CN117980471A - 阳离子交换剂上的腺相关病毒分离 - Google Patents

Abstract

本公开提供了纯化腺相关病毒的方法，其包括从包含空AAV衣壳和完整AAV衣壳的浓缩AAV级分或制备物中纯化完整AAV衣壳。本公开还提供了纯化腺相关病毒的方法，其包括从包含空AAV衣壳和完整AAV衣壳的浓缩AAV级分或配制物中纯化空AAV衣壳。该方法利用一种或多种单价和一种或多种二价阳离子来实现分离，产生经纯化的完整AAV衣壳或空AAV衣壳。

Description

阳离子交换剂上的腺相关病毒分离

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年8月4日提交的美国临时申请No.63/229,303的优先权，其在此通过引用整体并入。

背景技术

腺相关病毒(AAV)是一种小型、无包膜病毒，其包装了线性单链DNA基因组。AAV属于细小病毒科(Parvoviridae)和依赖病毒属(Dependovirus)，因为AAV的生产性感染仅在辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)存在的情况下发生。即使在辅助病毒不存在的情况下，AAV病毒(血清型2)也可以通过整合入宿主人基因组的19q13.4号染色体来实现潜伏。所述AAV病毒是已知的唯一能够位点特异性整合的哺乳动物DNA病毒(Daya和Berns,ClinicalMicrobiology Reviews,第583-593页(2008))。

为了让AAV在临床上安全使用，已将AAV在其基因组的几个位置进行了遗传修饰。例如，在许多病毒载体中，Rep基因(其是病毒复制所需的)和位点特异性整合所需的元件已经从AAV基因组中消除。这些重组AAV(rAAV)以染色体外状态存在，并且整合到基因组DNA中的效率非常低。因此，rAAV在宿主细胞中诱导随机诱变的可能性即使没有完全消除也有所降低。由于这些特性和缺乏致病性，rAAV作为基因疗法载体在临床前和临床应用的多个方面显示出巨大的前景。新的血清型和自身互补载体正处于临床测试中。除了这些正在进行的载体开发以外，持续的努力还集中在可扩展的制造工艺上，所述工艺可以高效地产生高滴度的具有高纯度和高效力的rAAV载体。

尽管已作出很大努力以设计高效、大规模的方法来纯化适合人施用的AAV产物，但仍需要更好的AAV纯化方法。例如，目前在细胞培养物中生成AAV的方法会导致“空”衣壳形成，这已被证明会导致T细胞介导的针对衣壳抗原的免疫应答，从而导致低度肝毒性和部分丧失表达式(Wright,Molec Therapy 22(1):1-2(2014))。因此，需要包括从最终AAV产物中除去空AAV衣壳的步骤的AAV纯化方法。

发明内容

细胞培养中AAV载体生成的特征是形成过量的“空”衣壳，其缺乏载体基因组。此类空衣壳无法提供与转基因产生相关的治疗益处。空衣壳对临床结果的影响尚不清楚。然而，有可能增加对载体的先天或适应性免疫应答，从而使空衣壳成为基因治疗背景下的一个问题。Wright,Molec Therapy 22(1):1–2(2014)。

本文提供了从包含完整AAV衣壳和空AAV衣壳的AAV配制物中纯化完整AAV衣壳以提供基本上不含空AAV衣壳的AAV产物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述完整AAV衣壳和所述空AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从空AAV衣壳中纯化出完整AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至阳离子交换柱。

本文提供了分离AAV配制物中的完整AAV衣壳和空AAV衣壳的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述完整AAV衣壳和所述空AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述空AAV衣壳中分离出所述完整AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

本文提供了分离AAV配制物中的空AAV衣壳和完整AAV衣壳的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述空AAV衣壳和所述完整AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述完整AAV衣壳中纯化出所述空AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

本文提供了分离AAV配制物中的空AAV衣壳和完整AAV衣壳的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述空AAV衣壳和所述完整AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述完整AAV衣壳中分离出所述空AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱

