JP2022538497A - ライソゾーム蓄積症を処置するためのベクター組成物およびそれを使用する方法 - Google Patents

ライソゾーム蓄積症を処置するためのベクター組成物およびそれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置または予防するためのバイシストロニックベクターを使用する組成物および方法が本明細書で提供される。開示される組成物は、プロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックベクターを含む。本方法は、対象に、本明細書に開示されるバイシストロニックベクターを含む医薬組成物を投与するステップを含む。

Description

関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年７月２日出願の仮出願ＵＳＳＮ６２／８６９，７８１および２０１９年７月２日出願のＵＳＳＮ６２／８６９，８０８の利益を主張するものである。
配列表の組み込み
２０２０年７月１日に作成されたサイズが６１１ＫＢである「Ｍ６ＰＴ－００２／０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
開示される開示は、ライソゾーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するための組成物および方法に関する。より詳細には、開示される開示は、改善された遺伝子治療および改善された酵素補充療法（ＥＲＴ）を使用してライソゾーム障害を処置する分野に関する。
背景
ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）は、ライソゾーム機能の欠陥に起因する遺伝性代謝障害に関する。現在、約５０種の別個のＬＳＤが同定されているが、処置が報告されているのはこれらのうちの少数（１０種未満）である。したがって、ＬＳＤに対する安全かつ有効な処置に関するまだ対処されていない必要性が当技術分野において存在する。本開示は、このまだ対処されていない必要性に対して酵素補充療法（ＥＲＴ）または遺伝子治療のいずれかによる２つの解決法を提供する。
要旨
本開示は、プロモーター、ライソゾーム酵素をコードする第１のポリヌクレオチド配列および改変Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ、ＰＴａｓｅ）をコードする第２のポリヌクレオチド配列をコードする配列を含むベクターを含む組成物であって、プロモーターが、哺乳動物細胞における発現を駆動することができ、プロモーターが、第１のポリヌクレオチドと、および第２のポリヌクレオチドと作動可能に連結している、組成物を提供する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＲＥＳをコードする配列はライソゾーム酵素をコードする配列と改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードする配列の間に位置付けられている。一部の実施形態では、ベクターは、５’から３’までに、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードする配列、ＩＲＥＳをコードする配列、およびライソゾーム酵素をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、５’から３’までに、ライソゾーム酵素をコードする配列、ＩＲＥＳをコードする配列、および改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードする配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、切断部位をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、切断部位は、２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一部の実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは送達ベクターである。一部の実施形態では、送達ベクターはウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは非ウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ミセル、ポリマーソーム、ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、またはエキソソームを含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ミセル、ポリマーソーム、ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、またはエキソソームを含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型のうちの１つまたは複数から単離されたまたはそれに由来するカプシドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型のうちの１つまたは複数から単離されたまたはそれに由来する少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）をコードする配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターはバイシストロニックベクターである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターはマルチシストロニックベクターである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターは、遍在するプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、哺乳動物細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒト細胞における発現を駆動することができるものである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、哺乳動物細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒト細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、これだけに限定されないが、ニューロンまたはグリア細胞を含めた神経系細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、これだけに限定されないが、平滑筋細胞、横紋筋細胞または心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）を含めた筋肉細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、肺細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、骨細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、これだけに限定されないが、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、その前駆体または造血幹細胞を含めた血液細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、これだけに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージを含めた免疫細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、脾臓または膵臓の細胞における発現を駆動することができるものである。一部の実施形態では、プロモーターは、腎臓の細胞における発現を駆動することができるものである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターはヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）プロモーターである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターはＣＢｈプロモーターである。一部の実施形態では、ＣＢｈプロモーターは、改変ニワトリβ－アクチンプロモーターと融合したＣＭＶ初期エンハンサーを含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターはＣＥＦまたはｈＣＥＦＩプロモーターである。一部の実施形態では、ｈＣＥＦＩプロモーターはヒトＥＦ１ａプロモーターと作動可能に連結したヒトＣＭＶエンハンサーを含む。一部の実施形態では、ｈＣＥＦＩプロモーターは配列番号１６１の配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターを含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは配列番号１の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドは配列番号４の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム酵素を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、β－グルコセレブロシダーゼ（glucocebrosidase）（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ、ＧＢＡ遺伝子によってコードされる）、ガラクトシルセラミダーゼ（Galactosylceramidase）（ＧＡＬＣ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ遺伝子によってコードされる）、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）およびライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素はβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号５の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素はガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号２３の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素はα－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号７の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素はα－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号８の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号９の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素はライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号１０の核酸配列を含む。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を有効量で投与するステップを含み、組成物によりＬＳＤの原因であるライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、それにより、前記ＬＳＤが処置される、方法を提供する。本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を有効量で投与するステップを含み、組成物によりＬＳＤの原因であるライソゾーム酵素のＮ結合オリゴ糖リン酸化が増加し、それにより、ＬＳＤが処置される、方法を提供する。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの徴候または症状を示している。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの診断を受けている。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の出現または発症を予防する方法であって、対象に本開示の組成物を有効量で投与するステップを含み、組成物によりＬＳＤの原因であるライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、それにより、対象におけるＬＳＤの出現が予防される、方法を提供する。一部の実施形態では、対象はＬＳＤが出現または発症するリスクを有する。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの徴候または症状を示している。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の原因であるライソゾーム酵素のリン酸化を改善する方法であって、対象に本開示の組成物を有効量で投与するステップを含み、組成物によりライソゾーム酵素のリン酸化が増加する、方法を提供する。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの徴候または症状を示している。一部の実施形態では、対象はＬＳＤが出現または発症するリスクを有する。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの診断を受けている。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の原因であるライソゾーム酵素のリン酸化を改善する方法であって、細胞に本開示の組成物を有効量で接触させるステップを含み、組成物によりライソゾーム酵素のリン酸化が増加する、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、対象は細胞を含む。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの徴候または症状を示している。一部の実施形態では、対象はＬＳＤが出現または発症するリスクを有する。一部の実施形態では、対象はＬＳＤの診断を受けている。
本開示の方法の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する。
本開示の方法の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つである。
本開示の方法の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）およびライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）のうちの１つまたは複数を含む。
本開示の方法の一部の実施形態では、投与するステップは、全身投与経路を含む。一部の実施形態では、全身投与経路は、経腸、非経口、経口、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、脊髄内、脳室内、くも膜下腔内、脳室内である。
本開示の方法の一部の実施形態では、投与するステップは、局所投与経路を含む。
本開示の方法の一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は男性である。一部の実施形態では、対象は女性である。
本開示を例示する目的で、本開示のある特定の実施形態を図に示す。しかし、本開示は図に示されている実施形態の正確な取り合わせおよび手段に限定されない。
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供されるであろう。
図１Ａ～１Ｃは、Ｓ１－Ｓ３バイシストロニックベクターを示す一連の図およびグラフである。図１Ａ：ＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３ベクター。図１Ｂ：ｐＬＬ０１：ｐＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｓ１Ｓ３ベクター。図１Ｃ：ＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３およびｐＬＬ０１の発現のレベルを例示するグラフ（ＣＰＭ：カウント／分）。
図２Ａ～２Ｃは、Ｓ１－Ｓ３バイシストロニックベクターにおけるＧＢＡバイシストロニック発現プラスミドの生成を示す一連の図およびヒストグラムである。図２Ａ：ｐＬＬ１１：ｐＣＭＶ－ｈＧＢＡ－ＩＲＥＳ－Ｓ１Ｓ３ベクター。図２Ｂ：条件培地でのＧＢＡ活性。図１Ｃ：ＰＴａｓｅ活性のパーセントを例示するヒストグラム。
図３Ａ～３Ｃは、バイシストロニック発現によりＧＢＡ酵素のリン酸化が増加することを示す一連のグラフおよびヒストグラムである。
図４Ａ～４Ｄは、バイシストロニック発現によりＧＡＡ酵素のリン酸化が増加することを示す一連の図、グラフおよびヒストグラムである。
図５Ａ～５Ｄは、バイシストロニック発現によりＧＡＬＣ酵素のリン酸化が増加することを示す一連の図、グラフおよびヒストグラムである。
図６Ａ～６Ｄは、バイシストロニック発現によりＮＡＧＬＵ酵素のリン酸化が増加することを示す一連の図、グラフおよびヒストグラムである。
図７Ａ～７Ｄは、バイシストロニック発現によりＧＬＡ酵素のリン酸化が増加することを示す一連の図、グラフおよびヒストグラムである。
図８Ａ～８Ｄは、バイシストロニック発現によりＬＡＭＡＮ酵素のリン酸化が増加することを示す一連の図、グラフおよびヒストグラムである。
図９Ａ～９Ｅは、ゴーシェ病の処置において、本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターによりＧＢＡ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合およびその細胞取り込みが有意に増加することを実証する一連のグラフである（Ａ～Ｃ）。パネルＤおよびＥは、ＧＢＡ酵素における単一の点突然変異によりその安定性が増大するが、ＣＩ－ＭＰＲに対する結合性は影響を受けないことを実証する。
図１０Ａ～１０Ｃは、ポンペ病の処置において、本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターによりＧＡＡ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合およびその細胞取り込みが有意に増加することを実証する一連のグラフである。
図１１Ａ～１１Ｃは、クラッベ病の処置において、本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターによりＧＡＬＣ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合およびその細胞取り込みが有意に増加することを実証する一連のグラフである。
図１２Ａ～１２Ｃは、ＭＰＳ ＩＩＩＢ疾患の処置において、本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターによりＮＡＧＬＵ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合およびその細胞取り込みが有意に増加することを実証する一連のグラフである。
図１３Ａ～１３Ｃは、ファブリー病の処置において、本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターによりＧＬＡ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合およびその細胞取り込みが有意に増加することを実証する一連のグラフである。
図１４Ａ～１４Ｃは、α－マンノシドーシスの処置において、本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターによりＬＡＭＡＮ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合およびその細胞取り込みが有意に増加することを実証する一連のグラフである。
図１５Ａ～１５Ｂは、ＡＡＶ９ベクターによって送達された本開示のＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅバイシストロニックベクターをムコリピドーシス疾患の処置において遺伝子治療として使用することができることを実証する概略図およびグラフである。
図１６Ａ～１６Ｂは、２０週齢のＧａｕｃｈｅｒＤ４０９Ｖ／ヌルマウスの肝臓、肺および脾臓において観察されたグルコシルセラミドレベルの上昇を示すグラフの対である。ＧＢＡの天然の基質であるグルコセレブロシドの蓄積を組織ホモジネートにおいて決定した。肺内のＧＣの蓄積は統計学的にかつ治療的に価値のある結果であり、これは、現行の標準治療薬に関する公知のまだ対処されていない必要性である。２０μＬの一定分量の組織ホモジネートおよび妥当な対照から、グルコシルセラミドを、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）２００μＬを添加し、８００ｒｐｍで５分間混合し、その後、４℃、３２２０ｇで１５分間遠心分離することによって抽出した；３）。上清５０μＬを回収し、窒素を用いて乾燥させ、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）中に再懸濁させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために直接注入した。
図１７Ａ～１７Ｃは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいてＧＣａｓｅＭ６Ｐがイミグルセラーゼと比較して長い半減期および大きな組織内取り込みを有することを実証する一連のグラフである。Ｇａｕｃｈｅｒ Ｄ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおけるＰＫ／ＰＤ試験を、標準治療薬であるイミグルセラーゼと、Ｅｘｐｉ２９３細胞においてＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅおよびＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用して一過性に同時発現させることによって産生させた精製ＧＢＡとを使用して実施した。このＧＣａｓｅのバリアントは中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きい。簡単に述べると、動物３匹に約１．５ｍｇ／ｋｇの組換えＧＣａｓｅを尾静脈注射した。血清（ｓｅｒｕｍ）中薬物動態データに関しては、血漿試料を２分、１０分、２０分、４０分および６０分の時点で採取した。合成基質である４－メチルウンベリフェリル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（４ＭＵ－Ｇｌｃ）を使用して活性を測定した。２分時点を１００％の活性として設定し、その後の時点をｔ＝２分時点に対するパーセントとすることにより、個々の動物における活性を正規化した。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅの存在下で発現された安定化されたＧＣａｓｅはより長い半減期を有すると思われる。このより長い半減期は、当該酵素がより大きな安定性を有することと、クリアランス経路が異なることの組合せである。ＧＣａｓｅがどのくらい組織に取り込まれたかを決定するために、酵素注射の２時間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｇｌｃ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。妥当なリン酸化を伴う安定したＧＣａｓｅの真の利点は示されている組織内取り込みのデータにおいて認められる。評価した全ての組織について、バイシストロニックＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅベクタープラットフォームＳ１’Ｓ３ ＰＴａｓｅを利用して発現させた安定化されたＧＣａｓｅに関してより大きな活性が見いだされる。これは、イミグルセラーゼの活性がわずかである肺、筋肉および脳において最も劇的である。組織中のデータと血清中のデータを総合すると、より多くの酵素を患部組織に送達することに関して、より多くのＮ結合オリゴ糖リン酸化を伴うより安定なＧＣａｓｅの利点が明らかである。これは、有意な量のＧＣａｓｅが肺、筋肉および心臓にこれらの用量で送達された最初のことである。
図１８Ａ～１８Ｅは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好に組織マクロファージを減少させた（抗ＣＤ６８染色）ことを実証する一連の写真および棒グラフである。Ｄ４０９Ｖ Ｇａｕｃｈｅｒマウスモデルにおける有効性試験を、標準治療薬であるＣｅｒｅｚｙｍｅと、Ｓ１Ｓ３ ＰＴａｓｅおよび中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きいことが報告されているＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用してＥｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた精製ＧＢＡ（Ｍ０１１１）とを使用して実施した。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。４週間後、ＣＤ６８抗体を用いた免疫組織化学的検査のために、肝臓および肺の組織を収集し、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に固定した。ＣＤ６８ Ａｂによって可視化された患部組織中のマクロファージの減少によって証明される通り、Ｍ０１１１は現行の標準治療薬と比較して大きな有効性を有する。 図１８Ａ～１８Ｅは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好に組織マクロファージを減少させた（抗ＣＤ６８染色）ことを実証する一連の写真および棒グラフである。Ｄ４０９Ｖ Ｇａｕｃｈｅｒマウスモデルにおける有効性試験を、標準治療薬であるＣｅｒｅｚｙｍｅと、Ｓ１Ｓ３ ＰＴａｓｅおよび中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きいことが報告されているＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用してＥｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた精製ＧＢＡ（Ｍ０１１１）とを使用して実施した。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。４週間後、ＣＤ６８抗体を用いた免疫組織化学的検査のために、肝臓および肺の組織を収集し、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に固定した。ＣＤ６８ Ａｂによって可視化された患部組織中のマクロファージの減少によって証明される通り、Ｍ０１１１は現行の標準治療薬と比較して大きな有効性を有する。
