TW202027781A - 雙硫鍵穩定化之多肽組合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供包含一或多個非天然半胱胺酸殘基之多肽，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在該蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。該等經修飾人類多肽可經由酶替代療法及/或基因療法用於治療遺傳疾病。

Description

雙硫鍵穩定化之多肽組合物及使用方法
遺傳疾病可利用使用重組多肽之酶替代療法或使用編碼重組蛋白之核酸的基因療法來治療。舉例而言，可以使用重組α-半乳糖苷酶A或小分子伴護蛋白(例如1-去氧半乳糖野尻黴素(1-deoxygalactonojirimycin)(米加司他(Migalastat))治療法布瑞氏病(Fabry disease)。然而，重組野生型多肽在中性pH下通常具有差的溶解性且在血清中快速降解。由於其係藉由靜脈內輸注遞送，故此實質上限制了治療酶之半衰期。
在某些態樣中，提供包含核酸構築體之基因療法載體，該核酸構築體包含：編碼用於治療遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸。在一些實施例中，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。在一些實施例中，蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病1型、神經性類蠟脂褐質病2型、神經性類蠟脂褐質病3型、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病5型、神經性類蠟脂褐質病6型、神經性類蠟脂褐質病7型、神經性類蠟脂褐質病8型、神經性類蠟脂褐質病9型、神經性類蠟脂褐質病10型、神經性類蠟脂褐質病11型、神經性類蠟脂褐質病12型、神經性類蠟脂褐質病13型、神經性類蠟脂褐質病14型、神經性類蠟脂褐質病15型、神經性類蠟脂褐質病16型及週期蛋白依賴型激酶樣5。在一些實施例中，蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病10型(細胞自溶酶D)、神經性類蠟脂褐質病11型(顆粒蛋白前體(progranulin))、神經性類蠟脂褐質病13型(細胞自溶酶F)、神經性類蠟脂褐質病14型(KCTD7)、神經性類蠟脂褐質病15型(TBCK)及週期蛋白依賴型激酶樣5。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含溶酶體酶。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含穩定化之α-半乳糖苷酶(α-GAL)蛋白質。在一些實施例中，穩定化之α-半乳糖苷酶A (α-GAL)蛋白質包含一或多個選自由以下組成之群之非天然半胱胺酸殘基：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含穩定化之棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)。在一些實施例中，穩定化之PPT1蛋白質包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 7.4下具有更長半衰期。在一些實施例中，穩定化之蛋白質可替代遺傳病症中有缺陷或缺失之蛋白質。在一些實施例中，穩定化之蛋白質可減少或減緩與遺傳病症相關之一或多個症狀。在一些實施例中，與未穩定化之蛋白質相比，穩定化之蛋白質在減少或減緩遺傳病症之一或多個症狀方面更有效。在一些實施例中，遺傳病症為神經病症。在一些實施例中，遺傳病症為胞溶體貯積症。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病(Batten disease)、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型(Gaucher disease type I)、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病(Pompe disease)、泰-薩二氏症(Tay Sachs disease)、山多夫氏病(Sandhoff disease)、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病(Hurler disease)、韓特氏症(Hunter disease)、聖菲利柏氏病A型(Sanfilippo disease type A)、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型(Morquio disease type A)、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症(Maroteaux-Lamy disease)、沙利氏病(Sly disease)、尼曼匹克症A型(Niemann-Pick disease type A)、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型(Schindler disease type I)、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、嬰兒、青少年及成年形式之神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。在一些實施例中，基因療法載體係選自由以下組成之群之病毒載體：腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及疱疹病毒載體。在一些實施例中，腺相關病毒係選自由以下組成之群之血清型：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74、AAV-B1及AAV-hu68。在一些實施例中，核酸構築體包含在病毒載體基因體中。在一些實施例中，病毒載體基因體包含重組AAV (rAAV)基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含自補基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含單鏈基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含第一反向末端重複序列及第二反向末端重複序列。在一些實施例中，AAV反向末端重複序列係AAV2反向末端重複序列。在一些實施例中，rAAV基因體進一步包含SV40內含子。在一些實施例中，rAAV基因體進一步包含多腺苷酸化序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 7-12中之一者至少85%一致。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該α-GAL蛋白質包含與SEQ ID NO: 1-6中之一者至少85%一致之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 8-12中之一者的序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該α-GAL蛋白質包含SEQ ID NO: 2-6中之一者的序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 15-16中之一者至少85%一致。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該PPT1蛋白質包含與SEQ ID NO: 13-14中之一者至少85%一致之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 16之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該PPT1蛋白質包含SEQ ID NO: 14之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含啟動子序列。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，構築體進一步包含一或多個選自由以下組成之群之核酸序列：Kozak序列、CrPV IRES、編碼連接體之核酸序列、編碼信號序列之核酸序列及編碼IGF2肽之核酸序列。在一些實施例中，信號肽序列包含結合免疫球蛋白(Bip)信號序列。在一些實施例中，信號肽序列包含Bip信號序列，該Bip信號序列包含與選自由SEQ ID NO: 29-33組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，構築體進一步包含內部核糖體進入序列(IRES)。在一些實施例中，IRES包含蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼變體IGF2 (vIGF2)肽之核酸序列。在一些實施例中，vIGF2肽包含與選自由SEQ ID NO: 17-27組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼vIGF2肽之核酸序列係位於編碼穩定化形式蛋白質之核酸序列的5’處。在一些實施例中，編碼vIGF2肽之核酸序列位於編碼穩定化形式蛋白質之核酸序列的3’處。在一些實施例中，構築體包裝於病毒殼內。
在額外態樣中，提供醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有核酸構築體之基因療法載體，該核酸構築體包含：編碼用於治療遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸；及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一些實施例中，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。在一些實施例中，蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病1型、神經性類蠟脂褐質病2型、神經性類蠟脂褐質病3型、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病5型、神經性類蠟脂褐質病6型、神經性類蠟脂褐質病7型、神經性類蠟脂褐質病8型、神經性類蠟脂褐質病9型、神經性類蠟脂褐質病10型、神經性類蠟脂褐質病11型、神經性類蠟脂褐質病12型、神經性類蠟脂褐質病13型、神經性類蠟脂褐質病14型、神經性類蠟脂褐質病15型、神經性類蠟脂褐質病16型及週期蛋白依賴型激酶樣5。在一些實施例中，蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病10型(細胞自溶酶D)、神經性類蠟脂褐質病11型(顆粒蛋白前體)、神經性類蠟脂褐質病13型(細胞自溶酶F)、神經性類蠟脂褐質病14型(KCTD7)、神經性類蠟脂褐質病15型(TBCK)及週期蛋白依賴型激酶樣5。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含溶酶體酶。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含穩定化之α-半乳糖苷酶(α-GAL)蛋白質。在一些實施例中，穩定化之α-半乳糖苷酶A (α-GAL)蛋白質包含一或多個選自由以下組成之群之非天然半胱胺酸殘基：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含穩定化之棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)。在一些實施例中，穩定化之PPT1蛋白質包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 7.4下具有更長半衰期。在一些實施例中，穩定化之蛋白質可替代遺傳病症中有缺陷或缺失之蛋白質。在一些實施例中，穩定化之蛋白質可減少或減緩與遺傳病症相關之一或多個症狀。在一些實施例中，與未穩定化之蛋白質相比，穩定化之蛋白質在減少或減緩遺傳病症之一或多個症狀方面更有效。在一些實施例中，遺傳病症為神經病症。在一些實施例中，遺傳病症為胞溶體貯積症。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病、泰-薩二氏症、山多夫氏病、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病、韓特氏症、聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症、沙利氏病、尼曼匹克症A型、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、嬰兒、青少年及成年形式之神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。在一些實施例中，基因療法載體係選自由以下組成之群之病毒載體：腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及疱疹病毒載體。在一些實施例中，腺相關病毒係選自由以下組成之群之血清型：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74、AAV-B1及AAV-hu68。在一些實施例中，核酸構築體包含在病毒載體基因體中。在一些實施例中，病毒載體基因體包含重組AAV (rAAV)基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含自補基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含單鏈基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含第一反向末端重複序列及第二反向末端重複序列。在一些實施例中，AAV反向末端重複序列係AAV2反向末端重複序列。在一些實施例中，rAAV基因體進一步包含SV40內含子。在一些實施例中，rAAV基因體進一步包含多腺苷酸化序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 7-12中之一者至少85%一致。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該α-GAL蛋白質包含與SEQ ID NO: 1-6中之一者至少85%一致之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 8-12中之一者的序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該α-GAL蛋白質包含SEQ ID NO: 2-6中之一者的序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 15-16中之一者至少85%一致。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該PPT1蛋白質包含與SEQ ID NO: 13-14中之一者至少85%一致之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 16之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該PPT1蛋白質包含SEQ ID NO: 14之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含啟動子序列。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，構築體進一步包含一或多個選自由以下組成之群之核酸序列：Kozak序列、CrPV IRES、編碼連接體之核酸序列、編碼信號序列之核酸序列及編碼IGF2肽之核酸序列。在一些實施例中，信號肽序列包含結合免疫球蛋白(Bip)信號序列。在一些實施例中，信號肽序列包含Bip信號序列，該Bip信號序列包含與選自由SEQ ID NO: 29-33組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，構築體進一步包含內部核糖體進入序列(IRES)。在一些實施例中，IRES包含蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼變體IGF2 (vIGF2)肽之核酸序列。在一些實施例中，vIGF2肽包含與選自由SEQ ID NO: 17-27組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼vIGF2肽之核酸序列係位於編碼穩定化形式蛋白質之核酸序列的5’處。在一些實施例中，編碼vIGF2肽之核酸序列位於編碼穩定化形式蛋白質之核酸序列的3’處。在一些實施例中，構築體包裝於病毒殼內。在一些實施例中，賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
在其他態樣中，提供治療受試者之遺傳病症之方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量之基因療法載體或其醫藥組合物，該基因療法載體包含含有以下之核酸構築體：編碼用於治療遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸。在一些實施例中，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。在一些實施例中，蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病1型、神經性類蠟脂褐質病2型、神經性類蠟脂褐質病3型、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病5型、神經性類蠟脂褐質病6型、神經性類蠟脂褐質病7型、神經性類蠟脂褐質病8型、神經性類蠟脂褐質病9型、神經性類蠟脂褐質病10型、神經性類蠟脂褐質病11型、神經性類蠟脂褐質病12型、神經性類蠟脂褐質病13型、神經性類蠟脂褐質病14型、神經性類蠟脂褐質病15型、神經性類蠟脂褐質病16型及週期蛋白依賴型激酶樣5。在一些實施例中，蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病10型(細胞自溶酶D)、神經性類蠟脂褐質病11型(顆粒蛋白前體)、神經性類蠟脂褐質病13型(細胞自溶酶F)、神經性類蠟脂褐質病14型(KCTD7)、神經性類蠟脂褐質病15型(TBCK)及週期蛋白依賴型激酶樣5。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含溶酶體酶。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含穩定化之α-半乳糖苷酶(α-GAL)蛋白質。在一些實施例中，穩定化之α-半乳糖苷酶A (α-GAL)蛋白質包含一或多個非天然半胱胺酸殘基D233C及I359C。在一些實施例中，穩定化之蛋白質包含穩定化之棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)。在一些實施例中，穩定化之PPT1蛋白質包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 7.4下具有更長半衰期。在一些實施例中，穩定化之蛋白質可替代遺傳病症中有缺陷或缺失之蛋白質。在一些實施例中，穩定化之蛋白質可減少或減緩與遺傳病症相關之一或多個症狀。在一些實施例中，與未穩定化之蛋白質相比，穩定化之蛋白質在減少或減緩遺傳病症之一或多個症狀方面更有效。在一些實施例中，遺傳病症為神經病症。在一些實施例中，遺傳病症為胞溶體貯積症。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病、泰-薩二氏症、山多夫氏病、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病、韓特氏症、聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症、沙利氏病、尼曼匹克症A型、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、嬰兒、青少年及成年形式之神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。在一些實施例中，基因療法載體係選自由以下組成之群之病毒載體：腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及疱疹病毒載體。在一些實施例中，腺相關病毒係選自由以下組成之群之血清型：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74、AAV-B1及AAV-hu68。