在一些方面，所公开的方法还可用于纯化AdV颗粒、慢病毒颗粒、γ逆转录病毒载体颗粒、单纯疱疹病毒(HSV)颗粒、猿猴病毒40(SV40)颗粒、甲病毒颗粒、披膜病毒科颗粒、罗斯河病毒颗粒和痘苗病毒颗粒。在一些方面，所公开的方法还可用于生产载体疫苗。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺及其组合组成的组。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约5mM至约1500mM。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Co²⁺及其组合组成的组。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约1mM至约30mM。在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约至约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液具有约5.0至约8.5的pH。在一些实施方案中，第一溶液具有约6.0的pH。

在一些实施方案中，第一溶液还包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛、还原Triton N-101、Triton X-100及其组合。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.0025w/w％至约0.0075w/w％。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.005w/w％。

在一些实施方案中，阳离子交换柱包含具有带电基团的树脂，其中带电基团是磺酸根、硫酸根、磺丙基、羧基、磷酸根或其组合。在一些实施方案中，阳离子交换柱包含树脂，其中所述树脂是Capto S、Eshmuno S、Mustang S、Poros 50HS、Poros 50XS、S-SepharoseFF、Source S、Capto MMC、Toyopearl Gigacap S、Gigacap CM、Toyopearl SP、ToyopearlCM、MacroPrep S、UNOsphereS、MacroprepCM、Fractogel EMD SO3、Fractogel EMD COO、Fractogel EMD SE Hicap、Cellufine Sulfate、CM和SP Trisacryl、CM和S HyperD、S和CMSepharose CL、CM Sepharose FF、S和CM CAPTO^TM、MonoS、Nuvia S、Cellufine phosphat、Cellufine MAX-S r、Cellufine MAX-S h、Cellufine MAX DexS-HbP、Cellufine MAXDexS-VirS、Toyopearl Sulfate 650或Heparin Sepharose High Performance。在一些实施方案中，CaptoS。在一些实施方案中，Eshmuno S。在一些实施方案中，Mustang S。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺及其组合组成的组。在一些实施方案中，第二溶液的单价阳离子是Na⁺。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺及其组合组成的组。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺。

在一些实施方案中，第二溶液具有约5.0至约8.5的pH。在一些实施方案中，第二溶液具有约6.0的pH。

在一些实施方案中，第二溶液还包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛(cremophor)、还原Triton N-101、Triton X-100及其组合。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.00w/w25％至约0.0075w/w。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂的总量为约0.005w/w％。

在一些方面，添加第二溶液在恒定浓度的一种或多种单价阳离子下进行。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约5mM至约1500mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约30mM。

在一些方面，添加第二溶液在恒定浓度的一种或多种二价阳离子下进行。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约1mM至约30mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约2mM。

在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种单价阳离子的浓度的逐步增加。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约15mM至约60mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约30mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约100mM至约300mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约200mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约500mM至约1500mM。在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约1000mM。

在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种二价阳离子的总浓度的逐步增加。

在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的初始总浓度为约1mM至约10mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的中间总浓度为约10mM至约20mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的最终总浓度为约20mM至约30mM。

在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加。

在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约200mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约80mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约40mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约200mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约80mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些方面，添加第二溶液包括一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加。

在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约30mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约15mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约5mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约30mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约15mM。在某些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约5mM。

在某些实施方案中，AAV衣壳衍生自由以下各项组成的组：AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、遗传修饰的AAV、化学修饰的AAV、遗传和化学修饰的AAV及其组合。在某些实施方案中，AAV衣壳衍生自AAV8。在某些实施方案中，AAV衣壳衍生自AAV9。在某些实施方案中，AAV衣壳衍生自AAV6。

在某些方面，该方法还包括制备免疫吸收柱，其包括以下步骤

(a)通过超滤、阴离子交换剂和/或阳离子交换剂浓缩空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将空AAV衣壳固定在活化树脂上。

本文还提供了包含根据如本文所述的方法纯化的完整AAV衣壳的AAV制剂。在某些实施方案中，AAV制剂还包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，AAV制剂基本上不含空AAV衣壳。

