JP6506250B2 - 化学架橋剤 - Google Patents
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Description
配列番号1
IGF2/CI−MPR受容体への結合を増大させるために、vIGF2ペプチドのリソソーム酵素への化学的カップリングのために新しい化学的結合アプローチを利用した。このアプローチは既に記載されているものとは異なり、リソソーム酵素は、アルデヒド基を導入するために第1の架橋剤により修飾され、一方、vIGF2ペプチドは、N末端残基にヒドラジド基を導入するために第2の架橋剤により修飾される。特に、組換え野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼ(rhGAA)を、50kDa分子量カットオフ膜を備えた濃縮器によって7.5mg/mlまで濃縮してから、4℃で一晩、透析によって緩衝液を50mMのリン酸ナトリウム(pH6.5)/100mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80に交換した。次に、20倍モル過剰のN−スクシンイミジル−4−ホルミルベンズアミド(S−4FB、Solulink)クロスリンカーを用いて、周囲温度で2時間rhGAAを化学修飾して、新規のベンズアルデヒド基を導入した。次に、ベンズアルデヒド修飾rhGAAは50mMのNaOAc(pH4.8)/50mMのNaCl緩衝液中で精製されて、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物が除去され、vIGF2ペプチドへの化学的カップリングまで4℃で貯蔵される。
NHS−PEG4−tBoc−ヒドラジドクロスリンカーは、ペプチドに対する良好な溶解度を保持しながら、vIGF2ペプチドを効率的に修飾して新規のヒドラジド基を導入することが示された。しかしながら、tBoc保護基は弱酸条件を用いて除去するのが困難であり、脱保護のために高濃度のTFA(15%)および4時間のインキュベーションを使用した。これらの厳しい条件下でも、脱保護ヒドラジド修飾vIGF2ペプチドの約50%しか回収できなかった。効率的な除去および修飾ペプチドのより良好な回収のためにより不安定な保護基を用いてクロスリンカーを設計することができれば、アプローチはさらに改善されるであろう。
遠心濃縮器(例えば、50kDa公称分子量カットオフ(MWCO)膜を有するAmicon Ultra、Millipore)を用いて、小さいスケール(すなわち、100mg未満)で、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼ(rhGAA)を8〜10mg/mlまで濃縮してから、4℃で一晩、透析によって修飾緩衝液[50mMのリン酸ナトリウム(pH6.5)/100mMのNaCl/100mMのグルコース/2%のマンニトール/0.05%のポリソルベート−80]に緩衝液交換した。より大きいスケールの調製(例えば、200mgよりも多いrhGAA)の場合、タンパク質濃度および緩衝液交換は、50kDaのMWCO膜を有するタンジェンシャルフローろ過(TFF)システムを用いて、ダイアフィルトレーション/濃縮によって達成することができる。rhGAAタンパク質の濃度は、166,117M−1cm−1のモル吸光係数(ε)を用いて280nmでのUV吸光分光法によって決定される。次に、修飾緩衝液で希釈することによって、rhGAAタンパク質濃度を7.5mg/mlに調整し、25倍モル過剰の二官能性クロスリンカースクシンイミジル4−ホルミル安息香酸(SFB)と共に約20℃で4時間インキュベートして、rhGAA上に新規のベンズアルデヒド(芳香族アルデヒド)基を導入した。ベンズアルデヒド修飾rhGAAを、4℃で50mMのNaOAc(pH4.8)/100mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80に対して、緩衝液を複数変化させて透析して、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去した。化学修飾rhGAAはこの緩衝液中で安定であり、vIGF2ペプチドへの化学的結合まで無期限に貯蔵することができる。重要なことに、rhGAA上に導入されたベンズアルデヒド基は、ヒドラジド修飾またはアミノオキシ修飾vIGF2ペプチドに対する結合のために化学反応性を保持する。また、ベンズアルデヒド修飾rhGAAが、GAAの安定性またはカップリング効率に悪影響を与えることなく、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)/100mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80中で貯蔵可能であることも決定した。