図１９Ａ～１９Ｃは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好にＧａｕｃｈｅｒ貯蔵細胞の数およびサイズを減少させたことを実証する一連の写真である（ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）。Ｄ４０９Ａ Ｇａｕｃｈｅｒマウスモデルにおける有効性試験を、標準治療薬であるＣｅｒｅｚｙｍｅと、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅおよび中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きいことが報告されているＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用してＥｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた精製ＧＢＡとを使用して実施した。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。４週間後、肝臓および肺の組織を収集し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためのホルマリン処理のために４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に固定した。Ｈ＆Ｅ染色によって可視化された患部組織内の貯蔵細胞の減少によって証明される通り、ＧＣａｓｅＭ６Ｐは現行の標準治療薬と比較して大きな有効性を有する。
図２０Ａ～２０Ｂは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好に蓄積した基質を減少させたことを実証するグラフの対である。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを、約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。グリコシルセラミド分析のために組織試料を採取し、ホモジナイズした。ＧＣａｓｅの天然の基質であるグルコセレブロシドの蓄積を組織ホモジネートにおいて決定した。肺内のＧＣの蓄積は現行の標準治療薬に関する公知のまだ対処されていない必要性であり、大きな価値がある。２０μＬの一定分量の組織ホモジネートおよび妥当な対照から、グルコシルセラミドを、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）２００μＬを添加し、８００ｒｐｍで５分間混合し、その後、４℃、３２２０ｇで１５分間遠心分離することによって抽出した；３）。上清５０μＬを回収し、窒素を用いて乾燥させ、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）中に再懸濁させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために直接注入した。測定した２種のセラミドに関して、ＧＣａｓｅＭ６Ｐで処置した動物はＥＲＴ療法後にイミグルセラーゼよりも低いレベルを有した。
図２１Ａ～２１Ｄは、ゴーシェ病を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＡＶ媒介性遺伝子治療試験の結果を示す一連のグラフである。３つの異なるプロモーターを伴う安定なＧＢＡ＋Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅのバイシストロニック発現導入遺伝子を用いたＡＡＶ９遺伝子治療の効果を決定するために、１５週齢のＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスに中用量のＡＡＶ９－安定なＧＢＡ＋Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅ、５Ｅ１１ｖｇを投薬した。組織によりＧＢＡがどのくらい生成されたかを決定するために、ＡＡＶ９注射の２週間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｇｌｃ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。
図２２Ａ～２２Ｃは、ライソゾームアルファ－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）のＥＲＴとしての使用に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す一連のグラフである。
図２３Ａ～２３Ｂは、ＬＡＭＡＮ酵素の発現、精製、および特徴付けを示す写真および対応するデータ表である。ＬＡＭＡＮの２つの調製物を、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅをコードするバイシストロニックベクターを用いて（Ｍ０６１１）または用いずに、Ｅｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた。どちらもＨＰＣ４アフィニティータグを利用して精製した。固定化されたカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体に用量依存的に結合するＬＡＭＡＮの量を測定することにより、リン酸化の有意な増加が実証された。結合したＬＡＭＡＮの量は、ＬＡＭＡＮ合成基質である４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－マンノピラノシド（４ＭＵ－Ｍａｎ）を使用した、ＬＡＭＡＮの活性に基づくものであった。添加したマンノース６リン酸の結合を遮断する能力により、リン酸化されたオリゴ糖を介した結合の特異性を確認した。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１）がＭ６Ｐの存在下であっても受容体に結合することができることに留意すべきである。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１、Ｐ－００３０）およびＬＡＭＡＮ（Ｐ－００３１）をｉｎ ｖｉｖｏ動物試験のために選択した。
図２３Ｃは、ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１）酵素の発現、精製、および特徴付けを示すグラフである。ＬＡＭＡＮの２つの調製物を、ＰＴａｓｅのＳ１－Ｓ３バリアントをコードするバイシストロニックベクターを用いてまたは用いずに、Ｅｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた。どちらもＨＰＣ４タグを利用して精製した。固定化されたカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体に用量依存的に結合するＬＡＭＡＮの量を測定することにより、リン酸化の有意な増加が実証された。結合したＬＡＭＡＮの量を、合成基質である４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－マンノピラノシド（４ＭＵ－Ｍａｎ）を使用し、活性によって決定した。添加したマンノース６リン酸の結合を遮断する能力により、リン酸化されたオリゴ糖を介した結合の特異性を確認した。Ｍ０６１１がＭ６Ｐの存在下であっても受容体に結合することができることに留意すべきである。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１、Ｐ－００３０）およびＬＡＭＡＮ（Ｐ－００３１）をｉｎ ｖｉｖｏ動物試験のために選択した。
図２４Ａ～２４Ｂは、酵素補充療法に関する野生型マウスにおけるＬＡＭＡＮおよびＬＡＭＡＮＭ６Ｐ酵素の体内分布を実証するグラフの対である。ＬＡＭＡＮとＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の間の組織内取り込みの差異を評価するために、２ｍｇ／ｋｇの各調製物を野生型マウス（ｎ＝４）に尾静脈を介して注入した。投薬の２時間後および８時間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｍａｎ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の利点が組織内取り込みのデータにおいて認められた。肝臓、脾臓、心臓、肺、および脳について、２時間の時点で組織における活性がより大きかった。この傾向は８時間の時点でも真であったが、肺は例外であった。これは、この組織の分析において観察された高い変動の結果であり得る。活性がより大きいという知見の唯一の例外は腎臓であった。全ての試料から内因性ＬＡＭＡＮ活性を差し引く。我々のＬＡＭＡＮＭ６Ｐ酵素を注射したマウスのほとんどの組織においてより高いＬＡＭＡＮ酵素活性が検出された。
図２５Ａ～２５Ｂは、酵素補充療法に関する、野生型マウスにおけるαＬＡＭＡＮおよびＬＡＭＡＮＭ６Ｐ酵素の体内分布を実証するグラフの対である。ＬＡＭＡＮとＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の間の組織内取り込みの差異を評価するために、１０ｍｇ／ｋｇの各調製物を野生型マウス（ｎ＝４）に尾静脈を介して注入した。投薬の２時間後および８時間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｍａｎ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の利点が組織内取り込みのデータにおいて認められた。肝臓、脾臓、心臓、肺、および脳について、２時間の時点で組織における活性がより大きかった。この傾向は８時間の時点でも真であったが、腎臓は例外であった。これは、この組織の分析において観察された高い変動の結果であり得る。
図２６Ａ～２６Ｂは、ムコリピドーシスに対する遺伝子治療（ＧＴｘ）についてのＡＡＶ９設計およびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を示す概略図およびグラフである。２９３Ｔ細胞に種々のＭ００２１（ＡＡＶ９－ＣＡＧｐ－Ｓ１－Ｓ３）ウイルスを用いた形質導入を行い、２日間培養した後、ＰＴａｓｅ活性アッセイを行った。
図２７Ａ～２７Ｂは、Ｍ００２１処置によりＭＬ ＩＩマウスにおける血清中ライソゾーム酵素レベルが低下することを実証するグラフの対である。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅ遺伝子治療の効果を決定するために、３４週齢の雌マウスに中用量のＭ００２１（ＡＡＶ９－ＣＡＧｐ－Ｓ１－Ｓ３）、４ｅ１２ｖｇ（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）を投薬した。ＭＬ ＩＩの表現型の１つは、ライソゾーム酵素を細胞内のライソゾームにターゲティングすることができないことに起因してライソゾーム酵素の血清中レベルが上昇することである。治療を受けてからちょうど１週間後に血清中のＬＡＭＡＮおよびＭａｎＢ活性が低下した時、有望な結果が認められた。この結果は、ＭＬＩＩマウスモデルの記載されている表現型をもたらすことができることを実証するものであるので、重要である。
図２８Ａ～２８Ｃは、Ｍ００２１処置によりＭＬ ＩＩにおけるライソゾーム酵素のリン酸化が増加することを実証する一連のグラフである。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅ遺伝子治療のＬＡＭＡＮおよびＭａｎＢの血清中活性の低下に対する影響をさらに理解するために、以前に記載されている固定化受容体結合アッセイを使用して、血清中に見いだされる酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合を評価した。簡単に述べると、既知量の酵素を漸増量で固定化したＣＩ－ＭＰＲに添加する。結合しなかった酵素を洗い流し、残りの結合した酵素を妥当な合成基質；Ｍａｎ－ｂ－４ＭＵ（ＭａｎＢ、ＬＡＭＡＮ ４ＭＵ－Ｍａｎ（ＬＡＭＡＮ）を使用して測定する。ＭＬ ＩＩマウスにおけるＡＡＶ９－Ｓ１Ｓ３遺伝子治療によりライソゾーム酵素のグリカンリン酸化が増加する。血清中の総リン酸化ライソゾーム酵素は３週間後に正常レベルまたはわずかに高いレベルまで正常化した。
図２９Ａ～２９Ｃは、ＧａｕｃｈｅｒマウスにおけるＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐ遺伝子治療の注射の２週間後の肺および肝臓における酵素活性およびＧＣａｓｅ基質の選択を示す一連のグラフである。ＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡ－Ｓ１Ｓ３は他にはＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐとして公知であり、ここで、Ｍ６ＰはＳ１Ｓ３構築物を指す。ＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡまたはＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐ（ＧＢＡおよびＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを有するバイシストロニックベクターを伴う導入遺伝子）の２週間後、肝臓において両方の構築物の発現が上昇した（図２９Ａ）。肝臓中グルコシル－β－セラミドレベルを測定したところ（図２９Ｂ、Ｃ）、ＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐで処置した動物では、ＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡで処置した動物と比較して、肝臓におけるＧＣａｓｅ活性が低いにもかかわらず、蓄積した基質の最大の減少が観察された。この低活性でのより大きな基質減少により、Ｎ結合オリゴ糖リン酸化が、細胞取り込みおよびライソゾームへのターゲティングに関して、遺伝子治療のために重要であることが示される。肺では、ＡＡＶ９で処置した動物でのＧＣａｓｅ活性は低い。しかし、ＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐで処置した動物では、肺における蓄積したグルコシル－β－セラミドレベルの有意な減少が示された（図２９Ｂ、Ｃ）。ＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡで処置した動物ではわずかな減少が観察された。これにより、ＣＩ－ＭＰＲに対する親和性が高いリン酸化された導入遺伝子産物により、活性レベルが低くとも、効率的な細胞取り込みおよびライソゾームへのターゲティングに起因して、有効な治療を導くことができることが実証される。
詳細な説明
ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）は、ライソゾーム機能の欠陥に起因する遺伝性代謝障害に関する。現在、約５０種の別個のＬＳＤが同定されているが、処置が報告されているのはこれらのうちの少数（１０種未満）である。患者は、現在のところ、患者において欠損酵素を補充して疾患の症状に対処する酵素補充療法（ＥＲＴ）の静脈内注入による処置を受ける。ＥＲＴの目的は、欠陥を有する細胞のライソゾームに十分な量の正常酵素を導入して、貯蔵材料を一掃し、ライソゾーム機能を取り戻させることである。影響を受けているライソゾームへのＥＲＴの効率的な取り込みを保証するためには、ＥＲＴが高レベルのマンノース６リン酸（Ｍ６Ｐ）を含有することが必須である。理想的には、ＬＳＤの患者を、ライソゾームへの有効な送達を可能にするために高飽和レベルのＭ６Ｐを有する欠損酵素を投与することよって処置すべきである。しかし、このプロセスは非常に困難であり、それは、Ｍ６Ｐのライソゾームへの付加を可能にするリン酸化プロセスが本質的に非効率的であるからである。最近のＧｌｃＮＡｃ－１ＰＴａｓｅのＳ１－Ｓ３バリアントの発見により、ライソゾーム酵素のリン酸化プロセスが有意に改善される。さらに、患者にＬＳＤの長期間にわたる治癒をもたらす遺伝子治療手法が必要とされている。
本開示は、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼのＳ１－Ｓ３バリアントに作動可能に連結したライソゾーム酵素を生成するための発現ベクター、組成物および方法を提供する。ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼのＳ１－Ｓ３バリアントは、取り込み、分布、およびライソゾーム酵素活性の増大のために、作動可能に連結したライソゾーム酵素の細胞内への輸送および血清（ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ）または腎臓からの輸送を有意に増大させる。
本開示は、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼのＳ１－Ｓ３バリアントに作動可能に連結したライソゾーム酵素を生成するための遺伝子治療用ベクター、組成物および方法を提供する。本開示は、Ｓ１－Ｓ３バリアントの発現により、内因性ライソゾーム酵素の取り込み、分布および活性が増大することを実証する。
本開示は、新規のバイシストロニックベクターを介してＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させることによって妥当なリン酸化Ｎ結合オリゴ糖を有するライソゾーム酵素を生成するためのＥＲＴ、ベクター、組成物および方法を提供する。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅおよびライソゾーム酵素のバイシストロニック発現により、発現されるライソゾーム酵素のＭ６Ｐ含量が有意に増加する。十分にリン酸化された酵素により、酵素の効率的な取り込みおよびライソゾームへの送達が可能になる。これにより、より良好な組織分布、細胞取り込み、ライソゾームへのターゲティングおよび基質減少が可能になる。本開示は、高レベルの発現または高レベルの活性のＭ６Ｐライソゾーム酵素を、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させることによって生成するための遺伝子治療用ベクター、組成物および方法を提供する。ＰＴａｓｅのＳ１－Ｓ３バリアントのバイシストロニック発現により、ライソゾーム酵素のＭ６Ｐ含量レベルが有意に上昇する。ライソゾーム酵素の表面上の高Ｍ６Ｐにより、酵素を組織細胞に送達することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける取り込み、分布および有効性が増大する。
本開示のベクター、組成物および方法を酵素補充療法（ＥＲＴ）に使用することができる。
その代わりに、またはそれに加えて、本開示のベクター、組成物および方法を遺伝子治療に使用することができる。
多数のライソゾーム酵素が記載されており、ＥＲＴおよび遺伝子治療の両方におけるそれらの使用が実証されている。重要なことに、本開示のベクター、組成物および方法を任意のライソゾーム酵素を用いて使用して、ライソゾーム酵素の細胞取り込みを増加させ、したがって、１つまたは複数の体組織におけるライソゾーム酵素の活性を増大させることができる。
一部の実施形態では、ライソゾームタンパク質に作動可能に連結したＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを含む本開示の組成物および方法により、対象の脾臓、脳、１つもしくは複数の肺、または１つもしくは複数の筋肉のうちの１つまたは複数におけるライソゾームタンパク質の取り込みおよび活性が増大する。
一部の実施形態では、バイシストロニックベクターがＳ１－Ｓ３ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼをコードする配列およびライソゾームタンパク質をコードする配列を含む実施形態を含めた、Ｓ１－Ｓ３ ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼを含む本開示のベクター、組成物および方法により、対象の脾臓、脳、１つもしくは複数の肺、または１つもしくは複数の筋肉のうちの１つまたは複数におけるコードされるライソゾームタンパク質の取り込みおよび活性が増大する。
例示的な実施形態
本開示は、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む組成物を提供する。
本開示は、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックベクターを含む組成物を提供する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、バイシストロニックベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの前かつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの後ろに位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態では、バイシストロニックベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの後ろかつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの前に位置するＩＲＥＳを含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、バイシストロニックベクターはプロモーターを含む。一部の実施形態では、バイシストロニックベクターは構成的プロモーターを含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドまたは改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している。一部の実施形態では、プロモーターは、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している。
本開示の組成物の一部の実施形態では、バイシストロニックベクターは配列番号１の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは配列番号４の核酸配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、コードされるライソゾーム酵素は、表１に列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する。一部の実施形態では、コードされるライソゾーム酵素またはそのバリアントは、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を引き起こすものである。一部の実施形態では、コードされるライソゾーム酵素またはそのバリアントの活性または機能が、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）では低下している、阻害されているまたは調節解除されている。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されているライソゾーム酵素を含む。一部の実施形態では、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されているライソゾーム酵素は、少なくとも１つのライソゾーム酵素を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている１つまたは複数のライソゾーム酵素を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ、ＧＢＡ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）およびライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ、ＧＢＡ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、ライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号５～１０の核酸配列を含む。
本開示は、構成的プロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックベクターを含む組成物を提供する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本開示のベクターの一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスまたはレンチウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の１つまたは複数のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型１（ＡＡＶ１）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型２（ＡＡＶ２）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型３（ＡＡＶ３）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型４（ＡＡＶ４）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型５（ＡＡＶ５）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型６（ＡＡＶ６）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型７（ＡＡＶ７）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型８（ＡＡＶ８）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血清型９（ＡＡＶ９）のＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示のベクターの一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。
本開示は、本開示のベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は霊長類細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、細胞は不死化または安定化細胞株である。一部の実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。
本開示は、本開示のバイシストロニックベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は霊長類細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、細胞は不死化または安定化細胞株である。一部の実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。
本開示は、本開示の組成物を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は霊長類細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、細胞は不死化または安定化細胞株である。一部の実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。
本開示は、本開示のベクターによって発現されるライソゾーム酵素および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を投与するステップを含み、それにより、ＬＳＤが処置される、方法を提供する。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与するステップを含み、組成物によりライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、それにより、ＬＳＤが処置される、方法を提供する。