本文还提供了包含通过本文所述的方法产生的AAV产物、制剂或组合物的药物组合物。在某些实施方案中，AAV药物组合物还包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，AAV药物组合物基本上不含空AAV衣壳。

附图说明

图1描绘了实施例2的完整色谱图。

图2描绘了实施例2的洗脱区色谱图。

图3描绘了E2级分的曲线下面积(AUC)曲线。

图4描绘了E3级分的AUC曲线。

图5描绘了E4级分的AUC曲线。

图6描绘了E5级分的AUC曲线。

图7描绘了实施例3的完整色谱图。

图8描绘了实施例3的洗脱区色谱图。

图9描绘了E2级分的AUC曲线。

图10描绘了E3级分的AUC曲线。

图11描绘了E5级分的AUC曲线。

图12描绘了实施例4的完整色谱图。

图13描绘了实施例4的洗脱区色谱图。

图14描绘了E2级分的AUC曲线。

图15描绘了E3级分的AUC曲线。

图16描绘了E4级分的AUC曲线。

图17描绘了E5级分的AUC曲线。

图18描绘了实施例5的完整色谱图。

图19描绘了实施例5的洗脱区色谱图。

图20描绘了E1级分的AUC曲线。

图21描绘了E2级分的AUC曲线。

图22描绘了E3级分的AUC曲线。

图23描绘了E4级分的AUC曲线。

图24描绘了E5级分的AUC曲线。

图25描绘了实施例6的完整色谱图。

图26描绘了实施例6的洗脱区色谱图。

图27描绘了E1级分的AUC曲线。

图28描绘了E2级分的AUC曲线。

图29描绘了E3级分的AUC曲线。

图30描绘了E4级分的AUC曲线。

图31描绘了E5级分的AUC曲线。

图32描绘了E6级分的AUC曲线。

图33描绘了实施例7的洗脱区色谱图。

图34描绘了E1级分的AUC曲线。

图35描绘了E2级分的AUC曲线。

图36描绘了E3级分的AUC曲线。

图37描绘了E4级分的AUC曲线。

图38描绘了E5级分的AUC曲线。

定义

在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解本发明不限于描述的特定方法、组合物或方法学，因为它们可变化。还应理解，说明书中使用的术语仅为了描述特定版本或实施方案的目的，并非旨在限定本文的实施方案的范围，本文的实施方案只受所附权利要求限定。除非另外限定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有如一般由本领域的普通技术人员所能理解的相同的含义。尽管类似或等同于本文中所述的那些的任何方法和材料可以被用于本文的实施方案的实施方案实践或测试，现在描述了优选的方法、设备和材料。本文提及的所有公开均以引用的方式整体并入。不得将本文任何条款视为允许本文的实施方案未经授权依靠现有发明先于此公开内容。

如本文所用，以下术语具有指定的含义。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”以及类似的所指物被解释为涵盖单数和复数两者。

在一些实施方案中，如果本公开的各方面被描述为“包括”或其版本(如，包括)特征，则实施方案也被设想为“由......组成”或“基本上由......组成”

如本文所用的术语“约”旨在限定其所修饰的数值，表示这样的值是在误差范围内可变的。当没有提及特定的误差幅度(诸如数据图表或数据表中给出的平均值的标准偏差)时，术语“约”应理解为表示与它一起使用的数字数值的±10％。因此，约50％意指在45％-55％的范围内。

如本文单独或组合使用的术语“烷基”是指直链或支链烷基基团。烷基基团可任选地如本文所定义地被取代。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基，己基、辛基、壬基等。如本文单独或组合使用的术语“亚烷基”是指衍生自在两个或多个位置连接的直链或支链饱和烃的饱和脂族基团，诸如亚甲基(-CH₂-)。除非另有说明，否则术语“烷基”可包括“亚烷基”基团。