ベンズアルデヒド修飾rhGAAは、以下のようにヒドラゾン連結を形成するためにヒドラジドなどの特定の化学基を介して、vIGF2ペプチドへの化学的結合のために利用することができる。凍結乾燥した精製vIGF2ペプチドを、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)/50mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80中0.6mg/mlで再構成し、20倍モル過剰の二官能性クロスリンカーN−tert−ブトキシカルボニル(tBoc)保護ヒドラジドクロスリンカー(NHS−PEG4−tBoc−ヒドラジド、Quanta Biodesign)と共に周囲温度でインキュベートして、N末端に新規のtBoc保護ヒドラジド基を導入した。vIGF2の修飾の進行および程度を評価するために、C4逆相高速液体クロマトグラフィ(C4RP−HPLC)によって反応をモニターした。C4RP−HPLC法は、1100シリーズのクォータナリポンプ、自動サンプラー、サーモスタット付カラムコンパートメント、およびAgilent ChemStationソフトウェア(Rev.B.04.03)を有するダイオードアレイ検出器(DAD)からなるAgilent Technologies(Palo Alto,CA)HPLCシステムにおいて4.6×250mm、5μm、300ÅのC4 Jupiterカラム(Phenomenex,Torrence,CA)を用いた。移動相は、緩衝液A:水中0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)および緩衝液B:アセトニトリル(MeCN)中0.1%のTFAで構成した。26%のアセトニトリル(MeCN/0.1%TFA)で予め平衡化したC4カラムにペプチドサンプルを装填した。2分後に、MeCN/0.1%TFAの26〜33%の直線的なグラジエントを用いて、13分間にわたってカラムを展開させた。図4Aに示されるように、PEG4−tBoc−ヒドラジドを結合するためのvIGF2ペプチドの化学修飾において保持時間の著しいシフト(増大)が観察される(中央パネル)。vIGF2ペプチドの化学修飾が完了(通常2時間まで)したら、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用C4RP−HPLCによりtBoc−ヒドラジド修飾vIGF2ペプチドを精製し、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥した。次に、乾燥したペプチドを2%のTFA(dH2O中)中で再構成し、周囲温度で最長72時間までインキュベートして、tBoc保護基を除去し、その後のリソソーム酵素への結合のためにヒドラジド基を露出させた。tBoc脱保護の進行もC4RP−HPLCによってモニターし、通常、tBocが除去されるとペプチドの保持時間を出発の非修飾vIGF2ペプチドの付近まで減少させることが示された(図4A、下部パネル)。tBoc基の完全な脱保護は、通常、これらの実験条件下で約60時間を必要とした。次に、調製用C4RP−HPLCによってtBoc脱保護ヒドラジド修飾vIGF2を精製し、凍結乾燥し、ベンズアルデヒド修飾rhGAAへの化学的結合まで乾燥貯蔵した。また、より高いTFA濃度(例えば、4%のTFA)および他の酸および有機溶媒を用いてtBoc保護基の除去を試験したが、これらの条件は遥かにより低いヒドラジド修飾vIGF2ペプチドの回収率をもたらした。以下のように、結果として生じるヒドラゾン連結を介して脱保護ヒドラジドvIGF2ペプチドをベンズアルデヒド修飾rhGAAに化学的に結合した(rhGAAに対して4倍モル過剰のvIGF2ペプチドを用いる)。ベンズアルデヒド修飾rhGAAのタンパク質濃度を、通常、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)/100mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80緩衝液により4〜5mg/mlに調整し、凍結乾燥した脱保護ヒドラジド修飾vIGF2ペプチドに酵素を(1モルのrhGAA:4モルのvIGF2ペプチドのモル比で)直接添加し、約20℃で約16時間インキュベートした。カップリングの速度を増大するためにアニリン(5〜10mM)も添加することができるが、これらの実験条件下でカップリングのために絶対に必要とされるわけではないことが見出された。次に、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)/100mMのNaCl/2%のマンニトール/0.05%のポリソルベート−80緩衝液中におけるサイズ排除クロマトグラフィによってvIGF2ペプチド結合rhGAAを精製し、過剰のvIGF2ペプチドを除去した。vIGF2−rhGAAのピーク画分をプールし、30kDa公称分子量カットオフ酢酸セルロース膜によるAmicon Ultraを用いて濃縮した。