在一些實施例中，核酸構築體包含在病毒載體基因體中。在一些實施例中，病毒載體基因體包含重組AAV (rAAV)基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含自補基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含單鏈基因體。在一些實施例中，rAAV基因體包含第一反向末端重複序列及第二反向末端重複序列。在一些實施例中，AAV反向末端重複序列係AAV2反向末端重複序列。在一些實施例中，rAAV基因體進一步包含SV40內含子。在一些實施例中，rAAV基因體進一步包含多腺苷酸化序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 7-12中之一者至少85%一致。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該α-GAL蛋白質包含與SEQ ID NO: 1-6中之一者至少85%一致之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 8-12中之一者的序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該α-GAL蛋白質包含SEQ ID NO: 2-6中之一者的序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 15-16中之一者至少85%一致。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該PPT1蛋白質包含與SEQ ID NO: 13-14中之一者至少85%一致之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 16之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該PPT1蛋白質包含SEQ ID NO: 14之序列。在一些實施例中，構築體進一步包含啟動子序列。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，構築體進一步包含一或多個選自由以下組成之群之核酸序列：Kozak序列、CrPV IRES、編碼連接體之核酸序列、編碼信號序列之核酸序列及編碼IGF2肽之核酸序列。在一些實施例中，信號肽序列包含結合免疫球蛋白(Bip)信號序列。在一些實施例中，信號肽序列包含Bip信號序列，該Bip信號序列包含與選自由SEQ ID NO: 29-33組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，構築體進一步包含內部核糖體進入序列(IRES)。在一些實施例中，IRES包含蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES。在一些實施例中，構築體進一步包含編碼變體IGF2 (vIGF2)肽之核酸序列。在一些實施例中，vIGF2肽包含與選自由SEQ ID NO: 17-27組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼vIGF2肽之核酸序列位於編碼穩定化形式蛋白質之核酸序列的5’處。在一些實施例中，編碼vIGF2肽之核酸序列位於編碼穩定化形式蛋白質之核酸序列的3’處。在一些實施例中，構築體包裝於病毒殼內。在一些實施例中，基因療法載體或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內或靜脈內注射或其組合遞送。在一些實施例中，基因療法載體或醫藥組合物減少或減緩受試者之遺傳病症的一或多個症狀。在一些實施例中，遺傳病症為胞溶體貯積症。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病、泰-薩二氏症、山多夫氏病、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病、韓特氏症、聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症、沙利氏病、尼曼匹克症A型、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。
在額外態樣中，提供穩定化之人類α-半乳糖苷酶A (α-GAL)二聚體。在一些實施例中，穩定化之α-GAL二聚體包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基形成至少一個連接α-GAL二聚體之第一亞單元與第二亞單元之分子間雙硫鍵。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基選自由以下組成之群：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含D233C及I359C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含M51C及G360C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽具有與SEQ ID NO: 1-6中之一者至少90%一致之序列。在一些實施例中，多肽係由與SEQ ID NO: 7-12中之一者至少85%一致之核酸編碼。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。
在其他態樣中，提供醫藥組合物，其包含穩定化之人類α-GAL二聚體及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一些實施例中，穩定化之α-GAL二聚體包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基形成至少一個連接α-GAL二聚體之第一亞單元與第二亞單元之分子間雙硫鍵。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基選自由以下組成之群：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含D233C及I359C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含M51C及G360C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽具有與SEQ ID NO: 1-6中之一者至少90%一致之序列。在一些實施例中，多肽係由與SEQ ID NO: 7-12中之一者至少85%一致之核酸編碼。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。在一些實施例中，賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
在額外態樣中，提供治療受試者之法布瑞氏病之方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量之穩定化之人類α-GAL二聚體或其醫藥組合物給予需要的受試者。在一些實施例中，穩定化之α-GAL二聚體包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基形成至少一個連接α-GAL二聚體之第一亞單元與第二亞單元之分子間雙硫鍵。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基選自由以下組成之群：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含D233C及I359C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含M51C及G360C。在一些實施例中，該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽具有與SEQ ID NO: 1-6中之一者至少90%一致之序列。在一些實施例中，多肽係由與SEQ ID NO: 7-12中之一者至少85%一致之核酸編碼。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。在一些實施例中，賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。在一些實施例中，穩定化之人類α-GAL二聚體或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內、皮下、肌內、經眼、靜脈內注射或其組合遞送。在一些實施例中，穩定化之人類α-GAL二聚體或醫藥組合物減少或減緩受試者之法布瑞氏病的一或多個症狀。
在額外態樣中，提供穩定化之人類棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)分子。在一些實施例中，穩定化之PPT1分子包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基在PPT1分子內形成至少一個分子內雙硫鍵。在一些實施例中，穩定化之PPT1包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。在一些實施例中，多肽具有與SEQ ID NO: 13-14中之一者至少90%一致之序列。在一些實施例中，多肽係由與SEQ ID NO: 15-16中之一者至少85%一致之核酸編碼。在一些實施例中，與野生型PPT1多肽相比，多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。
在其他態樣中，提供醫藥組合物，其包含穩定化之PPT1及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。在一些實施例中，穩定化之PPT1分子包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基在PPT1分子內形成至少一個分子內雙硫鍵。在一些實施例中，穩定化之PPT1包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。在一些實施例中，多肽具有與SEQ ID NO: 13-14中之一者至少90%一致之序列。在一些實施例中，多肽係由與SEQ ID NO: 15-16中之一者至少85%一致之核酸編碼。在一些實施例中，與野生型PPT1多肽相比，多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。在一些實施例中，賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
在額外態樣中，提供治療受試者之CLN1疾病之方法，其包含向該受試者投與治療有效量之穩定化之PPT1或其醫藥組合物給予需要的受試者。在一些實施例中，穩定化之PPT1分子包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基在PPT1分子內形成至少一個分子內雙硫鍵。在一些實施例中，穩定化之PPT1包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。在一些實施例中，多肽具有與SEQ ID NO: 13-14中之一者至少90%一致之序列。在一些實施例中，多肽係由與SEQ ID NO: 15-16中之一者至少85%一致之核酸編碼。在一些實施例中，與野生型PPT1多肽相比，多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。在一些實施例中，賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。在一些實施例中，經修飾PPT1或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內、皮下、肌內、經眼、靜脈內注射或其組合遞送。
在額外態樣中，提供經修飾人類α-半乳糖苷酶A (α-GAL)多肽，其包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在其他態樣中，提供核酸分子，其包含編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在其他態樣中，提供包含核酸分子之基因療法載體，該核酸分子包含編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在額外態樣中，提供包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代之經修飾人類α-半乳糖苷酶A (α-GAL)多肽，其中半胱胺酸取代促進兩個α-GAL多肽之間之雙硫鍵形成，以形成同二聚體。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在其他態樣中，提供包含編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸的核酸分子。在一些實施例中，經修飾人類α-半乳糖苷酶A (α-GAL)多肽包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代，其中半胱胺酸取代促進兩個α-GAL多肽之間之雙硫鍵形成，以形成同二聚體。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在額外態樣中，提供包含編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸的基因療法載體。在一些實施例中，經修飾人類α-半乳糖苷酶A (α-GAL)多肽包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代，其中半胱胺酸取代促進兩個α-GAL多肽之間之雙硫鍵形成，以形成同二聚體。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在其他態樣中，提供包含兩個經修飾人類α-GAL多肽之同二聚體，其中每一經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，每一經修飾人類α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，每一經修飾人類α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL同二聚體相比，該同二聚體在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在額外態樣中，提供包含兩個經修飾人類α-GAL多肽之同二聚體，其中每一經修飾人類α-GAL多肽包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代，其中半胱胺酸取代促進兩個α-GAL多肽之間之雙硫鍵形成，以形成同二聚體。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，每一經修飾人類α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，每一經修飾人類α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL同二聚體相比，該同二聚體在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在其他態樣中，提供包含編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸的核酸分子，其中核酸編碼包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代之多肽：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之半胱胺酸取代之多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之半胱胺酸取代之多肽。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，核酸係基因療法構築體。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。
在額外態樣中，提供包含編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸的核酸分子，其中該核酸編碼包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代之多肽，其中該等半胱胺酸取代促進兩個α-GAL多肽之間之雙硫鍵形成，以形成同二聚體。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之半胱胺酸取代之多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之半胱胺酸取代之多肽。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該核酸係基因療法構築體。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，該核酸包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。
在額外態樣中，提供核酸構築體，其包含至少一個啟動子及編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸，其中該經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸構築體包含一或多個來自由以下組成之群之核酸：CrPV IRES、kozak序列、編碼連接體之核酸、編碼前導序列之核酸序列及編碼IGF2肽之核酸。在一些實施例中，核酸構築體包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，核酸構築體適於基因療法。
在其他態樣中，提供核酸構築體，其包含至少一個啟動子及編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸，其中該經修飾人類α-GAL多肽包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代，其中該等半胱胺酸取代促進兩個α-GAL多肽之間之雙硫鍵形成，以形成同二聚體。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸構築體包含一或多個來自由以下組成之群之核酸：CrPV IRES、kozak序列、編碼連接體之核酸、編碼前導序列之核酸序列及編碼IGF2肽之核酸。在一些實施例中，核酸構築體包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，核酸構築體適於基因療法。
在其他態樣中，提供醫藥組合物，其包含(a) 經修飾人類α-GAL多肽，其中該經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C，及(b) 醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，經修飾人類α-GAL多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。在一些實施例中，組合物適用於酶替代療法。
在額外態樣中，提供改善有需要之受試者中法布瑞氏病之至少一個症狀之方法，該方法包含投與至少一個劑量之包含基因療法核酸構築體之組合物，該基因療法核酸構築體包含至少一個啟動子及編碼經修飾人類α-GAL多肽之核酸，其中該經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼形成同二聚體之多肽。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，該核酸編碼與野生型α-GAL多肽相比在pH 7.4下具有增加之半衰期之經修飾人類α-GAL多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，該至少一個症狀選自以下中之一或多者：疼痛、皮膚變色、無法出汗、眼睛混濁、胃腸功能障礙、耳鳴、聽力損失、二尖瓣脫垂、心臟病、關節痛、腎衰竭及腎功能障礙。在一些實施例中，利用單次投與基因療法核酸構築體減少至少一個症狀。在一些實施例中，方法進一步包含治療後量測自該受試者獲得之組織中的α-GAL活性。