本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している対象を処置する方法であって、対象に本開示の医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、ライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、対象が処置される、方法を提供する。
本開示は、それを必要とする対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の出現を予防する方法であって、対象に本開示の医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、ライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、対象におけるＬＳＤの出現が予防される、方法を提供する。
本開示は、それを必要とする対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の原因であるライソゾーム酵素のリン酸化を改善する方法であって、対象に本開示の組成物を投与するステップを含み、組成物によりライソゾーム酵素のリン酸化が増加する、方法を提供する。
本開示の方法の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する。
本開示の方法の一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されているライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている１つまたは複数のライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を含む。
酵素補充療法（ＥＲＴ）
ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニック発現ベクターを含む組成物が本発明で提供される。一部の実施形態では、開示されるバイシストロニック発現ベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの前かつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの後ろに位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。他の実施形態では、開示されるバイシストロニック発現ベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの後ろかつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの前に位置するＩＲＥＳを含む。
開示されるバイシストロニック発現ベクターを含む哺乳動物細胞が本発明で提供される。
本明細書に開示されるバイシストロニックベクターによって発現されるライソゾーム酵素および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本発明で提供される。
ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している対象を処置するための方法およびそれを必要とする対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の出現を予防する方法が本発明で提供される。
遺伝子治療
ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックウイルスベクターを含む組成物が本発明で提供される。一部の実施形態では、開示されるバイシストロニックウイルスベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの前かつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの後ろに位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。他の実施形態では、開示されるバイシストロニックウイルスベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの後ろかつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの前に位置するＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスまたはレンチウイルスである。
対象に開示されるバイシストロニックウイルスベクターを投与することにより、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している対象を処置するための方法およびそれを必要とする対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の出現を予防する方法が本発明で提供される。
それを必要とする対象におけるＬＳＤの原因であるライソゾーム酵素のリン酸化を改善するための方法が本発明でさらに提供される。
対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置または予防するためのバイシストロニックベクターを使用した組成物および方法が本発明で提供される。
本開示は、プロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックベクターを含む組成物を提供する。本開示の方法は、対象に本明細書に開示されるバイシストロニックベクターを含む医薬組成物を投与するステップを含む。
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の試験の実施に使用することができるが、本明細書には、好ましい材料および方法が記載されている。本発明の説明および特許請求には以下の用語法が使用される。
本明細書において使用される用語法は単に一部の実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではないことも理解される。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、その冠詞の文法上の目的語のうちの１つ、または１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つよりも多くの要素を意味する。
本明細書で使用される場合、例えば量、持続時間など測定可能な値について言及する場合、「約」という用語は、指定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％、およびさらに好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、したがって、そのような変動は開示されている方法の実施に妥当なものである。
「２Ａ」または「２Ａペプチド」または「２Ａ様ペプチド」という用語は、自己プロセシングウイルスペプチドである。２Ａペプチドは、単一のＯＲＦ転写単位内の別々の異なるタンパク質コード配列であり得る（Ryan et al., 1991, J Gen Virol 72: 2727-2732）。「自己切断性」ペプチドまたはプロテアーゼ部位と称されるが、２Ａ配列が１つの転写物から２つのタンパク質を生成する機構は、正常なペプチド結合が２Ａにおいて損なわれ、その結果、１つの翻訳事象から２つの連続していないタンパク質断片が生じるリボソームスキッピングによって起こる。２Ａペプチド配列との連結により、単一のＯＲＦに由来する多数の別個のタンパク質（基本的に等モル分量）の細胞での発現がもたらされる（de Felipe et al., 2006, Trends Biotechnol 24: 68-75）。
「生物学的な」または「生体試料」という用語は、生物体からまたは生物体の構成成分（例えば細胞）から得られた試料を指す。試料は任意の生体組織または生体液の試料であり得る。試料が患者由来の試料である「臨床試料」になる頻度が高い。そのような試料としては、これだけに限定されないが、骨髄、心臓組織、喀痰、血液、リンパ液、血液細胞（例えば、白血球（ｗｈｉｔｅ ｃｅｌｌ））、組織または細針生検試料、尿、腹腔液、および胸膜液、またはそれに由来する細胞が挙げられる。生体試料は、組織学的目的のために取得された凍結切片などの組織の切片も含み得る。
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、ウイルスの誘導体が鋳型ウイルス核酸またはアミノ酸配列に対して核酸またはアミノ酸配列の差異を有し得ることを明示する。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、疾患がよくならない場合には動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することはできるが、障害が存在しない場合よりも動物の健康状態が好ましくない、健康状態である。無処置のまま放置した場合、障害は必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすものではない。
「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドが組み入れられる、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含有されるもの）ならびにウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で公知の全ての発現ベクターを含む。一部の実施形態では、開示されるベクターは、本明細書ではウイルスベクターと称される。一部の実施形態では、開示されるベクターは、本明細書では発現ベクターと称される。
本明細書で使用される場合、「より高い」は、発現レベルが対照参照よりも少なくとも１０％もしくはそれよりも大きく、例えば、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高いまたはそれよりも高い、および／または１．１倍、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、２．０倍であるもしくはそれよりも高い、ならびにこれらの間のありとあらゆる全体的または部分的な変化量だけ高いことを指す。本明細書に開示される参照値よりも高い発現レベルは、健康な対象において測定されたまたは当技術分野において定義もしくは使用されている発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質）に由来する正常または対照レベルよりも高い発現レベル（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を指す。
本明細書で使用される場合、「より低い」は、発現レベルが対照参照よりも少なくとも１０％低いもしくはそれよりも低い、例えば、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％低いもしくはそれよりも低い、および／または１．１分の１、１．２分の１、１．４分の１、１．６分の１、１．８分の１、２．０分の１であるもしくはそれよりも低い、ならびにこれらの間のおよびありとあらゆる全体的または部分的な変化量だけ低いことを指す。本明細書に開示される参照値よりも低い発現レベルは、健康な対象において測定されたまたは当技術分野において定義もしくは使用されている発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質）に由来する正常または対照レベルよりも低い発現レベル（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を指す。
本明細書で使用される場合、「対照」または「参照」という用語は互換的に使用することができ、比較の標準として使用される値を指す。
本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、第１の薬剤を別の薬剤と併せて投与することを意味する。「と組み合わせて」または「と併せて」とは、１つの処置モダリティに加えて別の処置モダリティを投与することを指す。そのように、「と組み合わせて」とは、個体に１つの処置モダリティを他の処置モダリティの送達前、その間、またはその後に投与することを指す。そのような組合せは単一の処置レジメンまたはレジームの一部とみなされる。例えば、本開示のベクターまたはベクターを含む組成物を第２の治療剤と組み合わせて対象に提供または投与することができる。一部の実施形態では、本開示のベクターおよび組成物を第２の治療剤と同時にまたは逐次的に対象に提供または投与する。一部の実施形態では、本開示のベクターおよび組成物を第２の治療剤と同時に対象に提供または投与する。一部の実施形態では、本開示のベクターおよび組成物を第２の治療剤と逐次的に対象に提供または投与する。一部の実施形態では、本開示のベクターおよび組成物を第２の治療剤の投与前に対象に提供または投与する。一部の実施形態では、本開示のベクターおよび組成物を第２の治療剤の投与後に対象に提供または投与する。一部の実施形態では、第２の治療剤は、本開示の第２のベクターの組成物を含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、本開示のライソゾーム酵素のバリアント形態をコードする本開示のベクターまたは組成物を含め、本開示のライソゾーム酵素のバリアント形態を含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、ライソゾーム蓄積症の徴候または症状を軽減するための１つまたは複数の薬剤を含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、１つまたは複数の抗炎症剤または免疫抑制剤を含む。
「作動可能に連結した」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸配列の発現が核酸配列と空間的に接続しているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターはその制御下にある核酸配列の５’（上流）に位置付けることができる。
本明細書で使用される場合、「初代細胞」は、生組織（すなわち生検材料）から直接取得され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長が樹立された細胞を指し、これは、非常にわずかな集団倍加を経ており、したがって、それが由来する組織の主要な機能的構成成分および特徴を、連続的な腫瘍形成性または人工不死化細胞株と比較してより大きく表す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合で連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、また、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に対する制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接合した２つまたはそれよりも多くのアミノ酸で構成される任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、当技術分野では一般に、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに、当技術分野では一般にタンパク質と称され、多くの型が存在する、より長い鎖のどちらも指す。「ポリペプチド」としては、例えば、とりわけ、生物活性のある断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組合せを含む。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸の発現を付与する、活性化するまたは増強することができる合成または天然由来の分子を意味し得る。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要である、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列と定義される。
本明細書で使用される場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。一部の場合では、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の場合では、この配列は遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合、細胞のほとんどまたは全ての生理的条件下で細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結した場合、実質的に、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「ＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、リボ核酸と定義される。
「処置」という用語は、本発明との関連で使用される場合、疾患または障害に対する治療的処置ならびに予防的措置または抑制的措置を包含するものとする。本明細書で使用される場合、「処置」という用語および「処置する」および「処置すること」などの関連用語は、疾患状態または少なくとも１つのその症状の増悪、重症度および／または持続時間の低減を意味する。したがって、「処置」という用語は、対象に利益をもたらし得る任意のレジメンを指す。処置は、既存の状態に関するものであり得る、または予防的なもの（防止的処置）であり得る。処置は、治癒効果、軽減効果または予防効果を含み得る。本明細書における「治療的」および「予防的」処置への言及は、それらの最も広範な文脈で考えられるべきである。「治療的」という用語は、必ずしも対象が完全に回復するまで処置されたことを意味するものではない。同様に、「予防的」は、必ずしも対象が最終的に疾患状態に罹患しないことを意味するものではない。したがって、例えば、処置という用語は、疾患または障害が発症する前またはその後に薬剤を投与し、それにより、疾患または障害の全ての徴候を予防するまたは取り除くことを含む。別の例として、疾患の症状と闘うために疾患の臨床的顕在化後に薬剤を投与することは疾患の「処置」を含む。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。この用語は、ヌクレオチド類似体から作出されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、および、記載されている実施形態に適用可能な場合には、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを等価物として含むことも理解されるべきである。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡが核酸と称され得る分子の代表的な例である。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、本発明の範囲内で有用な少なくとも１つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、アジュバント、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、および／または賦形剤などの他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物により、化合物の生物体への投与が容易になる。これだけに限定されないが、腫瘍内、静脈内、胸膜内、経口、エアロゾル、非経口、点眼、肺および局部投与を含めた、化合物を投与する多数の技法が当技術分野において存在する。
「薬学的に許容される担体」という語は、本発明の化合物（複数可）をその意図された機能が発揮されるように対象の内部または対象に運ぶまたは輸送することに関与する薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入用材料を含む。一般には、そのような化合物は、体の１つの器官または一部から、体の別の器官または一部に運ばれるまたは輸送される。塩または担体はそれぞれ、製剤の他の成分と適合し、対象に対して傷害性ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体としての機能を果たし得る材料の一部の例としては、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；粉末トラガント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐薬ワックスなど；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；希釈剤；増粒剤；滑沢剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；香料；保存剤；抗酸化剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤（ｈａｒｄｅｎｅｒ）；硬化剤（ｓｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）；懸濁化剤；界面活性物質；保湿剤；担体；安定剤；ならびに医薬製剤に使用される他の無毒性の適合する物質、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、化合物の活性に適合し、かつ対象に生理的に許容されるありとあらゆるコーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることもできる。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、特定の疾患状態を予防するために必要である、または、疾患状態もしくは少なくとも１つのその症状もしくはそれに関連する状態の重症度を低下させる、および／もしくは疾患状態もしくは少なくとも１つのその症状もしくはそれに関連する状態を好転させる、本発明のベクターによって生成されるウイルス粒子の量または感染単位を意味する。
「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物としては、例えば、家畜および愛玩動物、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミのような哺乳動物が挙げられる。対象はヒトであることが好ましい。
範囲：本開示全体を通して、一部の実施形態は範囲形式で示される場合がある。範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためだけのものであり、本開示の範囲に対する柔軟さのない限定と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲についての記載は、具体的に開示される全ての可能性のある部分範囲ならびにその範囲内に入る個々の値を有するとみなされるべきである。例えば、１から６までなどの範囲の説明は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの具体的に開示される部分範囲、ならびにその範囲内に入る個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有するとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。
組成物
対象にバイシストロニック発現ベクターを含む医薬を投与することにより、対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置または予防するための組成物および方法が本発明で提供される。
一部の実施形態では、本開示は、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックベクターを含む組成物を提供する。一実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドと改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドは作動可能に連結している。
一部の実施形態では、本開示は、構成的プロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロニックベクターを含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、バイシストロニックベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの前かつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの後ろに位置するＩＲＥＳを含む。他の実施形態では、バイシストロニックベクターは、改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドの後ろかつライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドの前に位置するＩＲＥＳを含む。
ＩＲＥＳの配列は、当技術分野で公知の配列またはそのバリアントであり得る。ＩＲＥＳバリアントは、改変されたまたは突然変異したものであり得る。一実施形態では、ＩＲＥＳの配列は配列番号３を含む。他の実施形態では、ＩＲＥＳの配列は、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％類似している。
一実施形態では、ライソゾーム酵素のポリヌクレオチドは、２Ａペプチドをコードする２Ａ ＤＮＡに作動可能に連結しており、それが今度は改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）のポリヌクレオチドに作動可能に連結している。これだけに限定されないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａを含めた当技術分野で公知の種々の２Ａペプチドを開示されるバイシストロニックベクターに使用することができる。一部の実施形態では、切断効率を改善するために、ペプチドの５’末端にＧＳＧ残基を付加することができる。
一部の実施形態では、バイシストロニックウイルスベクターは、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む。
一部の実施形態では、バイシストロニック発現ベクターはプロモーターを含む。
プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性／抑止可能プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターであり得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。哺乳動物細胞用の構成的プロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１ ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＣＢＡ／ＣＡＧＧＳ／ＡＣＴＢ、ＣＢｈ、ＭｅＣＰ２、Ｕ６およびＨ１が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のバイシストロニックベクターは構成的プロモーターを含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＣＭＶプロモーターのポリヌクレオチドは配列番号２の核酸配列を含む。
