの肝臓におけるベクターゲノムの相関（図１３Ｄ）が見出された。後者は、血液Ｐｈｅの正規化（１００ｕＭ）は最小で０．１ＶＧ／細胞を要することを示した。図１３Ｅは、ベクターＤＮＡ（赤色）のインサイチュにおける検出における代表的な画像を示し、転写物（緑色）は、各処置コホートにつきＨ＆Ｅ染色された断片で示される。動物数、統計的分析および略語は、図１１Ａ～１１Ｃで示した通り。 図１３－１の続き。 図１３－２の続き。 図１４Ａ～１４Ｄは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の肝臓におけるＰＡＨ活性およびＰＡＨタンパク質検出を示す。図１４Ａは、肝臓ホモジネートにおけるＰＡＨ活性を示す。１ｅ１１および３ｅ１１処置コホートにおけるＰＡＨ酵素活性は、ＨＥＴマウスにおける活性と有意に異なっていなかったが、１ｅ１２処置は、正常なマウスで観察されたものより有意に高いＰＡＨ活性をもたらした。図１４Ｂは、肝臓断片におけるＰＡＨ ＩＨＣによって確認されたＰＡＨタンパク質の生産を示し、ＨＡＬＯ分析を使用して、ＰＡＨ陽性細胞のパーセンテージを定量化した。図１４Ｃは、それと肝臓におけるベクターＤＮＡコピーとの相関を示し、血液Ｐｈｅの正規化（１００μＭ）は、最低でも２０％のＰＡＨ陽性細胞を要することが示された。図１４Ｄは、全ての研究コホートのＰＡＨ ＩＨＣの代表的な画像を示す。各画像におけるＰＡＨ陽性細胞のパーセント（＃は動物）は、ＨＯＭ（＃４）、０％；１ｅ１１（＃１９）、３８％；３ｅ１１（＃２１）、６２％；１ｅ１２（＃３４）、７２％；ＨＥＴ（＃４６）、９４％およびＷＴ（＃５６）、９９％である。 図１４－１の続き。 図１４－２の続き。 図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の脳のアミノ酸および神経伝達物質レベルを示す。図１５Ａは、脳のＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐレベルを示す。全ての処置コホートは、脳のＰｈｅレベルを有意に低減させたが、低（１ｅ１１ｖｇ／マウス）用量コホートでばらつきが観察された。このグループにおいて、より高い脳のＰｈｅレベルを有する３匹の動物は、より高い血液Ｐｈｅおよびより低い肝臓への遺伝子移入と相関していた。 図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の脳のアミノ酸および神経伝達物質レベルを示す。図１５Ｂは、脳の神経伝達物質であるドーパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンレベルを示す。ここでも、より低い神経伝達物質レベルを有する低用量グループの３匹の動物は、より高い血液Ｐｈｅレベルを有する動物を表す。動物数、統計分析および略語は、図１１Ａ～１１Ｃの凡例で示した通り。 図１６Ａ～１６Ｃは、脳白質含量における肝臓へのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ送達の作用を示す。白質含量を、ＭＲＩによって脳梁体積を定量化することによって分析した。これを、生きた動物において、処置前（図１６Ａ）および処置の１０６日後（図１６Ｂ）に測定した。図１６Ｃは、各動物の脳梁体積におけるパーセンテージの変化を示す。４ヶ月の研究期間中、全ての処置した動物は有意な増加を示したが、ＨＥＴおよびＷＴ動物では変化は観察されなかった。未処置のＰａｈ－ＫＯマウス（ＨＯＭ）は、この期間中、わずかな減少を示した。図１６Ｄは、研究終了時（処置後１２０日目）の脳重量を示す。３ｅ１１用量のみのコホートは、脳重量において有意な増加を示し、正常な動物の脳重量に到達しなかった。動物数、統計的分析および略語は図１１Ａ～１１Ｃの凡例で示した通り。 図１６－１の続き。 図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の研究中の行動分析を示す。図１７Ａは、巣の品質をスコア付けした巣構築アッセイによって評価された行動を示す（スコア１の巣なし、または低品質から、５の高品質まで）。 図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ投与の４ヶ月後の研究中の行動分析を示す。図１７Ｂは、処置前ならびに処置の３５および９７日後に実行された巣構築アッセイの結果を示す。巣作りスコアの改善は３５日目にすでに観察され、処置後の９７日目まで持続した。より低いスコアを有する低用量グループ中の３匹の動物は、より高い血液中Ｐｈｅレベルを有する動物を表す。動物数、統計的分析および略語は図１１Ａ～１１Ｃの凡例で示した通り。 図１８Ａ～１８Ｇは、インビトロおよびインビボでの様々な肝臓発現カセットを有するＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨベクターの比較を示す。図１８Ａは、ベクターの図解を示す。ｒＡＡＶＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ｈＰＡＨ（Ａ１ＭＢ２）は、４ヶ月の研究で使用されたのと同じベクターを表す。ｒＡＡＶＸＬ３２．１／ＬＰ１－ＨＩ２は、ｒＡＡＶＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－－ＷＴ ｈＰＡＨに使用されたのと同じイントロンを有するＬＰ１プロモーターを含有する。ｒＡＡＶＸＬ３２．１／ＬＰ１－ＳＩコンストラクトは、血友病Ｂ治験に使用されたのと同一なプロモーターおよびイントロンを有する（Ｎａｔｈｗａｎｉ ２０１１）。ヒト肝臓細胞株におけるインビトロでの分析のために、プラスミドコンストラクトを含有する各ＩＴＲを、３連でＨｕｈ７細胞に一時的にトランスフェクトし、３日後に細胞溶解物を生成した。図１８Ｂは、インビトロでのヒト細胞におけるＰＡＨタンパク質レベルを示す。レーンごとに１０μｇの細胞溶解物を泳動し、ＰＡＨレベルを、抗ＰＡＨ抗体を使用したウェスタンブロットで分析した。等しいローディングは、β－アクチン検出と共に示される。図１８Ｃは、インビトロでのヒト細胞におけるＰＡＨ活性アッセイを示す。ＰｈｅからＴｙｒへの変換を比色アッセイによって測定し、ＢＣＡによって測定された総タンパク質に正規化した。データは、ヒト肝臓細胞においてより高いＰＡＨタンパク質および活性がＡ１ＭＢ２コンストラクトによって生成されたことを実証した。インビボでの分析のために、各ベクターを３ｅ１１ｖｇ／マウスでＰＡＨ－ＫＯマウスにＩＶ投与し、５週間評価した。図１８Ｄは、ベクター送達の３６日後の血漿Ｐｈｅレベルを示す。図１８Ｅは、各処置コホートにおける肝臓におけるベクター由来の転写物のレベルを示す。図１８Ｆは、各処置コホートにおける肝臓ＰＡＨ活性を示す。図１８Ｇは、各動物におけるベクターＤＮＡによって正規化されたＰＡＨ活性を示す。肝臓におけるベクターＤＮＡレベルの観察されたばらつきのために、ＰＡＨ活性をベクターＤＮＡによって正規化した。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較により、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１および＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１である。各データポイントは、１匹の動物を表す（全てのグループにおいてｎ＝１０であり、但しＨＯＭは、ｎ＝４）。 図１８－１の続き。 図１８－２の続き。
一部の態様において、本発明は、ＰＡＨポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、発現カセット、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、およびウイルス粒子および医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、例えば、ＰＡＨ活性を増加させること、脳へのチロシンおよびトリプトファン輸送を増加させること、ならびにドーパミンおよびセロトニンを含む脳の神経伝達物質レベルを正規化することによって、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置するための方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置するための方法であって；例えば、ＰＡＨ活性を増加させること、脳へのチロシンおよびトリプトファン輸送を増加させること、およびドーパミンおよびセロトニンなどの脳神経伝達物質レベルを正規化することによる、方法を提供する。さらなる追加の態様において、本発明は、本開示の発現カセットを用いて個体におけるＰＫＵを処置するためのキットを提供する。
全般的な技術
本明細書に記載または参照された技術および手順は、一般的によく理解されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載される広く利用されている手法などの当業者により従来の方法論を使用して一般的に採用される。
定義
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドのバックボーンは、糖およびリン酸基（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡに見出すことができる通り）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含んでいてもよい。代替として、ポリヌクレオチドのバックボーンは、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含んでいてもよく、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混成のホスホルアミデート－リン酸ジエステルオリゴマーであってもよい。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、鎖を適切な条件下でアニーリングすること、またはＤＮＡポリメラーゼを使用して適切なプライマーと共に相補鎖をデノボ合成することのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得ることができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小限の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、その例としては、これらに限定されないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体が挙げられる。全長タンパク質およびそのフラグメントはどちらも、この定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本開示の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が望ましい活性を維持する限り、天然配列への欠失、付加、および置換（一般的に自然界において保存的な）などの改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によってなされるように計画的であってもよいし、または偶発的であってもよく、例えばタンパク質を生産する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーによって偶発的であってもよい。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターのケースにおいて、組換え核酸は、少なくとも１つの、ある実施形態では２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つの、ある実施形態では２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、複製され、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、およびＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶ ＲｅおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中に、または別のベクター例えばクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミド中に）取り込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター（ｐｒｏ－ｖｅｃｔｏｒ）」と称される場合もあり、これは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびカプシド化により「レスキュー」することができる。ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内に封入された、およびウイルス粒子、特定にはＡＡＶ粒子中にカプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。
「異種」は、それが比較される、またはそれに導入されるかもしくは取り入れられる実体の残りのそれと遺伝的に別個の実体から誘導されていることを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（さらに発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに取り込まれる細胞性の配列（例えば、遺伝子またはその部分）は、ベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。
用語「導入遺伝子」は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され、任意選択で適切な条件下で翻訳および／または発現させることが可能なポリヌクレオチドを指す。態様において、これは、それが導入された細胞に望ましい特性を付与するか、またはそれ以外の方法で望ましい治療または診断結果をもたらす。
「ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子番号３９６５２６によって表される、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン）由来のポリヌクレオチド配列を指す。「ニワトリβ－アクチンプロモーター」は、本明細書で使用される場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、ニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーターおよび第１のエクソンおよびイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含有するプロモーター、例えばＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９～７７に記載される配列を指す場合もある。用語「ＣＡＧプロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができる。用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができる。
用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価体」、または「ゲノムコピー」は、ウイルスタイターへの言及において使用される場合、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物におけるゲノム粒子の数は、例えば、本明細書の実施例に、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１～１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２～２７８に記載されたような手順によって測定することができる。
用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書で使用される場合、ベクター、例えばウイルスベクターのポリヌクレオチド配列のセットを含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す場合もある。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にカプシド化することができる。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列、および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入されたあらゆる異種配列を含んでいてもよい。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ配列、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列を含んでいてもよい。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを含み得る。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸のタイターは、ｖｇ／ｍＬの単位で測定することができる。このタイターを測定するのに好適な方法は、当業界において公知である（例えば、定量ＰＣＲ）。
用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、ウイルスタイターへの言及において使用される場合、感染中心アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）によって測定した場合の、感染性の、および複製可能な組換えＡＡＶベクター粒子の数を指し、このアッセイはまた、複製中心アッセイ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）としても公知であり、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３～１９７３に記載される通りである。
用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、ウイルスタイターへの言及において使用される場合、機能アッセイで、例えば、本明細書に記載の実施例、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３～１２４；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０～５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されたような機能アッセイで測定した場合の、機能的な導入遺伝子産物の生産をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当業界においてよく理解されている用語であり、ウイルスゲノムの末端に見出される逆方向の相対的に短い配列を指す。
「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当業界においてよく理解されている用語であり、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、２つの択一的な方向のいずれかに存在していてもよく、異なるＡＡＶゲノム間、および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間に不均質性をもたらす。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性を有するいくつかのより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と名付けられた）も含有し、これは、ＩＴＲのこの部分内において鎖内の塩基対形成を可能にする。
「末端分解配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製中にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶのＩＴＲのＤ領域中の配列である。突然変異末端分解配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に対して不応性である。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、宿主細胞によってＡＡＶを複製し、パッケージングすることを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、これらに限定されないが、ＡＡＶの複製およびパッケージングに役立つヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子などの多数の形態のいずれかで提供することができる。他のＡＡＶヘルパー機能は当業界において公知であり、例えば遺伝毒性物質などである。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、宿主細胞によってＡＡＶ（これは欠損パルボウイルスである）を複製し、パッケージングすることを可能にするウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。多数のこのようなヘルパーウイルスが同定されており、その例としては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアおよびバキュロウイルスが挙げられる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類および鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスも、ＡＴＣＣなどの受託機関から入手可能であり、その例としては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。ＡＡＶの複製のためのアデノウイルスヘルパー機能の例としては、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。受託機関から入手可能なバキュロウイルスとしては、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスが挙げられる。
ｒＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子の感染性ヘルパーウイルス粒子に対する比率が、少なくとも約１０２：１；少なくとも約１０４：１、少なくとも約１０６：１；または少なくとも約１０８：１またはそれより高い比率である場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。一部の実施形態において、調製物はまた、等価な量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記したヘルパーウイルス粒子の不純物が崩壊した形態で存在する場合、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在すると予想されるタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質汚染は、ＳＤＳゲルにおけるクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として一般的に観察することができる。
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮に入れない、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一な候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業界における能力の範囲内の様々な方法で、例えば、公共的に利用可能なコンピューターソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、Ｓｕｐｐ．３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載され、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを含むものを使用して達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ペンシルバニア）である。当業者は、比較されている配列の全長にわたり最高のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは、その代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それと、またはそれに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと言うことができる）は、Ｘ／Ｙの分数に１００をかけることによって計算され、式中Ｘは、配列アライメントプログラムによって、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて同一な一致とスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されると予想される。本明細書に記載の目的のために、所与の核酸配列Ｃの核酸配列同一性％への、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｄ（これは、その代わりに、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の核酸配列同一性％を有するかまたは含む所与の核酸配列Ｃと言うことができる）は、Ｗ／Ｚの分数に１００をかけることによって計算され、式中Ｗは、配列アライメントプログラムによって、ＣとＤのそのプログラムのアライメントにおいて同一な一致とスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する核酸配列同一性％は、ＤのＣに対する核酸配列同一性％と等しくないことが理解されると予想される。
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、それが、その天然環境の成分から、同定、分離および／または回収されていることを意味する。
「有効量」は、臨床結果（例えば、症状の改善、臨床エンドポイントの達成など）を含む有益な、または望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数の投与で投与することができる。病気の状態に関して、有効量は、疾患を改善する、安定化する、またはその発症を遅延させるのに十分な量である。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
「処置」は、本明細書で使用される場合、有益な、または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。この開示の目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能かまたは検出不能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の低減、安定化された（例えば、悪化していない）疾患の状態、疾患の拡がり（例えば、転移）の防止、疾患進行の遅延または減速、病気の状態の改善または一時的緩和、および寛解（部分的かまたは全体かにかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味する場合もある。
用語「予防的処置」は、本明細書で使用される場合、個体が、障害を有することがわかっている、もしくはその疑いのある、または障害を有するリスクがあるが、障害の症状を呈示していないかまたは最小の症状しか呈示していない場合の処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状が発症する前に処置することができる。