在其他態樣中，提供改善有需要之受試者中法布瑞氏病之至少一個症狀的方法，該方法包含投與至少一個劑量之包含經修飾人類α-GAL多肽之組合物，其中該經修飾人類α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾人類α-GAL多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，經修飾人類α-GAL多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該至少一個症狀選自以下中之一或多者：疼痛、皮膚變色、無法出汗、眼睛混濁、胃腸功能障礙、耳鳴、聽力損失、二尖瓣脫垂、心臟病、關節痛、腎衰竭及腎功能障礙。
交叉參考
本申請案主張2018年10月10日提交之美國臨時申請案第62/744,069號及2019年10月10日提交之專利合作條約申請案第PCT/US2019/055679號之權益，該等申請案以全文引用的方式併入本文中。 以引用方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確且個別地指示將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。
本文提供用於治療之多肽變體，其包括用於基因療法之構築體且具有半胱胺酸取代，該等多肽變體由於分子內雙硫鍵之形成或多肽中兩個亞單元之間之雙硫鍵形成以形成二聚體而穩定。該等雙硫鍵在中性pH (例如，血液之pH)下產生更穩定的重組酶。因此，提供具有更長半衰期之更穩定多肽，其可用於治療由突變引起之疾病，包括由α-GAL突變引起之疾病，例如法布瑞氏病；或PPT-1突變引起之疾病，例如CLN1疾病。多肽變體(亦稱為「經修飾多肽」)在本文中包括(但不限於) α-GAL及PPT-1之變體。經修飾 α-GAL 多肽
本文提供經修飾α-GAL多肽，其包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。本文所提供之預期取代包括：(i) R49C及G361C；(ii) R49C及G360C；(iii) D233C及I359C；(iv) M51C及G360C；及(v) S276C。在一些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。經修飾α-GAL多肽可形成同二聚體，該同二聚體藉由至少一個、更佳兩個分子間雙硫鍵穩定。與野生型α-GAL多肽相比，經修飾α-GAL多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
野生型及實例性經修飾α-GAL序列提供於下表1中
表 1 ： α-GAL 多肽序列
α-GAL 變體 序列 SEQ ID NO:
人類α-GAL野生型 (NP_000160.1) MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL 1
人類α-GAL R49C – G361C MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWE C FMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIG C PRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL 2
人類α-GAL R49C - G360C MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWE C FMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEI C GPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL 3
人類α-GAL M51C - G360C MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERF C CNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEI C GPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL 4
人類α-GAL D233C – I359C MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADI C DSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQE C GGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL 5
人類α-GAL S276C MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGL C WNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL 6
本文亦提供經修飾α-GAL多肽，其包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有至少90%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有至少95%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有至少96%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有至少97%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有至少98%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有至少99%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置51及360處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 4所示之序列具有多於99%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有如SEQ ID NO: 4所示之序列的多肽。
本文亦提供經修飾α-GAL多肽，其包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有至少90%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有至少95%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有至少96%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有至少97%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有至少98%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有至少99%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有在位置233及359處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 5所示之序列具有多於99%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含具有如SEQ ID NO: 5所示之序列的多肽。
本文亦提供包含兩個經修飾α-GAL多肽之同二聚體，其中每一經修飾α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) R49C及G361C；(ii) R49C及G360C；(iii) D233C及I359C；(iv) M51C及G360C；及(v) S276C。在一些實施例中，每一經修飾α-GAL多肽包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，每一經修飾α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，每一經修飾α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL同二聚體相比，同二聚體在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽在pH 4.6下具有增加之半衰期。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少50%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少150%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少200%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少250%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少300%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少350%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少400%。
在一些實施例中，經修飾α-GAL二聚體在pH 4.6下之半衰期與野生型α-GAL在pH 4.6下之半衰期相比增加至少約2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。更佳地，經修飾α-GAL二聚體在pH 4.6下之半衰期與野生型α-GAL在pH 4.6下之半衰期相比增加至少約3、3.5或4倍。
在一些實施例中，經修飾α-GAL二聚體之細胞內半衰期與野生型人類α-GAL之細胞內半衰期相比增加至少約2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。更佳地，經修飾α-GAL二聚體之細胞內半衰期與野生型α-GAL之細胞內半衰期相比增加至少約3、3.5、或4、4.5或5倍。
經修飾α-GAL二聚體與野生型人類α-GAL相比在pH 7.4下具有實質上增加之半衰期。編碼經修飾 α-GAL 多肽之核酸
本文亦提供核酸分子，其包含編碼經修飾α-GAL多肽之核酸。所預期核酸包括編碼包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代之多肽的彼等，該等半胱胺酸取代包括：(i) R49C及G361C；(ii) R49C及G360C；(iii) D233C及I359C；(iv) M51C及G360C；及(v) S276C。在一些實施例中，核酸編碼包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，核酸編碼包含D233C及I359C之半胱胺酸取代之多肽。在一些實施例中，核酸編碼包含M51C及G360C之半胱胺酸取代之多肽。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，核酸係基因療法構築體。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。
本文亦提供包含至少一個啟動子及編碼經修飾α-GAL多肽之核酸之核酸構築體。預期經修飾α-GAL多肽包含包括以下之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代：(i) R49C及G361C；(ii) R49C及G360C；(iii) D233C及I359C；(iv) M51C及G360C；及(v) S276C。在一些實施例中，該核酸編碼包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸構築體包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，該多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，核酸構築體適於基因療法。
表 2 ： α-GAL 核酸序列
α-GAL 變體 序列 SEQ ID NO:
α-GAL野生型 atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagcgcttcatgtgcaaccttgactgccaggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgcaggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgctttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaacctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttgatggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcattgtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcgaaattttgctgacattgatgattcctggaaaagtataaagagtatcttggactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatgttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctcagctggaatcagcaagtaactcagatggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcaggataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgggaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggagattggtggacctcgctcttataccatcgcagttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctatgaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaaaagacttactttaa 7
α-GAL R49C-G361C atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagT gcttcatgtgcaaccttgactgccaggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgcaggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgctttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaacctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttgatggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcattgtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcgaaattttgctgacattgatgattcctggaaaagtataaagagtatcttggactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatgttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctcagctggaatcagcaagtaactcagatggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcaggataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgggaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggagattggt T g C cctcgctcttataccatcgcagttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctatgaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaaaagacttactttaa 8
α-GAL R49C-G360C atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggag T gcttcatgtgcaaccttgactgccaggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgcaggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgctttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaacctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttgatggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcattgtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcgaaattttgctgacattgatgattcctggaaaagtataaagagtatcttggactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatgttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctcagctggaatcagcaagtaactcagatggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcaggataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgggaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggagatt T gtggacctcgctcttataccatcgcagttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctatgaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaaaagacttactttaa 9
α-GAL M51C-G360C atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagcgcttc TGC tgcaaccttgactgccaggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgcaggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgctttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaacctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttgatggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcattgtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcgaaattttgctgacattgatgattcctggaaaagtataaagagtatcttggactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatgttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctcagctggaatcagcaagtaactcagatggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcaggataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgggaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggagatt T gtggacctcgctcttataccatcgcagttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctatgaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaaaagacttactttaa 10