他の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、テトラサイクリン、熱ショック、ステロイドホルモン、重金属、ホルボールエステル、アデノウイルスＥ１Ａエレメント、インターフェロン、および血清誘導性プロモーターからなる群から選択することができる。
異なる実施形態では、プロモーターは細胞型特異的プロモーターであり得る。例えば、ニューロン用の細胞型特異的プロモーター（例えばシナプシン）、アストロサイト用の細胞型特異的プロモーター（例えばＧＦＡＰ）、オリゴデンドロサイト用の細胞型特異的プロモーター（例えばミエリン塩基性タンパク質）、ミクログリア用の細胞型特異的プロモーター（例えばＣＸ３ＣＲ１）、神経内分泌細胞用の細胞型特異的プロモーター（例えばクロモグラニンＡ）、筋肉細胞用の細胞型特異的プロモーター（例えばデスミン、Ｍｂ）、または心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）用の細胞型特異的プロモーター（例えばアルファミオシン重鎖プロモーター）を使用することができる。例示的な実施形態では、プロモーターは、Ｎｒｌ（桿体視細胞特異的）プロモーターまたはＨＢＢ（ヘモグロビンベータ）プロモーターであり得る。プロモーターは、核酸の発現をさらに増強するためならびに／または核酸の空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つまたは複数の特異的な転写調節配列をさらに含み得る。
ベクターに見いだされるエンハンサー配列によってもベクターに含有される遺伝子の発現が調節される。一般には、エンハンサーは、遺伝子の転写を増強するためにタンパク質因子に結合させる。エンハンサーはその調節を受ける遺伝子の上流または下流に位置させることができる。エンハンサーは、特定の細胞または組織型における転写を増強するために、組織特異的なものであってもよい。一実施形態では、本バイシストロニックベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写をブーストするために、１つまたは複数のエンハンサーを含む。エンハンサーの非限定的な例としては、ＣＭＶエンハンサーおよびＳＰ１エンハンサーが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドに１つよりも多くのプロモーターを作動可能に連結することができ、プロモーターは同じであってもまたは異なってもよい。プロモーターと発現される核酸配列との距離は、そのプロモーターとそれに制御されるネイティブな核酸配列との距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知の通り、この距離の変動はプロモーター機能を失わせることなく適応させることができる。
バイシストロニックベクター内のポリペプチドの発現を評価するために、ベクターに選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含めて、ウイルスベクターによってトランスフェクトされたまたは感染したことが探索される細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることもできる。一部の実施形態では、選択マーカーをＤＮＡの別々の一片に載せ、同時トランスフェクション手順に使用することができる。選択マーカーおよびレポーター遺伝子のどちらにも妥当な調節配列を隣接させて宿主細胞における発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物体または組織に存在しないまたはそれによって発現されないものであり、かつ、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によってその発現が顕在化するポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現をＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。適切な発現系は周知であり、また、公知の技法を使用して調製することもでき、商業的に入手することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、薬剤を、プロモーターにより駆動される転写をモジュレートする能力について評価するために使用することができる。
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は当技術分野で公知である。発現ベクターに関しては、ベクターを宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを宿主細胞に物理的手段、化学的手段、または生物学的手段によって移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、微量注射、電気穿孔などが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al.（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターが、遺伝子を哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に挿入するために最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来するものであり得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、巨大分子の複合体などのコロイド分散系、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質に基づく系が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達系を利用する一部の実施形態では、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸を宿主細胞に導入するための脂質製剤の使用が意図されている（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）。一部の実施形態では、核酸は脂質と結び付いたものであり得る。脂質と結び付いた核酸は、リポソームの水性内部に封入されたもの、リポソームの脂質二重層内に散在したもの、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結び付いた連結分子を介してリポソームに付着したもの、リポソーム内に閉じ込められたもの、リポソームと複合体を形成したもの、脂質を含有する溶液中に分散したもの、脂質と混合したもの、脂質と組み合わさったもの、脂質内に懸濁液として含有されるもの、ミセルに含有されるもしくはミセルと複合体を形成したもの、または他のやり方で脂質と結び付いたものであり得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターを伴う組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、当該組成物は、二重層構造中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在し得る。当該組成物はまた、単に溶液中に散在し、場合によってサイズまたは形状が一様でない凝集体を形成していてもよい。脂質は、天然に存在する脂質であっても合成脂質であってもよい脂肪性物質である。例えば、脂質は、細胞質内に天然に存在する脂肪性液滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラス、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどを含む。
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）をＳｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手することができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）をＫ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質をＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中脂質のストック溶液を約－２０℃で保管することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、囲い込まれた脂質二重層または凝集体の生成によって形成される種々の単一および多重膜脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二分子膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有すると特徴付けることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。これらはリン脂質を過剰な水溶液に懸濁すると自然発生的に形成される。脂質構成成分は自己再構成を受けた後に閉じた構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかし、溶液中で正常な小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造が想定され得るまたはただ単に脂質分子の一様でない凝集体として存在し得る。リポフェクタミン－核酸複合体も意図されている。
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなど；「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在または非存在を、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によって、または本開示の範囲内に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって検出することなどが挙げられる。
遺伝子治療用ベクター
本明細書に開示される対象におけるＬＳＤを処置または予防するために使用されるベクターは、複製、および必要に応じて真核細胞への組込みに適したものである。典型的なベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するために有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含有する。
本開示のベクターは、標準の遺伝子送達プロトコールを使用した核酸免疫および遺伝子治療に使用することもできる。遺伝子送達の方法は当技術分野で公知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本開示は、遺伝子治療用ベクターを提供する。
本開示の単離された核酸を多数の型のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸を、これだけに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含めたベクターにクローニングすることができる。目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターを含む。
さらに、ベクターをウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、これだけに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物体において機能的な複製開始点、プロモーター配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、および１種または複数種の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために多数のウイルスに基づく系が開発されている。例えば、レトロウイルスにより、遺伝子送達系のための都合のよいプラットフォームがもたらされる。選択された遺伝子を、当技術分野で公知の技法を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで送達することができる。多数のレトロウイルス系が当技術分野で公知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期間にわたる安定な組込みおよび娘細胞への伝達を可能にするものであるので、長期間にわたる遺伝子移入を実現するために適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに対してさらなる有利な点を有する。レンチウイルスベクターは、免疫原性が低いというさらなる有利な点も有する。好ましい実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは種々の障害を処置するための強力な遺伝子送達ツールになっている。ＡＡＶベクターは、病原性がないこと、免疫原性が最低限であること、および分裂終了細胞に安定かつ効率的な様式で形質導入できることを含めた、それらを遺伝子治療に理想的に適するものにする多数の特色を有する。ＡＡＶ血清型、プロモーター、および送達方法の妥当な組合せを選択することにより、ＡＡＶベクターに含有される特定の遺伝子の発現を１つまたは複数の型の細胞に特異的にターゲティングすることができる。
一部の実施形態では、開示されるバイシストロニックウイルスベクターは、アデノウイルス（例えばＡｄ－ＳＹＥ、ＡｄＳｕｒ－ＳＹＥ、Ａｄ５／３－ＭＤＡ７／ＩＬ－２４、Ａｄ－ＳＢ、Ａｄ－ＣＲＩＳＰＲ、腫瘍溶解性Ａｄ）；アデノ随伴ウイルス、ＡＡＶ（例えばＡＡＶ－ＭｅＣＰ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、Ｄｕａｌ ＡＡＶ９ ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）；単純ヘルペスウイルス、ＨＳＶ（例えばＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＨＳＶ－１、ＨＦ１０腫瘍溶解性ＨＳＶ－２）；レトロウイルス（例えばＲＲＶ／Ｔｏｃａ ５１１、ＧＲＶ）；レンチウイルス（例えばＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）；アルファウイルス（ＳＦＶ、Ｍ１）；フラビウイルス（Ｋｕｎｊｉｎウイルス）；ラブドウイルス（ＶＳＶ）；麻疹ウイルス（例えばＭＶ－Ｅｄｍ）；ニューカッスル病ウイルス（例えばＮＤＶ９０）；ヘビウピコルナウイルスコクサッキーウイルス（例えばＣＶＢ３、ＣＡＶ２１、ＥＶ１）；またはポックスウイルス（例えばＰＡＮＶＡＣ、ＶＶ、ＶＶ－ＧＬＶ－１ｈ１５３、ＣＰＸＶ）を含む。
一実施形態では、開示されるバイシストロニックウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、またはピコルナウイルスである。一実施形態では、開示されるバイシストロニックウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスまたはレンチウイルスである。
一実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドはＡＡＶベクターに含有される。３０種よりも多くの天然に存在するＡＡＶ血清型が利用可能である。ＡＡＶカプシドには多くの天然のバリアントが存在し、それにより、骨格筋に特に適した特性を有するＡＡＶの同定および使用が可能になる。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学技法を使用して工学的に操作することができ、それにより、２、３挙げると、核酸配列を細胞特異的に送達するため、免疫原性を最小化するため、安定性および粒子の寿命を調整するため、効率的な分解のため、核に正確に送達するために、これらの粒子を最適化することを可能にすることができる。
ＡＡＶの使用はＤＮＡの外因性送達の一般的な方式であり、これは、ＡＡＶが比較的無毒性であり、効率的な遺伝子移入をもたらすものであり、また、特定の目的のために容易に最適化することができるからである。ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、よく特徴付けられているＡＡＶの血清型の中で、遺伝子導入ベクターとして開発された第１のＡＡＶはヒト血清型２である；これは、異なる標的組織および動物モデルにおける効率的な遺伝子移入実験に広範に使用されている。いくつかのヒト疾患モデルに対するＡＡＶ２に基づくベクターの実験的適用の臨床試験が進行中であり、それらとして、例えば、嚢胞性線維症および血友病Ｂなどの疾患に対する治療が挙げられる。他の有用なＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９が挙げられる。
ベクター中にアセンブリするための望ましいＡＡＶ断片としては、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および超可変領域を含めたｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０を含めたｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらの断片を種々のベクター系および宿主細胞に容易に利用することができる。そのような断片を単独で、他のＡＡＶ血清型の配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される場合、人工ＡＡＶ血清型として、限定することなく、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられる。そのような人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）と、異なる選択されたＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の連続していない部分から、非ＡＡＶウイルス供給源から、または非ウイルス供給源から得ることができる異種配列を組み合わせて使用して、任意の適切な技法によって生成することができる。人工ＡＡＶ血清型は、これだけに限定することなく、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。したがって、目的のライソゾーム酵素および改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅの発現に適した例示的なＡＡＶまたは人工ＡＡＶとしては、とりわけ、ＡＡＶ２／８（米国特許第７，２８２，１９９号を参照されたい）、ＡＡＶ２／５（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から入手可能）、ＡＡＶ２／９（国際特許公開第ＷＯ２００５／０３３３２１号）、ＡＡＶ２／６（米国特許第６，１５６，３０３号）、およびＡＡＶｒｈ８（国際特許公開第ＷＯ２００３／０４２３９７号）が挙げられる。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法に有用なベクターは、最低でも、選択されたＡＡＶ血清型のカプシド、例えばＡＡＶ８のカプシドまたはその断片をコードする配列を含有する。別の実施形態では、有用なベクターは、最低でも、選択されたＡＡＶ血清型のｒｅｐタンパク質、例えば、ＡＡＶ８のｒｅｐタンパク質またはその断片をコードする配列を含有する。必要に応じて、そのようなベクターは、ＡＡＶのｃａｐタンパク質およびｒｅｐタンパク質の両方を含有し得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐの両方を提供するベクターでは、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列はどちらも１つの血清型起源のもの、例えば、全てＡＡＶ８起源のものであり得る。あるいは、ｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供するＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型由来のものであるベクターを使用することができる。一実施形態では、ｒｅｐ配列とｃａｐ配列を別々の供給源（例えば、別々のベクター、または宿主細胞およびベクター）から発現させる。別の実施形態では、これらのｒｅｐ配列を異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列とインフレームで融合して、米国特許第７，２８２，１９９号に記載されているＡＡＶ２／８などのキメラＡＡＶベクターを形成する。
適切な組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本明細書で定義されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型のカプシドタンパク質またはその断片；機能的なｒｅｐ遺伝子；最低でも、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）およびライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドで構成されるミニ遺伝子；ならびにミニ遺伝子のＡＡＶカプシドタンパク質へのパッケージングを可能するための十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することによって生成される。ＡＡＶミニ遺伝子をＡＡＶカプシドにパッケージングするために宿主細胞中で培養する必要がある構成成分を宿主細胞にトランスで提供することができる。あるいは、必要な構成成分（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のうちの任意の１つまたは複数を、当業者に公知の方法を使用して必要な構成成分のうちの１つまたは複数を含有するように工学的に操作された安定な宿主細胞によって提供することができる。
そのような安定な宿主細胞は構成的プロモーターの制御下にある必要な構成成分（複数可）を含有することが最も適切である。しかし、必要な構成成分（複数可）は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター例は本明細書の他の箇所に提示されており、また、当技術分野で周知である。なお別の代替では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された構成成分（複数可）および１種または複数種の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成成分（複数可）を含有し得る。例えば、２９３細胞に由来する安定な宿主細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含有する）を生成することができるが、これは、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する。当業者はなお他の安定な宿主細胞を生成することができる。
本開示のｒＡＡＶを作製するために必要なミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、これらの配列を運んで移入する任意の遺伝子エレメントの形態でパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載のものおよび当技術分野において利用可能な任意の他のものを含めた任意の適切な方法を使用して送達することができる。本開示の任意の実施形態を構築するために使用される方法は核酸操作の当業者には公知であり、それらとして、遺伝子操作、組換え操作、および合成技法が挙げられる（例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Yを参照されたい）。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、適切な方法の選択は本開示に対する限定ではない（例えば、とりわけ、K. Fisher et al, 1993 J. Virol., 70: 520-532および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい）。
別段の指定がない限り、ＡＡＶ ＩＴＲおよび本明細書に記載の他の選択されたＡＡＶ構成成分は、これだけに限定することなく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９または他の既知もしくは未知のＡＡＶ血清型を含めた任意のＡＡＶ血清型の中から容易に選択することができる。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成成分は、ＡＡＶ血清型から、当業者が利用可能な技法を使用して容易に単離することができる。そのようなＡＡＶは、学術的供給源、商業的供給源、または公共の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から単離することまたは入手することができる。あるいは、文献でまたはデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどで入手可能なものなどの公開された配列を参照することにより、合成または他の適切な手段によってＡＡＶ配列を得ることができる。
一部の実施形態では、バイシストロニックベクターは配列番号１の核酸配列を含む。他の実施形態では、バイシストロニックベクターは、配列番号１に対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の類似性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、コードされるライソゾーム酵素は、以下の表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する。他の実施形態では、ライソゾーム酵素は、以下の表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つである。
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一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）およびライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドは配列番号５～１０の核酸配列を含む。他の実施形態では、ライソゾーム酵素は、配列番号５～１０に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の類似性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅは、配列番号４の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。他の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅは、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の類似性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
本開示はまた、本明細書に開示されるものに対して実質的な相同性を有する任意の形態のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むと解釈されるべきである。