如本文所用，术语“衣壳”、“衣壳颗粒”和“颗粒”可互换使用，并且是指由至少一个完整的AAV衣壳壳组成的AAV颗粒。

如本文所用，关于AAV或AAV衣壳或AAV颗粒的术语“空”是指缺乏完全(即完整)载体基因组的那些。空AAV或空AAV衣壳或空AAV颗粒无法提供治疗益处。如本文所用，关于AAV或AAV衣壳或AAV颗粒的术语“完整”或“完整AAV衣壳”是指含有大部分完整载体基因组的那些。完整的AAV衣壳可以为接受者患者提供治疗益处。在某些实施方案中，“完整”还可以包括“不完整的载体DNA”或“截短的载体DNA”。在某些实施方案中，完整与不完整和/或截短的载体DNA可以通过另外的分析方法来区分。此类方法包括但不限于通过以下各项进行DNA大小测定：毛细管电泳、AUC(分析超速离心)、％琼脂糖DNA(天然或碱性)、凝胶、DNA印迹、斑点印迹杂交、UV分光光度法、弱阴离子交换色谱和质谱(参见Resolving Adeno-AssociatedViral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry ElizabethE.Piersonet.al Anal.Chem.,2016,88(13),第6718–6725页，其出于所有目的整体并入本文)。

术语“患者”和“受试者”可互换使用，并以其常规意义使用，是指患有或易患可通过施用本公开的AAV产物、制剂或组合物来预防或治疗的疾患的活生物体，并且包括人类和非人类动物两者。受试者的实例包括但不限于人类、黑猩猩和其他类人猿以及猴物种；农场动物，诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，诸如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野禽和猎禽，诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅等。所述术语不表示特定的年龄。因此，成人、青少年和新生儿都受到关注。

当AAV产物、AAV制剂或任何含有AAV的组合物包含少于约30％的空AAV衣壳时，其“基本上不含”空AAV衣壳。

除非本文另外说明，否则本文数值的范围的列举仅旨在用作单个地提及属于范围内的每个单独数值和每个端点的速记方法,并且将每个单独的数值和端点并入说明书，如同其在本文单个地列举一样。例如，需要明确理解，本文所引用的任何数值包括较低值至较高值的所有值，即，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合被认为在本申请中明确规定。例如，若浓度范围规定为约1％至50％，则数值诸如2％至40％、10％至30％或1％至3％等意图明确列举在此说明书中。上面所列的值仅仅是特别预期的实例。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法均能以任何合适的顺序进行。除非另有主张，否则本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地阐明本公开，并且不会对本公开范围构成限制。说明书中的语言均不应解释为指出任何非要求保护的实施本公开的必需要素。

本文描述了本公开的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本公开的最佳模式。对于本领域普通技术人员来说，在阅读了前面的描述之后，那些优选实施方案的变型将变得显而易见。本发明人期望熟练技术人员在适当情况下使用此类变型，并且发明人意图以不同于本文具体描述的方式实施该公开。因此，在适用法律允许的情况下，本公开包括在所附的权利要求中所引用主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则上述元素在其所有可能的变型中的任何组合都涵盖于本公开中。

本文所引用的所有参考文献、包括出版物、专利申请和专利特此通过引用并入，其并入程度等同于每篇参考文献单个地且具体地指示以引用方式并入，并且以其全文在本文得以陈述。

具体实施方式

本文提供了生产腺相关病毒(AAV)产物、制剂或组合物的方法、纯化AAV的方法、从包含完整AAV衣壳和空AAV衣壳的AAV配制物或级分中纯化完整AAV衣壳的方法、从包含空AAV衣壳和完整AAV衣壳的AAV配制物或级分中纯化空AAV衣壳的方法，以及用纯化的空AAV衣壳和纯化的完整AAV衣壳两者制备免疫吸收柱的方法。

在某些实施方案中，从包含完整AAV衣壳和空AAV衣壳的AAV配制物或级分纯化完整AAV衣壳以提供基本上不含空AAV衣壳的AAV产物、制剂或组合物的方法包括以下步骤：

(a)提供包含完整AAV衣壳、空AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述完整AAV衣壳和所述空AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从空AAV衣壳中纯化出完整AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至阳离子交换柱。