α-GAL D233C-I359C atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagcgcttcatgtgcaaccttgactgccaggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgcaggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgctttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaacctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttgatggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcattgtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcgaaattttgctgacatt TGC gattcctggaaaagtataaagagtatcttggactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatgttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctcagctggaatcagcaagtaactcagatggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcaggataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgggaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggag TGC ggtggacctcgctcttataccatcgcagttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctatgaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaaaagacttactttaa 11
α-GAL S276C atgcagctgaggaacccagaactacatctgggctgcgcgcttgcgcttcgcttcctggccctcgtttcctgggacatccctggggctagagcactggacaatggattggcaaggacgcctaccatgggctggctgcactgggagcgcttcatgtgcaaccttgactgccaggaagagccagattcctgcatcagtgagaagctcttcatggagatggcagagctcatggtctcagaaggctggaaggatgcaggttatgagtacctctgcattgatgactgttggatggctccccaaagagattcagaaggcagacttcaggcagaccctcagcgctttcctcatgggattcgccagctagctaattatgttcacagcaaaggactgaagctagggatttatgcagatgttggaaataaaacctgcgcaggcttccctgggagttttggatactacgacattgatgcccagacctttgctgactggggagtagatctgctaaaatttgatggttgttactgtgacagtttggaaaatttggcagatggttataagcacatgtccttggccctgaataggactggcagaagcattgtgtactcctgtgagtggcctctttatatgtggccctttcaaaagcccaattatacagaaatccgacagtactgcaatcactggcgaaattttgctgacattgatgattcctggaaaagtataaagagtatcttggactggacatcttttaaccaggagagaattgttgatgttgctggaccagggggttggaatgacccagatatgttagtgattggcaactttggcctc T gctggaatcagcaagtaactcagatggccctctgggctatcatggctgctcctttattcatgtctaatgacctccgacacatcagccctcaagccaaagctctccttcaggataaggacgtaattgccatcaatcaggaccccttgggcaagcaagggtaccagcttagacagggagacaactttgaagtgtgggaacgacctctctcaggcttagcctgggctgtagctatgataaaccggcaggagattggtggacctcgctcttataccatcgcagttgcttccctgggtaaaggagtggcctgtaatcctgcctgcttcatcacacagctcctccctgtgaaaaggaagctagggttctatgaatggacttcaaggttaagaagtcacataaatcccacaggcactgttttgcttcagctagaaaatacaatgcagatgtcattaaaagacttactttaa 12
在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，本文編碼經修飾α-GAL多肽之核酸具有增加之半衰期。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少50%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少150%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少200%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少250%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少300%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少350%。經修飾 PPT-1 多肽
本文提供包含PPT-1多肽序列之半胱胺酸取代的經修飾PPT-1多肽。本文提供之預期取代包括A171C及A183C。在一些實施例中，多肽包含A171C及A183C之PPT-1多肽序列之半胱胺酸取代。經修飾PPT-1多肽藉由化至少一個、更佳兩個分子內雙硫鍵穩定。與野生型PPT-1多肽相比，經修飾PPT-1多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
野生型及實例性經修飾PPT-1提供於下表3中。
表 3 ： PPT-1 多肽序列
PPT-1 變體 序列 SEQ ID NO:
人類PPT-1野生型 (NP_000301.1) MASPGCLWLLAVALLPWTCASRALQHLDPPAPLPLVIWHGMGDSCCNPLSMGAIKKMVEKKIPGIYVLSLEIGKTLMEDVENSFFLNVNSQVTTVCQALAKDPKLQQGYNAMGFSQGGQFLRAVAQRCPSPPMINLISVGGQHQGVFGLPRCPGESSHICDFIRKTLNAGAYSKVVQERLVQAEYWHDPIKEDVYRNHSIFLADINQERGINESYKKNLMALKKFVMVKFLNDSIVDPVDSEWFGFYRSGQAKETIPLQETSLYTQDRLGLKEMDNAGQLVFLATEGDHLQLSEEWFYAHIIPFLG 13
PPT-1 A171C A183C MASPGCLWLLAVALLPWTCASRALQHLDPPAPLPLVIWHGMGDSCCNPLSMGAIKKMVEKKIPGIYVLSLEIGKTLMEDVENSFFLNVNSQVTTVCQALAKDPKLQQGYNAMGFSQGGQFLRAVAQRCPSPPMINLISVGGQHQGVFGLPRCPGESSHICDFIRKTLNAG C YSKVVQERLVQ C EYWHDPIKEDVYRNHSIFLADINQERGINESYKKNLMALKKFVMVKFLNDSIVDPVDSEWFGFYRSGQAKETIPLQETSLYTQDRLGLKEMDNAGQLVFLATEGDHLQLSEEWFYAHIIPFLG 14
本文亦提供經修飾PPT-1多肽，其包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有至少90%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有至少95%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有至少96%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有至少97%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有至少98%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有至少99%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有在位置171及183處含有半胱胺酸殘基且與如SEQ ID NO: 14所示之序列具有多於99%一致性之序列的多肽。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽包含具有如SEQ ID NO: 14所示之序列的多肽。
在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽在pH 4.6下具有增加之半衰期。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少50%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少150%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少200%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少250%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少300%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少350%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少400%。
在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽在pH 4.6下之半衰期與野生型PPT-1在pH 4.6下之半衰期相比增加至少約2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。更佳地，經修飾PPT-1多肽在pH 4.6下之半衰期與野生型PPT-1多肽在pH 4.6下之半衰期相比增加至少約3、3.5或4倍。
在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽之細胞內半衰期與野生型人類α-GAL之細胞內半衰期相比增加至少約2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。更佳地，經修飾PPT-1多肽之細胞內半衰期與野生型PPT-1多肽之細胞內半衰期相比增加至少約3、3.5、或4、4.5或5倍。
與野生型人類α-GAL相比，經修飾PPT-1多肽在pH 7.4下具有實質上增加之半衰期。編碼經修飾 PPT-1 多肽之核酸
本文亦提供包含編碼經修飾PPT-1多肽之核酸的核酸分子。預期核酸包括編碼包含PPT-1多肽序列之半胱胺酸取代之多肽的彼等，該等半胱胺酸取代包括：A171C及A183C。在一些實施例中，該核酸編碼包含A171C及A183C之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，多肽藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型PPT-1多肽相比，多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，核酸係基因療法構築體。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒核酸序列之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。
表 4 ： PPT-1 核酸序列
PPT-1 變體 序列 SEQ ID NO:
PPT-1野生型 TTATTTTGATTCACCGCAGAGGGCGGTCTACGAGAGCGCAGAGCCCCACTCGGCCAGCGGGGTCTGGCGGGGGACCTGTCGCGCTGAAAGCTCCAGGGTAGGGCCGACGCCCATCAGGCTGGGCATCCGTTCGGGATGCGCAGGTTGCGATCTGCAACCGGCGGCGCCACGCCCAGGCGGGCGGAGCGCGGTTCCCGGAGTCTCGCGCCCGCGGTCATGTGACACAGCGAAGATGGCGTCGCCCGGCTGCCTGTGGCTCTTGGCTGTGGCTCTCCTGCCATGGACCTGCGCTTCTCGGGCGCTGCAGCATCTGGACCCGCCGGCGCCGCTGCCGTTGGTGATCTGGCATGGGATGGGAGACAGCTGTTGCAATCCCTTAAGCATGGGTGCTATTAAAAAAATGGTGGAGAAGAAAATACCTGGAATTTACGTCTTATCTTTAGAGATTGGGAAGACCCTGATGGAGGACGTGGAGAACAGCTTCTTCTTGAATGTCAATTCCCAAGTAACAACAGTGTGTCAGGCACTTGCTAAGGATCCTAAATTGCAGCAAGGCTACAATGCTATGGGATTCTCCCAGGGAGGCCAATTTCTGAGGGCAGTGGCTCAGAGATGCCCTTCACCTCCCATGATCAATCTGATCTCGGTTGGGGGACAACATCAAGGTGTTTTTGGACTCCCTCGATGCCCAGGAGAGAGCTCTCACATCTGTGACTTCATCCGAAAAACACTGAATGCTGGGGCGTACTCCAAAGTTGTTCAGGAACGCCTCGTGCAAGCCGAATACTGGCATGACCCCATAAAGGAGGATGTGTATCGCAACCACAGCATCTTCTTGGCAGATATAAATCAGGAGCGGGGTATCAATGAGTCCTACAAGAAAAACCTGATGGCCCTGAAGAAGTTTGTGATGGTGAAATTCCTCAATGATTCCATTGTGGACCCTGTAGATTCGGAGTGGTTTGGATTTTACAGAAGTGGCCAAGCCAAGGAAACCATTCCCTTACAGGAGACCTCCCTGTACACACAGGACCGCCTGGGGCTAAAGGAAATGGACAATGCAGGACAGCTAGTGTTTCTGGCTACAGAAGGGGACCATCTTCAGTTGTCTGAAGAATGGTTTTATGCCCACATCATACCATTCCTTGGATGAAACCCGTATAGTTCACAATAGAGCTCAGGGAGCCCCTAACTCTTCCAAACCACATGGGAGACAGTTTCCTTCATGCCCAAGCCTGAGCTCAGATCCAGCTTGCAACTAATCCTTCTATCATCTAACATGCCCTACTTGGAAAGATCTAAGATCTGAATCTTATCCTTTGCCATCTTCTGTTACCATATGGTGTTGAATGCAAGTTTAATTACCATGGAGATTGTTTTACAAACTTTTGATGTGGTCAAGTTCAGTTTTAGAAAAGGGAGTCTGTTCCAGATCAGTGCCAGAACTGTGCCCAGGCCCAAAGGAGACAACTAACTAAAGTAGTGAGATAGATTCTAAGGGCAAACATTTTTCCAAGTCTTGCCATATTTCAAGCAAAGAGGTGCCCAGGCCTGAGGTACTCACATAAATGCTTTGTTTTGCTGGTGATTTAACCAGTGCTTGGAAAAATCTTGCTTGGCTATTTCTGCATCATTTCTTAAGGCTGCCTTCCTCTCTCAGTACGTTGCCCTCTGTGCTATCATCTTATCATCAATTATTAGACAAATCCCACTGGCCTACAGTCTTGCTTCTGCAGCACCCACTTTGTCTCCTCAGGTAGTGATGAATTAGTTGCTGTCACAAAAGGAGGGAAGTAGCACCCAAATTAAGTTGCTTAAGAGAGGAAATGTACATCTTGTATAACTTAGGGAGCGAAGAAAATGTAGGCGCGAAAGTGAAAAGTGAGGCAGCTAGTTCTTCCTATTCCATTCTCGACCAACCTGCCCTTTCTTAATATGACTAGTGGTCTTGATGCTAGAGTCAACTTACTCTGTTGCTGGCTTTAGCAGAGAATAGGAGGAACCATATGAAAAAGATCAGGCTTTCTGACTTCCATCCCCAAAACACATTTACCAGCATACTCCAAACTGTTTCTGATGTGTTCCATGAGAAAAGGATTGTTTGCTCAAAAAGCTTGGAAAATACTACACACTCCCTTTCTCCTTCTGGAGATCAACCCACATTAGAGTGTCTAAGGACTCCTGAGAATTCCTGTTACAGTAAACAAAACTAACGTAATCTACCATTTCCTACACTATTTGAGCATGGAAATCATAGTCCCCACTCTGTGAAAACTTAACGCTTTTTGGAAGACATTTCTGTAGCATGTCAGTTTGGAGAAATGATGAGCTACGCCTTGATGAAAGAACCGTGTTGGTGCTGCTAAGTTTAGCCATTATGGTTTTTCCTTTCTCTCTCTTAAGCCTTATTCTTCAACTAAAAGATGAGGATTAAGAGCAAGAAGTTGGGGGGGATGTGAAAATAATTTTATGAGGTTGTCTAAAATAAAGAGTAGTTTCTTATC 15
PPT-1 A171C A183C ATGGCATCACCGGGTTGCCTCTGGTTGTTGGCCGTTGCGTTGCTTCCGTGGACATGTGCATCAAGAGCTCTTCAACATCTGGATCCCCCAGCTCCCCTGCCGCTCGTAATCTGGCACGGGATGGGGGATTCATGTTGTAACCCGTTGTCAATGGGCGCGATAAAAAAGATGGTTGAAAAGAAGATTCCAGGCATCTACGTTCTGTCCCTGGAAATCGGTAAGACACTGATGGAAGACGTGGAGAACTCCTTCTTTCTCAACGTCAATAGTCAGGTCACTACCGTCTGTCAAGCATTGGCAAAGGACCCTAAACTTCAGCAGGGGTACAATGCGATGGGGTTTAGCCAGGGCGGACAGTTTCTTAGAGCCGTCGCACAGCGCTGTCCATCTCCCCCGATGATTAACCTTATATCTGTCGGGGGACAACACCAGGGTGTTTTTGGTCTTCCTCGCTGTCCTGGTGAAAGCTCCCACATCTGTGATTTCATACGCAAAACGTTGAACGCAGGATGCTATAGTAAAGTCGTCCAAGAACGGCTTGTTCAATGCGAGTATTGGCATGACCCAATAAAAGAAGACGTTTATAGGAATCACTCTATCTTCTTGGCCGATATCAACCAAGAACGCGGAATCAACGAAAGCTACAAAAAGAATCTTATGGCTCTCAAGAAATTTGTTATGGTGAAATTCCTTAATGACTCTATAGTAGATCCTGTCGATTCAGAATGGTTCGGGTTCTACAGGTCTGGCCAGGCGAAGGAGACTATTCCCCTCCAAGAAACGTCTCTCTATACACAAGACAGACTCGGACTGAAAGAGATGGATAATGCGGGCCAGTTGGTCTTCTTGGCTACGGAAGGCGATCATCTCCAACTCTCCGAAGAGTGGTTCTATGCCCATATAATCCCGTTCCTGGGCTAA 16
在一些實施例中，本文編碼經修飾PPT-1多肽之核酸與野生型PPT-1多肽相比具有增加之半衰期。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少50%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少150%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少200%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少250%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少300%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少350%。IGF2 肽