「実質的に相同な」ポリペプチドは、本明細書に開示されるペプチドのアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％相同である、より好ましくは約７０％相同である、なおより好ましくは約８０％相同である、より好ましくは約９０％相同である、なおより好ましくは約９５％相同である、およびなおより好ましくは約９９％相同である。
あるいは、ポリペプチドを、組換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作出することができる。ペプチドの組成をアミノ酸分析または配列決定によって確認することができる。本開示によるポリペプチドのバリアントは、（ｉ）アミノ酸残基のうちの１つまたは複数が保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基（保存されたアミノ酸残基が好ましい）で置換されたバリアントであって、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされるものであってもそうでなくてもよい、バリアント（ｉｉ）１つまたは複数の修飾されたアミノ酸残基、例えば、置換基の付着によって修飾された残基が存在するバリアント、（ｉｉｉ）ポリペプチドが本開示のポリペプチドのオルタナティブスプライスバリアントであるバリアント、（ｉｖ）ポリペプチドの断片および／または（ｖ）ポリペプチドがリーダー配列もしくは分泌配列または精製のために使用される配列（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出のために使用される配列（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）などの別のポリペプチドと融合しているバリアントであり得る。断片は、元の配列のタンパク質分解による切断（多部位タンパク質分解を含む）によって生成されたポリペプチドを含む。バリアントは、翻訳後修飾または化学修飾されたものであり得る。そのようなバリアントは本明細書における教示から当業者の能力の範囲内に入るとみなされる。
当技術分野で公知の通り、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。バリアントは、元の配列とは異なる、好ましくは元の配列と目的のセグメント当たり残基の４０％未満が異なる、より好ましくは元の配列と目的のセグメント当たり残基の２５％未満が異なる、より好ましくは目的のセグメント当たり残基の１０％未満が異なる、最も好ましくは、元のタンパク質配列と目的のセグメント当たりほんのわずかな残基だけ異なり、同時に、元の配列の機能性および／またはユビキチンもしくはユビキチン化タンパク質に結合する能力が保存されるのに十分に元の配列と相同であるポリペプチド配列を含むと定義される。本開示は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似しているまたは同一であるアミノ酸配列を含む。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性をＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)］を使用して決定することが好ましい。
本明細書に開示されるポリペプチドを翻訳後修飾することができる。例えば、本開示の範囲内に入る翻訳後修飾としては、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディングおよびタンパク質プロセシングなどが挙げられる。いくつかの修飾またはプロセシング事象には、追加的な生物学的機構の導入が必要である。例えば、シグナルペプチド切断およびコアグリコシル化などのプロセシング事象を、イヌミクロソーム膜またはアフリカツメガエル卵抽出物を標準の翻訳反応に追加することによって試験することができる。
本開示のポリペプチドは、翻訳後修飾によって、または翻訳の間に非天然アミノ酸を導入することによって形成される非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳の間に非天然アミノ酸を導入するための種々の手法が利用可能である。
「機能的に等価」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示のライソゾーム酵素の特定のアミノ酸配列の少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持することが好ましいポリペプチドを指す。
ポリペプチドをタンパク質などの他の分子とコンジュゲートして融合タンパク質を調製することができる。これは、例えば、得られる融合タンパク質が本開示のライソゾーム酵素の機能性を保持することを条件として、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質を合成することによって実現することができる。
ポリペプチドを従来の方法を使用してリン酸化することができる。一実施形態では、本開示のライソゾーム酵素を本開示の改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）によりリン酸化することができる。
ペプチドまたはキメラタンパク質の環状誘導体も本明細書において意図されている。環化により、ペプチドまたはキメラタンパク質に他の分子との結び付きのためのより好都合なコンフォメーションを想定することが可能になり得る。環化は、当技術分野で公知の技法を使用して実現することができる。例えば、遊離のスルフヒドリル基を有する２つの妥当な間隔が空いた構成成分の間にジスルフィド結合を形成することができる、または、１つの構成成分のアミノ基と別の構成成分のカルボキシル基の間にアミド結合を形成することができる。
環化は、アゾベンゼン含有アミノ酸を使用して実現することもできる。結合を形成する構成成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸構成成分またはこれら２つの組合せであり得る。一実施形態では、環状ペプチドは、右位にベータターンを含み得る。ベータターンは、アミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを右位に付加することによって本開示のペプチドに導入することができる。上記のペプチド結合による連結を含有する環状ペプチドよりも柔軟な環状ペプチドを作製することが望ましい。より柔軟なペプチドは、ペプチドの右位および左位にシステインを導入し、２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成することによって調製することができる。２つのシステインは、ベータ－シートおよびターンが変形しないように配置する。ペプチドは、ジスルフィド連結の長さ、およびベータ－シート部分の水素結合の数がより少ないことの結果として、より柔軟なものになる。環状ペプチドの相対的な柔軟性は分子ダイナミクスシミュレーションによって決定することができる。
タグ
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、タグのアミノ酸配列をさらに含む。タグは、これだけに限定されないが、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えばＨ６およびＨ１０など）またはＩＭＡＣ系に使用するための他のタグ、例えばＮｉ２＋アフィニティーカラムなど、ＧＳＴ融合、ＭＢＰ融合、ストレプトアビジンタグ、細菌酵素ＢＩＲＡのＢＳＰビオチン化標的配列および抗体の対象となるタグエピトープ（例えば、とりわけ、ｃ－ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＰＣ４－タグ）を含む。当業者には認められる通り、タグペプチドを本開示の融合タンパク質の精製、検査、選択および／または可視化のために使用することができる。一実施形態では、タグは、検出タグおよび／または精製タグである。タグ配列は本開示のタンパク質の機能に干渉しないことが理解されよう。
リーダー配列および分泌配列
したがって、本開示のポリペプチドをリーダー配列もしくは分泌配列または精製もしくは検出のために使用される配列などの別のポリペプチドまたはタグと融合することができる。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示のポリペプチドの迅速な高親和性精製のための基礎をもたらすグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタンパク質タグを含む。実際に、次いでこのＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンに対する高親和性によって細胞から精製することができる。アガロースビーズをグルタチオンにカップリングすることができ、そのようなグルタチオン－アガロースビーズはＧＳＴタンパク質と結合する。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドを固体支持体に結合させることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドがＧＳＴ部分を含む場合、ポリペプチドはグルタチオンで修飾された支持体とカップリングする。一部の実施形態では、グルタチオンで修飾された支持体はグルタチオン－アガロースビーズである。さらに、プロテアーゼ切断部位をコードする配列をアフィニティータグとポリペプチド配列の間に含めることができ、したがって、この特定の酵素とのインキュベーション後に結合しているタグを除去し、したがって、対応する目的のタンパク質の精製を容易にすることが可能になる。
本明細書に開示されるポリペプチドを、標的タンパク質および／またはキメラタンパク質を所望の細胞構成成分または細胞型または組織に向きつけることができるターゲティングドメインと融合するまたはそれに組み込むこともできる。キメラタンパク質は、追加的なアミノ酸配列またはドメインも含有し得る。キメラタンパク質は、種々の構成成分が異なる供給源に由来し、したがって、天然では一緒に見いだされない（すなわち異種である）という意味で、組換え型である。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ポリペプチドは、本開示のライソゾームタンパク質のペプチド模倣体または本開示のライソゾームタンパク質のペプチド模倣体をコードするベクターを含む。ペプチド模倣体は、ペプチドおよびタンパク質に基づくまたはそれに由来する化合物である。
他の分子とコンジュゲートした本開示のペプチドまたはキメラタンパク質で構成されるＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、ペプチドまたはキメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端と、所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質または選択マーカーの配列を組換え技法によって融合することによって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載の選択されたタンパク質またはマーカータンパク質と融合したペプチドまたはキメラタンパク質を含むライソゾーム酵素を含有する。融合タンパク質を調製するために使用することができるタンパク質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、および短縮型ｍｙｃが挙げられる。
本開示のポリペプチドおよびキメラタンパク質を、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、またはギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、およびトルエンスルホン酸などの有機酸と反応させることによって医薬塩に変換することができる。
改変された細胞
一部の実施形態では、本開示は、本開示のベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）である。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクター（例えば、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ミセル、ポリマーソーム、エキソソームである）。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの配列のバイシストロニック発現、ポリシストロニック発現またはマルチシストロニック発現を可能にする少なくとも１つのエレメントを含有する。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のライソゾーム酵素をコードする配列を含む。その代わりに、またはそれに加えて、一部の実施形態では、ベクターは、本開示のＳ１Ｓ３構築物をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている酵素のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、ベクターは、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている酵素のうちの１つまたは複数であるライソゾーム酵素をコードする核酸またはアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のベクターを含む細胞は、本開示の改変された細胞である。一部の実施形態では、本開示のベクターを含む細胞は天然には存在しないものである。
一部の実施形態では、細胞は、ヒト配列を発現することおよび／またはヒトタンパク質を産生することができる哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、または非ヒト霊長類から単離されたまたはそれに由来するものである。
一部の実施形態では、細胞は、ヒト配列を発現することおよび／またはヒトタンパク質を産生することができるヒト細胞である。
一部の実施形態では、細胞は、本開示のベクターを発現するように改変され、ｅｘ ｖｉｖｏで培養された初代細胞である。一部の実施形態では、培養細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の無制限の増殖が容易になるように不死化したまたは他のように改変し、それにより、培養細胞株を生成する。
宿主細胞
一部の実施形態では、本開示は、本開示のバイシストロニックベクターを含む細胞を提供する。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。妥当な細胞としては、これだけに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示は、本開示のバイシストロニックベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。
開示されるバイシストロニックベクターを含む宿主細胞を、タンパク質の発現、および必要に応じて精製のために使用することができる。タンパク質を発現させ、必要に応じて、発現されたタンパク質を宿主から精製するための方法は当技術分野では標準である。
一部の実施形態では、本開示のベクターを含む宿主細胞を使用して、本開示の酵素構築物によってコードされるポリペプチドを産生させることができる。一般に、本開示のポリペプチドの産生は、宿主細胞に酵素構築物を含むベクターをトランスフェクトし、次いで、細胞を培養し、その結果、細胞により所望のポリペプチドが転写され、翻訳されることを伴う。次いで、単離された宿主細胞を溶解させて、発現されたポリペプチドをその後の精製のために抽出することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。適切な原核細胞の非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ． Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｓｐ．、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｚｙｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐ．、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ． 、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． 、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．ならびに、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ ｓｐ．などのアルファ－プロテオバクテリア、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄細菌および緑色非硫黄細菌、グラム陰性球菌、選好性であるグラム陰性桿菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅグルコース発酵性グラム陰性桿菌、非グルコース発酵体であるグラム陰性桿菌、オキシダーゼ陽性グルコース発酵性グラム陰性桿菌が挙げられる。タンパク質発現のために特に有用な細菌宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＣ １０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｆ ｌａｖａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓなどのグラム陰性菌、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓなどのグラム陽性菌が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉは最も広く使用されている発現宿主の１つである。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける過剰発現のための技法は十分に開発されており、当業者は容易に利用可能である。
さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、組換えタンパク質の高レベル産生のため（すなわち、生物学的治療薬およびワクチンを開発するため）に一般に使用される。
一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母または真菌細胞である。タンパク質発現のために特に有用な真菌宿主細胞としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍが挙げられる。タンパク質発現のために特に有用な酵母宿主細胞としては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。非限定的な例としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１など）、ショウジョウバエ属細胞株、または蚊細胞株（例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株など）が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。タンパク質発現のために有用な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト胎児由来腎臓細胞、Ｂｏｓ ｐｒｉｍｉｇｅｎｉｕｓ、およびＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓが挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。さらに、哺乳動物宿主細胞は、樹立された、商業的に入手可能な細胞株（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）であり得る。宿主細胞は不死化細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は初代細胞であり得る。
一部の実施形態では、宿主細胞は、目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学的に操作されている。
本開示の方法
一部の実施形態では、本開示は、ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に罹患している対象を処置する方法を提供する。方法は、対象に、本明細書の他の箇所で開示されているバイシストロニックベクターによって発現されるライソゾーム酵素を含む医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、ライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、対象が処置される。
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の出現を予防する方法を提供する。方法は、対象に、本明細書の他の箇所で開示されているバイシストロニックベクターによって発現されるライソゾーム酵素を含む医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、ライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、対象におけるＬＳＤの出現が予防される。
一部の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１に列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する。他の実施形態では、ライソゾーム酵素は、表１に列挙されている少なくとも１つである。
さらなる実施形態では、投与するステップは、経腸、非経口、経口、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、および動脈内（ＩＡ）からなる群から選択される投与経路を含む。開示される方法に使用することができる追加的な投与経路は本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。
併用療法
本明細書に記載のＬＳＤを処置または予防するための組成物および方法は、ＬＳＤの処置に有用な少なくとも１種の追加的な化合物と組み合わせると有用であり得る。追加的な化合物は、ＬＳＤを処置する、予防する、またはＬＳＤの症状を低減することが分かっている市販の化合物を含み得る。化合物は当技術分野で公知のＥＲＴであり得るが、それに限定されない。
医薬組成物および製剤
本開示のバイシストロニックベクターによって発現されるライソゾーム酵素を含む医薬組成物も本発明で提供される。
そのような医薬組成物は対象への投与に適した形態である、または、医薬組成物は１種または複数種の薬学的に許容される担体、１種または複数種の追加的な成分、またはこれらのいくつかの組合せをさらに含み得る。医薬組成物の種々の構成成分は、例えば、当技術分野で周知の生理的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わせてなど、生理的に許容される塩の形態で存在し得る。
本開示の一部の実施形態では、本開示の方法を実施するために有用な医薬組成物を１ｎｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日の間の送達用量で投与することができる。本開示の一部の実施形態では、本開示を実施するために有用な医薬組成物を１ｎｇ／ｋｇ／日から５００ｍｇ／ｋｇ／日の間の送達用量で投与することができる。本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加的な成分の相対量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および状態に応じて、さらに組成物を投与する経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含み得る。
本開示の一部の実施形態では、本開示の方法を実施するために有用な医薬組成物を１ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間の送達用量で投与することができる。本開示の一部の実施形態では、本開示を実施するために有用な医薬組成物を１ｎｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇの間の送達用量で投与することができる。本開示の一部の実施形態では、医薬組成物を毎日、週に１回、２週間に１回、月に１回、年に１回提供する。本開示の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、および任意の追加的な成分の相対量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および状態に応じて、さらに組成物を投与する経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含み得る。
本開示の方法において有用な医薬組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局部、経皮、肺、鼻腔内、頬側、点眼、くも膜下腔内、静脈内または別の投与経路用に適切に開発することができる。他の意図されている製剤としては、突出ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再封赤血球、および免疫に基づく製剤が挙げられる。投与の経路（複数可）は当業者には容易に明らかになり、処置される疾患の型および重症度、処置を受ける動物またはヒト患者の型および年齢を含めた任意の数の因子などに依存する。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知の、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような予備的方法は、活性成分を担体または１つもしくは複数の他の副成分と結び付けるステップ、次いで、必要であるまたは望ましい場合、製品を所望の単回単位用量または多数回単位用量に形づくるまたは包装するステップを含む。一部の実施形態では、本開示の組成物は、天然のカプシド、改変されたカプシド中に、ネイキッドＲＮＡとして、または保護被覆に封入して製剤化することができる。
活性成分の量は、一般に、対象に投与されることになる活性成分の投薬量、またはそのような投薬量の都合のよい一部分、例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１などと等しい。単位剤形（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）は、単一の１日用量または多数の１日用量（例えば、１日当たり約１～４回またはそれよりも多く）のうちの１回分であり得る。多数の１日用量を使用する場合、単位剤形（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）の各用量は同じ場合もあり、異なる場合もある。
本発明で提供される医薬組成物の説明はヒトへの倫理的投与に適した医薬組成物を主に対象とするが、そのような組成物は一般にあらゆる動物への投与に適することが当業者には理解される。ヒトへの投与に適した医薬組成物を種々の動物への投与に適するものにするための組成物の改変はよく理解され、通常の技術を有する獣医薬理学者はそのような改変を、もし行う場合にはただ単に通常の実験だけで設計し、実施することができる。本開示の医薬組成物の投与を受けることが意図されている対象としては、これだけに限定されないが、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなどの商業的に適当な哺乳動物を含めた哺乳動物が挙げられる。一実施形態では、対象は、ヒト、または、これだけに限定されないが、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミなどの非ヒト哺乳動物である。一実施形態では、対象はヒトである。