在某些实施方案中，分离AAV配制物或级分中的完整AAV衣壳和空AAV衣壳的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含完整AAV衣壳、空AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述完整AAV衣壳和所述空AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述空AAV衣壳中分离出所述完整AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、N(C_1-5烷基)₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺、Cu⁺、Ag⁺、Au⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约5mM至约1500mM、约50mM至约1500mM、约100mM至约1500mM、约200mM至约1500mM、约300mM至约1500mM、约400mM至约1500mM、约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约5mM至约1400mM、约5mM至约1300mM、约5mM至约1200mM、约5mM至约1100mM、约5mM至约1000mM、约5mM至约900mM、约5mM至约800mM、约5mM至约700mM、约5mM至约600mM、约5mM至约500mM、约5mM至约400mM、约5mM至约300mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、30mM至约200mM、30mM至约80mM、30mM至约60mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约5mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mM至约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约5mM至约1500mM、约50mM至约1500mM、约100mM至约1500mM、约200mM至约1500mM、约300mM至约1500mM、约400mM至约1500mM、约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约5mM至约1400mM、约5mM至约1300mM、约5mM至约1200mM、约5mM至约1100mM、约5mM至约1000mM、约5mM至约900mM、约5mM至约800mM、约5mM至约700mM、约5mM至约600mM、约5mM至约500mM、约5mM至约400mM、约5mM至约300mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、30mM至约200mM、30mM至约80mM、30mM至约60mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约5mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约30mM至约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺，并且其总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约5mM至约1500mM、约50mM至约1500mM、约100mM至约1500mM、约200mM至约1500mM、约300mM至约1500mM、约400mM至约1500mM、约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约5mM至约1400mM、约5mM至约1300mM、约5mM至约1200mM、约5mM至约1100mM、约5mM至约1000mM、约5mM至约900mM、约5mM至约800mM、约5mM至约700mM、约5mM至约600mM、约5mM至约500mM、约5mM至约400mM、约5mM至约300mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、30mM至约200mM、30mM至约80mM、30mM至约60mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约5mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约30mM至约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是K⁺，并且其总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约5mM至约1500mM、约50mM至约1500mM、约100mM至约1500mM、约200mM至约1500mM、约300mM至约1500mM、约400mM至约1500mM、约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约5mM至约1400mM、约5mM至约1300mM、约5mM至约1200mM、约5mM至约1100mM、约5mM至约1000mM、约5mM至约900mM、约5mM至约800mM、约5mM至约700mM、约5mM至约600mM、约5mM至约500mM、约5mM至约400mM、约5mM至约300mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、30mM至约200mM、30mM至约80mM、30mM至约60mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约5mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约30mM至约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约200mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约80mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约60mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种单价阳离子是NH₄ ⁺，并且其总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Co²⁺、Be²⁺、Ga²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Ti²⁺、Sr²⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Co²⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约至约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺，并且其总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺，并且其总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mg²⁺，并且其总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Zn²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Zn²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Zn²⁺，并且其总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Zn²⁺，并且其总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mn²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mn²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mn²⁺，并且其总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Mn²⁺，并且其总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Cu²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Cu²⁺，并且其总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Cu²⁺，并且其总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第一溶液的一种或多种二价阳离子是Cu²⁺，并且其总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，第一溶液的pH为约5.0至约8.5、约5.5至约8.5、约6.0至约8.5、约6.5至约8.5、约7.0至约8.5、约7.5至约8.5、约8.0至约8.5、约5.0至约8.0、约5.0至约7.5、约5.0至约7.0、约5.0至约6.5、约5.0至约6.0、约5.0至约5.5，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第一溶液具有约6.0的pH。