ヒドラゾン連結vIGF2ペプチドが、対象とするIGF2/CI−MPR受容体に対するrhGAAの結合を増大させるかどうかを決定するために、受容体プレート結合アッセイによってvIGF2−rhGAAを特徴付けた。図4Bに示されるように、vIGF2−rhGAAは、非結合rhGAAよりも著しく良くIGF2/CI−MPR受容体に結合し、骨格筋細胞モデルにおける実質的により良好な外因性リソソーム酵素の細胞取込みと相関した(図5A)。これらの結果は、標的筋肉細胞における外因性治療薬の細胞取込みの増強のための改善された受容体結合の機能的重要性を示す。筋肉細胞ライセートのウエスタンブロット分析は、内部移行したvIGF2−rhGAAがリソソームに送達され、そこでvIGF2ペプチドが除去され、非結合rhGAA酵素について観察されるようにrhGAAが正常に処理されたことを示す(図5B)。IGF2ペプチドは、常在リソソームプロテアーゼによって自然に分解されることが既に報告されていたことから、これらの結果は予想された。重要なことに、ウエスタンブロットデータは、化学結合されたvIGF2ペプチドが除去され、リソソームにおけるGAAプロセシングを妨害しなかったことを示す(GAAプロセシングは、天然グリコーゲン基質を加水分解するために、高親和性結合および最適なGAA酵素の動態学のために必要とされる)。
vIGF2ペプチドの修飾のためのtBoc保護ヒドラジドクロスリンカーの利用に加えて、異なる保護基を有する他のクロスリンカーも利用することができる。本発明者らは、vIGF2ペプチドのN末端に新規のヒドラジド基を導入するためにメチルベンジルオキシカルボニル(BOM)保護ヒドラジド(NHS−PEG4−BOM−ヒドラジド)を含有する二官能性クロスリンカーを化学的に合成した。BOM保護基を除去した後、以下のように、ベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素に対するその後の結合(結果として生じるヒドラゾン連結を介する)のために化学反応性ヒドラジド基が露出される。凍結乾燥した精製vIGF2ペプチドを50mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)/50mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80中0.6mg/mlで再構成し、20倍モル過剰のNHS−PEG4−BOM−ヒドラジドと共に周囲温度でインキュベートして、N末端に新規のBOM保護ヒドラジド基を導入した。vIGF2の修飾の進行および程度を評価するために、C4RP−HPLCによって反応をモニターした。PEG4−BOM−ヒドラジドを結合するためのvIGF2ペプチドの化学修飾において保持時間の著しいシフト(増大)が観察される(図6、中央パネル)。vIGF2ペプチドの化学修飾が完了(通常2時間まで)したら、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用C4RP−HPLCによりBOM−ヒドラジド修飾vIGF2ペプチドを精製し、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥した。次に、乾燥したペプチドを2%のTFA(dH2O中)中で再構成し、周囲温度で最長72時間までインキュベートして、BOM保護基を除去し、その後のリソソーム酵素への結合のためにヒドラジド基を露出させた。BOM脱保護の進行もC4RP−HPLCによってモニターし、通常、BOMが除去されるとペプチドの保持時間を出発の非修飾vIGF2ペプチドの付近まで減少させることが示された(図6、下部パネル)。BOM基の完全な脱保護は、通常、これらの実験条件下で約60時間を必要とした。次に、調製用C4RP−HPLCによってBOM脱保護ヒドラジド修飾vIGF2を精製し、凍結乾燥し、ベンズアルデヒド修飾rhGAAへの化学的結合まで乾燥貯蔵した。
またベンズアルデヒド修飾rhGAAは、以下のように、非常に安定したオキシム連結を介したアミノオキシ修飾vIGF2ペプチドへの化学的結合のために利用することができる。凍結乾燥した精製vIGF2ペプチドを50mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)/50mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80中0.6mg/mlで再構成し、20倍モル過剰のフタルイミドオキシ−PEG12−NHSエステル(Quanta Biodesign)と共に周囲温度でインキュベートして、N末端に新規のフタルイミドオキシ基を導入した。vIGF2ペプチドの化学修飾が完了(通常2時間まで)したら、次にフタルイミドオキシ修飾vIGF2ペプチドを0.5Mのヒドラジンと共に周囲温度で30〜60分間インキュベートして、中間体フタルイミドオキシ基を所望のアミノオキシ基に変換した。