一実施形態では、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を使用して組成物を製剤化する。一部の実施形態では、本開示は、ＬＳＤに罹患している対象を処置するための医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本開示のバイシストロニックベクターによって発現されるライソゾーム酵素および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
有用な薬学的に許容される担体としては、これだけに限定されないが、グリセロール、水、生理食塩水、エタノールならびにリン酸塩および有機酸の塩などの他の薬学的に許容される塩溶液が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。妥当な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより、微生物の作用の予防を実現することができる。一部の実施形態では、等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールなどの多価アルコールを組成物に含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に含めることにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
製剤を従来の賦形剤、すなわち、当技術分野で公知の経口、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または任意の他の適切な投与形式に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質と混合して使用することができる。医薬調製物を滅菌し、所望であれば補助的な薬剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤の浸透圧に影響を及ぼす塩、着色物質、香味物質および／または芳香物質などと混合することができる。医薬調製物を所望であれば他の活性薬剤、例えば他の鎮痛剤と組み合わせることもできる。
開示される組成物は、組成物の総重量の約０．００５％から２．０％までの保存剤を含み得る。保存剤は、環境中の夾雑物に曝露する場合に腐敗を防止するために使用される。本開示に従って有用な保存剤の例としては、これだけに限定されないが、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素およびこれらの組合せからなる群から選択されるものが挙げられる。一部の実施形態では、保存剤は、約０．５％～２．０％のベンジルアルコールと０．０５％～０．５％のソルビン酸の組合せである。
組成物は、化合物の分解を阻害する抗酸化剤およびキレート剤を含み得る。いくつかの化合物に対して好ましい抗酸化剤は、約０．０１％～０．３％の好ましい範囲内のＢＨＴ、ＢＨＡ、アルファ－トコフェロールおよびアスコルビン酸であり、組成物の総重量の０．０３重量％～０．１重量％の範囲内のＢＨＴがより好ましい。キレート剤は、組成物の総重量の０．０１重量％から０．５重量％までの量で存在することが好ましい。特に好ましいキレート剤として、組成物の総重量の約０．０１％～０．２０％の重量範囲内およびより好ましくは０．０２重量％～０．１０重量％の範囲内のエデト酸塩（例えばエデト酸二ナトリウム）およびクエン酸が挙げられる。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に対して有害であり得る組成物中の金属イオンのキレート化に有用である。一部の実施形態では、一部の化合物に対してはＢＨＴおよびエデト酸二ナトリウムがそれぞれ抗酸化剤およびキレート剤であるが、当業者に公知の他の適切かつ等価の抗酸化剤およびキレート剤で代用することができる。
投与／投薬
投与のレジメンは有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。例えば、治療用製剤を患者対象にライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関連する外科的介入の前もしくはその後のいずれか、または患者がライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の診断を受けた直後に投与することができる。さらに、いくつかの分割投薬量、ならびに時差的投薬量を毎日もしくは逐次的に投与することができる、または、用量を連続的に注入することができる、またはボーラス注射であり得る。さらに、治療用製剤の投薬量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示される通り比例して増加または減少し得る。
本開示の組成物の患者対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの投与は、公知の手順を使用して、対象におけるライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置するために有効な投薬量でそのために有効な期間にわたって行われる。治療効果を実現するために必要な治療用化合物の有効量は、使用される特定の化合物の活性；投与時間；化合物の排出速度；処置の持続時間；化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物または材料；疾患または障害の状態、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子などの因子に応じて変動し得る。最適な治療応答がもたらされるように投薬量レジメンを調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することができる、または治療状況の緊急性に示される通り用量を比例して減少させることができる。本開示の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な例は１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから１日当たり体重１ｋｇ当たり５０ｍｇまでである。
化合物を対象に１日数回の頻度で投与することもでき、化合物をより低頻度で、例えば、１日１回、週に１回、２週間に１回、１カ月に１回、またはさらにはより低頻度で、例えば、数カ月に１回またはさらには１年に１回またはそれよりも低頻度で投与することができる。１日当たりに投薬される化合物の量を、非限定的な例では、毎日、１日おきに、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、または５日ごとに投与することができることが理解される。例えば、１日おきに投与する場合、１日当たり５ｍｇの用量を月曜日に開始し、第１のその後の１日当たり５ｍｇの用量を水曜日に投与し、第２のその後の１日当たり５ｍｇの用量を金曜日に投与する、などであり得る。投薬の頻度は当業者には容易に明らかになり、これだけに限定されないが、処置される疾患の型および重症度、ならびに動物の型および年齢などの任意の数の因子に依存する。本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者に関して所望の治療応答を実現するために有効な活性成分の量、組成物、および投与形式が患者に対して有毒になることなく得られるように変動させることができる。当技術分野における通常の技術を有する医学博士、例えば医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物に使用される本開示の化合物の投薬を所望の治療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、投薬量を所望の効果が実現されるまで徐々に増加させることができる。
一部の実施形態では、投与のしやすさおよび投薬量の均一性のために化合物を単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）に製剤化することが特に有利である。単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）は、本明細書で使用される場合、処置を受ける患者に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位が、所望の治療効果がもたらされるように算出された所定の数量の治療用化合物を必要な医薬ビヒクルを伴って含有する。本開示の単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）は、（ａ）治療用化合物の固有の特徴および実現されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）ＬＳＤを処置するためのそのような治療用化合物の配合／製剤化の技術分野における固有の制限によって規定され、それに直接依存する。
投与経路
１つよりも多くの経路を投与のために使用することができるが、特定の経路により、別の経路よりも即時的かつ有効な反応がもたらされることが当業者には理解されよう。
開示される組成物の投与経路としては、吸入、経口、経鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣（例えば、経膣および膣周囲）、鼻（内）、および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、大槽内（ＩＣＭ）、脊髄内、脳室内、脳室内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、および局部投与が挙げられる。適切な組成物および剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット、ピル、ジェルカプセル、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ、経皮吸収パッチ、ゲル、散剤、ペレット、泥膏、ロゼンジ、クリーム剤、ペースト剤、貼付剤、ローション剤、ディスク、坐剤、経鼻または経口投与用の液体噴霧剤、吸入用の乾燥粉末またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが挙げられる。本開示において有用な製剤および組成物は本明細書に記載されている特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるべきである。一実施形態では、ＬＳＤの処置は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局部、経皮、肺、鼻腔内、頬側、点眼、肝内動脈、胸膜内、くも膜下腔内、腫瘍内、静脈内およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される投与経路を含む。
遺伝子治療の投与
種々の送達方法を利用してベクターを細胞に投与することができることが当業者には理解される。例としては、（１）電気穿孔（電気的）、遺伝子銃（物理的な力）または大きな体積の液体の適用（圧力）などの物理的手段を利用する方法；および（２）ベクターをリポソーム、凝集タンパク質またはトランスポーター分子などの別の実体との複合体にする方法が挙げられる。
さらに、実際の用量およびスケジュールは、組成物を他の医薬組成物と組み合わせて投与するかどうかに応じて、または、薬物動態、薬物消失、および代謝の個体間の差異に応じて変動し得る。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける適用では、利用される特定の細胞株に応じて（例えば、細胞表面上に存在するベクター受容体の数、または複製の遺伝子移入に使用される特定のベクターの、その細胞株において複製する能力に基づいて）量を変動させることができる。さらに、細胞当たりに添加されるベクターの量は、ベクターに挿入される治療用遺伝子の長さおよび安定性によって、ならびに配列の性質によっても変動する可能性が高く、特に経験的に決定する必要があるパラメータであり、本開示の方法に固有ではない因子（例えば、合成に伴う費用）に起因して変更することができる。当業者は特定の状況の緊急性に従って任意の必要な調整を容易に行うことができる。
治療剤を含有する細胞はまた、自殺遺伝子、すなわち、細胞を破壊するために使用することができる産物をコードする遺伝子も含有し得る。多くの遺伝子治療の状況において、治療のための遺伝子を宿主細胞において発現させることができることが望ましいが、宿主細胞を随意に破壊する能力を有することも望ましい。治療剤を、活性化化合物の非存在下では発現が活性化されない自殺遺伝子と連結することができる。薬剤と自殺遺伝子の両方が導入された細胞の死滅が望まれる場合、活性化化合物を細胞に投与し、それにより、自殺遺伝子の発現を活性化し、細胞を死滅させる。使用することができる自殺遺伝子／プロドラッグの組合せの例は、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）とガンシクロビル、アシクロビル；オキシドレダクターゼとシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼと５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。
治療薬
本開示は、ＬＳＤの診断を受けた対象またはＬＤＳが発症するリスクがある対象におけるライソゾーム酵素の欠損を処置するための方法を包含する。当該方法により、ライソゾーム酵素のリン酸化が改善され、それにより、対象が処置されるまたは対象におけるＬＳＤの出現が予防される。さらに、当該方法により、患者の生活の質が改善される。一実施形態では、本開示の方法は、対象に、ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドおよびＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与するステップを含む。
核酸配列：
ｐＬＬ０１バイシストロニックベクター配列（配列番号１）（ＣＭＶプロモーター：イタリック体および下線。ＩＲＥＳ：太字およびイタリック体。Ｓ１－Ｓ３：太字および下線。）
Figure 2022538497000016
Figure 2022538497000017
Figure 2022538497000018
ＣＭＶ配列（配列番号２）
Figure 2022538497000019
ＩＲＥＳ配列（配列番号３）
Figure 2022538497000020
改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）、Ｓ１－Ｓ３配列（配列番号４）
Figure 2022538497000021
Figure 2022538497000022
ｈＧＢＡ野生型配列（配列番号５）：
Figure 2022538497000023
ｈＧＢＡの天然のバリアント配列（配列番号１６２）：ｈＧＢＡ（Ｋ３６０Ｎ）配列。突然変異部位のヌクレオチドに太字および下線が引かれている。
Figure 2022538497000024
Figure 2022538497000025
ｈＧＢＡの工学的に作製されたバリアント配列（配列番号１６３）：ｈＧＢＡ（Ｃ１６５Ｓ）配列。突然変異部位のヌクレオチドに太字および下線が引かれている。
Figure 2022538497000026
ｍＧＡＬＣ配列（配列番号６）：
Figure 2022538497000027
Figure 2022538497000028
ｈＧＬＡ配列（配列番号７）：
Figure 2022538497000029
ｈＮＡＧＬＵ配列（配列番号８）：
Figure 2022538497000030
Figure 2022538497000031
ｈＧＡＡ配列（配列番号９）：
Figure 2022538497000032
Figure 2022538497000033
ｈＧＡＡ（配列番号１６４；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０２５３－１）
Figure 2022538497000034
ｈＬＡＭＡＮ配列（配列番号１０）：
Figure 2022538497000035
Figure 2022538497000036
ｈＧＡＬＣ配列（配列番号２３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０３６５１８．２）：
Figure 2022538497000037
Figure 2022538497000038
ＣＥＦプロモーター配列（配列番号１６１）：
Figure 2022538497000039
Figure 2022538497000040
ここで以下の実施例を参照して本開示を説明する。これらの実施例は単に例示する目的で提示され、本開示は決してこれらの実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、本明細書に提示される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形形態を包含するものと解釈されるべきである。
さらなる説明を伴わずに、当業者は、前述の説明および以下の実例を使用して、本開示の化合物を作出し、利用し、特許請求された方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例では本開示の好ましい実施形態が具体的に示され、本開示の残りを決して限定するものではないと解釈される。
これらの実験に使用される材料および方法をここに記載する。
細胞株：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有するＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持した。Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、懸濁液として成長させた。
ＤＮＡ構築物：ＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３プラスミドはＳｔ．ＬｏｕｉｓにあるＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＰｒｏｆ．Ｓｔｕａｒｔ Ｋｏｒｎｆｅｌｄから提供された。バイシストロニックベクターｐＬＬ０１を以下の通り二段階で創出した：第１のステップでは、Ｐｔａｓｅ α／βおよびγバイシストロニック構築物（Ｐｒｏｆ．Ｓｔｕａｒｔ Ｋｏｒｎｆｅｌｄから提供されたもの）から４８６ｂｐのＩＲＥＳ配列を増幅し、プラスミドＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３からＰＣＲによってＳ１－Ｓ３遺伝子断片を得た。これらの２つの断片を、その後、第２のステップで、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって連結して、ＩＲＥＳ－Ｓ１Ｓ３断片を形成した。ＩＲＥＳ－Ｓ１Ｓ３断片をＨｐａＩおよびＰｍｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）で消化し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにライゲーションした。ｐＬＬ１１、ｐＬＬ２１、ｐＬＬ３１、ｐＬＬ４１、ｐＬＬ５１およびｐＬＬ６１バイシストロニックプラスミドを生成するために、ｈＧＢＡ、ｈＧＡＡ、ｍＧＡＬＣ、ｈＮＡＧＬＵ、ｈＧＬＡおよびｈＬＡＭＡＮ遺伝子をそれらの特異的なプライマー（表１）によって増幅し、バイシストロニックベクター（ｐＬＬ０１）に挿入した。
ホスホトランスフェラーゼアッセイ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＥｘｐｉ２９３細胞を回収し、溶解緩衝剤（２５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に溶解させた。細胞抽出物５μｌをホスホトランスフェラーゼアッセイ緩衝剤（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、２ｍＭのＡＴＰ）中、７５ｍＭのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、１ｍＣｉのＵＤＰ－［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、および１００ｍＭのａＭＭの存在下、最終的な体積を５０μＬとして、３７℃で０．５時間インキュベートした。２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０ １ｍＬを添加することによって反応を停止させ、試料をＱＡＥ－セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）クロマトグラフィーに供した。
酵素産生：Ｅｘｐｉ２９３細胞に空ベクター、バイシストロニックプラスミドまたはその単一発現プラスミドをトランスフェクトした。２～３日後に培地を回収した。ＧＢＡの産生のために、分泌された酵素を安定化するための細胞培養中の３０μＭのイソファゴミンを含有する条件培地を４℃で終夜ＰＢＳ緩衝剤中に透析して酵素活性アッセイのためにイソファゴミンを除去した。
酵素活性アッセイ：以下の基質を酵素活性アッセイのために使用する：４－メチルウンベリフェリル［３－Ｄ－グルコピラノシド（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ酵素基質、Ｍ３６３３、Ｓｉｇｍａ）、４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－グルコピラノシド（ＧＡＡ酵素基質、Ｍ９７６６、Ｓｉｇｍａ）、６－ヘキサデカノイルアミノ－４－メチルウンベリフェリル［３－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＧＡＬＣ酵素基質、ＥＨ０５９８９、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）、４－メチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニド（ＮＡＧＬＵ酵素基質、４７４５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＧＬＡ酵素基質、Ｍ７６３３、Ｓｉｇｍａ）、および４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－マンノピラノシド（ＬＡＭＡＮ酵素基質、Ｍ３６５７、Ｓｉｇｍａ）。ＧＢＡ酵素活性について、クエン酸・リン酸緩衝剤、ｐＨ５．０、０．２５％ＴＸ－１００、０．２５％タウロコール酸Ｎａ中、１ｍＭのＧＢＡ基質を用いてアッセイした。ＧＡＡ酵素活性について、クエン酸緩衝剤、ｐＨ４．０、０．２５％ＴＸ－１００中、１ｍＭのＧＡＡ基質を用いてアッセイを行った。ＧＡＬＣ酵素活性について、クエン酸・リン酸緩衝剤、ｐＨ４．０、０．２５％ＴＸ－１００、０．６％タウロコール酸Ｎａ、０．２％オレイン酸中、０．１ｍＭのＧＡＬＣ基質を用いてアッセイを実行した。ＮＡＧＬＵ酵素活性について、クエン酸緩衝剤、ｐＨ４．０、０．２５％ＴＸ－１００中、１ｍＭのＮＡＧＬＵ基質を用いてアッセイした。ＧＬＡ酵素活性について、クエン酸緩衝剤、ｐＨ４．５、０．２５％ＴＸ－１００中、１ｍＭのＧＬＡ基質を用いてアッセイした。ＬＡＭＡＮ酵素活性について、クエン酸緩衝剤、ｐＨ４．０、０．２５％ＴＸ－１００中、１ｍＭのＬＡＭＡＮ基質を用いてアッセイした。
ＣＩ－ＭＰＲ結合アッセイ：ＣＩ－ＭＰＲへの結合を高結合性９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６０１）において実施した。プレートを、精製ウシＣＩ－ＭＰＲ５０μｌを用い、１０μｇ／ｍｌ、室温（ＲＴ）で１時間にわたって固定化を行い、２％ＢＳＡを用いて室温でさらに１時間ブロッキングした。トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞由来の条件培地の一定分量をＨｅｐｅｓ緩衝剤（４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で希釈し、固定化したＣＩ－ＭＰＲと一緒に室温で１時間インキュベートして、リン酸化ライソゾーム酵素を結合させた。３回洗浄した後、ライソゾーム酵素活性を４－メチルウンベリフェロン法によってアッセイした。
（実施例１）
ライソゾーム酵素発現のための、ホスホトランスフェラーゼ（Ｓ１－Ｓ３）を含有する空のバイシストロニックベクターの生成
２つの遺伝子（ＧＮＰＴＡＢおよびＧＮＰＴＧ）によってコードされるα２β２γ２六量体であるＧｌｃＮＡｃ－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１－ＰＴａｓｅ、Ｐｔａｓｅとも称される）は、カチオン非依存性マンノース６リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）を介したライソゾームへのターゲティングに必要なリン酸化オリゴ糖の生成に関与する。発現されたライソゾーム酵素のリン酸化は、工学的に作製された短縮型Ｐｔａｓｅ（Ｓ１－Ｓ３）の同時トランスフェクションによって有意に増加する。この試験では、ライソゾーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＬＳＤ、これだけに限定されないが、ゴーシェ病、ポンペ病、およびα－マンノシドーシスなど）を処置するためのリン酸化ライソゾーム酵素の産生のためにＳ１－Ｓ３構築物を利用する。
酵素補充療法（ＥＲＴ）のための高度にリン酸化された治療用ライソゾーム酵素を産生させるために、同じ細胞で同時に、治療用ライソゾーム酵素およびＳ１－Ｓ３を同時発現させた。Ｓ１－Ｓ３とライソゾーム酵素は異なるベクターで発現されるので、高度にリン酸化された治療用ライソゾーム酵素を産生させるために、ライソゾーム酵素およびＳ１－Ｓ３を発現する安定細胞株を二段階で生成した：（ａ）Ｐｔａｓｅ Ｓ１－Ｓ３を発現する安定細胞株を創出する；（ｂ）Ｓ１－Ｓ３安定細胞株に基づいて、Ｓ１－Ｓ３安定細胞株に治療用ライソゾーム酵素の発現が追加される第２の細胞株を生成する。この二段階の時間のかかる手順を回避するために、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を導入することにより、２つの別々の遺伝子を単一のプロモーターの下で発現させることができるバイシストロニックベクターが本明細書に開示される。