在一些实施方案中，第一溶液还包含一种或多种表面活性剂。

在一些实施方案中，阳离子交换柱包含具有带电基团的树脂，其中带电基团是磺酸根、硫酸根、磺丙基、羧基、磷酸根或其组合。

在一些实施方案中，阳离子交换柱包含树脂，其中所述树脂是CaptoS、Eshmuno S、Mustang S、Poros 50HS、Poros 50XS、S-Sepharose FF、Source S、Capto MMC、ToyopearlGigacap S、Gigacap CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、MacroPrep S、UNOsphereS、MacroprepCM、Fractogel EMD SO3、Fractogel EMD COO、Fractogel EMD SE Hicap、Cellufine Sulfate、CM和SP Trisacryl、CM和S HyperD、S和CM Sepharose CL、CMSepharose FF、S和CM CAPTO^TM、MonoS、Nuvia S、Cellufine phosphat、Cellufine MAX-S r、Cellufine MAX-S h、Cellufine MAX DexS-HbP、Cellufine MAX DexS-VirS、ToyopearlSulfate 650或Heparin Sepharose High Performance。

在一些实施方案中，树脂是CaptoS。

在一些实施方案中，树脂是Eshmuno S。

在一些实施方案中，树脂是Mustang S。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、N(C_1-5烷基)₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺、Cu⁺、Ag⁺、Au⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第二溶液的单价阳离子是Na⁺。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Co²⁺、Be²⁺、Ga²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Ti²⁺、Sr²⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn^{2 +}、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺及其组合组成的组。

在一些实施方案中，第二溶液的二价阳离子是Ca²⁺。

在一些实施方案中，第二溶液的二价阳离子是Mg²⁺。

在一些实施方案中，第二溶液的二价阳离子是Zn²⁺。

在一些实施方案中，第二溶液的二价阳离子是Mn²⁺。

在一些实施方案中，第二溶液的pH为约5.0至约8.5、约5.5至约8.5、约6.0至约8.5、约6.5至约8.5、约7.0至约8.5、约7.5至约8.5、约8.0至约8.5、约5.0至约8、约5.0至约7.5、约5.0至约7.0、约5.0至约6.5、约5.0至约6、约5.0至约5.5，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约5、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液具有约6的pH。