C4RP−HPLCを利用して、化学修飾反応、およびフタルイミドオキシ基のアミノオキシ基への変換をモニターした。図7Aに示されるように、アミノオキシ修飾vIGF2ペプチドは、非修飾vIGF2ペプチドと比較して、C4RP−HPLCにおいてわずかに長い保持時間を有した。アミノオキシ修飾vIGF2ペプチドはTFAにより酸性化されてから、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用C4RP−HPLCによって精製され、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥される。結果として生じるオキシム連結を介したベンズアルデヒド修飾rhGAAへの化学的結合のために、乾燥したアミノオキシ修飾ヒドラジドvIGF2ペプチドを直接使用した。簡単に言うと、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)/100mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80緩衝液によってベンズアルデヒド修飾rhGAAのタンパク質濃度を通常4〜5mg/mlに調整し、乾燥アミノオキシ修飾vIGF2ペプチドに酵素を(1モルのrhGAA:4モルのvIGF2ペプチドのモル比で)直接添加し、約20℃で約16時間インキュベートした。次に、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)/100mMのNaCl/2%のマンニトール/0.05%のポリソルベート−80緩衝液中におけるサイズ排除クロマトグラフィによってvIGF2ペプチド結合rhGAAを精製し、上記のように、過剰のvIGF2ペプチドを除去した。
またvIGF2ペプチドは、tBoc保護アミノオキシ二官能性クロスリンカーを用いてオキシム連結を介してリソソーム酵素へ化学的に結合させることもできる。このアプローチは、潜在的に危険なヒドラジンを用いる化学変換を必要とすることなく、ベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素への化学的結合のためにアミノオキシ修飾vIGF2ペプチドをもたらす。簡単に言うと、凍結乾燥した精製vIGF2ペプチドを50mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)/50mMのNaCl/0.05%のポリソルベート−80中0.6mg/mlで再構成し、20倍モル過剰の二官能性クロスリンカーtBoc保護アミノオキシクロスリンカー(NHS基またはペンタフルオロベンゼン基のいずれかを有する)と共に周囲温度でインキュベートして、N末端に新規のtBoc保護アミノオキシ基を導入し、C4RP−HPLCによりモニターした。図8(中央パネル)に示されるように、PEG化tBoc−アミノオキシクロスリンカーを結合するためのvIGF2ペプチドの化学修飾において保持時間の著しいシフト(増大)が観察される(中央パネル)。vIGF2ペプチドの化学修飾が完了(通常2時間まで)したら、過剰のクロスリンカーおよび反応副産物を除去するために調製用C4RP−HPLCによりtBoc−アミノオキシ修飾vIGF2ペプチドを精製し、揮発性溶媒を除去するために凍結乾燥した。次に、乾燥したペプチドを2%のTFA(dH2O中)中で再構成し、周囲温度で最長72時間までインキュベートして、tBoc保護基を除去し、その後のリソソーム酵素への結合のためにアミノオキシ基を露出させた。tBoc脱保護の進行もC4RP−HPLCによってモニターし、通常、tBocが除去されるとペプチドの保持時間を出発の非修飾vIGF2ペプチドの付近まで減少させることが示された(図8、下部パネル)。tBoc基の完全な脱保護は、通常、これらの実験条件下で約50時間を必要とした。次に、調製用C4RP−HPLCによってtBoc脱保護アミノオキシ修飾vIGF2を精製し、凍結乾燥し、ベンズアルデヒド修飾リソソーム酵素への化学的結合まで乾燥貯蔵した。
単一のクロスリンカーを用いてオキシム連結vIGF2−rhGAAを生成するための代替の方法は、以下のように化学的に酸化されたrhGAAにアミノオキシ修飾vIGF2ペプチドをカップリングさせることによって達成することができる。透析またはサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によってrhGAAを0.1MのNaOAc(pH5.2)中に緩衝液交換し、同じ緩衝液によりタンパク質濃度を5mg/mlに調整した。次に、rhGAAを2mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共に4℃で30分間インキュベートして、rhGAAのN−グリカンにおいて炭水化物(大部分は末端シアル酸およびガラクトース)を酸化し、アミノオキシ修飾vIGF2ペプチドへの化学的結合のために化学反応性アルデヒド基を生じさせた。