「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）」は、本明細書で使用される場合、フェニルアラニンの芳香族側鎖の水酸化を触媒してチロシンを生成する酵素（ＥＣ１．１４．１６．１）である。ＰＡＨは、触媒作用のためにテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４、プテリジン補因子）および非ヘム鉄を使用するモノオキシゲナーゼである。反応中、分子酸素は、ＢＨ４およびフェニルアラニン基質への１つの酸素原子の逐次的な取り込みによってヘテロリシスにより切断される。フェニルアラニンのチロシンへの水酸化は、フェニルアラニンの異化における律速工程であり、この酵素活性の欠損は、常染色体劣性障害であるフェニルケトン尿症を引き起こす。ＰＡＨはまた、ＰＨ、ＰＫＵ、またはＰＫＵ１と称される場合もある。ＰＡＨは、Ｎ末端調節（１～１１７）、中央触媒（１１８～４１０）およびＣ末端四量体化ドメイン（４１１～４５２）からなるマルチドメインタンパク質である。ヒトＰＡＨは、ＧｅｎＢａｎｋに提供されており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６００８２．１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００２６８．１（タンパク質）、およびＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００２７７．３（ｍＲＮＡ）である。野生型ヒトＰＡＨの例は、配列番号１として提供される。
「フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）」は、本明細書で使用される場合、肝臓酵素のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝学的欠損を指す。いかなる処置も行われなければ、ＰＫＵの重度の形態は、高度に上昇した血液Ｐｈｅレベルに至り、これは、神経毒性であり重度の精神遅滞に関連する。
「ｍＴＴＲプロモーター」は、マウストランスチレチン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列を指す。ｍＴＴＲプロモーターの例であるｍＴＴＲ４８２は、Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅ、（２０１６）およびＮａｍｂｉａｒ（２０１７）によって提供される。
「改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２）」は、ヒトプロトロンビン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列の２つのコピーを指す。ｍＰｒＴ２エンハンサーの例は、（ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ２００６、Ｊａｃｏｂｓ ２００８）によって提供される。ｍＰｒＴ２配列の例は、配列番号７によって提供される。
「改変されたアルファ１－マイクロビクニン（ｍＡ１ＭＢ２）」は、ヒトアルファ１－ミクログロブリン／ビクニン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列の２つのコピーを指す。ｍＡ１ＭＢ２の例は、（ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ２００６、Ｊａｃｏｂｓ ２００８）によるエンハンサーである。ｍＡ１ＭＢ２配列の例は、配列番号８によって提供される。
「改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）」は、マウスアルブミン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列を指す。ｍＥａｌｂエンハンサーの例は、（Ｋｒａｍｅｒ ２００３）によって提供される。ｍＥａｌｂ配列の例は、配列番号９によって提供される。
「Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）」は、ＰｒｅＣｏｒｅプロモーターの上流に配置されたＢ型肝炎ウイルス由来のポリヌクレオチド配列を指す。ｈＥＩＩエンハンサーの例は、（Ｋｒａｍｅｒ ２００３）によって提供される。ＨＥＩＩ配列の例は、配列番号１０によって提供される。
「ＣＲＭ８」は、ヒトＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子からのポリヌクレオチド配列由来のシス作用性調節モジュールを指す（Ｃｈｕａｈ ２０１４）。ＣＲＭ８配列の例は、配列番号１１によって提供される。
「Ａｌｂ３’」は、ヒトアルブミン遺伝子のコード領域に対して３’のポリヌクレオチド配列を指す。Ａｌｂ３’エレメントの例は、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ（２００８）によって提供される。Ａｌｂ３’配列の例は、配列番号１２によって提供される。「Ａｌｂ３’／ＳＭＡＲ」は、ヒトアルファ１－抗トリプシン遺伝子（ＡＦ１５６５４２）の足場／マトリックス付着領域に連結されたＡｌｂ３’を指す。Ａｌｂ３’／ＳＭＡＲ配列の例は、配列番号１３によって提供される。
本明細書において「約」の値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーターそのものに向けられた実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及している記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の単数形は、別段の指定がない限り、複数形の対象を含む。
本明細書に記載される開示の態様および実施形態は、「含む」、「からなる」、および／または「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
肝臓特異的発現カセット
一部の態様において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現するための発現カセットであって、発現カセットが、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、プロモーターが、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーが、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含む、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ｍＴＴＲコアプロモーターおよびｍＴＴＲ上流エンハンサーを含む。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’である。一部の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるＰＡＨポリペプチドをコードする。
一部の実施形態において、本発明は、肝臓細胞において導入遺伝子を発現するための発現カセットであって、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）、またはヒトα１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）である、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるＰＡＨポリペプチドをコードする。
一部の実施形態において、本発明は、肝臓細胞内で導入遺伝子を発現するための発現カセットであって、発現カセットが、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーが、１つまたは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｍＰｒＴ２）、１つまたは２つの改変されたアルファ１－マイクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）、またはＣＲＭ８エンハンサーを含み、３’エレメントが、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）、またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）である、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである。一部の実施形態において、エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’である。一部の実施形態において、３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、本明細書に記載されるＰＡＨポリペプチドをコードする。
一部の実施形態において、本発明は、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットであって、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードする、発現カセットを提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、ヒトＰＡＨポリペプチドである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、Ｅ１８３残基を含む。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、番号１８３のアミノ酸残基にグルタミン酸残基を含む。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、Ｅ１８３Ｇアミノ酸置換を含むＰＡＨポリペプチドより高いレベルのＰＡＨ活性を示す。
一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドをコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドをコードする導入遺伝子は、特定の細胞、例えば真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物の細胞であるか、またはそれ由来であってもよく、このような生物は、例えば哺乳動物であり、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類が挙げられる。一般的に、コドン最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子においてより高い頻度で、または最も高い頻度で使用されるコドンと置き換えることによって、目的の宿主細胞における発現の強化のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドン出現頻度表は、例えば「コドン出現頻度データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ．ら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２を参照）。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）、ＤＮＡ２．０、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＧＡ）またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＧＳ）およびＣｐＧ含量の低減と組み合わせたＧＳアルゴリズムが利用可能である。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドをコードする導入遺伝子は、ＧＡアルゴリズムを使用してコドン最適化されている。
一部の実施形態において、発現カセットは、イントロンをさらに含む。本発明で使用するための様々なイントロンが当業者に公知であり、その例としては、ＭＶＭイントロン、Ｆ ＩＸ短縮化イントロン１、β－グロビンＳＤ／イムノグロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）重鎖ＳＡ、アデノウイルスＳＤ／イムノグロビンＳＡ、ＳＶ４０後期ＳＤ／ＳＡ（１９Ｓ／１６Ｓ）、およびハイブリッドアデノウイルスＳＤ／ＩｇＧ ＳＡが挙げられる。（Ｗｕら、２００８、Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５、Ｃｈｏｉら、２０１４、Ｗｏｎｇら、１９８５、Ｙｅｗら、１９９７、Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ（１９９０）。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、誤った翻訳開始部位を最小化するために全てのＡＴＧ部位が除去されている、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドプロモーターおよびイントロンである（配列番号１５）。一部の実施形態において、イントロンは、ＭＶＭイントロン、ＦＩＸ短縮化イントロン１、β－グロビンＳＤ／免疫グロビン重鎖ＳＡ、アデノウイルスＳＤ／免疫グロビンＳＡ、ＳＶ４０後期ＳＤ／ＳＡ（１９Ｓ／１６Ｓ）、またはハイブリッドアデノウイルスＳＤ／ＩｇＧ ＳＡである。一部の実施形態において、イントロンは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである。
一部の実施形態において、発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、Ｌｅｖｉｔｔ，Ｎら（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０１９～１０２５に記載されたような合成ポリアデニル化シグナルである。
一部の実施形態において、発現カセットは、スタッファー核酸を含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、レポーターポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよい。当業者により認識されると予想されるように、スタッファー核酸は、核酸内の様々な領域に配置されていてもよいし、核酸内の連続する配列（例えば、単一の場所における単一のスタッファー核酸）または複数の配列（例えば、１つより多くの場所（例えば、２つの場所、３つの場所など）における１つより多くのスタッファー核酸）で構成されていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ＰＡＨポリペプチドをコードする導入遺伝子の下流に位置していてもよい。実施形態において、スタッファー核酸は、ＰＡＨポリペプチドをコードする導入遺伝子の上流に（例えば、プロモーターと導入遺伝子との間に）位置していてもよい。同様に当業者により認識されると予想されるように、様々な核酸をスタッファー核酸として使用することができる。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ヒトアルファ－１－抗トリプシン（ＡＡＴ）スタッファー配列またはＣ１６Ｐ１第１６染色体Ｐ１クローン（ヒトＣ１６）スタッファー配列の全部または一部を含む。一部の実施形態において、スタッファー配列は、遺伝子の全部または一部を含む。例えば、スタッファー配列は、ヒトＡＡＴ配列の部分を含む。当業者は、スタッファーフラグメントとして遺伝子の異なる部分（例えば、ヒトＡＡＴ配列）を使用できることを認識していると予想される。例えば、スタッファーフラグメントは、遺伝子の５’末端、遺伝子の３’末端、遺伝子の中央、遺伝子の非コード部分（例えば、イントロン）、遺伝子のコード領域（例えばエクソン）、または遺伝子の非コード部分とコード部分との混合物からであってもよい。当業者はまた、スタッファー配列の全部または一部をスタッファー配列として使用できることも認識していると予想される。一部の実施形態において、スタッファー配列は、内部ＡＴＧコドンを除去するように改変されている。一部の実施形態において、スタッファー配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、発現カセットは、ベクターに組み込まれる。一部の実施形態において、発現カセットは、ウイルスベクターに組み込まれる。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号１４の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターである。
ベクターおよびウイルス粒子
特定の態様において、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）を発現させるための発現カセットは、ベクター中に含有されている。一部の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子、例えば、以下に記載されるウイルス粒子にパッケージングするためのＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列の導入のための組換えウイルスゲノムの使用を企図する。組換えウイルスゲノムは、ＰＡＨポリペプチドの発現を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を含み得る。ウイルス粒子についての例示的なウイルスゲノムエレメントおよび送達方法を、より詳細に以下に記載する。
非ウイルス送達系
核酸を細胞または標的組織に導入するために、従来の非ウイルス遺伝子導入方法も使用される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および送達系に複合化される核酸が挙げられる。例えば、ベクターは、脂質（例えば、カチオン性もしくは中性脂質）、リポソーム、ポリカチオン、ナノ粒子、または核酸の細胞取り込みを増強する薬剤に複合化される。ベクターは、本明細書に記載される送達方法のいずれかに適した薬剤に複合化される。一部の実施形態において、核酸は、１つまたはそれ以上のウイルスＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）を含む。
ウイルス粒子
一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）を発現させるための発現カセットを含むベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。
ｒＡＡＶ粒子
一部の実施形態において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）を発現させるための発現カセットは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接している。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１または２つのＩＴＲが隣接した、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを含む組換えＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接している。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号１４の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、転写の方向の構成要素、転写開始および終了配列を含む制御配列と作動可能に連結され、それによって発現カセットを形成する。発現カセットは、５’端および３’端において、少なくとも１つの機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接している。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングのために意図される通りに機能することを意味する。Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４～４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０～１６頁が参照され、これらは全て、参照により全体として本明細書に組み入れる。本発明の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、カプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に不可欠なＡＡＶの配列の全て、およびｒＡＡＶによる感染のための物理構造を少なくとも含む。本発明のベクターで使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３～８０１頁に記載されるような配列）を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換による改変を有してもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。４０種類を超えるＡＡＶの血清型が現在知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが引き続き特定されている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１～６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照。
任意のＡＡＶ血清型の使用が、本発明の範囲内とみなされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型に由来するベクターであり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲなどである。一部の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶのＩＴＲを含む。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲ等である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を含んでもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードしてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットに対して３’に位置していてもよい。
一部の態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補性ベクターである。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、同第７，７６５，５８３号、同第７，７８５，８８８号、同第７，７９０，１５４号、同第７，８４６，７２９号、同第８，０９３，０５４号、および同第８，３６１，４５７号、ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載されており、これらの各々は、参照により全体として本明細書に組み入れる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、導入遺伝子の相補的コード鎖および非コード鎖）によって、迅速に二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子であって、ｒＡＡＶゲノムが、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のＰＡＨポリペプチドのコード鎖）および第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本開示のＰＡＨポリペプチドの非コード鎖またはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列が、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成することができる、ＡＡＶウイルス粒子を提供する。
一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対合を容易にする配列、例えば、ヘアピンＤＮＡ構造によって連結される。ヘアピン構造は、当該技術分野において公知であり、例えば、ｓｉＲＮＡ分子中にある。一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列とは、変異型ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。変異型ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムを複製すると、ｒｅｐタンパク質が、変異型ＩＴＲでウイルスゲノムを切断しないため、以下を５’から３’へ順に含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスカプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドに対して逆向きの第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲ。
一部の実施形態において、第１の異種核酸配列および第２の異種核酸配列は、変異型ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号１７）を含む。変異型ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。その結果、ＡＡＶウイルスゲノムを複製すると、ｒｅｐタンパク質が、変異型ＩＴＲでウイルスゲノムを切断しないため、以下を５’から３’へ順に含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスカプシドにパッケージングされる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドに対して逆向きの第２の異種ポリヌクレオチド、および第３のＡＡＶ ＩＴＲ。