在一些实施方案中，第二溶液还包含一种或多种表面活性剂。

在一些实施方案中，添加第二溶液在恒定总浓度的一种或多种单价阳离子下进行。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约5mM至约1500mM、约50mM至约1500mM、约100mM至约1500mM、约200mM至约1500mM、约300mM至约1500mM、约400mM至约1500mM、约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约5mM至约1400mM、约5mM至约1300mM、约5mM至约1200mM、约5mM至约1100mM、约5mM至约1000mM、约5mM至约900mM、约5mM至约800mM、约5mM至约700mM、约5mM至约600mM、约5mM至约500mM、约5mM至约400mM、约5mM至约300mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约5mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液在恒定总浓度的Na⁺下进行。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的恒定总浓度为约5mM至约1500mM、约50mM至约1500mM、约100mM至约1500mM、约200mM至约1500mM、约300mM至约1500mM、约400mM至约1500mM、约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约5mM至约1400mM、约5mM至约1300mM、约5mM至约1200mM、约5mM至约1100mM、约5mM至约1000mM、约5mM至约900mM、约5mM至约800mM、约5mM至约700mM、约5mM至约600mM、约5mM至约500mM、约5mM至约400mM、约5mM至约300mM、约5mM至约200mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的恒定总浓度为约5mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的恒定总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液在恒定总浓度的一种或多种二价阳离子下进行。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液在恒定总浓度的Ca²⁺下进行。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的恒定总浓度为约1mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约15mM至约30mM、约20mM至约30mM、约25mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的恒定总浓度为约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的恒定总浓度为约2mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括一种或多种单价阳离子的总浓度的逐步增加。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约15mM至约60mM、约20mM至约60mM、约25mM至约60mM、约30mM至约60mM、约35mM至约60mM、约40mM至约60mM、约45mM至约60mM、约50mM至约60mM、约55mM至约60mM、约15mM至约55mM、约15mM至约50mM、约15mM至约45mM、约15mM至约40mM、约15mM至约35mM、约15mM至约30mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约15mM至约60mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约100mM至约300mM、约125mM至约300mM、约150mM至约300mM、约175mM至约300mM、约200mM至约300mM、约225mM至约300mM、约250mM至约300mM、约275mM至约300mM、约100mM至约275mM、约100mM至约250mM、约100mM至约225mM、约100mM至约200mM、约100mM至约175mM、约100mM至约150mM、约100mM至约125mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约100mM至约300mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约500mM至约1400mM、约500mM至约1300mM、约500mM至约1200mM、约500mM至约1100mM、约500mM至约1000mM、约500mM至约900mM、约500mM至约800mM、约500mM至约700mM、约500mM至约600mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约500mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约1000mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括Na⁺的总浓度的逐步增加。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的初始总浓度为约15mM至约60mM、约20mM至约60mM、约25mM至约60mM、约30mM至约60mM、约35mM至约60mM、约40mM至约60mM、约45mM至约60mM、约50mM至约60mM、约55mM至约60mM、约15mM至约55mM、约15mM至约50mM、约15mM至约45mM、约15mM至约40mM、约15mM至约35mM、约15mM至约30mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的初始总浓度为约15mM至约60mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的初始总浓度为约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的中间总浓度为约100mM至约300mM、约125mM至约300mM、约150mM至约300mM、约175mM至约300mM、约200mM至约300mM、约225mM至约300mM、约250mM至约300mM、约275mM至约300mM、约100mM至约275mM、约100mM至约250mM、约100mM至约225mM、约100mM至约200mM、约100mM至约175mM、约100mM至约150mM、约100mM至约125mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的初始总浓度为约100mM至约300mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的中间总浓度为约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的最终总浓度为约500mM至约1500mM、约600mM至约1500mM、约700mM至约1500mM、约800mM至约1500mM、约900mM至约1500mM、约1000mM至约1500mM、约1100mM至约1500mM、约1200mM至约1500mM、约1300mM至约1500mM、约1400mM至约1500mM、约500mM至约1400mM、约500mM至约1300mM、约500mM至约1200mM、约500mM至约1100mM、约500mM至约1000mM、约500mM至约900mM、约500mM至约800mM、约500mM至约700mM、约500mM至约600mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、约1000mM、约1100mM、约1200mM、约1300mM、约1400mM、约1500mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的最终总浓度为约500mM至约1500mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的最终总浓度为约1000mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括一种或多种二价阳离子的总浓度的逐步增加。