バイシストロニック発現をライソゾーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＬＳＤ）に対する遺伝子治療に適用することもできる。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドベクター中、４８６ｂｐのＩＲＥＳ配列およびＳ１－Ｓ３遺伝子をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下で含有する空のバイシストロニックベクター－ｐＬＬ０１（図１Ｂ）。バイシストロニックベクターｐＬＬ０１は、ＩＲＥＳ配列の前に位置し、治療用ライソゾーム酵素遺伝子の挿入を可能にするマルチクローニング部位内の３つの独特の制限酵素切断部位を有する。バイシストロニックベクターｐＬＬ０１を使用したＳ１－Ｓ３の発現を調査するために、ＨＥＫ２９３細胞に、等価量のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３（図１Ａ）またはｐＬＬ０１をトランスフェクトした。４８時間後、細胞を回収し、溶解緩衝剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルを伴う２５ｍＭのトリス緩衝剤、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＴＸ－１００）中に溶解させた。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３またはｐＬＬ０１を発現する全細胞抽出物のホスホトランスフェラーゼ活性分析を実施してＳ１－Ｓ３の発現を決定した。図１Ｃに示されている通り、試料ＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３と比較して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）試料におけるホスホトランスフェラーゼ活性は無視できるものであったが、バイシストロニックベクターｐＬＬ０１では９．３％の活性が維持された。
（実施例２）
バイシストロニック発現により治療用ライソゾーム酵素のリン酸化が増強する
バイシストロニックベクターでのＳ１－Ｓ３の発現は低かったので（９．３％）（実施例１を参照されたい）、この試験は、低Ｓ１－Ｓ３活性がライソゾーム酵素のリン酸化に十分であるかどうかを決定するために設計した。６種の異なるライソゾーム酵素を本バイシストロニックベクターで試験した。酵素は以下の通りであった：酸性β－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）および酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）。
酸性β－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）：ＧＢＡは、ライソゾームにおいてその基質であるグルコセレブロシドを分解するライソゾーム酵素である。ライソゾームにおけるＧＢＡが欠損すると、最も一般的なライソゾーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＬＳＤ）であるゴーシェ病が引き起こされる。本開示のバイシストロニックベクターでのＧＢＡのリン酸化を試験するために、ＧＢＡバイシストロニックプラスミド－ｐＬＬ１１を、終止コドンを有する１６１１ｂｐのヒトＧＢＡ ｃＤＮＡ配列をバイシストロニック空ベクター－ｐＬＬ０１にＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を通じて挿入することによって生成した（図２Ａ）。ｐＬＬ１１およびＣＭＶ－Ｓ１Ｓ３プラスミドを伴うまたは伴わないＧＢＡプラスミドを同じ量で用いてＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞および条件培地を別々に回収した。驚いたことに、ｐＬＬ１１条件培地におけるＧＢＡ活性は２４０ｎｍｏｌ／時／ｍｌであり、これは、ＧＢＡ単独で調製された培地（９６ｎｍｏｌ／時／ｍｌ）またはＧＢＡとＳ１－Ｓ３の同時トランスフェクション（９０ｎｍｏｌ／時／ｍｌ、図２Ｂ）の２倍を超えるものであった。ＧＢＡ発現に加えて、Ｓ１－Ｓ３発現を、細胞抽出物を使用してホスホトランスフェラーゼアッセイによって数量化した。ＧＢＡを欠くバイシストロニックベクターｐＬＬ０１と同様に、ｐＬＬ１１試料のホスホトランスフェラーゼ発現はＧＢＡ＆Ｓ１－Ｓ３の同時トランスフェクション試料と比較して７．５％である（図２Ｃ）。
バイシストロニックベクターではＳ１－Ｓ３発現が低減したので、低ホスホトランスフェラーゼ発現のＧＢＡのリン酸化に対する結果を決定した。この目的のために、ｐＬＬ１１、ＧＢＡ単独およびＳ１－Ｓ３と同時トランスフェクトしたＧＢＡの条件培地を回収し、カチオン非依存性マンノース６リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）結合実験を実施することによってリン酸化の程度を定量化した。本開示のバイシストロニックベクターで産生されたＧＢＡのＣＩ－ＭＰＲへの結合はプラトー相でいっそう高かった（図３Ａ）。それにもかかわらず、線形範囲点を使用することによって受容体結合のパーセンテージを算出した場合、開示されるバイシストロニックベクターで生成されたＧＢＡの４４％がＣＩ－ＭＰＲと結合し、これは、Ｓ１－Ｓ３との同時トランスフェクションで産生されたＧＢＡと同じであり（４３％）、内因性ホスホトランスフェラーゼで産生されたＧＢＡの１０倍である（４．５％、図３Ｂ）。
力価測定は同定された分析物の濃度を決定するために当技術分野において広く使用されている。結合実験におけるＣＩ－ＭＰＲの濃度について力価測定を行った。受容体結合アッセイのために、段階的に希釈したＣＩ－ＭＰＲを９６ウェルプレートに固定化し、本開示のバイシストロニックベクターまたは内因性ホスファターゼ（Ｐｔａｓｅ）で産生されたＧＢＡ酵素を同様の量でプレートに添加した。図３Ｃに示されている通り、ｐＬＬ１１試料由来のＧＢＡの結合はＣＩ－ＭＰＲの濃度に依存し、受容体濃度が１５μｇ／ｍｌに達すると飽和し、一方、内因性Ｐｔａｓｅで産生されたＧＢＡの結合は低レベルのままである。本データから、開示されるバイシストロニックベクターによりＧＢＡ酵素のリン酸化レベルが著しく上昇することが示された。
酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）：ライソゾーム酵素ＧＡＡは、ライソゾームにおけるグリコーゲンのグルコースへの分解に必須である。ＧＡＡ遺伝子の突然変異はライソゾーム蓄積症であるポンペ病に関連する。ＧＡＡバイシストロニックプラスミド－ｐＬＬ２１を創出するために、終止コドンを含有する２８５９塩基対（ｂｐ）のヒトＧＡＡ遺伝子断片を増幅し、制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによる消化後にバイシストロニックベクターｐＬＬ０１に挿入した（図４Ａ）。配列が検証されたｐＬＬ２１およびＧＡＡプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。４８時間後、ＧＡＡ活性およびＣＩ－ＭＰＲへの結合実験のために条件培地を回収した。ＧＢＡと同様に、ｐＬＬ２１条件培地におけるＧＡＡ活性はＧＡＡ単一発現よりも高かった（図４Ｂ）。ｐＬＬ２１条件培地での結合はＧＡＡ単一条件培地よりも速く、かつ高度であった（図４Ｃ）。１時間のインキュベーション時間中、ｐＬＬ２１条件培地由来のＧＡＡの７２．５％がＣＩ－ＭＰＲに結合したが、ＧＡＡ単一発現由来のＧＡＡのＣＩ－ＭＰＲへの結合はたった２１．５％であった（図４Ｄ）。これらのデータにより、本開示のバイシストロニック発現プラットフォームによりＧＡＡ酵素のリン酸化を著しく増加させることができることが示唆された。
ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）：ライソゾームにおいて、ＧＡＬＣ酵素は、セラミド誘導体からガラクトースを除去することにより、ガラクトシルセラミドの異化の原因となる。ＧＡＬＣ酵素の遺伝子欠損はクラッベ病の原因である。本開示のバイシストロニック発現でのＧＡＬＣ酵素を試験するために、バイシストロニックプラスミドｐＬＬ３１を、マウスＧＡＬＣ遺伝子をベクターｐＬＬ０１に挿入することによって生成した（図５Ａ）。ｐＬＬ３１をトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞に関して収集されたｐＬＬ３１条件培地におけるＧＡＬＣ酵素活性はＧＡＬＣ単独培地と同様である（０．８６ｎｍｏｌ／μｌ／時対０．６２ｎｍｏｌ／μｌ／時、図５Ｂ）。ＣＩ－ＭＰＲ受容体への結合の結果から、ＧＡＬＣをＳ１－Ｓ３と共にバイシストロニック発現させることにより、ＧＡＬＣのＣＩ－ＭＰＲへの結合が２８．４％から５６．８％まで上昇することが示された（図５Ｃ＆Ｄ）。
α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）：ＮＡＧＬＵ遺伝子は、ライソゾームにおいてヘパリン硫酸を分解する酵素をコードする。ＮＡＧＬＵ酵素の欠陥により、ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢとしても公知のサンフィリポ症候群Ｂ型がもたらされる。ＥＲＴのための細胞株において産生されたＮＡＧＬＵ酵素はマンノース残基にいかなるリン酸も有さない。また、ＮＡＧＬＵ酵素のＥＲＴに関する臨床試験は今年初めに失敗している。ＮＡＧＬＵを本開示のバイシストロニックベクターで発現させるために、上記と同じ手順を使用した。２２２９ｂｐのヒトＮＡＧＬＵ遺伝子をｐＬＬ０１バイシストロニックベクターに挿入し（図６Ａ）、ＮＡＧＬＵバイシストロニックプラスミド－ｐＬＬ４１およびＮＡＧＬＵ単一発現プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地を使用することにより、試料ｐＬＬ４１におけるＮＡＧＬＵ活性がＮＡＧＬＵ単一発現試料よりも高いことが示された（図６Ｂ）。ＣＩ－ＭＰＲへの結合に関しては、ＮＡＧＬＵ単一発現試料からは、多量の酵素（９ｎｍｏｌ／時に至るまで、図６Ｃ～６Ｄ）を入れたにもかかわらず、ほとんどいかなるＮＡＧＬＵ結合も検出されなかった。しかし、バイシストロニックベクターで産生されたＮＡＧＬＵはＣＩ－ＭＰＲに最大２５％まで結合する（図６Ｃ～６Ｄ）。
α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）：ライソゾーム酵素ＧＬＡは、メリビオースをガラクトースおよびグルコースに加水分解し、また、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ－３）を代謝することができる。ＧＬＡ酵素活性が欠損すると、Ｘ連鎖障害であるファブリー病が引き起こされる。ＧＬＡバイシストロニックプラスミド－ｐＬＬ５１を作出するために、ヒトＧＬＡ遺伝子断片およびバイシストロニックベクターｐＬＬ０１をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｔ４リガーゼによってライゲーションした（図７Ａ）。正確なｐＬＬ５１クローンおよびＧＬＡ単一プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトし、発現させた。ＧＬＡ活性アッセイおよびＣＩ－ＭＰＲへの結合実験を、それらの条件培地を使用して実施した。図７Ｂに示されている通り、ＧＬＡ活性はＧＬＡ単独またはｐＬＬ５１条件培地のいずれにおいても同様である。これらの２つの培地を使用した力価測定曲線から、ｐＬＬ５１試料がＣＩ－ＭＰＲにＧＬＡ試料よりも多くかつ速く結合することが示唆される（図７Ｃ）。ｐＬＬ５１試料についての全体的な結合パーセンテージは６２．１％であり、これはＧＬＡ試料（３３．１％、図７Ｄ）のほぼ２倍である。
酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）：遺伝子疾患α－マンノシドーシスは、ＭＡＮ２Ｂ１遺伝子によってコードされるライソゾーム酵素であるＬＡＭＡＮの欠陥によって引き起こされる。ヒトＬＡＭＡＮ酵素はほとんどリン酸化されていないので、ｈＬＡＭＡＮは開示されるバイシストロニック発現の良好な候補である。３０３３ｂｐのヒトＬＡＭＡＮ遺伝子を、後の試験のために、ｐＬＬ０１バイシストロニックベクターに挿入し（図８Ａ）、Ｅｘｐｉ２９３細胞において発現させた。ＬＡＭＡＮバイシストロニックプラスミドｐＬＬ６１条件培地におけるＬＡＭＡＮ活性はＬＡＭＡＮ単一発現よりもわずかに低い（図８Ｂ）。ＬＡＭＡＮのＣＩ－ＭＰＲへの結合について力価測定を行った。ＬＡＭＡＮ酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合は、ＬＡＭＡＮ単一発現試料を使用するとほとんど検出されなかったが、ｐＬＬ６１試料由来の多量のＬＡＭＡＮ酵素がＣＩ－ＭＰＲと相互作用することが見いだされた（図８Ｃ）。Ｓ１－Ｓ３バイシストロニック発現を用いるとＬＡＭＡＮのＣＩ－ＭＰＲへの結合は１．６％から７５．２％まで上昇する（図８Ｄ）。
上記の６種の酵素は、それらの基本的なリン酸化のレベルに基づいて２つの群にカテゴリー化することができる。第１群は低リン酸化ライソゾーム酵素（ＧＢＡ、ＮＡＧＬＵおよびＬＡＭＡＮ）であり、これらは酵素産生の間の野生型Ｐｔａｓｅに対する不十分な基質である。第２群は高リン酸化酵素（ＧＡＡ、ＧＡＬＣおよびＧＬＡ）である。これらの酵素は、野生型Ｐｔａｓｅの良好な基質と考えられ、相当な量のリン酸を受け取る。本開示のＳ１－Ｓ３のバイシストロニック発現により、６種のライソゾーム酵素のリン酸化が、それらの基本的なリン酸化レベルに関係なく有意に増加することが示された。これらの所見を考慮して、本明細書に開示されるバイシストロニックベクターｐＬＬ０１を使用して、全てのライソゾーム蓄積症（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を処置するために高度にリン酸化されたライソゾーム酵素を産生させることができる。明白に、本開示のバイシストロニックベクターはライソゾーム蓄積症を処置するためのＥＲＴおよび遺伝子治療に著しい利益をもたらす。
（実施例３）
ゴーシェ病の処置
酵素補充療法（ＥＲＴ）
ＧＢＡをコードする配列およびＳ１－Ｓ３ Ｐｔａｓｅをコードする配列を含む発現ベクターを使用して、ゴーシェ病の徴候または症状を処置または予防することができる。以下の試験は、ゴーシェ病の当技術分野で理解されている標準のマウスモデルにおける（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ）－Ｓ１－Ｓ３の発現により、（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ）－Ｓ１－Ｓ３の発現、循環血流由来の細胞内へのｖ－Ｓ１－Ｓ３の輸送およびｖ－Ｓ１－Ｓ３複合体を取り込んだ細胞におけるｖの活性の増大が導かれることを実証するものである。ＧＢＡ－Ｓ１－Ｓ３複合体の発現および取り込みに起因する（ＧＣａｓｅ／ＧＢＡ）活性の小さな増大により、マウスモデルにおける機能の有意な機能回復が導かれる。
Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを有するバイシストロニック発現ベクターを利用したＧＢＡの発現により、ゴーシェ病の徴候または症状を処置または予防するために使用することができる、高レベルのリン酸化オリゴ糖を有する組換えタンパク質が生成する。以下の試験は、ゴーシェ病の当技術分野で理解されている標準のマウスモデルにおける、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを有するバイシストロニックベクターを使用して発現させた組換えタンパク質を使用したＥＲＴにより、現行の標準治療薬と比較して、より長い半減期、組織によるより多くの取り込み、より大きな基質減少および病理組織学的検査値のより良好な矯正が導かれることを実証するものである。
図１６Ａ～１６Ｂは、２０週齢のＧａｕｃｈｅｒＤ４０９Ｖ／ヌルマウスの肝臓、肺および脾臓において観察されたグルコシルセラミドレベルの上昇を示すグラフの対である。ＧＢＡの天然の基質であるグルコセレブロシドの蓄積を組織ホモジネートにおいて決定した。肺内のＧＣの蓄積は統計学的にかつ治療的に価値のある結果であり、これは、現行の標準治療薬に関する公知のまだ対処されていない必要性である。２０μＬの一定分量の組織ホモジネートおよび妥当な対照から、グルコシルセラミドを、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）２００μＬを添加し、８００ｒｐｍで５分間混合し、その後、４℃、３２２０ｇで１５分間遠心分離することによって抽出した；３）。上清５０μＬを回収し、窒素を用いて乾燥させ、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）中に再懸濁させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために直接注入した。
図１７Ａ～１７Ｃは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいてＧＣａｓｅＭ６Ｐがイミグルセラーゼと比較して長い半減期および大きな組織内取り込みを有することを実証する一連のグラフである。Ｇａｕｃｈｅｒ Ｄ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおけるＰＫ／ＰＤ試験を、標準治療薬であるイミグルセラーゼと、Ｅｘｐｉ２９３細胞においてＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅおよびＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用して一過性に同時発現させることによって産生させた精製ＧＢＡとを使用して実施した。このＧＣａｓｅのバリアントは中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きい。簡単に述べると、動物３匹に約１．５ｍｇ／ｋｇの組換えＧＣａｓｅを尾静脈注射した。血清中薬物動態データに関しては、血漿試料を２分、１０分、２０分、４０分および６０分の時点で採取した。合成基質である４－メチルウンベリフェリル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（４ＭＵ－Ｇｌｃ）を使用して活性を測定した。２分時点を１００％の活性として設定し、その後の時点をｔ＝２分時点に対するパーセントとすることにより、個々の動物における活性を正規化した。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅの存在下で発現された安定化されたＧＣａｓｅはより長い半減期を有すると思われる。このより長い半減期は、当該酵素がより大きな安定性を有することと、クリアランス経路が異なることの組合せである。ＧＣａｓｅがどのくらい組織に取り込まれたかを決定するために、酵素注射の２時間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｇｌｃ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。妥当なリン酸化を伴う安定したＧＣａｓｅの真の利点は示されている組織内取り込みのデータにおいて認められる。評価した全ての組織について、バイシストロニックＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅベクタープラットフォームＳ１’Ｓ３ ＰＴａｓｅを利用して発現させた安定化されたＧＣａｓｅに関してより大きな活性が見いだされる。これは、イミグルセラーゼの活性がわずかである肺、筋肉および脳において最も劇的である。組織中のデータと血清中のデータを総合すると、より多くの酵素を患部組織に送達することに関して、より多くのＮ結合オリゴ糖リン酸化を伴うより安定なＧＣａｓｅの利点が明らかである。これは、有意な量のＧＣａｓｅが肺、筋肉および心臓にこれらの用量で送達された最初のことである。
図１８Ａ～１８Ｅは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好に組織マクロファージを減少させた（抗ＣＤ６８染色）ことを実証する一連の写真および棒グラフである。Ｄ４０９Ｖ Ｇａｕｃｈｅｒマウスモデルにおける有効性試験を、標準治療薬であるＣｅｒｅｚｙｍｅと、Ｓ１Ｓ３ ＰＴａｓｅおよび中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きいことが報告されているＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用してＥｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた精製ＧＢＡ（Ｍ０１１１）とを使用して実施した。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。４週間後、ＣＤ６８抗体を用いた免疫組織化学的検査のために、肝臓および肺の組織を収集し、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に固定した。ＣＤ６８ Ａｂによって可視化された患部組織中のマクロファージの減少によって証明される通り、Ｍ０１１１は現行の標準治療薬と比較して大きな有効性を有する。
図１９Ａ～１９Ｃは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好にＧａｕｃｈｅｒ貯蔵細胞の数およびサイズを減少させた（ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）ことを実証する一連の写真である。Ｄ４０９Ａ Ｇａｕｃｈｅｒマウスモデルにおける有効性試験を、標準治療薬であるＣｅｒｅｚｙｍｅと、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅおよび中性条件およびわずかにアルカリ性条件での安定性がより大きいことが報告されているＧＢＡの天然のバリアントをコードするバイシストロニックベクターを利用してＥｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた精製ＧＢＡとを使用して実施した。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。４週間後、肝臓および肺の組織を収集し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためのホルマリン処理のために４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に固定した。Ｈ＆Ｅ染色によって可視化された患部組織内の貯蔵細胞の減少によって証明される通り、ＧＣａｓｅＭ６Ｐは現行の標準治療薬と比較して大きな有効性を有する。
図２０Ａ～２０Ｂは、ＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅＭ６ＰＥＲＴがイミグルセラーゼよりも良好に蓄積した基質を減少させたことを実証するグラフの対である。約２０週齢のＧａｕｃｈｅｒマウスを、約１．５ｍｇ／ｋｇの酵素を用いて週に１回、４週間にわたって処置した。グリコシルセラミド分析のために組織試料を採取し、ホモジナイズした。ＧＣａｓｅの天然の基質であるグルコセレブロシドの蓄積を組織ホモジネートにおいて決定した。肺内のＧＣの蓄積は現行の標準治療薬に関する公知のまだ対処されていない必要性であり、大きな価値がある。２０μＬの一定分量の組織ホモジネートおよび妥当な対照から、グルコシルセラミドを、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）２００μＬを添加し、８００ｒｐｍで５分間混合し、その後、４℃、３２２０ｇで１５分間遠心分離することによって抽出した；３）。上清５０μＬを回収し、窒素を用いて乾燥させ、メタノール／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ：ｖ＝８５：１０：５）中に再懸濁させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために直接注入した。測定した２種のセラミドに関して、ＧＣａｓｅＭ６Ｐで処置した動物はＥＲＴ療法後にイミグルセラーゼよりも低いレベルを有した。
遺伝子治療
ＧＢＡをコードする配列およびＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅをコードする配列を含むバイシストロニックベクターを有する送達ベクターを使用して、ゴーシェ病の徴候または症状を処置または予防することができる。一部の実施形態では、送達ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターはリポソーム、ＬＮＰ、ポリマーナノ粒子、ナノ粒子、ミセル、ポリマーソームまたはエキソソームである。以下の試験は、ゴーシェ病の当技術分野で理解されている標準のマウスモデルにおけるバイシストロニックベクターを利用したＧＢＡおよびＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅの発現により、ＧＢＡＭ６Ｐの発現、組織および血清における活性の増大、ならびに基質の減少が導かれることを実証するものである。これにより、ＣＩ－ＭＰＲに対する親和性が高いリン酸化された導入遺伝子産物により、活性レベルが低くとも、効率的な細胞取り込みおよびライソゾームへのターゲティングに起因して、有効な治療を導くことができることが実証される。
図２１Ａ～２１Ｄは、ゴーシェ病を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＡＶ媒介性遺伝子治療試験の結果を示す一連のグラフである。３つの異なるプロモーターを伴う安定なＧＢＡ＋Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅのバイシストロニック発現導入遺伝子を用いたＡＡＶ９遺伝子治療の効果を決定するために、１５週齢のＧＢＡＤ４０９Ｖ／ヌルマウスに中用量のＡＡＶ９－安定なＧＢＡ＋Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅ、５Ｅ１１ｖｇを投薬した。組織によりＧＢＡがどのくらい生成されたかを決定するために、ＡＡＶ９注射の２週間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｇｌｃ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。
図２９Ａ～２９Ｃは、ＧａｕｃｈｅｒマウスにおけるＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐ遺伝子治療の注射の２週間後の肺および肝臓における酵素活性およびＧＣａｓｅ基質の選択を示す一連のグラフである。ＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡ－Ｓ１Ｓ３は他にはＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐとして公知であり、ここで、Ｍ６ＰはＳ１Ｓ３構築物を指す。ＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡまたはＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐ（ＧＢＡおよびＳ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを有するバイシストロニックベクターを伴う導入遺伝子）の２週間後、肝臓において両方の構築物の発現が上昇した（図２９Ａ）。肝臓中グルコシル－β－セラミドレベルを測定したところ（図２９ＢおよびＣ）、ＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐで処置した動物では、ＡＡＶ９ ｈＴＬＶ－ＧＢＡで処置した動物と比較して、肝臓におけるＧＣａｓｅ活性が低いにもかかわらず、蓄積した基質の最大の減少が観察された。この低活性でのより大きな基質減少により、Ｎ結合オリゴ糖リン酸化が、細胞取り込みおよびライソゾームへのターゲティングに関して、遺伝子治療のために重要であることが示される。肺では、ＡＡＶ９で処置した動物でのＧＣａｓｅ活性は低い。しかし、ＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡＭ６Ｐで処置した動物では、肺における蓄積したグルコシル－β－セラミドレベルの有意な減少が示された（図２９Ｂ、Ｃ）。ＡＡＶ９－ｈＴＬＶ－ＧＢＡで処置した動物ではわずかな減少が観察された。これにより、ＣＩ－ＭＰＲに対する親和性が高いリン酸化された導入遺伝子産物により、活性レベルが低くとも、効率的な細胞取り込みおよびライソゾームへのターゲティングに起因して、有効な治療を導くことができることが実証される。