次に、過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去するために、化学的に酸化されたrhGAAを0.1MのNaOAc(pH5.2)に対して透析するか、あるいはSECにさらした。酸化rhGAA(約4mg/mlで貯蔵)を乾燥アミノオキシ修飾vIGF2ペプチドに、1モルのrhGAA:4モルのvIGF2ペプチドのモル比で直接添加し、約20℃で約16時間インキュベートし、結果として生じるオキシム連結を形成する。次に、上記のように過剰のvIGF2ペプチドを除去するために、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)/100mMのNaCl/2%のマンニトール/0.05%のポリソルベート−80緩衝液中におけるSECによってvIGF2ペプチド結合rhGAAを精製した。
Claims (13)
- a.変異インスリン様成長因子2(vIGF2)を第1の架橋剤と接触させて、N末端残基に保護ヒドラジド基を導入するステップ、
b.ヒドラジド修飾vIGF2を溶液中で脱保護して、脱保護ヒドラジド修飾vIGF2を形成するステップ、
c.リソソーム酵素を第2の架橋剤と接触させて、アルデヒド基を導入するステップ、及び
d.ステップbの脱保護ヒドラジド修飾vIGF2の少なくとも1つを、ステップcのアルデヒド修飾リソソーム酵素に結合するステップ
を含む、リソソーム酵素―リソソーム標的化ペプチド結合体を製造する方法。 - 第2の架橋剤がN−スクシンイミジル−4−ホルミルベンズアミド(S−4FB)を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1の架橋剤が、N−tert−ブトキシカルボニル(tBoc)保護ヒドラジドクロスリンカーを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- N−tert−ブトキシカルボニル(tBoc)保護ヒドラジドクロスリンカーが、NHS−PEG4−tBoc−ヒドラジドである、請求項3に記載の方法。
- 第1の架橋剤が、アセトン保護ヒドラジド基、ジメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、トリメトキシベンジルオキシカルボニル保護ヒドラジド基、又はこれらの任意の組み合わせを有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の架橋剤が、アセトン保護NHS−PEG4−ヒドラジド、ジメトキシベンジルカルボニル保護NHS−PEG4−ヒドラジド、又はトリメトキシベンジルオキシカルボニル保護NHS−PEG4−ヒドラジドを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素が、酸性α−グルコシダーゼ(rhGAA)、酸性α−ガラクトシダーゼA(GLA)、酸性β−グルクロニダーゼ(GUS)、酸性α−イズロニダーゼA(IduA)、酸性イズロン酸2−スルファターゼ(I2S)、β−ヘキソサミニダーゼA(HexA)、β−ヘキソサミニダーゼB(HexB)、酸性α−マンノシダーゼA、β−グルコセレブロシダーゼ(GlcCerase)、酸性リパーゼ(LPA)、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素がヒト型である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップdにおいて、脱保護ヒドラジド修飾vIGF2が約4倍モル過剰で添加される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップdにおいて、アニリンが添加される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- vIGF2が、野生型ヒトvIGF2の配列と比較して、次の変化:
野生型ヒトvIGF2のN末端アミノ酸残基1〜4の欠損;
野生型ヒトvIGF2の6位のグルタミン酸残基のアルギニン残基による置換;
野生型ヒトvIGF2の27位のチロシン残基のロイシン残基による置換;及び
野生型ヒトvIGF2の65位のリジン残基のアルギニン残基による置換;
の一つ以上を含む請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - vIGF2が、配列番号1、2、3、及び4の1つ以上を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップbの後で、脱保護ヒドラジド基修飾vIGF2を凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
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