一部の実施形態において、ベクターは、ウイルス粒子中にカプシド形成される。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。異なるＡＡＶ血清型が、特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、肝組織）内の特定の細胞型を標的とするために使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、本発明のＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むことができるか、またはＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲを含むことができる。ｒＡＡＶ粒子の作製のためのＡＡＶ血清型の任意の組合せが、それぞれの組合せが本明細書に明示的に記載されているかのように、本明細書において提供される。一部の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶ２カプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本発明の操作されたＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシド、または米国特許出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されるＳｈＨ１０などのバリアントＡＡＶ６カプシド）、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、または米国特許公出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載される改変ＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、チロシンカプシド変異体、ヘパリン結合カプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシド、または米国特許出願公開第２０１２／００６６７８３号に記載される任意の他のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開第２００３／０４２３９７号に記載されるＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１９２４１３２４号Ａ１に記載されるＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、変異体カプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドを形成する能力を維持している。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５チロシン変異体カプシド（Ｚｈｏｎｇ Ｌ．ら、（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７～７８３２頁）を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質（Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００４、７８（１２）：６３８１頁）を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質またはその変異体を含む。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質またはその変異体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）カプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。一部の実施形態において、組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、および／またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶｒｈ１０カプシドは、例えば、以下に記載されるチロシン変異またはヘパラン結合変異を含む。一部の実施形態において、カプシドは、肝臓標的化カプシドであり、例えば、限定されないが、ＬＫ０３カプシド、ＨＳＣ１５カプシド、１７カプシド、ＡＡＶ－ＸＬ－３２、またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドである。一部の実施形態において、カプシドは、操作されたＡＡＶカプシド（例えば、シャッフルされたカプシド）である。操作されたカプシドの例としては、ＤＪ（Ｇｒｉｍｍ Ｄら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、２００８、８２：５８８７～９１１頁）、ＬＫ０３（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４、５０６：３８２～６頁）ならびにＨＳＣ１５およびＨＳＣ１７（Ｓｍｉｔｈ ＬＪら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１４年９月；２２（９）：１６２５～３４頁）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８等）のカプシドは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含むことが知られている。これらのタンパク質は、かなりの量の重複アミノ酸配列と、固有のＮ末端配列を含む。ＡＡＶ２カプシドは、正二十面体対称性（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）によって配置される６０個のサブユニットを含む（Ｘｉｅ、Ｑ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（１６）：１０４０５～１０頁）。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、１：１：１０の比率で存在することがわかっている。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置において１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質と、ｂ）異種核酸および少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復を含むｒＡＡＶベクターとを含む。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を低減または除去するカプシドタンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ここで該１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１番号付けに基づく番号付けで４８４位、４８７位、５３２位、５８５位または５８８位にある。本明細書で使用されるとき、「ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付け」とは、ＡＡＶ２のＶＰ１の列挙されたアミノ酸に対応する列挙されたカプシドタンパク質のアミノ酸をいう。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付けで３４７位、３５０位、３９０位、３９５位、４４８位、４５１位、４８４位、４８７位、５２７位、５３２位、５８５位および／または５８８位にある場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８に対応する列挙されたカプシドタンパク質のアミノ酸にある。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１の４８４位、４８７位、５３２位、５８５位または５８８位にある。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付けで、ＡＡＶ３のＶＰ１の４８４位、４８７位、５３２位、５８５位または５８８位にある。一部の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１番号付けに基づく番号付けで４８５位、４８８位、５２８位、５３３位、５８６位または５８９位にある。一部の実施形態において、アミノ酸５８５および／または５８８（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付け）に対応する位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸は、アルギニン残基によって置き換えられる（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６についてはＳ５８６および／またはＴ５８９、ＡＡＶ９についてはＳ５８６および／またはＡ５８９、ＡＡＶｒｈ８ＲについてはＡ５８６および／またはＴ５８９、ＡＡＶ８についてはＱ５８８および／またはＴ５９１、ならびにＡＡＶｒｈ１０についてはＱ５８８および／またはＡ５９１）。他の実施形態において、アミノ酸４８４、４８７、５２７および／または５３２（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づく番号付け）に対応する位置にある１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）は、アラニンなどの正に荷電されていないアミノ酸によって置き換えられる（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６についてはＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８および／またはＫ５３３；ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ８ＲについてはＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８および／またはＲ５３３；ならびにＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０についてはＲ４８７、Ｒ４９０、Ｋ５３０および／またはＲ５３５）。
ＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドならびにカプシドタンパク質
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、操作されたＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号４の核酸配列によってコードされたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号４の核酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な核酸によってコードされたカプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号４の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、ＶＰＸを含み、ＶＰＸは、配列番号４の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、カプシドタンパク質を含み、カプシドタンパク質は、配列番号４の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、１、２、３、または４つのカプシドタンパク質を含み、１、２、３、または４つのカプシドタンパク質は、配列番号４の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質は、配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、配列番号４の核酸配列によってコードされたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号４の核酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な核酸によってコードされたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質は、配列番号４の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１、２、３、または４つのカプシドタンパク質を含み、１、２、３、または４つのカプシドタンパク質は、配列番号４の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、配列番号４の核酸配列によってコードされたＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号４の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＶＰＸを含み、ＶＰＸは、配列番号４の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰＸを含み、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰＸは、配列番号４の核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、操作されたＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、操作されたＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号６の核酸配列によってコードされたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号６の核酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な核酸によってコードされたカプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号６の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、カプシドタンパク質を含み、カプシドタンパク質は、配列番号６の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質は、配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、配列番号６の核酸配列によってコードされたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号６の核酸配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な核酸によってコードされたカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質は、配列番号６の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１、２、または３つのカプシドタンパク質を含み、１、２、または３つのカプシドタンパク質は、配列番号６の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、配列番号６の核酸配列によってコードされたＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号６の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、１、２、または３つのカプシドタンパク質を含み、１、２、または３つのカプシドタンパク質は、配列番号６の核酸配列内のオープンリーディングフレームによってコードされる。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１９２４１３２４号Ａ１に記載されるＡＡＶカプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１９２４１３２４号Ａ１に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
ＡＡＶ粒子の作製
ｒＡＡＶベクターの作製のための多数の方法が当該技術分野において知られており、例えば、トランスフェクション、安定細胞株作製、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ、ＪＥら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１（１１）：８７８０～８７８９頁）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｕｒａｂｅ、Ｍ．ら、（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１３（１６）：１９３５～１９４３頁；Ｋｏｔｉｎ、Ｒ．（２０１１）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１）：Ｒ２～Ｒ６頁）を含む感染性ハイブリッドウイルス産生系が挙げられる。ｒＡＡＶウイルス粒子の作製のためのｒＡＡＶ産生培養は全て、１）好適な宿主細胞、２）好適なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物、４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするＡＡＶゲノム）と隣接している核酸（治療用核酸など）、ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持するための好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態において、好適な宿主細胞は、霊長類宿主細胞である。一部の実施形態において、好適な宿主細胞は、ヒト由来細胞株、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、２９３、またはＰｅｒｃ．６細胞である。一部の実施形態において、好適なヘルパーウイルス機能は、野生型または変異体アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。必ずではないが、一般に、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物がｒＡＡＶゲノムの複製およびパッケージングに機能し得る限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型の遺伝子産物である。当該技術分野で公知の好適な培地が、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用される。これらの培地には、限定するものではないが、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって製造される培地、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されているものなどのカスタム調製物、ならびに米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地が含まれ、これらの各々は、特に組換えＡＡＶベクターの作製に使用するためのカスタム培地調製物に関係して、参照により全体として本明細書に組み入れる。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。
ｒＡＡＶ粒子の作製のための方法の１つは、トリプルトランスフェクション法である。簡潔に述べると、ｒｅｐ遺伝子およびカプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に、細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）にトランスフェクトし（例えば、リン酸カルシウム法を使用して）、ウイルスを回収して、場合により精製する。そのように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞へのトリプルトランスフェクションによって作製され、核酸の宿主細胞へのトランスフェクションにより、ｒＡＡＶ粒子を作製可能な宿主細胞が生成される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、プロデューサー細胞株法によって作製される（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：２５３～２６９頁；米国特許出願公開第２００４／０２２４４１１号；およびＬｉｕ、Ｘ．Ｌ．ら、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：２９３～２９９頁）。簡潔に述べると、細胞株（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰｅｒｃ．６細胞株）を、ｒｅｐ遺伝子、カプシド遺伝子、およびプロモーター－異種核酸配列（例えば、ＰＡＨポリペプチド）を含むベクターゲノムを含有するプラスミドで安定的にトランスフェクトしてもよい。細胞株を、ｒＡＡＶ産生のためのリードクローンを選択するためにスクリーニングしてもよく、次いで、生成バイオリアクターに拡張し、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶ）に感染させて、ｒＡＡＶ産生を開始してもよい。その後、ウイルスを収集し、アデノウイルスを不活化（例えば、熱によって）および／または除去してもよく、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。そのように、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸のうちの１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって作製した。本明細書に記載されるように、プロデューサー細胞株法は、トリプルトランスフェクション法と比較して、オーバーサイズのゲノムを有するｒＡＡＶ粒子の作製にとって有利であり得る。
一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、プロデューサー細胞株において安定して維持される。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入されて、プロデューサー細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドで安定的にトランスフェクトされた細胞株は、細胞株の複数の継代（例えば、細胞の５、１０、２０、３０、４０、５０または５０を超える継代）にわたってプラスミドを維持する。例えば、プラスミドは、細胞が複製するときに複製され、またはプラスミドは、細胞ゲノムに組み込まれる。プラスミドが細胞（例えば、ヒト細胞）内で自律的に複製することを可能にする様々な配列が同定されている（例えば、Ｋｒｙｓａｎ、Ｐ．Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：１０２６～１０３３頁）。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有し得る。哺乳類細胞において一般的に使用される選択マーカーとしては、ブラスチシジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ゼオシン、ピューロマイシン、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン等のカチオン性ポリマー、またはリポフェクタミン等のカチオン性脂質を使用）、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、エレクトロポレーション、およびナノ粒子トランスフェクションが挙げられる（詳細について、例えば、Ｋｉｍ、Ｔ．Ｋ．およびＥｂｅｒｗｉｎｅ、Ｊ．Ｈ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３９７：３１７３～３１７８頁を参照）。
一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、プロデューサー細胞株に安定して組み込まれる。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはｒＡＡＶゲノムをコードする核酸は、１つまたはそれ以上のプラスミドで細胞株に導入されて、プロデューサー細胞株を生成する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、同じプラスミドで細胞に導入される。他の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ、およびｒＡＡＶゲノムは、異なるプラスミドで細胞に導入される。一部の実施形態において、プラスミドは、プラスミドを維持する細胞の選択を可能にする選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有し得る。核酸を様々な宿主細胞株に安定に組み込むための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、反復選択を使用して（例えば、選択マーカーの使用を通じて）、選択マーカー（ならびにＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノム）を含む核酸を組み込んだ細胞が選択される。他の実施形態において、部位特異的様式で核酸を細胞株に組み込んで、プロデューサー細胞株を生成してもよい。いくつかの部位特異的組換え系は、ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１～１３５５頁参照）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６～５１７０頁参照）、およびｐｈｉ Ｃ３１－ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ．ら、（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５～６０００頁参照）のように、当該技術分野において公知である。
一部の実施形態において、プロデューサー細胞株は、霊長類細胞株（例えば、非ヒト霊長類細胞株、例えば、ＶｅｒｏまたはＦＲｈＬ－２細胞株）に由来する。一部の実施形態において、上記細胞株は、ヒト細胞株に由来する。一部の実施形態において、プロデューサー細胞株は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、またはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞に由来する。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに／またはオーバーサイズｒＡＡＶゲノムをコードする核酸を細胞株に導入および／または安定的に維持／組み込んでプロデューサー細胞株を生成する前に、細胞株は、ＨｅＬａ、２９３、Ａ５４９、もしくはＰＥＲＣ．６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）細胞株、またはその誘導体である。
一部の実施形態において、プロデューサー細胞株は、懸濁液中の増殖のために適合される。当該技術分野で公知であるように、アンカー依存細胞は、通常、マイクロキャリアビーズのような基板なしでは懸濁液中で増殖することができない。懸濁液中で増殖させるために細胞株を適合させることは、例えば、スピナー培養液中で攪拌パドルを用いて細胞株を増殖させること、凝集を防ぐためにカルシウムおよびマグネシウムイオンを欠く培地（および場合により消泡剤）を使用すること、シリコーン化化合物で被覆された培養容器を使用すること、ならびに各継代で培養液中の細胞（大きな凝集塊中にないまたは容器の側面上にない）を選択することを含み得る。さらなる説明については、例えば、ＡＴＣＣのよくある質問の文書（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｇｌｏｂａｌ／ＦＡＱｓ／９／１／Ａｄａｐｔｉｎｇ％２０ａ％２０ｍｏｎｏｌａｙｅｒ％２０ｃｅｌｌ％２０ｌｉｎｅ％２０ｔｏ％２０ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－４０．ａｓｐｘから入手可能）およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。
一部の態様において、本明細書に開示される任意のｒＡＡＶ粒子の作製方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が作製される条件下で宿主細胞を培養する工程であり、宿主細胞が、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であり、それぞれＡＡＶ複製および／またはカプシド形成タンパク質をコードしている、ＡＡＶパッケージ遺伝子と、（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲと隣接している本明細書に記載の異種核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクターと、（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能とを含む、培養する工程、ならびに（ｂ）宿主細胞によって作製されるｒＡＡＶ粒子を回収する工程、を含む方法が提供される。一部の実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲ等からなる群から選択される。例えば、一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０である。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、カプシド形成タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型、ＡＡＶ－ＸＬ３２、またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質またはその変異体からなる群から選択される。一部の実施形態において、カプシド形成タンパク質は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドおよびＡＡＶ２ ＩＴＲを含む組換えゲノム、ならびに治療的導入遺伝子／核酸をコードする核酸（例えば、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセット）を含む。一部の実施形態において、カプシド化タンパク質は、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質である。一部の実施形態において、カプシド化タンパク質は、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドタンパク質である。）。一部の実施形態において、カプシド化タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