在一些情形中，本文之經修飾多肽(例如，本文之經修飾α-GAL或經修飾PPT-1多肽)融合至胰島素樣生長因子2 (IGF2)肽以使經修飾多肽靶向需要其之溶酶體。IGF2肽序列之變體維持與IGF2/CI-MPR之高親和力結合並消除與IGF1、胰島素受體及IGF結合蛋白(IGFBP)之結合。與習用IGF2融合蛋白相比，變體IGF2肽實質上更具選擇性並具有降低之安全性風險。本文之IGF2肽包括具有AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE (SEQ ID NO: 17)之胺基酸序列的彼等。額外IGF2肽具有經最佳化以改良靶向性之變體胺基酸序列。變體IGF2肽包括在野生型IGF2序列之位置26、27、43、48、49、50、54、55或65處之變體胺基酸。該等包括在SEQ ID NO: 17之F26、Y27、V43、F48、R49、S50、A54、L55或K65處之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有一或多個來自由以下組成之群之取代：F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R及K65R。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有F26S之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有Y27L之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有V43L之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有F48T之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有R49S之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有S50I之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有A54R之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有L55R之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有K65R之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R及L55R之取代。在一些實施例中，IGF2肽具有N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有一個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有兩個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有三個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有三個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有四個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有五個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有六個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有七個胺基酸之N-末端缺失。在一些實施例中，IGF2肽具有七個胺基酸之N-末端缺失及Y27L及K65R之取代。
預期額外取代以減少不穩定性，同時維持CI-MPR結合親和性。該等取代預期與本文所述之任何其他取代組合。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有L17N之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有P31G之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有R38G之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有E45W之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有S50G之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有R38G及E45W之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有R38G、E45W及S50G之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有P31G、R38G、E45W及S50G之取代。在一些實施例中，IGF2肽之序列具有L17N、P31G、R38G、E45W及S50G之取代。實例性肽序列由SEQ ID NO: 17-27代表。
表 5 ： IGF 肽序列 ( 變體殘基加下劃線 )
肽 序列 SEQ ID NO
野生型 AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE 17
F26S AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGS YFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE 18
Y27L AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFL FSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE 19
V43L AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIL EECCFRSCDLALLETYCATPAKSE 20
F48T AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCT RSCDLALLETYCATPAKSE 21
R49S AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFS SCDLALLETYCATPAKSE 22
S50I AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRI CDLALLETYCATPAKSE 23
A54R AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLR LLETYCATPAKSE 24
L55R AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLAR LETYCATPAKSE 25
F26S, Y27L, V43L, F48T, R49S, S50I, A54R, L55R AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGSL FSRPASRVSRRSRGIL EECCTSI CDLRR LETYCATPAKSE 26
Δ1-6, Y27L, K65R TLCGGELVDTLQFVCGDRGFL FSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAR SE 27
內部核糖體進入序列
在一些實施例中，本文編碼經修飾多肽之核酸(例如，編碼經修飾α-GAL及PP-1多肽之核酸)進一步包含內部核糖體進入序列(IRES)以藉由繞過轉譯起始之瓶頸增加基因表現。用於最佳化表現以用於基因療法之適宜內部核糖體進入序列包括(但不限於)蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES、微小RNA病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)相關疱疹病毒IRES、A型肝炎IRES、C型肝炎IRES、瘟疫病毒屬IRES、蟋蟀麻痹病毒屬(Cripavirus) IRES、禾谷縊管蚜病毒(Rhopalosiphum padi virus) IRES、馬立克氏病(Merek’s disease)病毒IRES及其他適宜IRES序列。在一些實施例中，基因療法構築體包含CrPV IRES。在一些實施例中，CrPV IRES具有CGGUGUCGAAGUAGAAUUUCUAUCUCGACACGCGGCCUUCCAAGCAGUUAGGGAAACCGACUUCUUUGAAGAAGAAAGCUGACUAUGUGAUCUUAUUAAAAUUAGGUUAAAUUUCGAGGUUAAAAAUAGUUUUAAUAUUGCUAUAGUCUUAGAGGUCUUGUAUAUUUAUACUUACCACACAAGAUGGACCGGAGCAGCCCUCCAAUAUCUAGUGUACCCUCGUGCUCGCUCAAACAUUAAGUGGUGUUGUGCGAAAAGAAUCUCACUUCAAGAA (SEQ ID NO: 28)之核酸序列。信號序列
本文提供核酸分子，其包含編碼經修飾多肽(例如，經修飾α-GAL多肽或經修飾PPT-1多肽)之核酸，其中該等核酸分子進一步包含信號肽，該信號肽改良治療蛋白自利用基因療法構築體轉導之細胞的分泌。在一些實施例中，信號肽改良治療蛋白之蛋白加工，並促進新生多肽-核糖體複合物至ER之易位並確保適當共轉譯及轉譯後修飾。在一些實施例中，信號肽位於(i)信號轉譯起始序列之上游位置，(ii)轉譯起始序列與治療蛋白之間，或(iii)治療蛋白之下游位置。可用於基因療法構築體之信號肽包括(但不限於)來自HSP70蛋白家族(例如HSPA5，熱休克蛋白家族A成員5)之結合免疫球蛋白(BiP)信號肽及其變體。該等信號肽對信號識別粒子具有超高親和力。BiP胺基酸序列之實例提供於下表6中。在一些實施例中，信號肽具有與選自由SEQ ID No: 29-33組成之群之序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與選自由SEQ ID No: 29-33組成之群之序列相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。
表 6 ：信號 序列
信號序列 胺基酸序列 SEQ ID NO:
天然人類Bip MKLSLVAAMLLLLSAARA 29
經修飾Bip-1 MKLSLVAAMLLLLSLVAAMLLLLSAARA 30
經修飾Bip-2 MKLSLVAAMLLLLWVALLLLSAARA 31
經修飾Bip-3 MKLSLVAAMLLLLSLVALLLLSAARA 32
經修飾Bip-4 MKLSLVAAMLLLLALVALLLLSAARA 33
Kozak 序列
本文提供包含編碼經修飾多肽(例如，經修飾α-GAL多肽或經修飾PPT-1多肽)之核酸的核酸分子，其中該等核酸分子進一步包含具有kozak序列之核酸，該kozak序列幫助起始mRNA之轉譯。本文所預期之Kozak序列具有gccRccAUGG (SEQ ID NO: 34)之共有序列，其中小寫字母表示該位置處之最常見鹼基且鹼基可變，大寫字母指示僅存在很少變化之高度保守鹼基。R指示在彼位置經常觀察到嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)。括號中之序列(gcc)具有不確定意義。治療蛋白
本文所提供之基因療法構築體包含編碼用於治療遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸。自基因療法構築體表現之治療蛋白替代缺失或缺陷蛋白質。因此，治療蛋白係基於個體中需要治療之遺傳缺陷來選擇。本文之穩定化形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。
在一些實施例中，本文之基因療法構築體編碼酶，例如，患有胞溶體貯積症之個體中具有遺傳缺陷之酶。在一些實施例中，由本文所提供之基因療法構築體編碼之酶包括(但不限於) α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶、神經性類蠟脂褐質病1型、神經性類蠟脂褐質病2型、神經性類蠟脂褐質病3型、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病5型、神經性類蠟脂褐質病6型、神經性類蠟脂褐質病7型、神經性類蠟脂褐質病8型、神經性類蠟脂褐質病9型、神經性類蠟脂褐質病10型、神經性類蠟脂褐質病11型、神經性類蠟脂褐質病12型、神經性類蠟脂褐質病13型、神經性類蠟脂褐質病14型、神經性類蠟脂褐質病15型、神經性類蠟脂褐質病16型及週期蛋白依賴型激酶樣5。基因療法載體及組合物
本文提供包含核酸構築體之基因療法載體，該核酸構築體包含：編碼用於治療神經或遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。在一些實施例中，穩定化之形式包含經修飾α-GAL多肽或經修飾PPT-1多肽。
在一些實施例中，將編碼經修飾多肽之核酸選殖於許多類型之載體中。例如，在一些實施例中，將核酸選殖於包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏接質體之載體中。特別關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。
此外，編碼經修飾多肽之表現載體係以病毒載體之形式提供至細胞。病毒載體技術闡述於(例如) Sambrook等人，2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。通常，適宜載體含有在至少一個有機體中起作用之複製功能起點、啟動子序列、方便的限制性內切酶位點及一或多個可選擇標記(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
本文亦提供用於基因轉移之組合物及系統。已研發多種基於病毒之系統用於將基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供方便的平臺。在一些實施例中，使用適宜技術將所選基因插入載體中並包裝於逆轉錄病毒粒子中。然後將重組病毒分離並在活體內或離體遞送至受試者之細胞。許多反轉錄病毒系統適於基因療法。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體適於基因療法。在一些實施例中，使用腺相關病毒載體。許多腺相關病毒適於基因療法。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
本文所提供之基因療法構築體包含所關注基因選殖於其中或以某種方式包括所關注基因之載體(或基因療法表現載體)，該方式使得載體之核苷酸序列允許所關注基因之表現(組成型或以某一方式調控)。本文所提供之載體構築體包括能遞送至所關注組織且將提供所關注基因在所選之關注組織中之表現的任何適宜基因表現載體。
在一些實施例中，載體係腺相關病毒(AAV)載體，此乃因AAV載體具有穿越血腦障壁及神經元組織轉導之能力。在本文所提供之方法中，預期使用任何血清型AAV。在某些實施例中，所用病毒載體之血清型選自由以下組成之群：AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAVhu68載體、AAV-DJ載體及適於基因療法之其他載體。
AAV載體係對於哺乳動物無致病性之DNA小病毒。簡言之，基於AAV之載體去除了佔病毒基因體96%之rep及cap病毒基因，留下兩個側接145個鹼基對之反向末端重複序列(ITR)用於起始病毒DNA複製、包裝及整合。
其他實施例包括使用其他血清型殼體來創建AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAV-DJ載體及適於基因療法之其他載體。視情況，AAV病毒殼係AAV2/9、AAV9、AAVrhS、AAVrh10、AAVAnc80或AAV PHP.B。
額外啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。通常，該等元件位於起始位點上游30-110 bp區域中，但已顯示多種啟動子亦含有起始位點下游之功能元件。啟動子元件間之間距通常係靈活的，以使得元件相對於彼此反向或移動時保留啟動子功能。在胸腺嘧啶激酶(tk)啟動子中，啟動子元件間之間距通常在活性開始下降之前增加至相距50 bp。端視啟動子而定，個別元件似乎協同或獨立地起作用以激活轉錄。
能在哺乳動物T細胞中表現穩定化之蛋白質(例如，經修飾α-GAL多肽或經修飾PPT-1多肽轉基因)之啟動子的實例係EF1a啟動子。天然EF1a啟動子驅動負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體之延長因子-1複合物之α亞單元之表現。EF1a啟動子已廣泛地用於哺乳動物表現質體且已顯示有效驅動選殖於慢病毒載體中之轉基因表現(例如，參見Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009))。啟動子之另一實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係能夠驅動可操作地連接至其之任何多核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。然而，有時亦使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子以及人類基因啟動子，例如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延長因子-1a啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，基因療法載體預期不限於使用組成型啟動子。本文亦預期誘導型啟動子。使用誘導型啟動子提供能夠在期望該表現時啟動可操作地連接之多核苷酸序列的表現或在不期望該表現時關閉表現之分子開關。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、孕酮啟動子及四環素調控啟動子。在一些實施例中，啟動子係α-GAL啟動子。
為評價經修飾多肽之表現，欲引入至細胞中之表現載體通常含有可選標記基因或報導基因或二者，以促進自尋求經由病毒載體轉染或感染之細胞群鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記通常攜載於DNA之單獨片段上且用於共轉染程序中。可選標記及報導基因二者有時側接有適當調控序列以使得能夠在宿主細胞中表現。有用可選標記包括(例如)抗生素抗性基因，例如neo及諸如此類。
將基因引入細胞中並表現之方法適用於本文方法。在表現載體之情形中，可藉由此項技術中之任何方法將載體容易地引入至宿主細胞中，例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。舉例而言，藉由物理、化學或生物學方式將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於將多核苷酸引入至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、基因槍、電穿孔及諸如此類。用於產生包含載體及/或外源核酸之細胞的方法適用於本文之方法(例如，參見Sambrook等人，2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press, NY)。用於將多核苷酸引入至宿主細胞中之一種方法係磷酸鈣轉染。
用於將多核苷酸引入至宿主細胞中之化學方式包括膠體分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之實例性膠體系統係脂質體(例如人工膜囊泡)。可獲得目前最先進靶向遞送核酸之其他方法，例如使用靶向奈米粒子或其他適宜亞微米大小之遞送系統遞送多核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情形下，實例性遞送媒劑係脂質體。預期使用脂質調配物以將核酸引入至宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸與脂質締合。在一些實施例中，與脂質締合之核酸囊封於脂質體之水性內部、散佈於脂質體之脂質雙層內、經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子附接至脂質體、包埋於脂質體中，與脂質體複合、分散於含有脂質之溶液中、與脂質混合、與脂質組合、以懸浮液形式含於脂質中、包含膠束或與膠束複合或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物並不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，在一些實施例中，脂質體可以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。另一選擇，脂質體係簡單地散佈於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻之聚集物。在一些實施例中，脂質係為天然存在或合成脂質之脂肪性物質。舉例而言，脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪小滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物類別，例如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。