（実施例４）
α－マンノシドーシスの処置
酵素補充療法（ＥＲＴ）
ＬＡＭＡＮをコードする配列およびＳ１－Ｓ３ Ｐｔａｓｅをコードする配列を含む発現ベクターを使用して、α－マンノシドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。以下の試験は、マウスモデルにおけるＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３の発現により、ＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３の発現、循環血流由来の細胞内へのＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３の輸送およびＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３複合体を取り込んだ細胞におけるＬＡＭＡＮの活性の増大が導かれることを実証するものである。ＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３複合体の発現および取り込みに起因するＬＡＭＡＮの小さな増加により、マウスモデルにおける機能の有意な機能回復が導かれる。
Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを有するバイシストロニック発現ベクターを利用したＬＡＭＡＮの発現によりα－マンノシドーシスの徴候または症状を処置または予防するために使用することができる、高レベルのリン酸化オリゴ糖を有する組換えタンパク質が生成する。以下の試験は、野生型マウスにおける、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅを有するバイシストロニックベクターを使用して発現させた組換えＬＡＭＡＮタンパク質を使用したＥＲＴにより、組織へのより多くの取り込みおよび組織におけるより広範な分布が導かれることを実証するものである。
図２２Ａ～２２Ｃは、ライソゾームアルファ－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）のＥＲＴとしての使用に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す一連のグラフである。
図２３Ａ～２３Ｂは、ＬＡＭＡＮ酵素の発現、精製、および特徴付けを示す写真および対応するデータ表である。ＬＡＭＡＮの２つの調製物を、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅをコードするバイシストロニックベクターを用いて（Ｍ０６１１）または用いずに、Ｅｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた。どちらもＨＰＣ４アフィニティータグを利用して精製した。固定化されたカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体に用量依存的に結合するＬＡＭＡＮの量を測定することにより、リン酸化の有意な増加が実証された。結合したＬＡＭＡＮの量は、ＬＡＭＡＮ合成基質である４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－マンノピラノシド（４ＭＵ－Ｍａｎ）を使用した、ＬＡＭＡＮの活性に基づくものであった。添加したマンノース６リン酸の結合を遮断する能力により、リン酸化オリゴ糖を介した結合の特異性を確認した。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１）がＭ６Ｐの存在下であっても受容体に結合することができることに留意すべきである。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１、Ｐ－００３０）およびＬＡＭＡＮ（Ｐ－００３１）をｉｎ ｖｉｖｏ動物試験のために選択した。
図２３Ｃは、ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１）酵素の発現、精製、および特徴付けを示すグラフである。ＬＡＭＡＮの２つの調製物を、ＰＴａｓｅのＳ１－Ｓ３バリアントをコードするバイシストロニックベクターを用いてまたは用いずに、Ｅｘｐｉ２９３細胞において一過性に同時発現させた。どちらもＨＰＣ４タグを利用して精製した。固定化されたカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体に用量依存的に結合するＬＡＭＡＮの量を測定することにより、リン酸化の有意な増加が実証された。結合したＬＡＭＡＮの量を、合成基質である４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－マンノピラノシド（４ＭＵ－Ｍａｎ）を使用し、活性によって決定した。添加したマンノース６リン酸の結合を遮断する能力により、リン酸化オリゴ糖を介した結合の特異性を確認した。Ｍ０６１１がＭ６Ｐの存在下であっても受容体に結合することができることに留意すべきである。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｍ０６１１、Ｐ－００３０）およびＬＡＭＡＮ（Ｐ－００３１）をｉｎ ｖｉｖｏ動物試験のために選択した。
図２４Ａ～２４Ｂは、酵素補充療法に関する野生型マウスにおけるＬＡＭＡＮおよびＬＡＭＡＮＭ６Ｐ酵素の体内分布を実証するグラフの対である。ＬＡＭＡＮとＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の間の組織内取り込みの差異を評価するために、２ｍｇ／ｋｇの各調製物を野生型マウス（ｎ＝４）に尾静脈を介して注入した。投薬の２時間後および８時間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｍａｎ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の利点が組織内取り込みのデータにおいて認められた。肝臓、脾臓、心臓、肺、および脳について、２時間の時点で組織における活性がより大きかった。この傾向は８時間の時点でも真であったが、肺は例外であった。これは、この組織の分析において観察された高い変動の結果であり得る。この観察の唯一の例外は腎臓であった。全ての試料から内因性ＬＡＭＡＮ活性を差し引く。我々のＬＡＭＡＮＭ６Ｐ酵素を注射したマウスのほとんどの組織においてより高いＬＡＭＡＮ酵素活性が検出された。
図２５Ａ～２５Ｂは、酵素補充療法に関する野生型マウスにおけるαＬＡＭＡＮおよびＬＡＭＡＮＭ６Ｐ酵素の体内分布を実証するグラフの対である。ＬＡＭＡＮとＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の間の組織内取り込みの差異を評価するために、１０ｍｇ／ｋｇの各調製物を野生型マウス（ｎ＝４）に尾静脈を介して注入した。投薬の２時間後および８時間後に、組織を回収し、ホモジナイズし、４ＭＵ－Ｍａｎ基質を使用して活性を測定した。活性を、タンパク質決定のためのＢＣＡ法によって決定されたホモジネート中の総タンパク質に対して正規化した。ＬＡＭＡＮＭ６Ｐ（Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅと同時発現させたＬＡＭＡＮ）の利点が組織内取り込みのデータにおいて認められた。肝臓、脾臓、心臓、肺、および脳について、２時間の時点で組織における活性がより大きかった。この傾向は８時間の時点でも真であったが、腎臓は例外であった。これは、この組織の分析において観察された高い変動の結果であり得る。
遺伝子治療
ＬＡＭＡＮをコードする配列およびＳ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む送達ベクターを使用して、α－マンノシドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。一部の実施形態では、送達ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターはリポソーム、ＬＮＰ、ポリマーナノ粒子、ナノ粒子、ミセル、ポリマーソームまたはエキソソームである。以下の試験は、α－マンノシドーシスのマウスモデルにおけるＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３の発現により、ＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３の発現、循環血流由来の細胞内へのＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３の輸送およびＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３複合体を取り込んだ細胞におけるＬＡＭＡＮの活性の増大が導かれることを実証するものである。ＬＡＭＡＮ－Ｓ１－Ｓ３複合体の発現および取り込みに起因するｖの小さな増加により、マウスモデルにおける機能の有意な機能回復が導かれる。
その代わりに、またはそれに加えて、Ｓ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む送達ベクターを使用して、α－マンノシドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。Ｓ１－Ｓ３の発現により、体組織により内因性ＬＡＭＡＮの取り込みを増加させ、それにより、マウスモデルにおける機能の有意な機能回復を誘導することができる。
（実施例５）
ムコリピドーシスの処置
酵素補充療法（ＥＲＴ）
Ｓ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む発現ベクターを使用して、ムコリピドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。以下の試験は、Ｓ１－Ｓ３の発現により、Ｓ１－Ｓ３の発現、循環血流由来の細胞内へのＳ１－Ｓ３および１つまたは複数のライソゾーム酵素の輸送、ならびに、Ｓ１－Ｓ３複合体を取り込んだ細胞における１つまたは複数のライソゾーム酵素の活性の増大が導かれることを実証するものである。Ｓ１－Ｓ３複合体および１つまたは複数のライソゾーム酵素の発現および取り込みに起因するＳ１－Ｓ３複合体の小さな増加により、機能の有意な機能回復が導かれる。
遺伝子治療
Ｓ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む送達ベクターを使用して、ムコリピドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。一部の実施形態では、送達ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターはリポソーム、ＬＮＰ、ポリマーナノ粒子、ナノ粒子、ミセル、ポリマーソームまたはエキソソームである。可溶性Ｓ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む送達ベクターを使用して、ムコリピドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。Ｓ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む送達ベクターを使用して、ムコリピドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。以下の試験は、Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅの発現により、Ｓ１－Ｓ３細胞内活性が導かれ、その結果、誤って輸送されたライソゾーム酵素の血清中レベルが、それらのＮ結合オリゴ糖リン酸化が増加し、それにより、ライソゾームへの効率的なターゲティングが可能になったことによって矯正されることを実証するものである。
その代わりに、またはそれに加えて、Ｓ１－Ｓ３改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む送達ベクターを使用して、ムコリピドーシスの徴候または症状を処置または予防することができる。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅの発現により、体組織による１つまたは複数の内因性ライソゾーム酵素の取り込みを増加させ、それにより、マウスモデルにおける機能の有意な機能回復を誘導することができる。
図２６Ａ～２６Ｂは、ムコリピドーシスに対する遺伝子治療（ＧＴｘ）についてのＡＡＶ９設計およびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を示す概略図およびグラフである。２９３Ｔ細胞に種々のＭ００２１（ＡＡＶ９－ＣＡＧｐ－Ｓ１－Ｓ３）ウイルスを用いた形質導入を行い、２日間培養した後、ＰＴａｓｅ活性アッセイを行った。
図２７Ａ～２７Ｂは、Ｍ００２１処置によりＭＬ ＩＩマウスにおける血清中ライソゾーム酵素レベルが低下することを実証するグラフの対である。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅ遺伝子治療の効果を決定するために、３４週齢の雌マウスに中用量のＭ００２１（ＡＡＶ９－ＣＡＧｐ－Ｓ１－Ｓ３）、４ｅ１２ｖｇ（２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）を投薬した。ＭＬ ＩＩの表現型の１つは、ライソゾーム酵素を細胞内のライソゾームにターゲティングすることができないことに起因してライソゾーム酵素の血清中レベルが上昇することである。治療を受けてからちょうど１週間後に血清中のＬＡＭＡＮおよびＭａｎＢ活性が低下した時、有望な結果が認められた。この結果は、ＭＬＩＩマウスモデルの記載されている表現型を発揮させる能力を実証するものであるので、重要である。
図２８Ａ～２８Ｃは、Ｍ００２１処置によりＭＬ ＩＩにおけるライソゾーム酵素のリン酸化が増加することを実証する一連のグラフである。Ｓ１－Ｓ３ ＰＴａｓｅ遺伝子治療のＬＡＭＡＮおよびＭａｎＢの血清中活性の低下に対する影響をさらに理解するために、以前に記載されている固定化受容体結合アッセイを使用して、血清中に見いだされる酵素のＣＩ－ＭＰＲへの結合を評価した。簡単に述べると、既知量の酵素を、漸増量で固定化したＣＩ－ＭＰＲに添加する。結合しなかった酵素を洗い流し、残りの結合した酵素を妥当な合成基質；Ｍａｎ－ｂ－４ＭＵ（ＭａｎＢ、ＬＡＭＡＮ ４ＭＵ－Ｍａｎ（ＬＡＭＡＮ）を使用して測定する。ＭＬ ＩＩマウスにおけるＡＡＶ９－Ｓ１Ｓ３遺伝子治療によりライソゾーム酵素のグリカンリン酸化が増加する。血清中の総リン酸化ライソゾーム酵素は３週間後に正常レベルまたはわずかに高いレベルまで正常化した。
本明細書において引用されているありとあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示は特定の実施形態を参照して開示されているが、本開示の真の主旨および範囲から逸脱することなく本開示の他の実施形態および変形形態が当業者に想起され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および等価の変形形態の全てを包含するものと解釈されることが意図されている。

Claims (64)

  1. プロモーター、ライソゾーム酵素をコードする第１のポリヌクレオチドおよび改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅ）をコードする第２のポリヌクレオチドをコードする配列を含むベクターを含む組成物であって、前記プロモーターが、哺乳動物細胞における発現を駆動することができ、前記プロモーターが、前記第１のポリヌクレオチドと、および前記第２のポリヌクレオチドと作動可能に連結している、組成物。
  2. 前記ベクターが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＩＲＥＳをコードする配列が、前記ライソゾーム酵素をコードする配列と前記改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードする配列の間に位置付けられている、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ベクターが、５’から３’までに、前記改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードする配列、前記ＩＲＥＳをコードする配列、および前記ライソゾーム酵素をコードする配列を含む、請求項２または３に記載の組成物。
  5. 前記ベクターが、５’から３’までに、前記ライソゾーム酵素をコードする配列、前記ＩＲＥＳをコードする配列、および前記改変ＧｌｃＮＡｃ－１ ＰＴａｓｅをコードする配列を含む、請求項２または３に記載の組成物。
  6. 前記ベクターが、切断部位をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記切断部位が、２Ａ自己切断性ペプチドをコードする配列を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記ベクターが、送達ベクターである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記ベクターが、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型のうちの１つまたは複数から単離されたまたはそれに由来するカプシドをコードする配列を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群から選択される血清型のうちの１つまたは複数から単離されたまたはそれに由来する少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）をコードする配列を含む、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記ベクターが、バイシストロニックベクターである、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ベクターが、マルチシストロニックベクターである、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記構成的プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ベクターが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記改変ＧｌｃＮＡｃ－１ホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが、配列番号４の核酸配列を含む、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記ライソゾーム酵素が、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記ライソゾーム酵素が、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム酵素を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記ライソゾーム酵素が、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）およびライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記ライソゾーム酵素が、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）を含む、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号５の核酸配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記ライソゾーム酵素が、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）を含む、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号６の核酸配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２３の核酸配列を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ライソゾーム酵素が、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）を含む、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号７の核酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記ライソゾーム酵素が、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）を含む、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号８の核酸配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記ライソゾーム酵素が、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を含む、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号９の核酸配列を含む、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記ライソゾーム酵素が、ライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）を含む、請求項１から２１までまたは請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記ライソゾーム酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１０の核酸配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、対象に請求項１から３８までのいずれか一項に記載の組成物を有効量で投与するステップを含み、前記組成物により前記ＬＳＤの原因であるライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、それにより、前記ＬＳＤが処置される、方法。
  40. 前記対象が、前記ＬＳＤの徴候または症状を示している、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記対象が、前記ＬＳＤの診断を受けている、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の出現または発症を予防する方法であって、対象に請求項１から３８までのいずれか一項に記載の組成物を有効量で投与するステップを含み、前記組成物により前記ＬＳＤの原因であるライソゾーム酵素のリン酸化が増加し、それにより、前記対象における前記ＬＳＤの出現が予防される、方法。
  43. 前記対象が、前記ＬＳＤが出現または発症するリスクを有する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記対象が、前記ＬＳＤの徴候または症状を示している、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の原因であるライソゾーム酵素のリン酸化を改善する方法であって、対象に請求項１から３８までのいずれか一項に記載の組成物を有効量で投与するステップを含み、前記組成物により前記ライソゾーム酵素のリン酸化が増加する、方法。
  46. 前記対象が、前記ＬＳＤの徴候または症状を示している、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記対象が、前記ＬＳＤが出現または発症するリスクを有する、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記対象が、前記ＬＳＤの診断を受けている、請求項４５または４６に記載の方法。
  49. ライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）の原因であるライソゾーム酵素のリン酸化を改善する方法であって、細胞に請求項１から３８までのいずれか一項に記載の組成物を有効量で接触させるステップを含み、前記組成物により前記ライソゾーム酵素のリン酸化が増加する、方法。
  50. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにある、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項４９に記載の方法。
  52. 対象が前記細胞を含む、請求項４９から５１までのいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記対象が、前記ＬＳＤの徴候または症状を示している、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記対象が、前記ＬＳＤが出現または発症するリスクを有する、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記対象が、前記ＬＳＤの診断を受けている、請求項５２または５３に記載の方法。
  56. 前記ライソゾーム酵素が、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つのライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）に関与する、請求項３９から５５までのいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ライソゾーム酵素が、表１Ａ、表１Ｂまたは表１Ｃに列挙されている少なくとも１つである、請求項３９から５６までのいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ライソゾーム酵素が、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）およびライソゾーム酸性α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項３９から５６までのいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記投与するステップが、全身投与経路を含む、請求項３９から５８までのいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記全身投与経路が、経腸、非経口、経口、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、くも膜下腔内、脊髄内、または脳室内である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記投与するステップが、局所投与経路を含む、請求項３９から５８までのいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記対象が、ヒトである、請求項３９から６１までのいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記対象が、男性である、請求項３９から６２までのいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記対象が、女性である、請求項３９から６２までのいずれか一項に記載の方法。
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