本発明の好適なｒＡＡＶ産生培養培地は、０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで血清または血清由来組換えタンパク質で補足してもよい。代替的に、当該技術分野で公知であるように、ｒＡＡＶベクターは、動物由来の生成物を有しない培地としても参照される無血清条件下で作製し得る。当業者であれば、ｒＡＡＶベクターの作製を支持するように設計された市販培地またはカスタム培地も、産生培養物中のｒＡＡＶの力価を増加させるために、当該技術分野で公知の１つまたはそれ以上の細胞培養成分、例えば、限定されないが、ブドウ糖、ビタミン、アミノ酸、および／または成長因子で補足してもよいことを理解し得る。
ｒＡＡＶ産生培養は、利用される特定の宿主細胞に好適な様々な条件下（広い温度範囲、様々な時間の長さなど）で増殖させ得る。当該技術分野で公知であるように、ｒＡＡＶ産生培養としては、付着依存培養、例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルタ、マイクロキャリア、および充填床または流動床バイオリアクターのような好適な付着依存容器中で培養可能な培養が挙げられる。ｒＡＡＶベクター産生培養はまた、懸濁適合宿主細胞、例えば、スピナーフラスコ、攪拌タンクバイオリアクター、およびＷａｖｅバッグシステムのような使い捨てシステムを含む様々な方法で培養可能なＨｅＬａ、２９３およびＳＦ－９細胞などを含んでもよい。
本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、米国特許第６，５６６，１１８号でさらに完全に記載されているように、当該技術分野で公知の条件下で細胞を培養してｒＡＡＶ粒子をインタクトな細胞から培地へ放出させられるのであれば、産生培養物の宿主細胞の溶解によって、または産生培養物からの使用済み培地の収集によって、ｒＡＡＶ産生培養物から収集してもよい。好適な細胞溶解方法も、当該技術分野で公知であり、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに界面活性剤および／またはプロテアーゼのような化学物質を用いた処理が挙げられる。
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は精製される。本明細書で使用されるとき、用語「精製される」には、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在する場所または最初に調製される場所に存在する他の成分の少なくとも一部が除去された、ｒＡＡＶ粒子の調製物が含まれる。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解物または産生培養上清などの供給源混合物から濃縮精製技術を用いて調製される。濃縮は、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の割合による方法、もしくは感染性による方法などの様々な方法で測定することができ、または、濃縮は、混入物、例えば、産生培養混入物、もしくはヘルパーウイルス、培地成分等の工程内混入物等の、供給源混合物中に存在する第２の潜在的に干渉する物質に関係させて測定することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養収集物は、宿主細胞デブリスを除去するために清澄化される。一部の実施形態において、産生培養収集物は、一連のデプスフィルタ、例えば、グレードＤＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄフィルタ、グレードＡ１ＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄフィルタ、および０．２μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ親水性膜フィルタなどを通じた濾過によって清澄化される。清澄化は、当該技術分野で公知の他の様々な標準技術、例えば、遠心分離または当該技術分野で公知の０．２μｍまたはそれ以上の孔径の酢酸セルロースフィルタを通じた濾過によっても達成される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ産生培養収集物は、産生培養物中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化するために、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）でさらに処理される。一部の実施形態において、ベンゾナーゼ（登録商標）消化は、当該技術分野において公知の標準条件下、例えば、周囲温度～３７℃の温度範囲で３０分～数時間、最終濃度１～２．５ユニット／ｍｌのベンゾナーゼ（登録商標）の条件で実行される。
ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程：平衡遠心分離；フロースルー陰イオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；および陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉、のうちの１つまたはそれ以上を使用して単離または精製される。これらの工程は、単独で、様々な組合せで、または異なる順序で使用される。一部の実施形態において、方法は、下記のような順序で全ての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えば、Ｘｉａｏら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびに国際公開第２０１０／１４８１４３号に見出される。
処置方法
本開示のある特定の態様は、それを必要とする個体においてフェニルケトン尿症を処置する方法および／またはフェニルアラニンのレベルを低減する方法に関する。一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチドである。ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、特定の目的の組織に投与してもよいし、または全身に投与してもよい。一部の実施形態において、有効量のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、これらに限定されないが、静脈内、腹膜内、骨内、動脈内、大脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内などを挙げることができる。一部の実施形態において、肝臓を越える組織からのＰＡＨポリペプチドの発現は、補因子ＢＨ４の存在（例えば、全身的に送達されるか、または核酸から共発現される）を必要とし得る。Ｄｉｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００８、１６：６７３～６８１。一部の実施形態において、有効量のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、有効量のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、１つより多くの投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態において、有効量のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、１つの場所に投与される。他の実施形態において、有効量のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、１つより多くの場所に投与してもよい。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、ＤＮＡである。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体におけるフェニルアラニンのレベルを減少させる方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体におけるフェニルアラニンのレベルは、ＰＫＵがない個体に見出されるレベルに減少する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体におけるフェニルアラニンのレベルは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のいずれか、またはそれより多く減少する。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを減少させる方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、ＰＫＵがない個体の血液に見出されるレベルに減少する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のいずれか、またはそれより多く減少する。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体の脳におけるフェニルアラニンのレベルを減少させる方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の脳におけるフェニルアラニンのレベルは、ＰＫＵがない個体に見出されるレベルに減少する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の脳におけるフェニルアラニンのレベルは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のいずれか、またはそれより多く減少する。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体の脳における神経伝達物質のレベルを増加させる方法を提供する。一部の実施形態において、神経伝達物質は、ドーパミン、ノルエピネフリンまたはセロトニンの１つまたはそれ以上である。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の脳における神経伝達物質のレベルは、ＰＫＵがない個体に見出されるレベルに増加する。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体におけるチロシンおよび／またはトリプトファン（ｔｙｐｔｏｐｈａｎ）のレベルを増加させる方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体におけるチロシンおよび／またはトリプトファンのレベルは、ＰＫＵがない個体に見出されるレベルに増加する。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体の血液におけるチロシンおよび／またはトリプトファンのレベルを増加させる方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の血液におけるチロシンおよび／またはトリプトファンのレベルは、ＰＫＵがない個体に見出されるレベルに増加する。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを投与することによって、ＰＫＵを有する個体の脳におけるチロシンおよび／またはトリプトファンのレベルを増加させる方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの投与後のＰＫＵを有する個体の脳におけるチロシンおよび／またはトリプトファンのレベルは、ＰＫＵがない個体に見出されるレベルに増加する。
本発明の一部の態様において、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）を発現させるための発現カセットは、ウイルスベクターによって個体に送達される。遺伝子療法のためのウイルスベクターは、当該技術分野で公知である。一部の態様において、本発明は、本開示のＰＡＨポリペプチドをコードするレンチウイルス粒子の有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、本開示のＰＡＨポリペプチドをコードするｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。ｒＡＡＶを、目的の特定の組織に投与してもよく、または全身的に投与してもよい。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、２つ以上の投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態においてｒＡＡＶの有効量を、１つの場所に投与する。他の実施形態において、ｒＡＡＶの有効量を、２つ以上の場所に投与してもよい。
ｒＡＡＶ（一部の実施形態では、粒子の形態の）の有効量を、処置の目的に応じて投与する。例えば、低いパーセンテージの形質導入により所望の治療効果を達成することができる場合、処置の目的は、概して、この形質導入レベルを満たすこと、またはそれを超えることである。一部の事例において、この形質導入レベルは、所望の組織型の標的細胞のわずか約１～５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、一部の実施形態において、少なくとも約５０％、一部の実施形態において、少なくとも約８０％、一部の実施形態において、少なくとも約９５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成される。ｒＡＡＶ組成物は、同じ処理の間に、または数日間、数週間、数ヶ月間、もしくは数年間間隔を置いて、１回またはそれ以上の投与によって投与される。本明細書に記載される投与経路のいずれか１つまたはそれ以上を使用し得る。一部の実施形態において、ヒトを処置するために、複数のベクターを使用してもよい。
ＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された細胞を同定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、免疫組織化学または増強緑色蛍光タンパク質のようなマーカーを使用して、ウイルス粒子、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子、の形質導入を検出することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、２つ以上の場所に同時にまたは連続して投与する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の有効量を、１つの場所に２回以上投与する（例えば、繰り返す）。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、または２４時間以下の間隔である。
一部の実施形態において、本発明は、本開示のＰＡＨポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与することによって、ＰＫＵを有するヒトを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。
一部の実施形態において、方法は、ＰＫＵの処置を必要とする個体において、本開示のＰＡＨポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与して、ＰＫＵを処置することを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０１２～６×１０１２、６×１０１２～７×１０１２、７×１０１２～８×１０１２、８×１０１２～９×１０１２、９×１０１２～１０×１０１２、１０×１０１２～１１×１０１２、１１×１０１２～１５×１０１２、１５×１０１２～２０×１０１２、２０×１０１２～２５×１０１２、２５×１０１２～３０×１０１２、３０×１０１２～５０×１０１２、または５０×１０１２～１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０１２～１０×１０１２、１０×１０１２～２５×１０１２、または２５×１０１２～５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０９～６×１０９、６×１０９～７×１０９、７×１０９～８×１０９、８×１０９～９×１０９、９×１０９～１０×１０９、１０×１０９～１１×１０９、１１×１０９～１５×１０９、１５×１０９～２０×１０９、２０×１０９～２５×１０９、２５×１０９～３０×１０９、３０×１０９～５０×１０９、または５０×１０９～１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、約５×１０９～１０×１０９、１０×１０９～１５×１０９、１５×１０９～２５×１０９、または２５×１０９～５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０～６×１０１０、６×１０１０～７×１０１０、７×１０１０～８×１０１０、８×１０１０～９×１０１０、９×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～１１×１０１０、１１×１０１０～１５×１０１０、１５×１０１０～２０×１０１０、２０×１０１０～２５×１０１０、２５×１０１０～３０×１０１０、３０×１０１０～４０×１０１０、４０×１０１０～５０×１０１０または５０×１０１０～１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～１５×１０１０、１５×１０１０～２５×１０１０、または２５×１０１０～５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、ｒＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＸＬ３２カプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＸＬ３２．１カプシドを含む。
一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、少なくとも約１×１０８～約６×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重である。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０８～約６×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重である。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、約１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、１３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、または１×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重のいずれかである。
一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、少なくとも約１×１０９～約１×１０１４ゲノムコピーである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０９～約１×１０１４ゲノムコピーである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、約１３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、または１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。
本発明の組成物（例えば、本開示のＰＡＨポリペプチドをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子）は、単独で、またはＰＫＵを処置するための１つまたはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。連続する投与の間の間隔は、少なくとも数分、数時間もしくは数日（または、代替的に、数分、数時間もしくは数日未満）であり得る。
ｒＡＡＶ（一部の実施形態では、粒子の形態の）の有効量を、処置の目的に応じて投与する。例えば、低いパーセンテージの形質導入により所望の治療効果を達成することができる場合、処置の目的は、概して、この形質導入レベルを満たすこと、またはそれを超えることである。一部の事例において、この形質導入レベルは、標的細胞のわずか約１～５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約２０％、一部の実施形態において、少なくとも約５０％、一部の実施形態において、少なくとも約８０％、一部の実施形態において、少なくとも約９５％、一部の実施形態において、所望の組織型の細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成される。ｒＡＡＶ組成物は、同じ処理の間に、または数日間、数週間、数ヶ月間、もしくは数年間間隔を置いて、１回またはそれ以上の投与によって投与される。一部の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）を処置するために、複数のベクターを使用してもよい。
一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、ヒトへの投与のために使用される。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、小児投与のために使用される。理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＫＵの症状の多くは本質的に発達上のもの（例えば、重度の精神障害）であるため、一生のうちのできるだけ早期にＰＫＵを処置することが特に有利であり得る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ（一部の実施形態において、粒子の形態の）の有効量は、生後１ヶ月未満、２ヶ月未満、３ヶ月未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、７ヶ月未満、８ヶ月未満、９ヶ月未満、１０ヶ月未満、１１ヶ月未満、１年未満、１３ヶ月未満、１４ヶ月未満、１５ヶ月未満、１６ヶ月未満、１７ヶ月未満、１８ヶ月未満、１９ヶ月未満、２０ヶ月未満、２１ヶ月未満、２２ヶ月未満、２年未満、または３年未満の患者に投与される。
一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶ組成物は、若年成人への投与のために使用される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ（一部の実施形態では、粒子の形態のｒＡＡＶ）の有効量は、１２歳未満、１３歳未満、１４歳未満、１５歳未満、１６歳未満、１７歳未満、１８歳未満、１９歳未満、２０歳未満、２１歳未満、２２歳未満、２３歳未満、２４歳未満、または２５歳未満の患者に投与される。
一部の実施形態において、本発明は、有効量の本開示のＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセット（例えば、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）を含む細胞を投与することによってＰＫＵを処置する方法を提供する。ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを含む細胞は、目的の特定の組織に投与してもよく、または全身的に投与してもよい。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを含む細胞の有効量を、非経口的に投与してもよい。非経口投与経路としては、静脈内、腹腔内、骨内、動脈内、脳内、筋肉内、髄腔内、皮下、脳室内、肝臓内等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、細胞は、封入されるか、またはデバイス内にある。一部の実施形態において、肝臓外のＰＡＨ発現細胞は、外因的に付加されるかまたは共発現される補因子ＢＨ４を必要とし得る。一部の実施形態において、細胞は、ＢＨ４をさらに含んで封入されるかまたはＢＨ４をさらに含むデバイス内にある。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを含む細胞の有効量を、１つの投与経路を介して投与してもよい。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの有効量を、２つ以上の投与経路の組合せを介して投与してもよい。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの有効量を、１つの場所に投与する。他の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットの有効量は、２つ以上の場所に投与してもよい。
一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセットを含む細胞は、肝臓細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、血液細胞、骨髄細胞、幹細胞、または誘導多能性幹細胞である。一部の実施形態において、細胞は、外因的に付加される補因子ＢＨ４および／または共発現される補因子ＢＨ４をさらに含む。
一部の実施形態において、細胞は、細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株など）である。一部の実施形態において、本発明は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）を生産する方法であって、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で、ＰＡＨポリペプチドをコードする発現カセットを含む細胞を培養することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ＰＡＨポリペプチドを作製するための方法は、ＰＡＨポリペプチドを精製する１つまたはそれ以上の工程をさらに含む。
キットまたは製造物品
本明細書に記載される発現カセット（例えば、ＰＡＨポリペプチドを発現させるための発現カセット、例えば野生型ヒトＰＡＨポリペプチド）、ｒＡＡＶベクター、粒子、および／または医薬組成物は、例えば、本明細書に記載される本発明の方法の１つで使用するように設計されたキットまたは製造物品内に含まれる。
一般に、システムは、カニューレ、１つまたはそれ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、またはそれ以上）のシリンジ、および本発明の方法での使用に好適な１つまたはそれ以上（例えば、１個、２個、３個、４個またはそれ以上）の流体を含む。
シリンジは、流体の送達のためにカニューレに接続可能であれば、任意の好適なシリンジであり得る。一部の実施形態において、システムは、１つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、２つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、３つのシリンジを有する。一部の実施形態において、システムは、４つまたはそれ以上のシリンジを有する。本発明の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載の流体、例えば、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のベクターの有効量をそれぞれ含む１つまたはそれ以上の流体、および１つまたはそれ以上の治療剤を含む１つまたはそれ以上の流体が挙げられる。