適於使用之脂質係自商業來源獲得。舉例而言，在一些實施例中，二肉豆蔻基磷酯醯膽鹼(「DMPC」)係獲自Sigma, St. Louis, Mo.；在一些實施例中，磷酸二鯨蠟酯(「DCP」)係獲自K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)；在一些實施例中，膽固醇(「Choi」)係獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯基甘油(「DMPG」)及其他脂質通常獲自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之原液通常儲存於約-20℃下。使用氯仿作為唯一溶劑，此乃因其比甲醇更易於蒸發。「脂質體」係通用術語，其涵蓋多種藉由產生封閉脂質雙層或聚集物而形成之各種單層及多層脂質媒劑。脂質體之特徵通常在於具有磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組分在形成閉合結構之前發生自重排且將水及所溶解溶質陷獲於脂質雙層之間(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡狀結構不同之結構之組合物。例如，在一些實施例中，脂質呈膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦考慮脂質轉染胺(lipofectamine)-核酸複合物。
無論用於將外源核酸引入至宿主細胞中或以其他方式將細胞暴露於經修飾α-GAL多肽之方法如何，為確認宿主細胞中重組DNA序列之存在，考慮實施各種分析。該等分析包括例如適用於本文方法之「分子生物學」分析，例如南方墨點法(Southern blotting)及北方墨點法(Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，例如檢測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點)或藉由本文所述之分析，以鑑別屬本發明範圍內之藥劑。
本發明進一步提供包含編碼核酸分子之經修飾多肽的載體。在一個態樣中，治療融合蛋白載體能直接轉導至細胞中。在一個態樣中，載體係選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下各項之載體：一或多種質體(例如，表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、逆轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物細胞中表現經修飾多肽構築體。在一個態樣中，哺乳動物細胞係人類細胞。醫藥組合物
本文提供醫藥組合物，其包含經修飾多肽、用於治療遺傳病症之蛋白質之穩定化形式，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋，及(ii) 醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施例中，經修飾多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型多肽相比，經修飾多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。
另外，本文提供醫藥組合物，其包含(i) 經修飾α-GAL多肽，其中該經修飾α-GAL多肽包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代，及(ii) 醫藥上可接受之賦形劑。預期之取代包括：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，經修飾α-GAL多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，組合物包含伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白包含米加司他(Migalastat)。
本文進一步提供醫藥組合物，其包含(i) 經修飾PPT-1多肽，其中經修飾PPT-1多肽包含PPT-1多肽序列之半胱胺酸取代及(ii) 醫藥上可接受之賦形劑。所預期之取代包括A171C及A183C。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型PPT-1多肽相比，經修飾PPT-1多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，組合物包含伴護蛋白。
用於本文醫藥組合物之適宜賦形劑包括(但不限於)鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
在一些實施例中，本文之醫藥組合物包含本文之經修飾α-GAL多肽，該等多肽與野生型α-GAL多肽相比在pH 4.6下具有增加之半衰期。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少50%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少150%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少200%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少250%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少300%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少350%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少400%。
在一些實施例中，本文之醫藥組合物包含本文之經修飾PPT-1多肽，該等多肽與野生型PPT-1多肽相比在pH 4.6下具有增加之半衰期。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少50%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少150%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少200%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少250%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少300%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少350%。在一些實施例中，在pH 4.6下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少400%。
在一些實施例中，本文之醫藥組合物包含經修飾α-GAL多肽，該等多肽在pH 7.4下具有增加之半衰期。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少50%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少150%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少200%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少250%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少300%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少350%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少400%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少500%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少600%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少700%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少800%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少900%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型α-GAL多肽高至少1000%。
在一些實施例中，本文之醫藥組合物包含經修飾PPT-1多肽，該等多肽在pH 7.4下具有增加之半衰期。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少50%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少150%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少200%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少250%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少300%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少350%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少400%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少500%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少600%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少700%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少800%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少900%。在一些實施例中，在pH 7.4下之半衰期比野生型PPT-1多肽高至少1000%。治療方法 基因療法方法
本文亦提供改善有需要受試者中遺傳疾病之至少一個症狀之方法。一些該等方法包含投與至少一個劑量之包含基因療法之組合物，該基因療法包含編碼用於治療遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。在一些實施例中，該核酸編碼形成同二聚體之多肽。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，該核酸編碼與野生型多肽相比在pH 7.4下具有增加之半衰期的多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，至少一個症狀選自以下中之一或多者：疼痛、皮膚變色、無法出汗、眼睛混濁、胃腸功能障礙、耳鳴、聽力損失、二尖瓣脫垂、心臟病、關節痛、腎衰竭及腎功能障礙。在一些實施例中，利用單次投與基因療法核酸構築體減少至少一個症狀。在一些實施例中，方法進一步包含在治療後量測獲自該受試者之組織中的活性。
在一些實施例中，將基因療法載體或醫藥組合物投與腦脊髓液。在一些實施例中，基因療法載體或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內或靜脈內注射或其組合遞送。在一些實施例中，基因療法載體或醫藥組合物係藉由鞘內注射投與。在一些實施例中，基因療法載體或醫藥組合物係經由靜脈內注射投與。
在一些實施例中，遺傳病症係神經病症。在一些實施例中，遺傳病症為胞溶體貯積症。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病、泰-薩二氏症、山多夫氏病、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病、韓特氏症、聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症、沙利氏病、尼曼匹克症A型、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、嬰兒、青少年及成年形式之神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。
本文亦提供改善有需要之受試者中法布瑞氏病之至少一個症狀的方法。一些該等方法包含投與至少一個劑量之包含基因療法核酸構築體之組合物，該基因療法核酸構築體包含至少一個啟動子及編碼包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代之經修飾α-GAL多肽的核酸。預期經修飾α-GAL多肽包含包括以下之半胱胺酸取代：(i) R49C及G361C；(ii) R49C及G360C；(iii) D233C及I359C；(iv) M51C及G360C；及(v) S276C。在一些實施例中，該核酸編碼包含選自由以下組成之群之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，該核酸編碼包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代的多肽。在一些實施例中，該核酸編碼形成同二聚體之多肽。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，該核酸編碼與野生型α-GAL多肽相比在pH 7.4下具有增加之半衰期的經修飾α-GAL多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，至少一個症狀選自以下中之一或多者：疼痛、皮膚變色、無法出汗、眼睛混濁、胃腸功能障礙、耳鳴、聽力損失、二尖瓣脫垂、心臟病、關節痛、腎衰竭及腎功能障礙。在一些實施例中，利用單次投與基因療法核酸構築體減少至少一個症狀。在一些實施例中，方法進一步包含治療後量測自該受試者獲得之組織中的α-GAL活性。在一些實施例中，該方法進一步包含投與伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白包含米加司他。
本文亦提供改善有需要之受試者中CLN1疾病之至少一個症狀的方法。一些該等方法包含投與至少一個劑量之包含基因療法核酸構築體之組合物，該基因療法核酸構築體包含至少一個啟動子及編碼包含PPT-1多肽序列之半胱胺酸取代之經修飾PPT-1多肽的核酸。預期經修飾PPT-1多肽包含包括A171C及A183C之半胱胺酸取代。在一些實施例中，該核酸編碼形成同二聚體之多肽。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，該核酸編碼與野生型PPT-1多肽相比在pH 7.4下具有增加之半衰期的經修飾PPT-1多肽。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，核酸包含病毒之至少一部分。在一些實施例中，病毒係選自，其中該病毒包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒屬或疱疹病毒。在一些實施例中，該核酸包裝於病毒殼蛋白內。在一些實施例中，至少一個症狀選自以下中之一或多者：疼痛、皮膚變色、無法出汗、眼睛混濁、胃腸功能障礙、耳鳴、聽力損失、二尖瓣脫垂、心臟病、關節痛、腎衰竭及腎功能障礙。在一些實施例中，利用單次投與基因療法核酸構築體減少至少一個症狀。在一些實施例中，方法進一步包含治療後量測自該受試者獲得之組織中的PPT-1活性。在一些實施例中，該方法進一步包含投與伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白包含米加司他。
在一些實施例中，經由本文所述之方法進行之治療將編碼治療蛋白之基因遞送至需要該治療蛋白之細胞中。在一些實施例中，治療將基因遞送至個體中之所有體細胞中。在一些實施例中，治療替代靶細胞中之缺陷基因。在一些實施例中，將經離體處理以表現治療蛋白之細胞遞送至個體。
在一些實施例中，本文之基因療法治療包含投與編碼本文之經修飾α-GAL多肽之核酸，該等經修飾α-GAL多肽之細胞內半衰期與野生型人類α-GAL之半衰期相比增加至少約2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。酶替代療法方法
亦提供改善有需要之受試者中遺傳疾病之至少一個症狀的方法，該方法包含投與至少一個劑量之組合物，該組合物包含用於治療遺傳病症之蛋白質之穩定化形式，其中該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。在一些實施例中，經修飾多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型多肽相比，經修飾多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，至少一個症狀選自以下中之一或多者：精神損害、痙攣、失語及喪失運動技能。在一些實施例中，該方法進一步包含投與伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白包含米加司他。
在一些實施例中，組合物係經由鞘內、腦室內、腦實質內、皮下、肌內、經眼、靜脈內注射或其組合投與。
在一些實施例中，遺傳病症為神經病症。在一些實施例中，遺傳病症為胞溶體貯積症。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病、泰-薩二氏症、山多夫氏病、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病、韓特氏症、聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症、沙利氏病、尼曼匹克症A型、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、嬰兒、青少年及成年形式之神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。
亦提供改善有需要之受試者中法布瑞氏病之至少一個症狀的方法，該方法包含投與至少一個劑量之包含經修飾α-GAL多肽之組合物，其中該經修飾α-GAL多肽包含α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。所預期之半胱胺酸取代包括：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含D233C及I359C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽包含M51C及G360C之α-GAL多肽序列之半胱胺酸取代。在一些實施例中，經修飾α-GAL多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型α-GAL多肽相比，經修飾α-GAL多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，至少一個症狀選自以下中之一或多者：疼痛、皮膚變色、無法出汗、眼睛混濁、胃腸功能障礙、耳鳴、聽力損失、二尖瓣脫垂、心臟病、關節痛、腎衰竭及腎功能障礙。在一些實施例中，該方法進一步包含投與伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白包含米加司他。
亦提供改善有需要之受試者中CLN-1疾病之至少一個症狀的方法，該方法包含投與至少一個劑量之包含經修飾PPT-1多肽之組合物，其中該PPT-1多肽包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。所預期之半胱胺酸取代包括：A171C及A183C。在一些實施例中，經修飾PPT-1多肽形成同二聚體。在一些實施例中，同二聚體藉由雙硫鍵穩定。在一些實施例中，與野生型PPT-1多肽相比，經修飾PPT-1多肽在pH 7.4下顯示增加之半衰期。在一些實施例中，至少一個症狀選自以下中之一或多者：精神損害、痙攣、失語及喪失運動技能。在一些實施例中，該方法進一步包含投與伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白包含米加司他。