一部の実施形態において、キットは、単一の流体（例えば、ベクターの有効量を含む医薬的に許容される流体）を含む。一部の実施形態において、キットは、２つの流体を含む。一部の実施形態において、キットは、３つの流体を含む。一部の実施形態において、キットは、４つまたはそれ以上の流体を含む。流体は、本開示のＰＡＨポリペプチドまたはｒＡＡＶベクター組成物を発現させるための発現カセットを送達、希釈、安定化、緩衝、またはそれ以外の方法で輸送するために好適な、本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野において公知の任意の希釈剤、緩衝剤、賦形剤、または他の液体を含み得る。一部の実施形態において、キットは、１つまたはそれ以上の緩衝液、例えば、ｐＨ緩衝水溶液を含む。緩衝液の例としては、リン酸、クエン酸、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳおよび他の有機酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、キットは、容器を含む。好適な容器としては、例えば、バイアル、バッグ、シリンジ、およびボトルが挙げられる。容器は、ガラス、金属、またはプラスチックなどの材料の１つまたはそれ以上から作製される。一部の実施形態において、容器は、本開示のｒＡＡＶ組成物を保持するために使用される。一部の実施形態において、容器は、流体および／または他の治療剤を保持してもよい。
一部の実施形態において、キットは、本開示のｒＡＡＶ組成物と共に追加の治療剤を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、混合される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、別個に保持される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、同じ容器内にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、異なる容器内にある。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、同時に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物および追加の治療剤は、同じ日に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、追加の治療剤の投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週、３週、４週、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月以内に投与される。
一部の実施形態において、キットは、ＡＡＶ投与の前に免疫系を一過的に抑制するための治療剤を含む。一部の実施形態において、患者は、ＡＡＶ粒子に対するＴ細胞の応答を阻害するために、ウイルスの注射の直前および直後に一過的に免疫抑制される（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：１８０～１８８頁、２０１４参照）。一部の実施形態において、キットは、シクロスポリン、マイコフェノール酸モフェチル、および／またはメチルプレドニゾロンをさらに提供する。
本発明のｒＡＡＶ粒子および／または組成物を、使用説明書を含むキットにさらにパッケージングしてもよい。一部の実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物の送達（例えば、本明細書に記載される任意の種類の非経口投与）のためのデバイスをさらに含む。一部の実施形態において、使用説明書は、本明細書に記載される方法のうちの１つに係る使用説明書を含む。一部の実施形態において、説明書は、容器と共に（例えば、容器に貼付されて）提供されるラベルに印刷される。一部の実施形態において、使用説明書は、例えば、個体におけるＰＫＵを処置するために、個体（例えば、ヒト）に、ｒＡＡＶ粒子の有効量を投与するための説明書を含む。
例示的な実施形態
実施形態１．ｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ｒＡＡＶベクターは、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含み、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した導入遺伝子を含みプロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーは、１もしくは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１もしくは２つの改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む。
実施形態２．ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態１に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態３．エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、実施形態１または２に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態４．ｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ｒＡＡＶベクターは、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含み、発現カセットは、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）であり、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
実施形態５．ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態４に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態６．３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている、実施形態４または５に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態７．ｒＡＡＶベクター、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、エンハンサーは、１もしくは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１もしくは２つの改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み；３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）であり、導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
実施形態８．ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、実施形態７に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態９．エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、実施形態７または８に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１０．３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に配置されている、実施形態７～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１１．発現カセットは、イントロンをさらに含む、実施形態１～１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１２．イントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、実施形態１１に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１３．発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１４．ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、実施形態１３に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１５．ＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチドである、実施形態１～１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１６．ＰＡＨポリペプチドは、ヒトＰＡＨポリペプチドである、実施形態１～１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１７．ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１８．導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８０％同一である、実施形態１～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態１９．ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した発現カセットを含む、実施形態１～１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２０．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲと隣接している、実施形態１９に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２１．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、実施形態１９または２０に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２２．ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、実施形態１９～２１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２３．ベクターは、自己相補性ベクターである、実施形態１９～２２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２４．ベクターは、ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる、実施形態２３に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２５．第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、該突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、実施形態２４に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２６．ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロン、コドン最適化されたヒトＰＡＨ遺伝子、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、アルファ－１－抗トリプシン遺伝子由来のスタッファー断片、およびＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
実施形態２７．ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドである、実施形態１～２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２８．ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質を含む、実施形態２７に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態２９．ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号４の核酸配列によってコードされる、実施形態２８に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態３０．ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドである、実施形態１～２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態３１．ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含む、実施形態３０に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態３２．ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号６の核酸配列によってコードされる、実施形態３０に記載のｒＡＡＶ粒子。
実施形態３３．実施形態１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
実施形態３４．医薬的に許容される担体をさらに含む、実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５．実施形態１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む細胞。
実施形態３６．ＰＡＨポリペプチドを生産する方法であって、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で、実施形態３５に記載の細胞を培養することを含む、前記方法。
実施形態３７．ＰＡＨポリペプチドを精製する工程をさらに含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態１～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。
実施形態３９．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態３３または３４に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
実施形態４０．それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、実施形態３５に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。
実施形態４１．個体は、ＰＡＨ活性を欠如している、実施形態３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４２．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。
実施形態４３．それを必要とする個体の血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態３３または３４に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
実施形態４４．それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、実施形態３５に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。
実施形態４５．処置の前における個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している、実施形態４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４６．ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹腔内、または皮下に投与される、実施形態３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４７．投与は、別の療法と組み合わされる、実施形態３８～４６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４８．別の療法は、テトラヒドロビオプテリンでの処置、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニンが制限された食事である、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９．実施形態１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、実施形態３３もしくは３４に記載の組成物、または実施形態３５に記載の細胞を含むキット。
実施形態５０．使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／もしくはシリンジをさらに含む、実施形態４９に記載のキット。
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は例示目的にすぎないこと、ならびに様々な修正または変更が、本明細書に記載される実施例および実施形態に照らして当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の実施形態の範囲内に含まれることが理解される。
ＰＡＨコード配列のインビトロにおける評価
以下の実施例は、ヒトＰＡＨをコードするベクターの生成を記載する。具体的には、野生型およびＥ１８３Ｇアミノ酸置換を有するまたは有さないバリアントＰＡＨ対立遺伝子をベクターにクローニングし、肝臓細胞におけるＰＡＨ発現および活性を測定した。
材料および方法
ＰＡＨコード配列
野生型またはＥ１８３Ｇアミノ酸置換を有するまたは有さないバリアント１ ＰＡＨをコードするヒトＰＡＨ ｃＤＮＡを、以下の表１に要約したように試験した。ＰＡＨの「バリアント１」対立遺伝子は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０２００７７２５０号Ａ１に記載されたように、Ｍ１８０Ｔ、Ｋ１９９Ｐ、Ｓ２５０ＰおよびＧ２５６Ａアミノ酸置換を有する。
ＧｅｎｅＡｒｔ（ＧＡ）コドン最適化を使用して、ＰＡＨのｃＤＮＡのコドン出現頻度を最適化した。
Figure 2023544165000001
プラスミドベクターおよび組換えＡＡＶの生成
参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０２００７７２５０号Ａ１に記載されるＰＡＨコード配列を発現させた。
具体的には、肝臓プロモーター強度を増加させるために、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター、内因性ｍＴＴＲエンハンサーおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ｐＡ）部位を含有するプラスミドｍＴＴＲ４８２－ＨＩ－ｈＦＶＩＩＩ－ＢＧＨｐＡに改変を導入した（Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅ ２０１６、Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）。このプラスミドでは、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするｃＤＮＡに置き換え、既存のイントロンを１０６９ｂｐのニワトリｂ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンに置き換えた。改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）の２つのコピー（ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ２００６、Ｊａｃｏｂｓ ２００８）をｍＴＴＲ４８２エンハンサーの上流にクローニングして、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターを生成した。
誤った翻訳開始を減らすために５つの既存のＡＴＧ配列が排除されるように改変されたニワトリベータ－アクチン／ウサギベータ－グロビンイントロンで作製されたハイブリッドイントロンを使用した（ＨＩ２としても公知）。
全てのベクターは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ＢＧＨｐＡ）を含有していた。
最後に、第１４染色体のアルファ抗トリプシン遺伝子イントロン配列（ＳｅｒｐｉｎＡ１＝Ａ１ＡＴ）ＮＧ＿００８２９０．１；ｎｔ１３６３８～１７３６３）からなるフィラー配列（「スタッファー」）をＢＧＨｐＡとＩＴＲ部位との間に含めて、総ベクターゲノムサイズを４．６ｋｂにした。スタッファー配列中の７つのＡＴＧ部位をＴＴＧに改変して、可能性がある翻訳開始部位を除去した。
肝臓プロモーター、ハイブリッドイントロン、ＰＡＨ ｃＤＮＡおよびＢＧＨｐＡを有する、数々のＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するプラスミドを、ｒＡＡＶベクター生産に使用した。ＡＡＶＸＬ３２血清型カプシドを有するｒＡＡＶベクターを、トリプルトランスフェクション方法、続いてＣｓＣｌ精製（ＳａｂＴｅｃｈ）を使用して、またはカラム精製（Ｓａｎｏｆｉ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）によって生成した。ベクターロットを、ＢＧＨｐＡに対するｑＰＣＲによって定量した（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）。
インビトロ培養
全ての組織培養試薬は、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。一過性トランスフェクションのために、ヒト２９３またはヒト肝臓癌細胞（Ｈｕｈ７またはＨｅｐＧ２）（８×１０５細胞／ウェル）を、高グルコース、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０ｍＬ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１０ユニット／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、６ウェルディッシュに播種した。プラスミド（２μｇ）をリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。細胞溶解物または培養培地を、ＰＡＨ分析またはＳＥＡＰ活性のために、それぞれ４８時間後または７２時間後に収集した。
活性アッセイおよびタンパク質検出
ＰＡＨ活性を測定するために、溶解緩衝液またはＲＩＰＡ緩衝液中で細胞を溶解させることによって、４８時間後に全細胞溶解物を生成した。加えて、一部の実験において、超音波処理または剪断を使用して、細胞溶解を増強した。融解したら、アッセイ前に、溶解物を１４，０００ｇで３０分間スピンさせた。ＰＡＨタンパク質の酵素活性は、Ｙｅｗら、２０１３において先に記載されているように、但しいくつかの軽微な変更を加えて、測定した。また活性を、先に記載されているように、１３Ｃ標識Ｐｈｅを使用しても測定した（Ｈｅｉｎｔｚ ２０１２）。
ＰＡＨ検出のためのウェスタンブロッティングを、標準的なプロトコールを使用して、抗ｈＰＡＨ抗体（ＬＳ－Ｃ３４４１４５；ＬＳＢｉｏ）を使用して実行した。インビボの試料を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定された総タンパク質含量によって正規化した。ＦＬＡＧ－ＰＡＨタンパク質レベルの定量を、製造業者の説明書に従ってＦＬＡＧ－ＥＬＩＳＡ（ＳＥ００２－ｆｌａｇ；ＡＢＳｂｉｏ）により測定し、キット標準または自家精製３×ＦＬＡＧ－ｍＰＡＨ－ＦＬのいずれかをタンパク質標準として使用した。
結果
ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２の制御下にＰＡＨをコードする４つのベクターを生成した。具体的には、ｈＰＡＨ／１８３Ｇ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇ、ｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｅおよび野生型ＰＡＨ（「ｈＰＡＨ／Ｅ」）を発現させ、Ｈｕｈ７細胞におけるＰＡＨ活性（図１Ａ）およびタンパク質レベル（図１Ｂ、１Ｃ）に関して試験した。
野生型ＰＡＨは、図１Ａで示されるように最大のレベルのＰＡＨ活性を実証した。ｈＰＡＨ／Ｇ突然変異コード配列の場合、バリアント１の４つのアミノ酸置換の追加は、活性およびタンパク質生産を１０倍改善した。野生型ＰＡＨコード配列にバリアント１の４つのアミノ酸置換を取り入れることは、は、ＰＡＨ活性を増加させなかったが、ＰＡＨタンパク質レベルの２倍の増加をもたらした（図１Ｂ、１Ｃ）。
これらの結果に基づいて、Ｐａｈ－ＫＯマウスにおけるインビボでの効能研究のための導入遺伝子として野生型ＰＡＨを選択した。
非ヒト霊長類肝臓におけるカプシド、リード肝臓プロモーターおよび用量応答性の評価
以下の実施例は、肝臓細胞に形質導入する様々なＡＡＶカプシドタンパク質の能力を評価する実験を記載する。さらに、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において導入遺伝子発現を促進するｍＡ１Ｍ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターの能力を試験し、用量応答実験を実行して、ＮＨＰへのＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＥＧＦＰベクターの投与を評価した。
材料および方法
ＡＡＶカプシドタンパク質
様々なＡＡＶカプシドタンパク質を、Ｈｕｈ７細胞および非ヒト霊長類（ＮＨＰ）肝臓に形質導入するそれらの能力に関して試験した。具体的には、ＸＬ３２、ＬＫ０３（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４、５０６：３８２～６頁）、ＤＪ（Ｇｒｉｍｍ Ｄら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００８、８２：５８８７～５９１１頁）、ＡＡＶ８、およびＸＬ１４カプシドタンパク質を、最初の実験で、Ｈｕｈ７細胞およびＮＨＰにおいて試験した（図２Ａ～２Ｄ）。それに続くＮＨＰでの用量応答実験において、ＸＬ３２．１カプシドタンパク質を使用した（図３Ａ～３Ｂ、４Ａ～４Ｃ）。
国際公開第２０１９２４１３２４号Ａ１に記載されたように、ＸＬ３２およびＸＬ３２．１は、ＡＡＶ血清型１、２、３Ｂ、４、６、７、８、および９のカプシド遺伝子で構成されるＡＡＶカプシド遺伝子シャッフルライブラリーから生成したハイブリッドカプシドである。ＸＬ３２は、マウス肝臓でのその濃縮のために、ライブラリーから選択された。ＸＬ３２は、典型的なＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質生成物に加えて、ＸＬ３２コード配列内の弱い非ＡＴＧ開始コドンのために生産されると考えられる第４のタンパク質生成物（「ＶＰＸ」と呼ばれる）も生産した。具体的には、ＸＬ３２は、ＶＰ１開始コドンから数えてヌクレオチド２１９にＣからＧへの突然変異を有していた。ＸＬ３２．１は、ＣからＧへの突然変異を元のＣに戻し、野生型ＡＡＶ７およびＡＡＶ８配列に一致させるための部位特異的変異誘発によってＸＬ３２から得られた。国際公開第２０１９２４１３２４号Ａ１によれば、ＸＬ３２．１は、ベクター収量および感染力における見かけの差を示さなかった。以下の表２に、ＸＬ３２およびＸＬ３２．１のアミノ酸配列を提供する。
Figure 2023544165000002
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の研究
全ての研究は、２～３歳（３～４ｋｇ）の雄カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アジア起源）を使用した。動物を、ベクター投与の前に、ベクターカプシドの中和抗体に関してスクリーニングした。選択された動物に、輸注ポンプを使用した伏在静脈への緩徐な静脈内注入（１ｍｌ／分）によってベクターを与えた。血液試料を様々な時点で収集した。剖検のときに、ベクター生体内分布分析のために肝臓および複数他の臓器からの試料を収集した。
ベクター検出のために、１．４ｍｍのセラミックビーズおよびＯｍｎｉ Ｒｕｐｔｏｒ－２４、それに続いてプロテイナーゼＫ消化およびフェノール／クロロホルム抽出を使用して、総組織ＤＮＡを、各組織から単離した。ＤＮＡをイソプロピルアルコールによって沈殿させ、スピンし、トリス－ＥＤＴＡに再懸濁した。ＤＮＡを定量化し、ベクター由来のＤＮＡのレベルを、各ＶＧに存在するＢＧＨｐＡ配列に特異的なプライマーを使用したｑＰＣＲによって測定した（Ｋｙｏｓｔｉｏ－Ｍｏｏｒｅら、２０１６）。ＶＧのレベルを細胞当たりのコピー数として表した（二倍体細胞ゲノム当たり５ｐｇのｄｓＤＮＡを使用して）。
総ＥＧＦＰタンパク質測定のためのホモジネートを、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＥＬＩＳＡキット抽出緩衝液ＰＲＴ（Ａｂｃａｍ ＧＦＰ ＥＬＩＳＡキット；ａｂ１７１５８１）においてＯｍｎｉビーズ式破砕機を使用して生成した。遠心分離の後、上清を回収し、キット抽出緩衝液ＰＲＴで希釈し、ＥＧＦＰタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡによって、製造業者の説明書に従って定量化した。全ての値を、ＥＧＦＰのｎｇ／総タンパク質のｍｇとして表した。総タンパク質を、ＢＣＡアッセイによって測定した。
ベクター由来の転写物の定量のために、１．４ｍｍのセラミックビーズおよび１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３３２５０）を含有する２ｍｌチューブ中で、Ｏｍｎｉビーズ式破砕機を使用して、肝臓および脾臓ホモジネートを生成した。クロロホルムを添加し、混合し、次いで水性相を、ＳＶ全ＲＮＡキット、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｚ３１００のカラムに移した。カラムでＤＮアーゼ処理を実行し、カラムを洗浄した後、ＲＮＡを水中に溶出させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００を使用して全ＲＮＡを定量化した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、４３６８８１４）を使用して、ｃＤＮＡをランダムプライマーにより生成した。ベクター由来のｍＲＮＡのレベルを、ＢＧＨｐＡ配列に特異的なプライマーを使用したｑＰＣＲによって測定した。転写物のレベルを細胞当たりまたはＲＮＡ １μｇ当たりのコピー数として表した（二倍体細胞ゲノム当たり５ｐｇのｄｓＤＮＡを使用して）。
肝臓のための免疫組織化学（Ｉｍｍｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）およびインサイチュハイブリダイゼーション分析を、中性緩衝ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックからカットされた４μＭ断片を用いて実行した。自動蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）およびＩＨＣのために、全ての工程を、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸ機器（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）で実行した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＬＳ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔアッセイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）から始めて、それに続きＩＨＣを用いる逐次的な二重染色モードを利用した。簡単に言えば、ベークしていないパラフィン切片を６０℃で３０分でベークし、６０℃でパラフィンを除き、次いで、陰性プローブであるＤａｐＢ（カタログ番号３２０８７８、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、陽性プローブであるカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＰＩＢ（カタログ番号３２０９０８）、または標的プローブであるｅＧＦＰ（カタログ番号４００２８８、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）のハイブリダイゼーションの前に、標的検索のためのＢｏｎｄ ＥＲ溶液２、プロテアーゼ、および過酸化水素で４２℃で２時間前処置した。前置増幅器および増幅器を連続してつなぎ、次いでスライドを、１：１５００希釈したＯＰＡＬ６９０（カタログ番号ＦＰ１４９７００１ＫＴ、Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）と共にインキュベートした。ＨＲＰブロッカーを適用し、断片を、自動プロトコールのＩＨＣ部分の前に、Ｂｏｎｄ ＥＲ溶液１を用いた標的検索に供した。スライドを、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋ（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）でブロックし、ウサギＩｇＧアイソタイプ対照（カタログ番号ＡＢ１０５－Ｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）または１μｇ／ｍＬで使用されるウサギ抗ＧＦＰ（カタログ番号Ａ１１１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共に、室温で３０分インキュベートした。二次抗体である抗ウサギポリマーＨＲＰ（カタログ番号ＰＶ６１１９、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を適用し、検出を、１：１５０希釈したＯＰＡＬ５７０（カタログ番号ＦＰ１４８８００１ＫＴ、Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）によって達成した。細胞を、Ｓｐｅｃｔｒａｌ ＤＡＰＩ（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）で対比染色した。２０倍画像を、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ１によって獲得した。２０倍画像をＨＡＬＯ（Ｉｎｄｉｃａ ｌａｂｓ）画像分析ソフトウェアにインポートし、ＦＩＳＨ－ＩＦ ｖ１．１．３画像化モジュールを使用して分析した。
ＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドタンパク質の比較
ｍＡ１Ｍ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターを使用してｈＰＡＨ－Ｖ１／Ｇを発現するベクターをＸＬ３２またはＸＬ３２．１カプシドのいずれかにパッケージングし、ＮＨＰに投与した。５ｅ１２ｖｇ／ｋｇのベクターをＩＶ送達によって投与し、投与の２週間後に、肝臓および様々な他の臓器における細胞当たりのベクターゲノムコピー数をｑＰＣＲによって測定した（図５Ａ）。さらに、肝臓におけるベクター由来のｍＲＮＡのレベルを測定した（図５Ｂ）。
結果
初期のＡＡＶカプシド研究
ヒト遺伝子移入に優れた翻訳可能性を提供すると予想されるＰＡＨ遺伝子移入のためのＡＡＶカプシドを選択するために、それぞれＣＢＡ－ＥＧＦＰベクターゲノムを含有する５つのＡＡＶカプシドを生成した。ベクターは、インビトロでＨｕｈ７細胞における様々なレベルのＥＧＦＰ検出を示した（図２Ａ）。次いでＡＡＶベクターを静脈内経路によってＮＨＰに送達し、続いて２週間後に肝臓および様々な臓器を収集した。肝臓試料の場合、３つの異なる領域での右内側葉におけるＶＧを測定したところ、各試料間で同等のレベルを示したことから、葉内の均等な分布が示される（データは示されない）。右および左内側葉におけるＶＧを定量化することによって葉間の分布も評価したところ、両方の葉において類似のＶＧコピーが実証された（データは示されない）。図２Ｂに、各動物の肝臓におけるこれらの４つの試料の平均を示す。ｒＡＡＶ－ＸＬ３２で最大のベクター遺伝子移入が観察され、それに続いてＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ｒＡＡＶ－ＸＬ１４であり、ｒＡＡＶ－ＤＪで最も低く、最大および最小にランク付けされたカプシドベクター間の差はおよそ２２倍であった。各カプシド処置グループにおいて、個々の動物におけるＶＧレベルは同等であった。脾臓（図２Ｂ）ならびに筋肉、腎臓および心臓（図２Ｃ）においてＶＧコピーも測定した。他の組織において、ＸＬ３２では極めてわずかなベクターゲノムしか観察されなかった。まとめると、全身投与によって送達されたＸＬ３２カプシドベクターは、強力な肝臓への取り込みを提供したが、検査された他の臓器においてこのカプシドでは極めてわずかなベクターしか検出されなかった（図２Ｄ）。図２Ｅに、葉内および葉間のＥＧＦＰの発現を示す。
ＮＨＰ用量応答研究
第２のＮＨＰ研究において、ＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＥＧＦＰによる肝臓遺伝子移入の用量応答性を評価した。ベクターをＩＶ経路によって送達し、１６日後に組織を収集した。肝臓分析に関して、２つの肝臓試料（右および左内側葉から収集した）は、同等のＶＧレベルを示した（データは示されない）。５ｅ１１、２ｅ１２、５ｅ１２および２ｅ１３ｖｇ／ｋｇでの用量コホートは、平均してそれぞれ０．９、３．５、８．８および７．３（ＭおよびＦ）ならびに１９．０ＶＧ／細胞を有していた（図３Ａ）。したがって、用量応答が、最大用量を除き全てで実証された。２つの最大用量内で、導入遺伝子に対する免疫応答に起因する可能性がある個々の動物間のばらつきがみられた。５ｅ１２ｖｇ／ｋｇコホートにおいて、雄および雌動物で同等のベクターゲノムが検出された（図３Ａ）。
ベクタープロモーター機能を、肝臓試料におけるベクター由来のｅＧＦＰ ｍＲＮＡレベルを測定することによって評価した。総合すると、用量増加に伴い細胞当たりの転写レベルが増加する傾向がみられた（図３Ｂ）。試験された最大用量（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）は、ｅＧＦＰタンパク質に対する免疫反応による可能性がある（より低いＶＧ検出に対応する）低いｍＲＮＡをもたらした。
ベクター形質導入を、肝臓におけるｅＧＦＰタンパク質レベルを測定することによって評価した。データは、ｅＧＦＰタンパク質レベルの用量応答を示さなかった；２つのより低い用量であっても高いｅＧＦＰレベルが検出されたが、最大用量は、最も低いｅＧＦＰレベルをもたらした（図３Ｃ）。それにもかかわらず、肝臓ＶＧとベクター由来のｍＲＮＡコピーとの間に優れた相関がみられた（ｒ２＝０．５７）（図３Ｄ）。ｍＲＮＡコピーとｅＧＦＰタンパク質レベルとの間でも優れた相関（ｒ２＝０．８５）が観察された（図３Ｅ）。これは、必ずしも全てのベクターゲノムが転写活性を有するとは限らないが、一旦転写が起こると、ｅＧＦＰタンパク質生産は転写レベルに正比例したことを示唆する可能性がある。
ベクターを取り込んでいた肝細胞％を理解するために、肝臓におけるベクターの取り込みおよび局在化を、ｅＧＦＰプローブを用いたハイブリダイゼーションによって評価した。このプローブは、ベクターＤＮＡおよびｍＲＮＡの両方を検出することが期待される。図４Ａに、インサイチュハイブリダイゼーション画像の例を示す。ベクター陽性肝細胞を定量化して、肝臓におけるベクター陽性細胞のパーセンテージを推測した（図４Ｂ）。データは、ベクター用量に伴いベクター陽性細胞が増加することを実証した。雄および雌動物の両方の肝臓において、５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量で、肝臓における細胞のおよそ５０～８０％が陽性であった。肝臓における陽性細胞のパーセンテージとＶＧコピーの平均数との間に優れた相関がみられた（図４Ｃ）。
ＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドタンパク質の比較
ＮＨＰにおけるＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドベクターの生体内分布を比較するための実験を実行した。図５Ａ～５Ｂで示されるように、ＸＬ３２およびＸＬ３２．１は、肝臓において同等のレベルのウイルスゲノムおよびベクター由来のｍＲＮＡをもたらした。
インビボでのＰａｈ－ＫＯマウスにおけるＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ＰＡＨの効能
以下の実施例は、インビボでのＰａｈ－ＫＯマウスにおけるＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ＰＡＨの効能の研究を記載する。
材料および方法
ＰＡＨ－ＫＯマウスにおける効能試験
ホモ接合型（ＨＯＭ）およびヘテロ接合型（ＨＥＴ）Ｐａｈ－ＫＯ雄マウスを８～１２週齢で得て、動物の管理および使用に関する人道的指針（ｈｕｍａｎｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ）に従って収容および維持した。全ての動物の手順は、Ｓａｎｏｆｉの動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたものである。
組換えＡＡＶＸＬ３２．１ベクターを、尾静脈を介して静脈内経路によって投与した（６～１０匹の動物／処置）。イソフルラン麻酔によって動物を屠殺した。全血を、後眼窩洞よりＥＤＴＡ収集チューブに回収し、スピンし、分析まで凍結保存した。一部の動物は、左心室をＰＢＳで灌流した後、組織回収を行った。肝臓試料を収集し、分析まで凍結した。脳の分析のために、全脳を、頭蓋骨から収集し、秤量し、矢状に切断し、分析まで－８０℃で凍結した。
血液および組織分析
血漿ＰｈｅおよびＴｙｒレベルをＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。Ｋａｎｋａａｎｐａａ ２００１に記載されるように、但し軽微な変更を加えて、脳を処理した。肝臓試料のために、ベクターゲノム、ＰＡＨ活性およびタンパク質レベルを定量化した。ベクターゲノムのコピーをｑＰＣＲによって定量化した（Ｍａｒｔｉｎ ２０１３）。肝臓ホモジネートにおけるＰＡＨタンパク質活性は、上述した通りに実行し、総タンパク質によって正規化した（ＢＣＡタンパク質アッセイキット；Ｐｉｅｒｃｅ）。
結果
ＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ＰＡＨを、ＰＫＵマウスモデルにおいて効能に関して試験した。ＰＡＨタンパク質生産がまったくないＰａｈ－ＫＯモデルを使用した。ベクターを、成体マウスにＩＶ投与し、処置の３５日または４ヶ月後に効能を評価した。
血液および脳におけるＰｈｅおよびＴｙｒのレベルを測定した。脳中のドーパミンおよびセロトニンレベルを測定した。最後に、行動を、例えば巣構築アッセイによって評価した。
投与の４ヶ月後、徹底した脳病理学および白質変化の分析を実行した。これらをインビボでのＭＲＩによって、さらに終点の白質染色によって評価した。
ＰＡＨ－ＫＯマウスにおける短期間のインビボでのＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ｈＰＡＨの効能
ＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ｈＰＡＨベクター（ＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨとしても公知）を、５週間にわたりＰＫＵマウスモデルにおいてインビボで評価した。肝臓へのＰａｈ遺伝子移入後に、血液Ｐｈｅレベルの用量依存性の低減および血液Ｔｙｒの増加が観察された。これは、処置したマウスの肝臓におけるベクターゲノム、ベクター由来のｍＲＮＡおよびＰＡＨ活性の用量依存性検出と相関していた。Ｐｈｅが低いほど、脳へのアミノ酸輸送および様々な神経伝達物質レベルが増加した。肝臓におけるＰＡＨ陽性細胞のレベルの評価は、ベクター用量と相関する強度の増加と共に、ＰＡＨ陽性肝細胞の中心周囲の検出を実証した。まとめると、本発明者らの研究は、ＷＴ ｈＰＡＨをコードする最適化されたｒＡＡＶＸＬ３２．１ベクターが、ＰＡＨ－ＫＯマウスモデルにおいてＰＫＵ関連の病理を修正したことから、ヒトＰＫＵの処置のためのその使用を支持することを実証する。
材料および方法
ベクターの生成。最適化された肝臓プロモーターおよびイントロンから発現されたＷＴ ｈＰＡＨをコードするＸＬ３２．１カプシドベクター（ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２）を、上述したようにトリプルトランスフェクションによって生産した。ベクターを、アフィニティーカラム、続いてＣｓＣｌ勾配によって精製した。ベクターをｑＰＣＲによって力価測定し、動物実験の前にＰＡＨ生産および機能をインビトロで試験した。
ＰＡＨ－ＫＯマウスにおける効能試験。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで生成したＰａｈ－ＫＯマウスのコロニーをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで維持した（Ｓｉｎｇｈら、２０２０；提出済み）。一部の研究は、正常対照としてＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスも使用した。ホモ接合（ＨＯＭ）およびヘテロ接合（ＨＥＴ）雄マウスを８～１２週齢で得て、動物の管理および使用に関する人道的指針（ｈｕｍａｎｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ）に従って収容および維持した。ベクターを、尾静脈を介して静脈内経路により投与した（６～１０匹の動物／処置）。動物をイソフルラン麻酔によって屠殺した。全血を、後眼窩洞よりＥＤＴＡ採取チューブに回収し、スピンし、分析まで凍結保存した。一部の動物は、左心室をＰＢＳで灌流した後、組織回収を行った。肝臓試料を回収し、分析まで凍結した。脳の分析のために、全脳を、頭蓋骨から収集し、秤量し、矢状に切断し、分析まで－８０℃で凍結した。
血液および組織分析。血漿ＰｈｅおよびＴｙｒレベルを、Ｓｉｎｇｈら、２０２１に記載された通りに、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。脳神経伝達物質の定量のために、Ｋａｎｋａａｎｐａａ ２００１；Ｓｉｎｇｈ ２０２０に記載されるように、但し軽微な変更を加えて、脳を処理した。様々な組織におけるベクターゲノムのコピーをｑＰＣＲによって定量化した（Ｍａｒｔｉｎ ２０１３）。肝臓ホモジネートにおけるＰＡＨタンパク質活性およびＰＡＨタンパク質の検出を、先に記載されているように実行し（Ｈｅｉｎｔｚ ２０１２、Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）、総タンパク質によって正規化した（ＢＣＡタンパク質アッセイキット；Ｐｉｅｒｃｅ）。
動物行動アッセイ。巣構築アッセイを、先に公開された通りに、但し軽微な変更を加えて実行した（Ｄｅａｃｏｎ ２００６）。動物を、清潔な個別のケージに移し、３．０ｇｍ＋／－０．０２平方の綿（ネストレット（Ｎｅｓｔｌｅｔ）；ｃａｂｆｍ０００８８、Ａｎｃａｒｅ）を供給した。次の日、全ての未使用の寝床作りの材料の重さを量り、巣の品質を、以下の格付けスケールに基づき２つの個体によってスコア付けした：１－ネストレットが触れられていない（９０％より多くが手つかず）、２－ネストレットが部分的に引き裂かれている（５０～９０％が手つかず）、３－ネストレットの大部分が細断されているが、巣の場所を確認できないことが多い（５０％未満が手つかず）、４－確認可能であるが平坦な巣（ネストレットの９０％より多くが引き裂かれている）、５－クレーターと高い壁を有する完璧な巣（ネストレットの９０％より多くが引き裂かれている）。
作図および統計的分析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０．２）またはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して全てのデータをグラフ化した。Ｅｘｃｅｌでスチューデントのｔ検定またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的分析を実行した。
結果
Ｐａｈ－ＫＯマウスへのＸＬ３２／ＷＴ ｈＰＡＨ遺伝子移入後の血液ＰｈｅおよびＴｙｒの修正。ＰＡＨタンパク質生産がまったくないＰａｈ－ＫＯモデルを使用して、ＩＶ送達の後のＸＬ３２／ＷＴ ＰＡＨベクターの効能を試験し、３６日間効能を評価した。この処置は、用量依存性の方式で、血液ＰｈｅレベルをＨＥＴおよびＷＴマウスと同等のレベルに低減した（図６Ａおよび６Ｂ）。処置はまた、血液Ｔｙｒレベルも増加させ、試験された全てのベクター用量で正常な血液Ｔｙｒレベルが達成された（図６Ｃおよび６Ｄ）。
処置したマウスの肝臓を、遺伝子移入効率および肝臓形質導入に関して評価した。肝臓において、ベクターＤＮＡは、用量依存性方式で、１ｅ１１、３ｅ１１および１ｅ１２ｖｇ／マウスで検出され、平均して０．２、１．３および６．８ｖｇ／細胞をもたらした（図７Ａ）。ベクターは肝臓で優勢に検出され、試験された他の組織（脾臓、心臓、筋肉、腎臓および肺）で測定されたレベルは１０分の１未満であった（図７Ｂ）。用量依存性のベクターＤＮＡ検出を、肝臓におけるベクター由来のＰＡＨ ｍＲＮＡの用量依存性の増加に変換した（図７Ｃおよび７Ｄ）。コピーのｖｇ／細胞の血液Ｐｈｅレベルとの相関は、血液Ｐｈｅの正規化に最小の０．１ｖｇ／細胞が必要であることを実証した（図７Ｅ）。ＰＡＨタンパク質の機能性を、肝臓でＰＡＨ活性を測定することによって試験した。低用量（１ｅ１１ｖｇ／マウス）は、Ｈｅｔマウスにおける活性のものと同等のＰＡＨ活性をもたらしたが、２つのより高い用量は、Ｈｅｔ肝臓で測定された活性を超えた（図８Ａ）。ＰＡＨタンパク質レベルの類似の用量応答性パターンも、肝臓ホモジネートのウェスタンブロッティングによって観察された（図８Ｂ）。形質導入される肝細胞の位置を理解するために、処置した肝臓も免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価した。用量を増加させるにつれてＰＡＨ染色の増加が検出され、形質導入パターンは、主として中心周囲であった（図８Ｃ）。
脳のアミノ酸および神経伝達物質レベルへのＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨの作用。脳中のアミノ酸Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐレベルを測定した。データは、レベルがＨｅｔおよびＷＴマウスで測定されたものと同等であったことから、処置後に脳Ｐｈｅレベルの正規化を実証した。血液Ｐｈｅの低減はまた、アミノ酸ＴｙｒおよびＴｒｐが同じアミノ酸輸送体を共有することから、脳へのこれらのアミノ酸の輸送も増加させた（図９Ａ）。
神経伝達物質ドーパミンおよびセロトニンは、ＰＫＵ患者の脳で低減されていることがわかっている。したがって、ベクター処置したマウスの脳でこれらの神経伝達物質レベルを定量化した。ｒＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨベクターでの処置は、ドーパミン、ノルエピネフリンおよびセロトニンの、ＨｅｔおよびＷＴマウスで観察されたレベルへの正規化をもたらした（図９Ｂ）。
Ｐａｈ－ＫＯマウスの行動分析。巣作り行動アッセイを実行して、動物行動への脳における生化学的変化の作用を評価した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。このアッセイは、巣を作るマウスの能力を測定する。次いでこれらを、使用された巣作り材料の量および全体的な巣の品質に基づいてスコア付けした（図１０Ａ）。処置前、全ての未処置のＰＫＵマウスは、Ｈｅｔマウスによって作成されたものと比較して、有意により低い巣スコアを有していた（図１０Ｂ）。しかしながら、処置の３６日後、処置したマウスにおいてスコアは有意に改善された（図１０Ｂ）。ＨｅｔマウスとＷＴマウスとの間で巣作りスコアの差は観察されなかった。
要約
本発明者らのデータは、ＸＬ３２．１カプシドからなり、最適化された肝臓プロモーターからＷＴ ｈＰＡＨを発現するｒＡＡＶベクターは、処置の５週間後にヒトＰＫＵのマウスモデルにおける複数のＰＫＵ関連の病理を修正できたことを実証した。このベクターの全身への送達は、Ｐａｈ－ＫＯマウスの肝臓におけるベクター、ベクター由来のｍＲＮＡおよびＰＡＨ活性の用量依存性の増加をもたらした。これは、試験された全ての用量での、血液中の、それに続いて脳中の、Ｐｈｅレベルの低下に加えてＴｙｒレベルの増加に関連していた。血液と脳の両方におけるＰｈｅの低減はまた、脳における神経伝達物質であるドーパミンおよびセロトニンレベルも正規化した。これらの生化学的変化は、マウスの行動の改善と相関していた。この研究で使用された最も低い用量の５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ（１ｅ１１ｖｇ／マウス）は、平均０．２ｖｇ／細胞のベクターを提供し、これは、Ｈｅｔマウスで測定された同等の肝臓ＰＡＨ活性をもたらした。
ＰＡＨ－ＫＯマウスにおける長期のインビボにおけるＸＬ３２．１／ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＷＴ ｈＰＡＨの効能
材料および方法
ベクターの生成。ＷＴ ｈＰＡＨをコードするＸＬ３２．１カプシドベクターは、改変されたＡ１ＭＢ２エンハンサー（２コピーのアルファ１－ミクログロブリン）、改変されたマウストランスチレチンコアプロモーターおよび遠位エンハンサー（ｍＴＴＲ４８２）、ハイブリッドイントロン２（ＨＩ２、ニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンハイブリッドイントロンからなるイントロン）およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位（ＢＧＨ）（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）を有する肝臓特異的発現カセットを含有していた（完全なゲノム名称は、ＩＴＲ－／ｍＡ１Ｍ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２－ＷＴ ｈＰＡＨ－ＢＧＨｐＡ－スタッファー－ＩＴＲであり、ＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨとしても公知）。ＬＰ１肝臓プロモーターを有する２つの追加のベクターも構築した；１つのベクターは、ハイブリッドイントロン２（ＨＩ２）（Ａ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２コンストラクトで使用されたものと同一）または短いイントロン（ＳＩ、Ｎａｔｈｗａｎｉ ２０１２）を含有していた。全てのコンストラクトのサイズを、スタッファー配列（Ａ１ＡＴイントロン配列）を付加することによって野生型ＡＡＶゲノムのサイズに調整した。全てのＩＴＲを含有するプラスミドを、ヒト肝臓細胞株であるＨｕｈ７細胞への一過性トランスフェクション、ＰＡＨウェスタンおよび活性を先に記載されているように実行して、インビトロでのＰＡＨタンパク質生産および活性に関して試験した（Ｓｉｎｇｈ ２０２１）。全てのＸＬ３２．１カプシドベクターを、上述したようにトリプルトランスフェクションによって生産した。４ヶ月の効能研究のためのベクターを、アフィニティーカラム、続いてＣｓＣｌ勾配によって精製した。１および４ヶ月の効能研究のためのベクターを、アフィニティーカラム、続いてＣｓＣｌ勾配によって精製した。全てのベクターのロットを、ＢＧＨｐＡに対するｑＰＣＲによって定量化した（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）。