在一些實施例中，本文之方法包含投與本文之經修飾多肽，該等經修飾多肽與野生型多肽相比具有增加之半衰期。在一些實施例中，半衰期比野生型多肽高至少50%。在一些實施例中，半衰期比野生型多肽高至少150%。在一些實施例中，半衰期比野生型多肽高至少200%。在一些實施例中，半衰期比野生型多肽高至少250%。在一些實施例中，半衰期比野生型多肽高至少300%。在一些實施例中，半衰期比野生型多肽高至少350%。
在一些實施例中，本文之方法包含投與本文之經修飾α-GAL多肽，該等經修飾α-GAL多肽與野生型α-GAL多肽相比具有增加之半衰期。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少50%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少150%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少200%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少250%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少300%。在一些實施例中，半衰期比野生型α-GAL多肽高至少350%。
在一些實施例中，本文之方法包含投與本文之經修飾PPT-1多肽，該等經修飾PPT-1多肽與野生型PPT-1多肽相比具有增加之半衰期。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少50%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少150%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少200%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少250%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少300%。在一些實施例中，半衰期比野生型PPT-1多肽高至少350%。定義
如本文關於蛋白質所用之「穩定化」係指經修飾蛋白質(例如，經修飾以含有非天然半胱胺酸殘基)，其在比沒有該修飾之相應蛋白質長之時間段內維持其生物活性之一或多者。在一些實施例中，穩定化之蛋白質維持其生物活性之時間比沒有該修飾之相應蛋白質長約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%或500%。在一些實施例中，穩定化之蛋白質維持其生物活性之時間比沒有該修飾之相應蛋白質長至少10%、長至少20%、長至少30%、長至少40%、長至少50%、長至少60%、長至少70%、長至少80%、長至少90%、長至少100%、長至少150%、長至少200%、長至少250%、長至少300%、長至少350%、長至少400%、長至少450%或長至少500%。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質具有更長半衰期。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 4.0至pH 8.0、或pH 4.0至6.0或pH 6.0至8.0下具有更長半衰期。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 4.5至5.0或7.0至7.5下具有更長半衰期。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 7.4下具有更長半衰期。在一些實施例中，與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，穩定化之蛋白質在pH 4.6下具有更長半衰期。
如本文所用，「離體基因療法」係指患者細胞在受試者之外部經基因修飾以(例如)表現治療基因之方法。然後將帶有新遺傳資訊之細胞送回至其來源之受試者。
如本文所用，「活體內基因療法」係指將攜載治療基因之載體直接投與給受試者之方法。
如本文所用，「融合蛋白」及「治療融合蛋白」在本文中可互換使用且係指具有至少一個連接至其之額外肽或多肽之治療蛋白。在一些情形中，融合蛋白係含有兩個或更多個蛋白質或其片段之單一蛋白質分子，其經由各別肽鏈內之肽鍵共價連接而無化學連接體。在一些實施例中，融合蛋白包含治療蛋白及信號肽、增加融合蛋白之胞吞作用的肽或二者。在一些實施例中，增加胞吞作用之肽係結合CI-MPR之肽。
如本文所用，「質體」係指在細胞內獨立於染色體DNA進行複製之環狀雙鏈DNA單元。
如本文所用，「啟動子」係指DNA上酶RNA聚合酶結合並起始DNA轉錄成RNA之位點。
如本文所用，「身體療法」係指其中操縱細胞中之基因表現將對患者進行矯正但不會被下一代繼承之方法。體細胞包括人體內所有非生殖細胞。
如本文所用，「體細胞」係指除生殖細胞以外之所有體細胞。
如本文所用，「向性」係指載體(例如病毒)對於某一細胞或組織類型之偏好。有各種因素決定載體感染特定細胞之能力。例如，病毒必須結合至特定細胞表面受體才能進入細胞。若不能表現必需受體，則病毒通常無法感染細胞。
如本文所用，「載體」或「基因療法載體」在本文中可互換使用，係指將治療基因遞送至細胞之基因療法遞送媒劑或載劑。基因療法載體係適用於基因療法之任何載體，例如適於將核酸聚合物(編碼多肽或其變體)治療性遞送至患者的靶細胞(例如感覺神經元)之任何載體。在一些實施例中，基因療法載體將編碼治療蛋白或治療融合蛋白之核酸遞送至細胞，在其中表現治療蛋白或融合物並自該細胞分泌。載體可為任何類型，例如其可為質體載體或微環DNA。通常，載體係病毒載體。該等包括遺傳缺陷病毒(例如腺病毒)及非病毒載體(例如脂質體)二者。病毒載體可源自(例如)腺相關病毒(AAV)、反轉錄病毒、慢病毒屬、單純疱疹病毒或腺病毒。AAV衍生載體。載體可包含AAV基因體或其衍生物。
如本文所用，「構築體」係指編碼治療蛋白或融合蛋白且視情況包含額外序列(例如轉譯起始序列或IRES序列)之核酸分子或序列。
使用術語「轉導」以指經由本揭示內容之複製缺陷型rAAV將編碼治療蛋白之核酸活體內或活體外投與/遞送至靶細胞，使得由受體細胞表現功能多肽。利用基因療法載體(例如本揭示內容之rAAV)轉導細胞導致由rAAV編碼之多肽或RNA的持續表現。因此，本發明提供藉由鞘內、視網膜內、眼內、玻璃體內、腦室內、腦實質內或靜脈內途徑或其任一組合將基因療法載體(例如，編碼治療蛋白之rAAV)投與/遞送至受試者之方法。「鞘內」遞送係指遞送至大腦或脊髓之蛛網膜下空間。在一些實施例中，鞘內投與係經由腦池內投與。
術語「接受者」、「個體」、「受試者」、「宿主」及「患者」在本文中可互換使用，且在一些情形中係指期望診斷、治療或療法之任何哺乳動物受試者，特別地人類。出於治療目的，「哺乳動物」係指任何歸類為哺乳動物之動物，包括人類、家畜及農場動物以及實驗室、動物園動物、運動或玩賞動物，例如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠(guinea pig)、猴子等。在一些實施例中，哺乳動物係人類。
如本文所用，在一些情形中，術語「治療(treatment, treating)」、「改善症狀」及諸如此類係指投與藥劑或實施程序用於獲得治療效應之目的，包括以統計學上顯著之方式或臨床上顯著之方式抑制、減弱、減少、預防或改變病症之至少一個態樣或標誌。術語「改善」或「治療」並不陳述或暗示潛在病況之治癒。如本文所用，「治療」或「改善」(及諸如此類)可包括治療哺乳動物、特別地人類，且包括：(a) 防止該病症或病症之症狀在可能易患該病症但尚未診斷出患有該病症之受試者中發生(例如，包括可能與原發性疾病相關或由其引起之病症)；(b) 抑制病症，即阻止其發展；(c) 減輕病症，即使病症消退；及(d)改良病症之至少一個症狀。治療可係指在治療或改善或預防病症方面之任何成功象徵，包括任何客觀或主觀參數，如減輕；緩解；減少症狀或使患者對病症狀況之容忍度更高；使惡化或衰退之速率減慢；或使惡化之終點較不虛弱。症狀之治療或改善係基於一或多個客觀或主觀參數；包括醫師之檢查結果。因此，術語「治療」包括投與本發明之化合物或藥劑以防止或延遲、緩和、或阻止或抑制與病症相關之症狀或狀況之發展。術語「治療效應」係指減少、消除或預防受試者之病症、病症症狀或病症之副作用。
術語「親和力」係指分子與其結合配偶體或受體之間之結合強度。
如本文所用，片語「高親和力」係指(例如)含有結合CI-MPR之此一肽的治療融合物與CI-MPR之親和力係無該肽之治療蛋白的約100至1,000倍或500至1,000倍。在一些實施例中，親和力係無該肽之情形的至少100、至少500或至少1000倍。舉例而言，在治療蛋白與CI-MPR以相對相等濃度結合時，高親和力之肽將與可用CI-MPR結合，以使平衡向高濃度之所得複合物位移。
如本文所用，「分泌」係指蛋白質自細胞釋放至(例如)欲攜帶至所關注組織或治療蛋白之作用位點的血流中。當基因療法產物分泌至器官之胞間隙中時，分泌可允許相鄰細胞之交叉校正。
如本文所用，「遞送」意指藥物遞送。在一些實施例中，遞送過程意指將藥物物質(例如，自基因療法載體產生之治療蛋白或融合蛋白)自細胞外部(例如，血液、組織或胞間隙)輸送至靶細胞中以發揮藥物物質之治療活性。
如本文所用，「工程化」或「蛋白質工程化」係指藉由提供編碼蛋白質以產生期望性質之適當核酸序列來操縱蛋白質之結構，或合成具有特定結構之蛋白質。
在一些情形中，「治療有效量」意指當投與給受試者用於治療疾病時該量足以實現彼疾病之治療。
如本文所用，術語「約」一數值係指自比彼數值少10%至比彼數值多10%之範圍，且包括該範圍內之值(例如數值本身)。
如本文所用，術語「包含」申請專利範圍中之一或多個要素係指彼等要素，但不排除包括額外的一或多個要素。實例
以下實例係出於說明本發明之各個實施例之目的給出且不意欲以任何方式限制本發明。本發明實例以及本文所述之方法目前代表較佳實施例，係實例性的且不欲限制本發明之範圍。熟習此項技術者將瞭解其中之變化及由申請專利範圍之範圍界定之本發明之精神內涵蓋之其他用途。實例 1 ：鑑別用於野生型 α-GAL 之半胱胺酸取代的胺基酸殘基
檢查二聚化α-GAL (PDB ID 3HG3)之晶體結構用於之潛在位點用於取代半胱胺酸殘基，並產生額外雙硫鍵以增強穩定性(圖1A )。使用NAMD以及CHARMM力場用於分析。基於分析，使用定向誘變之標準方法製備表8中所示之半胱胺酸突變體。
表 8 ： α-GAL 雙硫鍵突變體
突變 SEQ ID NO
R49C - G361C 2
R49 C – G360 C 3
M51 C – G360 C 4
D233 C – I359 C 5
S276 C 6
亦參見圖 1B 。胺基酸序列提供於表1中。實例 2 ：經修飾 α-GAL 之二聚化及酶活性
在細胞溶解產物及培養基中檢查經修飾α-GAL之雙硫鍵二聚體的形成(圖2A )。在293HEK細胞中瞬時表現每一α-GAL構築體之純系。將細胞溶解產物及培養基溶解產物在4-12%梯度SDS-PAGE上運行並轉移至硝化纖維素。藉由西方墨點法利用兔單株抗α-GAL 1:2000 (abcam ab168341)檢測α-GAL。
還原及未還原樣品經受電泳及西方墨點法。如圖2中所見，α-GAL之M51C-G360C及D233C-I359C型式易於形成雙硫鍵結之α-GAL二聚體。
為製備樣品，用α-GAL構築體之瞬時表現收穫1x 10^6個細胞。使細胞在500 ul 20mM磷酸鈉緩衝液pH6.5、0.25% TX-100中溶解。將細胞溶解產物在10,000g下離心2分鐘並將上清液轉移至新試管。將40 ul細胞溶解產物或培養基轉移至新試管並添加16 µl LDS 4X樣品緩衝液以及6 µl 10X還原劑(用於還原條件)。將如下製備之樣品混合物在95℃下加熱5分鐘。使用1x MOPS SDS運行緩衝液用於電泳。
為測試酶活性，溶解產物或培養基用4-甲基傘形酮-α-D-吡喃半乳糖苷(4-MUG)受質培育1小時。然後停止酶促反應，並藉由螢光在激發波長360 nm及發射波長450 nm下量測α-GAL酶活性。如圖 2B 中所示，M51C-G360C及D233C-I359C雙硫鍵α-GAL突變體二者均具有酶活性。由於未量化每一樣品中α-GAL之比活性及量，故圖2B未提供α-GAL之野生型與突變體之間活性的定量比較。實例 3 ：經修飾 α-GAL 在酸性環境中隨時間之穩定性分析
為測試pH經24小時之穩定性，根據標準方法使用伴刀豆球蛋白A (ConA)瓊脂糖下拉(pull-down)捕獲瞬時表現突變體及野生型α-GAL。將ConA溶析液稀釋於pH 4.6緩衝液或pH 7.4緩衝液中。將樣品在pH 4.6或7.4下預培育0、0.5、1、2、4、5及24小時。
為量測酶活性，將pH 4.6緩衝液添加至每一樣品並在4-MUG受質上測試活性。將反應混合物在37℃下培育1小時。藉由添加125 uL停止緩衝液(0.4 M甘胺酸-NaOH, pH 10.8)終止反應。利用Spectramax板讀取器：激發波長: 360 nm, 發射波長: 450 nm讀取螢光。結果顯示於圖 3A 中。
對於長期穩定性測試， 自培養基分離瞬時表現經修飾及野生型α-GAL並使用如上所述之ConA瓊脂糖珠粒富集及純化。將溶析之α-GAL在pH 4.6或pH 7.4下培育用於時程穩定性試驗。時間點包括0小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、5小時、24小時、2天、5天、6天及7天。圖 3B 顯示M51C-G360C α-GAL在pH 4.6下歷經7天之跨度比野生型對照更穩定。兩種經修飾α-GAL在pH 7.4下經7天均比野生型對照實質上更穩定。實例 4 ：法布瑞氏患者纖維母細胞之 α-GAL 攝取及酶分析 細胞攝取方案
為實施攝取分析，在第1天，將300,000個法布瑞氏患者纖維母細胞(R301Q)接種於6孔板之每一孔中。在第2天，將培養基替換為1.8 mL攝取培養基並在37℃及5% CO2 下培育1小時。細胞給予在攝取培養基中製備的200 uL劑量250 nM酶(法布瑞酶(Fabrazyme)、M51C-G360C、D233C-I359C及WT)，放入步驟2中製備之6孔並持續16-18小時。第3天，添加300 uL 1 M Tris並在室溫下培育30分鐘。添加400 uL 1M NaH2SO4並混合。將細胞板用1 ml DPBS洗滌兩次。將500 uL水添加至各孔並自板收集細胞。添加Matric-green，然後在-80℃冷凍器中冷凍直至分析。在酶及蛋白質分析之前將板旋轉。
藉由將20 uL細胞溶解產物添加至130 uL水中實施蛋白質分析。添加150 uL BCA工作試劑並在37℃下培育2小時。然後在Spectramax上讀取板。
藉由將5 uL細胞溶解產物添加至15 uL分析緩衝液、然後添加50 uL 4-MUG受質來實施酶分析。將此在37℃下培育1小時。添加125 uL停止緩衝液並在Spectramax上讀取。
作為對照，將冷凍細胞溶解產物在室溫下解凍並聲波處理5分鐘。將50 μL轉移至13 mL矽烷化玻璃試管中。添加25 μL葡萄糖鞘胺醇半乳糖苷(Glucopsychosine)(IS) (濃度125 ng/mL)。添加1 mL甲醇並將混合物音波處理大約10分鐘。添加500 μL 1N HCl，渦旋，然後音波處理大約10分鐘。然後將混合物在室溫下震盪大約30分鐘。將樣品在4,000 rpm下在室溫下離心10分鐘。將上清液轉移至預調節之SPE筒上。
藉由用1ml甲醇及1ml Millipore水調節SPE筒來製備固體樣品。將樣品加載於SPE筒上。將筒用2 mL 0.1N HCl且然後2 mL MEOH洗滌。將樣品用2 mL甲醇中之5%氫氧化銨溶析至清潔的矽烷化玻璃中。將樣品在氮下在40℃下蒸發至乾燥。將25 µL DMSO添加至每一提取物中並渦旋。添加125 μL (運行03使用175 µL)移動相B並渦旋。將樣品轉移至玻璃小瓶中。將10 µl注射於分析柱上。
培養來自法布瑞氏病患者之纖維母細胞並接種於6孔板中。使用利用野生型α-GAL處理之細胞作為陽性對照用於攝取及隨後酶研究。將纖維母細胞與野生型α-GAL、M51C-G360C α-GAL或D233C-I359C α-GAL一起培育16至18小時。然後使細胞溶解用於α-GAL酶分析，如藉由螢光輸出所測定。圖 4A 顯示M51C-G360C與D233C-I359C α-GAL能夠至少與野生型α-GAL一樣恢復α-GAL酶活性。參見圖 4B 。 球三糖神經鞘胺醇(lyso-Gb3)係法布瑞氏病之生物標記。法布瑞氏病之成功治療導致lyso-Gb3之顯著減少，如由LC-MS/MS所測定。實例 5 ： FB-14 (R301Q) 法布瑞氏患者纖維母細胞中之變體同二聚體攝取
將法布瑞氏患者纖維母細胞接種於6孔板中用於法布瑞酶及α-GAL細胞攝取研究。將細胞在37℃、5% CO2 培育器中在含有7nM法布瑞酶、野生型α-GAL、M51C-G360C α-GAL或D233C-I359C α-GAL之攝取培養基中培育16小時。在第1天，將細胞洗滌並進一步在正規生長培養基中再維持5天。在圖 5 中所指示之時間點收穫細胞。使用細胞溶解產物測定酶活性。測定α-GAL酶活性並利用細胞溶解產物蛋白質濃度正規化為nmol/mg蛋白質/hr。經測定，變體同二聚體在細胞攝取後在細胞內部之半衰期係野生型的2-3倍及法布瑞酶的3-4倍(圖5 )。實例 6 ：小鼠模型中之法布瑞氏病基因療法
將AAV載體稀釋於無菌PBS中。AAV載體包括：AAVhu68.CB7.hGLAnatural.rBG、AAVhu68.CB7.hGLAco.rBG及AAVhu68.CB7.hGLA-M51C-G360Cco.rBG。
載體產生
將參考GLA序列及在位置51甲硫胺酸至半胱胺酸且在位置360甘胺酸至半胱胺酸之變體反向轉譯且核苷酸序列經密碼子最佳化以利用表現盒在CB7啟動子下生成用於AAV生產之順式-質體。另外，將天然hGLA (參照序列) cDNA進行排序並選殖於相同AAV-順式主鏈中以與密碼子-最佳化序列相當。產生AAVhu68載體併入先前所述進行滴定(Lock, Alvira等人 2010, 「Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.」 Hum Gene Ther 21(10): 1259-1271)。簡言之，將HEK293細胞三重轉染並收穫培養上清液，濃縮並利用碘克沙醇(iodixanol)梯度純化。如先前所述，使用靶向兔β-球蛋白polyA序列之引子藉由液滴數位PCR滴定經純化載體(Lock M、R. Alvira、S. J. Chen及J. M. Wilson, 「Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.」 Hum Gene Ther Methods 25(2): 115-125 (2014))。
動物
以C57BL/6/129背景建立者(background founder)之小鼠(Gla剔除之法布瑞小鼠)係在Jackson Labs購買(庫存編號003535 –亦稱為「α-Gal A KO小鼠」)。將種畜群維持在經基因療法計畫AAALAC認可的隔離小鼠設施中，利用異型合子與異型合子交配方式，以便在同一窩內產生無效空白對照及WT對照。Gla剔除小鼠廣泛地用於法布瑞氏病模型。
小鼠看起來在臨床上係正常的，但其展現GLA受質球三糖神經鞘胺醇(aka lyso-GB3)在血漿中及球三糖神經醯胺(aka GL3、GB3)在肝、心臟、腎、皮膚、小腸及大腸及中樞神經系統中之逐漸累積。小規模、可再生表型及有效繁殖允許快速研究，該等研究對於臨床前候選者之活體內篩選係最佳的。
將動物容納室維持在64-79°F (18-26℃)之溫度範圍內以及30-70%之濕度範圍內。將動物與其父母及同窩出生仔畜一起飼養直至斷乳，且然後在轉化研究實驗室(Translational Research Laboratories, TRL) GTP飼養箱中以2至5隻動物/籠之標準籠飼進行飼養。將籠、水瓶及墊料基材經高壓滅菌放入隔離設施中。維持自動控制之12-小時明/暗循環。每一黑暗期開始於1900小時(± 30分鐘)。隨意提供食物(Purina, LabDiet®, 5053, Irradiated, PicoLab®, 齧齒類動物飼料20, 25lb)。所有動物均可經由每一飼養籠中個別放置之水瓶隨意飲水。
活體內研究及組織學
小鼠經由側尾靜脈接受0.1 mL 5x1011 GC (大約2.5x1013 GC/kg) AAVhu68.CB7.hGLA (各種hGLA構築體)，在載體給藥後第7天及第21天採血用於血清分離，並最後採血(用於血漿分離)，並在注射後28天藉由放血安樂死。立即自大腦開始收集組織。
將用於組織學之組織經福馬林(formalin)固定，並用標準方法包埋石蠟。將具有DRG之脊髓(在骨骼中)固定於ZF中，在EDTA中脫鈣，並根據GTP Morphology Core之標準程序進行處理。使用鋅-福馬林以獲得良好的組織保藏，並藉由IHC及形態學(H&E)對Gb3儲存進行染色。