４ヶ月間のＰＡＨ－ＫＯマウスにおける効能試験。効能試験を実施例４に記載された通りに実行した。全ての動物は、左心室をＰＢＳで灌流した後、組織回収を行った。
血液および組織分析。血液および組織分析を実施例４に記載された通りに実行した。肝臓におけるベクターＤＮＡのコピーを、肝臓におけるｑＰＣＲによって定量化した（Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）。肝臓ホモジネートにおけるＰＡＨタンパク質活性およびＰＡＨタンパク質の検出を、先に記載されているように実行し（Ｈｅｉｎｔｚ ２０１２、Ｎａｍｂｉａｒ ２０１７）、総タンパク質によって正規化した（ＢＣＡタンパク質アッセイキット；Ｐｉｅｒｃｅ）。ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓を、Ｓｉｎｇｈ ２０２１に記載された通りに、ＰＡＨ ＩＨＣに使用した。ＩＨＣ陽性細胞パーセントのデジタル定量化のために、ＶＩＳＩＯＰＨＡＲＭ画像分析ソフトウェア（バージョン２０２０．０８）を使用して、ＩＨＣスライドを分析し、肝臓全体のスライド画像における関心領域（ＲＯＩ）の測定を行った。核から３μｍの境界線を引いて、ＰＡＨ染色強度を測定し、各細胞をＰＡＨ陽性または陰性のいずれかとして分類した。またホルマリン固定パラフィン包埋肝臓断片は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＡＣＤ）での、そのプロトコールに従った、マニュアルモードでＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）二重鎖試薬キットを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによる選択された動物におけるベクターＤＮＡおよび転写物の検出にも使用した。ＨＡＬＯ ＩＳＨ画像分析モジュール（ｖ４．１）を使用して断片全体におけるＩＳＨ染色を分析した。定量化されたエンドポイントは、ベクターＤＮＡおよびｍＲＮＡ陽性細胞の％であった。
脳の画像化。Ｓｉｎｇｈ ２０２１に記載された通りに、生きた動物で、脳白質含量を、様々なタイムポイントで分析した。脳周辺の関心領域および目に見える脳梁構造を冠状切片にわたり描線して、脳梁体積を計算した。
動物行動アッセイ。動物行動を実施例４に記載された通りに評価した。
作図および統計的分析。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０．２）またはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してグラフ化した。統計的分析を、テューキーの多重比較を使用するＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで一元配置ＡＮＯＶＡを使用して実行した。
結果
処置の４ヶ月後における健康状態、血液Ｐｈｅレベルおよび肝臓ＰＡＨ修正へのＸＬ３２．１／ＷＴ ＰＡＨ遺伝子移入の作用
ＰＡＨタンパク質生産がまったくないＰａｈ－ＫＯモデルを使用して、ＩＶ送達の後にＸＬ３２．１／ＷＴ ＰＡＨベクターの効能を試験し、効能を４ヶ月間評価した。試験されたベクター用量は、およそ５ｅ１２、２ｅ１２および５ｅ１３ｖｇ／ｋｇに変換される、１ｅ１１、３ｅ１１および１ｅ１２ｖｇ／マウスであった。研究にわたり動物の体重を評価して、４ヶ月の研究中の成長をモニターした。投与の８日前に動物の体重を量ってベースライン体重を確立し、次いでベクター送達後の１２０日目の研究終了時に体重を量った（図１１Ａ、１１Ｂ）。ＸＬ３２．１／ＷＴ ＰＡＨで処置した全てのＰａｈ－ＫＯマウスは体重を増加させ、平均して１３０～１４５％増加させた。処置はまた、ＰＡＨ－ＫＯマウスの肝臓重量も増加させ、体重は、全ての処置グループでＨＥＴおよびＷＴマウスの体重に到達した（図１１Ｃ）。したがって、肝臓におけるＰＡＨの発現は、処置したマウスに有意な成長および健康状態の改善をもたらした。
肝臓へのＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨベクター送達は、低減した血液中Ｐｈｅレベルをもたらした（図１２Ａ～１２Ｃ）。データは、処置コホートにおける血液Ｐｈｅレベルの迅速な低減を実証し、７日目のＰｈｅレベルは、ナイーブＰａｈ－ＫＯマウス（２７４２±７０μＭ）と比較して、３３７±１２３μＭ（１ｅ１１ｖｇ／マウス）、９４±１４μＭ（３ｅ１１ｖｇ／マウス）および７０±１１μＭ（１ｅ１２ｖｇ／マウス）であった。これらは、ＨＥＴおよびＷＴマウスにおけるＰｈｅレベル（それぞれ８４±９および６２±５μＭ）と同等であった（図１２Ｂ）。１２０日目に、未処置のＰａｈ－ＫＯにおける血液Ｐｈｅレベルは、２６１２±７１μＭであり、処置コホートにおけるＰｈｅレベルの平均は、１２３７±４８３μＭ（１ｅ１１ｖｇ／マウス）、１５８±３２μＭ（３ｅ１１ｖｇ／マウス）および６４±５μＭ（１ｅ１２ｖｇ／マウス）であった。２つのより高い用量のコホートにおけるＰｈｅレベルは、ＨＥＴ（１１０±１３μＭ）およびＷＴ（８２±３μＭ）マウスにおけるＰｈｅレベルと有意差はなかった（図１２Ｃ）。したがって、中間および高用量ベクターコホート（３ｅ１１および１ｅ１２ｖｇ／マウス）は、血液Ｐｈｅレベルの持続的な正規化をもたらした。最も低い用量（１ｅ１１ｖｇ／マウス）はばらつきを示し、６匹のマウスのうち３匹が正常な血液Ｐｈｅレベルを呈示した。残りの３匹の動物は、最初のうちは低減した血液Ｐｈｅレベルを有していたが、作用は持続しなかった。
処置されたマウスの肝臓を、遺伝子移入効率および肝臓形質導入に関して評価した。ベクターＤＮＡは、肝臓において用量依存性方式で検出され、１ｅ１１、３ｅ１１および１ｅ１２ｖｇ／マウスコホートは、平均して、それぞれ以下のｖｇ／細胞のレベル：０．０４２ｖｇ／細胞±０．０２、０．３２１ｖｇ／細胞±０．１１１および３．４０ｖｇ／細胞±０．４９をもたらした（図１３Ａ）。肝臓におけるベクター由来のｍＲＮＡの定量は、各用量コホートにおいて、それぞれ平均して２．１ｅ６±１．０ｅ６、９．０ｅ６±２．０ｅ６および３．７ｅ７±０．６ｅ７のｍＲＮＡコピー／μｇ ＲＮＡを実証した（図１３Ｂ）。これは、各用量での発現においておよそ４倍の増加である。ベクターＤＮＡおよびｍＲＮＡレベルとの優れた相関がみられた（Ｒ２＝０．９０）（図１３Ｃ）。ｖｇコピー／細胞の血液Ｐｈｅレベルとの相関は、最小の０．１ｖｇ／細胞が血液Ｐｈｅ正規化に必要であったことを実証した（図１３Ｄ）。低用量コホートにおけるベクターＤＮＡ分析は、血液Ｐｈｅが正規化された３匹の動物は０．１ｖｇ／細胞を含有していたが、一方で残りの３匹のＰｈｅレベルが増加した動物は、長期にわたり０．１ｖｇ／細胞未満を有していたことを解明した。またベクターの取り込みおよび遺伝子発現も、ベクターＤＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションによって確認した。図１３Ｅに、ベクター由来の転写物および代表的な画像を示す。
ベクターから発現されたＰＡＨの機能性を、肝臓におけるＰＡＨ活性を測定することによって試験した。ＰＡＨ活性を、ＭＳベースのアッセイによって、ＴｙｒへのＰｈｅ変換を定量化することによって測定した。３つの処置コホート（低～高用量）におけるＰＡＨ活性は、１１．５±７．９μＭ（ｎ＝６）、４２．８±１２．４μＭ（ｎ＝８）および１６８．２±２１．４μＭ（ｎ＝８）の１３Ｃ－Ｔｙｒ／ｍｇタンパク質であった（図１４Ａ）。比較のために、ＨＥＴおよびＷＴ動物におけるＰＡＨ活性は、６３．７±５．９μＭ（ｎ＝６）および１１１．８±９．９μＭ（ｎ＝６）であったが、一方で未処置Ｐａｈ－ＫＯマウス（ＨＯＭ、ｎ＝７）においてＰＡＨ活性は検出されなかった。アッセイは、低用量コホートにおける検出可能なＰＡＨ活性を有さない３匹の動物を実証し、同じ動物が、非常に低いベクターＤＮＡおよびｍＲＮＡコピーを有していた。ＰＡＨ活性は、ベクター転写レベルと十分な相関を示した（Ｒ２＝０．８８；示されていない）。
肝臓におけるＰＡＨ陽性細胞のレベルを理解するために、肝臓断片を、抗ＰＡＨ抗体を使用してＩＨＣによって評価した。各処置コホートでの肝臓における平均ＰＡＨ陽性細胞は、グループ１（ＨＯＭ）、０．４±０．１％、グループ２（低）２１．０±８．６％、グループ３（中）４２．２±４．０％、グループ４（高）５２．８±４．６％、グループ５（ＨＥＴ）９３．６±１．７％およびグループ６（ＷＴ）９７．４±０．４％（ＷＴ）であった（図１４Ｂ）。データは、およそ２０％のＰＡＨ陽性肝臓が、血液Ｐｈｅ正規化に必要であったことを示した（図１４Ｃ）。２０％のＰＡＨ陽性肝臓の条件は、Ｐａｈｅｎｕ２マウスにおいて血液Ｐｈｅレベルを正規化するのに、肝細胞移植実験における最小の１０％の野生型またはヘテロ接合型肝細胞が必要とされることを実証したＨａｍｍａｎら（２０１１）による公開された肝臓再増殖の結果と一致する。ＰＡＨ ＩＨＣの代表的な画像は、ＷＴ ＰＡＨをコードするベクターの用量の増加に伴う染色強度の増加を示した（図１４Ｄ）。ＰＡＨ染色は、処置された肝臓において陰性細胞間に高度に陽性の細胞のクラスターが分散した不均一な染色パターンを示した。これは、肝臓断片にわたり染色強度が均一のＨＥＴおよびＷＴ肝臓で観察された染色とは対照的であった（図１４Ｄ）。
脳のアミノ酸、神経伝達物質レベルおよび白質含量へのＸＬ３２．１／ＷＴ ＰＡＨの作用
高い血液Ｐｈｅは、脳へのＰｈｅ取り込みの増加のために、神経毒性の原因となる。高い血液中Ｐｈｅレベルはまた、同じアミノ酸輸送体（ＬＡＴ１）を使用することから、脳への他の大きい中性アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）の取り込みも低減する可能性がある。本発明者らのデータは、各処置コホートにおいて、低用量で脳のＰｈｅレベルが低減されたことを実証し、変動しやすい効能が示された（図１５Ａ）。平均の脳のＰｈｅレベルは、グループ１（ＨＯＭ）、１６７±４μＭ、グループ２（低）９４±２７μＭ、グループ３（中）２８±３μＭ、グループ４（高）２６±１μＭ、グループ５（ＨＥＴ）３０±３μＭおよびグループ６（ＷＴ）３０±１μＭであった。低用量ＷＴ ＰＡＨベクターコホートを除いて全てが、ＨＥＴおよびＷＴマウスのレベルと同等に脳のＰｈｅレベルを正規化した。血液Ｐｈｅの低下は、脳におけるＴｙｒレベルも改善した：グループ１（ＨＯＭ）、１３±１μＭ、グループ２（低）１６±１μＭ、グループ３（中）１６±１μＭ、グループ４（高）１９±１μＭ、グループ５（ＨＥＴ）２０±２μＭおよびグループ６（ＷＴ）２０±１μＭ。脳へのＴｒｐ輸送も改善された；各処置グループにおける平均Ｔｒｐレベルは、グループ１（ＨＯＭ）４．６±０．２μＭ、グループ２（低）５．７±０．５μＭ、グループ３（中）５．４±０．３μＭ、グループ４（高）６．５±０．３μＭ、グループ５（ＨＥＴ）６．３±０．５μＭおよびグループ６（ＷＴ）６．４±０．３μＭであった。しかしながら、脳のＴｙｒおよびＴｒｐレベルにおける有意な処置作用は、最大用量でのみみられた。
神経伝達物質であるドーパミンおよびセロトニンのレベルは、ＰＫＵ患者の脳で低減される。説明として、これらの神経伝達物質の合成における基質欠乏（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）に加えてＰｈｅ毒性の両方が提唱されている。データはここで、肝臓へのＰＡＨ遺伝子送達が、脳における神経伝達物質であるドーパミンおよびセロトニンレベルの両方を改善したこと実証した（図１５Ｂ）。３ｅ１１および１ｅ１２／マウス用量での処置は、神経伝達物質レベルをＨＥＴおよびＷＴマウスにおけるレベルと同等に正規化したが、低用量コホートではばらつきが観察された。低用量コホート（１ｅ１１ｖｇ／マウス）におけるばらつきは、その遺伝子移入効率とそれに続くＰｈｅ制御と相関していた（３匹の有効な動物および３匹の有効ではない動物）。ドーパミンおよびセロトニンレベルの脳のＰｈｅまたはそれらの基質レベル（ドーパミンの場合はＴｙｒ、セロトニンの場合はＴｒｐ）との相関分析は、Ｐｈｅの低下は、それらのアミノ酸基質レベルより大きな改善をもたらしたことを示した。したがって、ドーパミン生産は、脳のＴｙｒレベルとそこそこの相関を示したが（Ｒ２＝０．３８８７）、脳における低減したＰｈｅレベルとより優れた相関を示した（Ｒ２＝０．５０５７）。同様に、セロトニン生産は、脳におけるＴｒｐレベルの増加に対してそれほど修正を示さなかったが（Ｒ２＝０．１９３８）、脳のＰｈｅレベルの減少と密接な相関を示した（Ｒ２＝０．６４１８）。
インビボのＭＲＩ研究を実行して、脳白質の変化を評価し、脳の健康状態における処置の効能を評価した。３Ｄ容量ＭＲＩセグメンテーションおよび測定を適用して、脳梁におけるＭＲＩの特徴的な外観を定量化した。ＭＲＩ分析は、Ｐａｈ－ＫＯマウスにおいて、ＭＲＩ脳梁体積がＨＥＴおよびＷＴマウスと比較してより有意に低く、ベースラインのアセスメント時に全てのＰａｈ－ＫＯコホートが同等であったことを示した（図１６Ａ）。Ｐａｈ－ＫＯマウスの処置の１０６日後、全ての用量コホートにおいて、特にパーセンテージとしてそれぞれ個々の動物のベースラインと比較した場合、脳梁体積は増加した（図１６Ｂ、１６Ｃ）。しかしながら、１０６日目のタイムポイントで、いずれの処置コホートも脳梁体積を正常なレベルに修正せず；処置コホートのいずれにおいても脳重量を正規化しなかった（図１６Ｄ）。
Ｐａｈ－ＫＯマウスの行動分析。
ＰＫＵ患者は、より高い頻度の不安、うつ病および運動性振戦に罹っている。巣を作るマウスの能力を測定する行動アッセイを使用して、これらの問題を測定した（Ｄｅａｃｏｎら、２００６）。正常な動物は、詰め物を引き裂き、それを円形の盛り上がった形状の巣にまとめるが、うつ病に罹っている動物は、この材料を使用しないかほとんど使用しないと予想される。図１７Ａに、使用された巣作りのスコア付けを示す。処置前、スコアは、グループ１（ＨＯＭ）、１．７±０．４、グループ２（低）１．４±０．２、グループ３（中）１．７±０．４、グループ４（高）１．８±０．４、グループ５（ＨＥＴ）５．０±０．０およびグループ６（ＷＴ）５．０±０．０であり、未処置のＰａｈ－ＫＯマウスコホート間で有意差はなかった（図１７Ｂ）。処置の３５日後、巣作りスコアは、処置したＰａｈ－ＫＯマウス間で有意に改善され、グループ平均は、グループ１（ＨＯＭ）、２．１±０．６、グループ２（低）３．８±０．５、グループ３（中）４．６±０．２、グループ４（高）３．９±０．４、グループ５（ＨＥＴ）５．０±０．０およびグループ６（ＷＴ）４．９±０．１であった。処置したＰａｈ－ＫＯマウスは、ＨＥＴおよびＷＴマウスにおけるスコアと有意差はなかった。９７日目、グループ平均は３５日目と類似しており、以下の通りであった：グループ１（ＨＯＭ）、１．７±０．３、グループ２（低）２．５±０．６、グループ３（中）４．１±０．３、グループ４（高）４．±０．３、グループ５（ＨＥＴ）５．０±０．０およびグループ６（ＷＴ）４．９±０．１。低用量処置グループを除いて全てが、未処置のＰａｈ－ＫＯマウスと比較して有意に改善された。同様に、低用量コホートを除いて全てが、ＨＥＴまたはＷＴマウスと有意差はなかった。
要約
ＰＫＵ患者の肝臓における欠陥のあるＰＡＨ活性を修正するための肝臓への機能的なＰａｈ遺伝子の移入による遺伝子療法は、ＰＫＵ患者に長期のＰｈｅ制御を提供するための魅力的な戦略である。本発明者らのデータは、ＸＬ３２．１カプシドからなり、最適化された肝臓発現カセットからＷＴ ｈＰＡＨを発現するｒＡＡＶベクター（ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２）が、４ヶ月の研究期間中、ヒトＰＫＵのモデルであるＰａｈ－ＫＯマウスにおいて複数のＰＫＵ関連の病理を修正できたことを実証した。このベクターの全身への送達は、Ｐａｈ－ＫＯマウスの肝臓において、ベクターＤＮＡ、ベクター由来のｍＲＮＡ、ＰＡＨタンパク質およびＰＡＨ活性の用量依存性の増加をもたらした。試験された全ての３つのベクター用量（およそ５ｅ１１、２ｅ１３および５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）は、血液Ｐｈｅレベルを低減したが、最も低い用量コホートでばらつきが観察された。血液Ｐｈｅレベルの様々な研究エンドポイントへの修正は、４ヶ月の研究期間にわたる治療的有用性は、血液Ｐｈｅの正規化を可能にするために、最小の０．１ベクターＤＮＡ／細胞、３×１０６ｍＲＮＡ／μｇ ＲＮＡおよび２０％のＰＡＨ陽性肝臓の維持を必要としたことを示した。２０％のＰＡＨ陽性肝臓の条件は、Ｐａｈｅｎｕ２マウスにおいて血液Ｐｈｅレベルを正規化するのに、最小の１０％の野生型またはヘテロ接合型肝細胞の移植を必要としたことを実証したＨａｍｍａｎら（１６）による公開された肝臓再増殖の結果と類似している。本発明の実施例はまた、４ヶ月にわたり、アミノ酸輸送、神経伝達物質であるドーパミンおよびセロトニンレベルの正規化、ならびに脳の脳梁体積の増加での脳の健康状態における持続的な改善も実証した。これらの生化学的変化は、マウスの行動の改善と相関していた；処置の３５日後に有効性がすでに観察され、後のタイムポイント（９７日目）まで維持された。興味深いことに、持続的なＰｈｅ制御がない低用量グループにおける３匹の動物は、測定された全てのエンドポイントにおいてより劣った値を実証したことから、血液Ｐｈｅおよび疾患病理との相関が示唆される。さらに、血液Ｐｈｅの正規化は、処置した動物の体重を増加させたことから、ＰＫＵ動物の全体的な成長および代謝に、高フェニルアラニン血症（ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｅｍｉａ）の大きな影響があることが強調される。この成長は、肝細胞の増殖を示唆するＷＴおよびＨＥＴマウスのレベルへの肝臓重量の増加で反映された。それにもかかわらず、中および高ベクターコホートは、研究の終了まで効能を提供するのに十分なベクターＤＮＡを維持した。さらに、低用量１ｅ１１ｖｇ／マウス（５×１０１２ｖｇ／ｋｇ）用量コホートで観察されたばらつきは、肝臓の傷害または増殖などのベクターゲノムの喪失を引き起こす可能性がある状況で求められる遺伝子移入の閾値レベルを定義することを可能にした。
まとめると、本発明の実施例は、ｒＡＡＶＸＬ３２．１／ＷＴ ｈＰＡＨ遺伝子移入は、血液Ｐｈｅレベルを低減することができ、結果として、改善された成長、増加した脳白質、脳のアミノ酸含量および神経伝達物質レベル、ならびに全体的な改善された行動を持続的な方式でもたらすことを実証した。インビボにおけるリードゲノム（ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２）の、診療施設ですでに使用された肝臓発現カセット（ＬＰ１－ＳＩ、Ｎａｔｈｗａｎｉ ２０１１）との比較は、マウス肝臓において、リード候補によって、より高いレベルの転写および酵素活性を示した。したがって、リード候補のより高い発現レベルと、ＸＬ３２．１カプシドによる優れた遺伝子移入効率との組合せは、可能性のあるより低いベクター用量での診療施設におけるＰＫＵ患者の処置を可能にし、療法の安全面の改善が提供される。総合すると、本発明の実施例は、臨床的に有効な、実現可能で安全なＡＡＶベクター用量での処置を可能にすることによって、ＰＫＵの処置のためにこのベクターを使用することを支持する。
インビボにおける肝臓の発現エレメントの比較
上記の４ヶ月の研究で使用されたｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２を有するＸＬ３２．１ベクターを、血友病Ｂ治験で使用された肝臓発現カセット（ＬＰ１－ＳＩ）（Ｎａｔｈｗａｎｉ ２０１１）に対して評価した。ＨＩ２イントロンを有するＬＰ１プロモーターを有する中間体コンストラクトも評価した。（図１８Ａ）。一過性トランスフェクションによるヒト肝臓細胞株であるＨｕｈ７細胞におけるＩＴＲ含有プラスミドコンストラクトの試験は、ＬＰ１プロモーターを有するコンストラクトと比較して、Ａ１ＭＢ２コンストラクトからのより高いＰＡＨタンパク質および活性を示した（図１８Ｂ、１８Ｃ）。ＸＬ３２．１カプシドにパッケージングされた３つの発現カセットを、Ｐａｈ－ＫＯマウスに５週間、同等の用量（３ｅ１１ｖｇ／マウス）で投与し、評価した。発現カセット比較に使用された全てのｒＡＡＶベクターを、ＣｓＣｌ勾配によって精製した。全てのベクターは、未処置のＰａｈ－ＫＯマウス（ＨＯＭ）のレベルと比較して、血液Ｐｈｅレベルを有意に低減させ、Ｐｈｅレベルは、ＨＥＴマウスで観察されたレベルと類似していた（図１８Ｄ）。クローズアップ分析は、ベクター発現レベルにおいて差を示した。肝臓におけるｍＲＮＡレベルの定量は、ＬＰ１－ＳＩのものと比較して、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターを有するベクターからより多く発現する傾向を示し、転写レベルを正規化した場合、ＶＧ当たりおよそ３倍高いレベルのｍＲＮＡが、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２プロモーターを用いて観察された。平均の正規化したＲＮＡレベル（ｍＲＮＡ／ＶＧ）は、Ａ１ＭＢ２、１３３．９±１９．５、ＬＰ１－ＨＩ２、９５．５±１１．０、およびＬＰ１－ＳＩ、４３．０±４．９であった（図１８Ｅ）。同様に、肝臓ＰＡＨ酵素活性は、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２で処置した動物において、ＬＰ１－ＳＩコンストラクトと比較してより３倍高かった。研究コホートの平均肝臓ＰＡＨ活性（μＭ Ｔｙｒ／ｍｇタンパク質）は、Ａ１ＭＢ２、１５７．４±２５．７、ＬＰ１－ＨＩ２、４２．９±１０．２、ＬＰ１－ＳＩ、５４．９±１３．４、およびＨＥＴ６７．８±１０．９であった（図１８Ｆ）。ＰＡＨ活性をＶＧコピーに正規化した場合、この差は６倍であった（図１８Ｇ）。活性をｍＲＮＡコピーに正規化した場合、より小さい差（２倍）が観察されたことから、ｍＲＮＡ当たりのＰＡＨ生産というより、ベクターＤＮＡからの発現の増加が差の主な理由であったことが示される（図示せず）。したがって、データは、マウス肝臓において、ＬＰ１－ＳＩ発現カセットからの発現より、ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２からのより強い発現を実証した。
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配列
ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ６００８２．１／ＮＰ＿０００２６８．１タンパク質／ＮＭ＿０００２７７．３ ｍＲＮＡ；Ｅ１８３を有するＷＴ ＰＡＨアミノ酸配列）
MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPS
RLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGA
ELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIF
PLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPE
PDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSS
FGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQR
IEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK（配列番号１）
ヒトＷＴ ＰＡＨコード配列
ATGAGCACAGCCGTGCTGGAAAACCCCGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAGGAAACCAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGCGGCTGTTCGAGGAGAACGACGTGAACCTGACCCACATCGAGAGCCGGCCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCCGCCCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACCGTGCACGAGCTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCCTGGTTCCCCAGAACCATCCAGGAACTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGTCCTACGGCGCCGAGCTGGATGCCGACCACCCTGGCTTCAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGACGGAAGCAGTTCGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCCATCCCCAGAGTCGAGTACATGGAAGAGGAGAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACAAGACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTGGAGGACGTGTCCCAGTTTCTGCAGACCTGCACCGGCTTCAGACTCAGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGAGCAGCAGAGATTTTCTGGGCGGACTGGCCTTCCGGGTGTTCCACTGCACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCCGACATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGACAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAGGAAATCGGCCTGGCCTCTCTGGGCGCTCCCGACGAGTATATCGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAGGCCTATGGCGCCGGACTCCTGTCCAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCCAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCCCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATCCCTCGGCCCTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACCCAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGA（配列番号２）
ＸＬ３２およびＸＬ３２．１カプシドアミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL（配列番号３）
ＸＬ３２カプシドＤＮＡ配列
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTGGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTGCAGGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGTTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAACAGCCCGCCAGAAAAAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAATACGGCTACCTGACGCTCAACAATGGCAGCCAAGCCGTGGGACGTTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCTTCTCAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTACCTTCAGCTACACCTTTGAGGAAGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAGAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGTGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAACTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTCAATGGGCGTGAATCCATCATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAGGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAGACGTATACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCAGAGTTTTCGGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTAACTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTTACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA（配列番号４）