在經福馬林固定石蠟包埋之樣品上實施GL3之免疫染色。將切片去石蠟，用於PBS + 0.2% Triton中之1%驢血清封阻15分鐘，且然後依序與稀釋於封阻緩衝液中之一級抗體(Amsbio AMS.A2506, 抗Gb3單株抗體)及生物素化二級抗體一起培育；使用基於HRP之比色反應檢測信號。由國際認證之獸醫病理學家以盲化方式審查幻燈片。
法布瑞-/-小鼠媒劑PBS對照展現顯著GL3 (IHC染色切片上之深色染色)累積。WT小鼠及所有載體治療之小鼠幾乎完全清除GL3儲存(圖6 )。
GLA活性
將血漿或均質組織之上清液與6 mM 4-MU-α-吡喃半乳糖苷pH 4.6、90mM GalNAc混合並在37℃下培育3小時。利用0.4 M甘胺酸pH 10.8停止反應。使用Victor3螢光計(激發波長 355 nm及發射波長460 nm)量測相對螢光單位RFU。藉由內插自4-MU之標準曲線計算以nmol/mL/hr計之活性。針對勻漿上清液中之總蛋白質含量將個別組織樣品中之活性量正規化。相同體積用於血漿樣品。
法布瑞-/-小鼠展現α-Gal A活性之完全缺乏。用AAVhu68.CB7.hGLA-M51C-G360Cco.rBG GTx載體治療法布瑞小鼠使得腎中之GLA活性係野生型的7倍以上(圖7 )。
藉由LC-MS/MS量化球三糖神經醯胺(aka GL3、GB3)
藉由LC-MS/MS分析量化組織均漿中之GLA受質GL3。簡言之，將內標準品添加至均漿樣品(50 µL)並使用基於C18之固相萃取(SPE)處理樣品。自含有12種神經醯胺形式之儲積液製備已知濃度之GL3 (8.83 nM至4.41 µM)之標準曲線。將來自所有12種同種型之監測反應求和，並在該分析中產生相對於內標準品之比率。然後將研究樣品之所得比率與製備之曲線進行比較用於GL3量化。
法布瑞-/-小鼠展現＞ 10-倍GLA受質球三糖神經醯胺(GL3)之累積。用AAVhu68.CB7.hGLA-M51C-G360Cco.rBG GTx載體治療之法布瑞小鼠使得腎中之GL3完全降低至野生型量(圖8 )。
藉由LC-MS/MS量化球三糖神經鞘胺醇(aka lyso-GB3)
藉由LC-MS/MS分析量化血漿中之GLA受質lyso-GB3。簡言之，將穩定C13-標記之內標準品添加至血漿樣品(50 µL)並使用C18/陽離子交換混合模式固相萃取(SPE)處理樣品。製備已知濃度之lyso-GB3 (0.254 nM至254 nM)之標準曲線並然後將研究樣品之lyso-GB3反應與製備之曲線進行比較用於lyso-GB3量化。
藉由LC/MS之GLA特徵肽
使血漿於100%甲醇中沈澱並離心。丟棄上清液。球粒加入hGLA特有的穩定同位素標記肽作為內標準品並用胰蛋白酶重新懸浮並在37℃下培育2小時。利用10%甲酸停止消化。藉由C-18反相層析分離肽並藉由ESI-質譜術來鑑別並量化。根據特徵肽濃度計算血漿中之總GLA濃度。
細胞表面受體結合分析
將96孔板用受體塗佈，洗滌並用BSA封阻。將含有等活性之rhGLA或工程化GLA之CHO培養條件培養基或血漿連續稀釋3倍，以獲得一系列9個遞減濃度並與共偶聯受體一起培育。培育後，將板洗滌以去除任何未結合GLA並添加4-MU-α-吡喃半乳糖苷，在37℃下持續1小時。利用1.0 M甘胺酸pH 10.5停止反應，並藉由Spectramax螢光計；激發波長 370，發射波長460讀取RFU。藉由內插自4-MU之標準曲線將每一樣品之RFU轉換為以nmol/mL/hr計之活性。使用GraphPad Prism實施非線性回歸。實例 7 ：穩定化之 PPT-1 構築體
基於晶體結構(PDB ID 3GRO)對穩定化之PPT-1構築體進行工程化。該兩個半胱胺酸預計形成雙硫鍵，其穩定結構且發現延長酶功能之半衰期(參見以下數據)。發現此構築體在HEG 293中之表現含量接近野生型PPT-1之表現量。
PPT-1酶之經改良穩定性及半衰期
將分子內雙硫橋工程化於PPT-1中以穩定該酶，如藉由量測活性酶之半衰期所測定。選擇突變之殘基A171C/A183C，此乃因同源蛋白質PPT-2中之等效殘基形成雙硫橋。同源蛋白質之此自然變異用於報告PPT-1中之工程化成效。
構築體PPT-1之穩定性測試
將構築體PPT-1瞬時表現於HEK 293T細胞中並在轉染後5天收穫條件培養基。對野生型PPT1實施相同操作。經48或72小時之時期對兩組條件培養基實施酶活性分析。測定隨時間流逝保留之酶活性的量，以便將半胱胺酸雙突變體與WT進行比較(圖9 )。
半衰期以代表α及β相之兩種方式來估計，此乃因活性似乎係雙相消除的(參見以下毗鄰PK表之log圖)。α半衰期係在早期末端或分佈相期間估計，β半衰期係在末端消除相估計。對於ATB200總GAA蛋白分析，經常報告有α相，此乃因其對於證實AT2221在血液中分佈至組織期間對ATB200之結合及穩定具有較重要的意義。
報告構築體PPT-1之藥物動力學，包括C0 及AUC。AUCinfinity 係源自用於估計β半衰期之相同消除速率常數。
表 9 ： PPT-1 藥物動力學 (5 天平均 )
構築體 C0 AUC0-t AUC0- ∞ t½α t½β
野生型 1.46 15.9 21.0 1.7 23.1
Cys-突變體 3.40 65.6 80.3 2.8 28.2
儘管本文中已顯示並闡述了本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，該等實施例僅作為實例提供。熟習此項技術者現將構想出多種變化、改變及取代而不背離本發明。應瞭解，可採用本文所述實施例之各種替代形式。以下申請專利範圍意欲界定本發明範圍並由此覆蓋該等申請專利範圍及其等效形式範圍內之方法及結構。
參閱陳述其中利用本發明原理之說明性實施例的以下詳細說明及附圖將瞭解本發明之特徵及優點，在附圖中：
圖1A 及圖 1B 顯示α-半乳糖苷酶A (α-GAL)之結構及胺基酸取代之建議位點。
圖2A 顯示經修飾α-GAL二聚體形成。
圖2B 顯示經修飾α-GAL酶活性。
圖3A 顯示α-GAL在pH 4.6及pH 7.4下經24小時之穩定性。
圖3B 顯示α-GAL在pH 4.6及pH 7.4下經7天之穩定性。
圖4A 顯示法布瑞氏患者纖維母細胞之經修飾α-GAL之攝取及酶活性。
圖4B 顯示法布瑞氏患者纖維母細胞中球三糖神經鞘胺醇(globotriaosylsphingosine)(lyso-Gb3 )之減少。
圖5 顯示法布瑞氏病細胞中兩個α-GAL雙硫鍵二聚體之增強半衰期活性。
圖6 顯示在利用及不利用經修飾α-GAL基因療法治療之野生型小鼠及GLA剔除小鼠中之GB3受質組織學。
圖7 顯示在利用及不利用經修飾α-GAL基因療法治療之野生型小鼠及GLA剔除小鼠中之GLA酶活性。
圖8 顯示在利用及不利用經修飾α-GAL基因療法治療之野生型小鼠及GLA剔除小鼠中在腎組織溶解產物中所量測之GB3受質。
圖9 顯示棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT-1)野生型對構築體PPT-1突變體之酶活性隨時間之WinNonlin分析。
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Claims (59)

  1. 一種包含核酸構築體之基因療法載體，該核酸構築體含有編碼用於治療遺傳病症之穩定化形式蛋白質之核酸，該穩定化之形式包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，該等殘基在該蛋白質內之非天然半胱胺酸之間或在該蛋白質之兩個單體之非天然半胱胺酸之間形成雙硫橋。
  2. 如請求項1之基因療法載體，其中該蛋白質係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖腦苷酶、葡萄糖腦苷酶、溶酶體酸脂酶、醣胺聚醣α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙醯基-α-胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、醣胺聚醣N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、α-葡萄糖苷酶、三肽基肽酶1 (TPP1)、棕櫚醯基蛋白質硫酯酶(PPT)、神經性類蠟脂褐質病4型、神經性類蠟脂褐質病10型(細胞自溶酶D)、神經性類蠟脂褐質病11型(顆粒蛋白前體)、神經性類蠟脂褐質病13型(細胞自溶酶F)、神經性類蠟脂褐質病14型(KCTD7)、神經性類蠟脂褐質病15型(TBCK)及週期蛋白依賴型激酶樣5。
  3. 如請求項1之基因療法載體，其中該穩定化之蛋白質包含溶酶體酶。
  4. 如請求項1之基因療法載體，其中該穩定化之蛋白質包含穩定化之α-半乳糖苷酶(α-GAL)蛋白質。
  5. 如請求項4之基因療法載體，其中該穩定化之α-半乳糖苷酶A (α-GAL)蛋白質包含一或多個選自由以下組成之群之非天然半胱胺酸殘基：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。
  6. 如請求項1之基因療法載體，其中該穩定化之蛋白質包含穩定化之棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)。
  7. 如請求項6之基因療法載體，其中該穩定化之PPT1蛋白質包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。
  8. 如請求項1至7中任一項之基因療法載體，其中與沒有該等非天然半胱胺酸之相應蛋白質相比，該穩定化之蛋白質在pH 7.4下具有更長半衰期。
  9. 如請求項1之基因療法載體，其中該穩定化之蛋白質可替代該遺傳病症中有缺陷或缺失之蛋白質。
  10. 如請求項1之基因療法載體，其中該穩定化之蛋白質可減少或減緩與該遺傳病症相關之一或多個症狀。
  11. 如請求項1之基因療法載體，其中與未穩定化之蛋白質相比，該穩定化之蛋白質在減少或減緩該遺傳病症之一或多個症狀方面更有效。
  12. 如請求項1之基因療法載體，其中該遺傳病症係神經病症。
  13. 如請求項1之基因療法載體，其中該遺傳病症係胞溶體貯積症。
  14. 如請求項1之基因療法載體，其中該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病(Batten disease)、胱胺酸病、法布瑞氏病(Fabry disease)、高歇氏病I型(Gaucher disease type I)、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病(Pompe disease)、泰-薩二氏症(Tay Sachs disease)、山多夫氏病(Sandhoff disease)、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病(Hurler disease)、韓特氏症(Hunter disease)、聖菲利柏氏病A型(Sanfilippo disease type A)、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型(Morquio disease type A)、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症(Maroteaux-Lamy disease)、沙利氏病(Sly disease)、尼曼匹克症A型(Niemann-Pick disease type A)、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型(Schindler disease type I)、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、嬰兒、青少年及成年形式之神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。
  15. 如請求項1之基因療法載體，其中該基因療法載體係選自由以下組成之群之病毒載體：腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及疱疹病毒載體。
  16. 如請求項1之基因療法載體，其中該核酸構築體包含在病毒載體基因體中。
  17. 如請求項16之基因療法載體，其中該病毒載體基因體包含重組AAV (rAAV)基因體。
  18. 如請求項16之基因療法載體，其中rAAV基因體包含自補基因體。
  19. 如請求項16之基因療法載體，其中rAAV基因體包含單鏈基因體。
  20. 如請求項16之基因療法載體，其中rAAV基因體包含第一反向末端重複序列及第二反向末端重複序列。
  21. 如請求項20之基因療法載體，其中該AAV反向末端重複序列係AAV2反向末端重複序列。
  22. 如請求項16之基因療法載體，其中rAAV基因體進一步包含SV40內含子。
  23. 如請求項16之基因療法載體，其中rAAV基因體進一步包含多腺苷酸化序列。
  24. 如請求項16之基因療法載體，其中該構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 7至12中之一者至少85%一致。
  25. 如請求項16之基因療法載體，其中該構築體進一步包含編碼α-GAL蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 8至12中之一者的序列。
  26. 如請求項16之基因療法載體，其中該構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 15至16中之一者至少85%一致。
  27. 如請求項16之基因療法載體，其中該構築體進一步包含編碼PPT1蛋白質之核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO: 16之序列。
  28. 如請求項16之基因療法載體，其中該構築體進一步包含啟動子序列。
  29. 如請求項28之基因療法載體，其中該啟動子係組成型啟動子。
  30. 如請求項28之基因療法載體，其中該啟動子係組織特異性啟動子。
  31. 如請求項16之基因療法載體，其中該構築體進一步包含一或多個選自由以下組成之群之核酸序列：Kozak序列、CrPV IRES、編碼連接體之核酸序列、編碼信號序列之核酸序列及編碼IGF2肽之核酸序列。
  32. 如請求項1之基因療法載體，其中該構築體囊封於病毒殼內。
  33. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至32中任一項之基因療法載體及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  34. 如請求項33之醫藥組合物，其中該賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
  35. 一種治療受試者中遺傳病症之方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量之如請求項1至43中任一項之基因療法載體或如請求項33至34中任一項之醫藥組合物給予需要的受試者。
  36. 如請求項35之方法，其中該基因療法載體或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內或靜脈內注射或其組合進行遞送。
  37. 如請求項35之方法，其中該基因療法載體或醫藥組合物減少或減緩該受試者之該遺傳病症的一或多個症狀。
  38. 如請求項35之方法，其中該遺傳病症係胞溶體貯積症。
  39. 如請求項35之方法，其中該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯基葡萄糖胺尿症、巴登氏病、胱胺酸病、法布瑞氏病、高歇氏病I型、高歇氏病II型、高歇氏病III型、龐貝氏病、泰-薩二氏症、山多夫氏病、異染性腦白質失養症、黏脂貯積病I型、黏脂貯積病II型、黏脂貯積病III型、黏脂貯積病IV型、賀勒氏疾病、韓特氏症、聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、聖菲利柏氏病D型、莫奎歐氏病A型、莫奎歐氏病B型、馬-拉二氏症、沙利氏病、尼曼匹克症A型、尼曼匹克症B型、尼曼匹克症C1型、尼曼匹克症C2型、辛德勒病I型、辛德勒病II型、腺苷去胺酶嚴重聯合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽腫疾病(CGD)、神經性類蠟脂褐質病及CDKL5缺乏症。
  40. 一種穩定化之人類α-半乳糖苷酶A (α-GAL)二聚體，其包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基形成至少一個連接該α-GAL二聚體之第一亞單元與第二亞單元之分子間雙硫鍵。
  41. 如請求項40之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基係選自由以下組成之群：(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。
  42. 如請求項40或41之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含D233C及I359C。
  43. 如請求項40至42中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含M51C及G360C。
  44. 如請求項40至43中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基包含(i) D233C及I359C；及(ii) M51C及G360C。
  45. 如請求項40至44中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 1至6中之一者至少90%一致之序列。
  46. 如請求項40至45中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該多肽係由與SEQ ID NO: 7至12中之一者至少85%一致之核酸編碼。
  47. 如請求項40至46中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該多肽與野生型α-GAL多肽相比在pH 7.4下顯示經增加之半衰期。
  48. 如請求項40至47中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體，其中該多肽進一步包含變體IGF2 (vIGF2)肽。
  49. 一種醫藥組合物，其包含如請求項40至48中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  50. 如請求項49之醫藥組合物，其中該賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
  51. 一種治療受試者中法布瑞氏病之方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量之如請求項40至48中任一項之穩定化之人類α-GAL二聚體或如請求項49至50中任一項之醫藥組合物給予需要的受試者。
  52. 如請求項51之方法，其中該穩定化之人類α-GAL二聚體或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內、皮下、肌內、經眼、靜脈內注射或其組合進行遞送。
  53. 如請求項51之方法，其中該穩定化之人類α-GAL二聚體或醫藥組合物減少或減緩該受試者中該法布瑞氏病之一或多個症狀。
  54. 一種穩定化之人類棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)分子，其包含一或多個非天然半胱胺酸殘基，其中該一或多個非天然半胱胺酸殘基在該PPT1分子內形成至少一個分子內雙硫鍵。
  55. 如請求項54之穩定化之PPT1蛋白質，其包含非天然半胱胺酸殘基A171C及A183C。
  56. 一種醫藥組合物，其包含如請求項54至55中任一項之穩定化之人類PPT1及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
  57. 如請求項56之醫藥組合物，其中該賦形劑係選自由以下組成之群：鹽水、馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、碳酸氫鈉、磷酸鈉、組胺酸、甘胺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、水、右旋糖、N-甲基吡咯啶酮、二甲亞碸、N,N-二甲基乙醯胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二乙二醇單乙基醚及表面活性劑聚氧乙烯-山梨醇酐單油酸酯。
  58. 一種治療受試者中CLN1疾病之方法，該方法包含向該受試者投與治療有效量之如請求項54至55中任一項之穩定化之人類PPT1或如請求項56至57中任一項之醫藥組合物給予需要的受試者。
  59. 如請求項58之方法，其中該經修飾人類PPT1或醫藥組合物係藉由鞘內、腦室內、腦實質內、皮下、肌內、經眼、靜脈內注射或其組合進行遞送。
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