ＸＬ３２．１カプシドＤＮＡ配列
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTGCAGGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGTTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAACAGCCCGCCAGAAAAAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCGTCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCACGGTTCAAGTCTTCTCGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAATACGGCTACCTGACGCTCAACAATGGCAGCCAAGCCGTGGGACGTTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCTTCTCAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTACCTTCAGCTACACCTTTGAGGAAGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGAACAGAACTCAGAATCAGTCCGGAAGTGCCCAAAACAAGGACTTGCTGTTTAGCCGTGGGTCTCCAGCTGGCATGTCTGTTCAGCCCAAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAAAAACAGACAACAACAACAGCAACTTTACCTGGACTGGTGCTTCAAAATATAACCTCAATGGGCGTGAATCCATCATCAACCCTGGCACTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCATGATTTTTGGAAAGGAGAGCGCCGGAGCTTCAAACACTGCATTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAAATCAAAGCCACTAACCCCGTGGCCACCGAAAGATTTGGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCACAGACCCTGCGACCGGAGATGTGCATGTTATGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAGACGTATACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCTCTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGCGAATCCTCCGGCAGAGTTTTCGGCTACAAAGTTTGCTTCATTCATCACCCAGTATTCCACAGGACAAGTGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAGTGCAGTATACATCTAACTATGCAAAATCTGCCAACGTTGATTTTACTGTGGACAACAATGGACTTTATACTGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAA（配列番号６）
改変されたＰｒＴ２エンハンサー配列
Figure 2023544165000003
 下線部、肝臓核因子結合部位；太字、生成された親和性のより高い結合部位に導入された改変、斜体、反復配列
改変された Ａ１ＭＢ２ エンハンサー
Figure 2023544165000004
 下線部、肝臓核因子結合部位；太字、生成された親和性のより高い結合部位に導入された改変、斜体、反復配列
改変されたＥａｌｂ配列
Figure 2023544165000005
 下線部、肝臓核因子結合部位；太字、生成された親和性のより高い結合部位に導入された改変、斜体、反復配列
ＨＥＩＩエンハンサー
CCATCAGATCCTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCCCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCCTACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTG (配列番号１０)
ＣＲＭ８エンハンサー
ＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＣＣＡＣ（配列番号１１）
３’Ａｌｂ安定性エレメント
CTCAATTGGATGACACTAGTCATCACATTTAAAAGCATCTCAGGTAACTATATTTTGAATTTTTTAAAAAAGTAACTATAATAGTTATTATTAAAATAGCAAAGATTGACCATTTCCAAGAGCCATATAGACCAGCACCGACCACTATTCTAAACTATTTATGTATGTAAATATTAGCTTTTAAAATTCTCAAAATAGTTGCTGAGTTGGGAACCACTATTATTTCTATCGATTCAGCAGCCGTAAGTCTAGGACAGGCTTAAATTGTTTTCACTGGTGTAAATTGCAGAAAGATGATCTAAGTAATTTGGCATTTATTTTAATAGGTTTGAAAAACACATGCCATTTTACAAATAAGACTTATATTTGTCCTTTTGTTTTTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCATGGTATAGGTAAGGAATATAAAACATGGCTTTTACCTTAGAAAAAACAATTCTAAAATTCATATGGAATCAAAAAAGAGCCTGCAGGTACCCT（配列番号１２）
３’ａｌｂおよびＳＭＡＲ安定性エレメント
CTCAATTGGATGACACTAGTCATCACATTTAAAAGCATCTCAGGTAACTATATTTTGAATTTTTTAAAAAAGTAACTATAATAGTTATTATTAAAATAGCAAAGATTGACCATTTCCAAGAGCCATATAGACCAGCACCGACCACTATTCTAAACTATTTATGTATGTAAATATTAGCTTTTAAAATTCTCAAAATAGTTGCTGAGTTGGGAACCACTATTATTTCTATCTACTGTTTTAATTAAAATTATCTCTAAGGCATGTGAACTGGCTGTCTTGGTTTTCATCTGTACTTCATCTGCTACCTCTGTGACCTGAAACATATTTATAATTCCATTAAGCTGTGCATATGATAGATTTATCATATGTATTTTCCTTAAAGGATTTTTGTAAGAACTAATTGAATTGATACCTGTAAAGTCTTTATCACACTACCCAATAAATAATAAATCTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTTCTATAAATATGTACCAGTTTTATTGTTTTTAGTGGTAGTGATTTTATTCTCTTTCTATATATATACACACACATGTGTGCATTCATAAATATATACAATTTTTATGAATAAAAAATTATTAGCAATCAATATTGAAAACCACTGATTTTTGTTTATGTGAGCAAACAGCAGATTAAAAGGAATTCCTGCAGATTCAGCAGCCGTAAGTCTAGGACAGGCTTAAATTGTTTTCACTGGTGTAAATTGCAGAAAGATGATCTAAGTAATTTGGCATTTATTTTAATAGGTTTGAAAAACACATGCCATTTTACAAATAAGACTTATATTTGTCCTTTTGTTTTTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCATGGTATAGGTAAGGAATATAAAACATGGCTTTTACCTTAGAAAAAACAATTCTAAAATTCATATGGAATCAAAAAAGAGCCTGCAGGTACCCT（配列番号１３）
ＩＴＲ－ｍＡ１ＭＢ２－ｍＴＴＲ４８２－ＨＩ２－ＷＴ ｈＰＡＨ／Ｅ－ＢＧＨｐＡ－スタッファー－ＩＴＲ配列；ＷＴ ＰＡＨのコード配列は、下線で示される
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTACCGCGTGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGCCAATTGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTTTGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAATTGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCATTTCGAAGCCGCCACCATGAGCACAGCCGTGCTGGAAAACCCCGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAGGAAACCAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGCGGCTGTTCGAGGAGAACGACGTGAACCTGACCCACATCGAGAGCCGGCCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCCGCCCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACCGTGCACGAGCTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCCTGGTTCCCCAGAACCATCCAGGAACTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGTCCTACGGCGCCGAGCTGGATGCCGACCACCCTGGCTTCAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGACGGAAGCAGTTCGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCCATCCCCAGAGTCGAGTACATGGAAGAGGAGAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACAAGACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTGGAGGACGTGTCCCAGTTTCTGCAGACCTGCACCGGCTTCAGACTCAGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGAGCAGCAGAGATTTTCTGGGCGGACTGGCCTTCCGGGTGTTCCACTGCACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCCGACATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGACAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAGGAAATCGGCCTGGCCTCTCTGGGCGCTCCCGACGAGTATATCGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAGGCCTATGGCGCCGGACTCCTGTCCAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCCAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCCCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATCCCTCGGCCCTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACCCAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGAACTAGTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGTACCACCGGTCCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGTTGCCATCGTGGCTGTCCATCGATTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAATTGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTAATTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAATTGCAGTTGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCTTGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTTTGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGATTGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTCGACATTTAAATTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA (配列番号１４)
改変されたニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）／ウサギβ－グロビンハイブリッド／イントロン（ＨＩ２）
Figure 2023544165000006
０．９ｋｂのＡ１ＡＴイントロンスタッファー配列
Figure 2023544165000007

Claims (50)

  1. ｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、該ｒＡＡＶベクターは、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含み、該発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該エンハンサーは、１もしくは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１もしくは２つの改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み、該導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；
    該ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  2. ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  3. エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  4. ｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、該ｒＡＡＶベクターは、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含み、該発現カセットは、プロモーターおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）であり、該導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；
    該ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  5. ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  6. ３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置している、請求項４または５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  7. ｒＡＡＶベクター、肝臓細胞中で導入遺伝子を発現させるための発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、該発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサーおよび３’エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を含み、該プロモーターは、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターを含み、該エンハンサーは、１もしくは２つの改変されたプロトロンビンエンハンサー（ｐＰｒＴ２）、１もしくは２つの改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、改変されたマウスアルブミンエンハンサー（ｍＥａｌｂ）、Ｂ型肝炎ウイルスエンハンサーＩＩ（ＨＥ１１）またはＣＲＭ８エンハンサーを含み；該３’エレメントは、アルブミン３’エレメント（３’Ａｌｂ）またはヒトアルファ１抗トリプシン足場／マトリックス付着領域（ＳＭＡＲ）に連結されたアルブミン３’エレメント（３’ＡｌｂＳＭＡＲ）であり、該導入遺伝子は、ＰＡＨポリペプチドをコードし；該ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ－ＸＬ３２またはＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  8. ｍＴＴＲプロモーターは、ｍＴＴＲ４８２プロモーターである、請求項７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  9. エンハンサーは、ｍＴＴＲプロモーターに対して５’にある、請求項７または８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  10. ３’エレメントは、導入遺伝子に対して３’に位置している、請求項７～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  11. 発現カセットは、イントロンをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  12. イントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロンである、請求項１１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  13. 発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  14. ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  15. ＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨポリペプチドである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  16. ＰＡＨポリペプチドは、ヒトＰＡＨポリペプチドである、請求項１～１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  17. ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  18. 導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  19. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した発現カセットを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  20. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の発現カセットは、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接している、請求項１９に記載のｒＡＡＶ粒子。
  21. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項１９または２０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  22. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  23. ベクターは、自己相補性ベクターである、請求項１９～２２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  24. ベクターは、ＰＡＨポリペプチドをコードする第１の核酸配列、およびＰＡＨポリペプチドの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てに沿って、第２の核酸配列との鎖内塩基対を形成することができる、請求項２３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  25. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  26. ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子であって、該ｒＡＡＶベクターは、５’から３’に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、改変されたアルファ１－ミクロビクニンエンハンサー（ｍＡ１ＭＢ２）、マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンハイブリッドイントロン、コドン最適化されたヒトＰＡＨ遺伝子、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、アルファ－１－抗トリプシン遺伝子由来のスタッファー断片、およびＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  27. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドである、請求項１～２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  28. ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドタンパク質を含む、請求項２７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  29. ＡＡＶ－ＸＬ３２カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号４の核酸配列によってコードされる、請求項２８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  30. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドである、請求項１～２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  31. ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  32. ＡＡＶ－ＸＬ３２．１カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含み、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、配列番号６の核酸配列によってコードされる、請求項３０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  33. 請求項１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
  34. 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 請求項１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む細胞。
  36. ＰＡＨポリペプチドを生産する方法であって、ＰＡＨポリペプチドを生産する条件下で、請求項３５に記載の細胞を培養することを含む、前記方法。
  37. ＰＡＨポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項１～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。
  39. それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項３３または３４に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
  40. それを必要とする個体におけるフェニルケトン尿症を処置するための方法であって、請求項３５に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。
  41. 個体は、ＰＡＨ活性を欠如している、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を個体に投与することを含む、前記方法。
  43. それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項３３または３４に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
  44. それを必要とする個体における血液中のフェニルアラニンのレベルを低減させるための方法であって、請求項３５に記載の細胞を個体に投与することを含む、前記方法。
  45. 処置前の個体の血液中のフェニルアラニンのレベルは、同等の対応する対照個体の血液中のフェニルアラニンのレベルと比較して上昇している、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. ｒＡＡＶ粒子、組成物または細胞は、静脈内、動脈内、肝内、門脈内、腹腔内、または皮下に投与される、請求項３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 投与は、別の療法と組み合わされる、請求項３８～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 別の療法は、テトラヒドロビオプテリンでの処置、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）もしくはペグ化ＰＡＬでの処置、またはフェニルアラニンが制限された食事である、請求項４７に記載の方法。
  49. 請求項１～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項３３もしくは３４に記載の組成物、または請求項３５に記載の細胞を含むキット。
  50. 使用説明書；緩衝液および／もしくは医薬的に許容される賦形剤；ならびに／またはボトル、バイアルおよび／もしくはシリンジをさらに含む、請求項４９に記載のキット。
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