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的初始总浓度为约1mM至约10mM、约2mM至约10mM、约3mM至约10mM、约4mM至约10mM、约5mM至约10mM、约6mM至约10mM、约7mM至约10mM、约8mM至约10mM、约9mM至约10mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、约1mM至约2mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的初始总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的中间总浓度为约10mM至约20mM、约11mM至约20mM、约12mM至约20mM、约13mM至约20mM、约14mM至约20mM、约15mM至约20mM、约16mM至约20mM、约17mM至约20mM、约18mM至约20mM、约19mM至约20mM、约10mM至约19mM、约10mM至约18mM、约10mM至约17mM、约10mM至约16mM、约10mM至约15mM、约10mM至约14mM、约10mM至约13mM、约10mM至约12mM、约10mM至约11mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的中间总浓度为约10mM至约20mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的最终总浓度为约20mM至约30mM、约21mM至约30mM、约22mM至约30mM、约23mM至约30mM、约24mM至约30mM、约25mM至约30mM、约26mM至约30mM、约27mM至约30mM、约28mM至约30mM、约29mM至约30mM、约20mM至约29mM、约20mM至约28mM、约20mM至约27mM、约20mM至约26mM、约20mM至约25mM、约20mM至约24mM、约20mM至约23mM、约20mM至约22mM、约20mM至约21mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约20mM、约21mM、约22mM、约23、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的最终总浓度为约20mM至约30mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括Ca²⁺的总浓度的逐步增加。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的初始总浓度为约1mM至约10mM、约2mM至约10mM、约3mM至约10mM、约4mM至约10mM、约5mM至约10mM、约6mM至约10mM、约7mM至约10mM、约8mM至约10mM、约9mM至约10mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、约1mM至约2mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的初始总浓度为约1mM至约10mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的中间总浓度为约10mM至约20mM、约11mM至约20mM、约12mM至约20mM、约13mM至约20mM、约14mM至约20mM、约15mM至约20mM、约16mM至约20mM、约17mM至约20mM、约18mM至约20mM、约19mM至约20mM、约10mM至约19mM、约10mM至约18mM、约10mM至约17mM、约10mM至约16mM、约10mM至约15mM、约10mM至约14mM、约10mM至约13mM、约10mM至约12mM、约10mM至约11mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的中间总浓度为约10mM至约20mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的最终总浓度为约20mM至约30mM、约21mM至约30mM、约22mM至约30mM、约23mM至约30mM、约24mM至约30mM、约25mM至约30mM、约26mM至约30mM、约27mM至约30mM、约28mM至约30mM、约29mM至约30mM、约20mM至约29mM、约20mM至约28mM、约20mM至约27mM、约20mM至约26mM、约20mM至约25mM、约20mM至约24mM、约20mM至约23mM、约20mM至约22mM、约20mM至约21mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约20mM、约21mM、约22mM、约23、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的最终总浓度为约20mM至约30mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约200mM、在40个柱体积中约40mM至约200mM、在40个柱体积中约50mM至约200mM、在40个柱体积中约75mM至约200mM、在40个柱体积中约100mM至约200mM、在40个柱体积中约125mM至约200mM、在40个柱体积中约150mM至约200mM、在40个柱体积中约175mM至约200mM、在40个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在40个柱体积中约30mM至约125mM、在40个柱体积中约30mM至约100mM、在40个柱体积中约30mM至约80mM、在40个柱体积中约30mM至约75mM、在40个柱体积中约30mM至约50mM、在40个柱体积中约30mM至约40mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约40mM至约200mM、在30个柱体积中约50mM至约200mM、在30个柱体积中约75mM至约200mM、在30个柱体积中约100mM至约200mM、在30个柱体积中约125mM至约200mM、在30个柱体积中约150mM至约200mM、在30个柱体积中约175mM至约200mM、在30个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约30mM至约125mM、在30个柱体积中约30mM至约100mM、在30个柱体积中约30mM至约80mM、在30个柱体积中约30mM至约75mM、在30个柱体积中约30mM至约50mM、在30个柱体积中约30mM至约40mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约200mM、在20个柱体积中约40mM至约200mM、在20个柱体积中约50mM至约200mM、在20个柱体积中约75mM至约200mM、在20个柱体积中约100mM至约200mM、在20个柱体积中约125mM至约200mM、在20个柱体积中约150mM至约200mM、在20个柱体积中约175mM至约200mM、在20个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在20个柱体积中约30mM至约125mM、在20个柱体积中约30mM至约100mM、在20个柱体积中约30mM至约80mM、在20个柱体积中约30mM至约75mM、在20个柱体积中约30mM至约50mM、在20个柱体积中约30mM至约40mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约200mM、在10个柱体积中约40mM至约200mM、在10个柱体积中约50mM至约200mM、在10个柱体积中约75mM至约200mM、在10个柱体积中约100mM至约200mM、在10个柱体积中约125mM至约200mM、在10个柱体积中约150mM至约200mM、在10个柱体积中约175mM至约200mM、在10个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在10个柱体积中约30mM至约125mM、在10个柱体积中约30mM至约100mM、在10个柱体积中约30mM至约80mM、在10个柱体积中约30mM至约75mM、在10个柱体积中约30mM至约50mM、在10个柱体积中约30mM至约40mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约200mM、在5个柱体积中约40mM至约200mM、在5个柱体积中约50mM至约200mM、在5个柱体积中约75mM至约200mM、在5个柱体积中约100mM至约200mM、在5个柱体积中约125mM至约200mM、在5个柱体积中约150mM至约200mM、在5个柱体积中约175mM至约200mM、在5个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在5个柱体积中约30mM至约125mM、在5个柱体积中约30mM至约100mM、在5个柱体积中约30mM至约80mM、在5个柱体积中约30mM至约75mM、在5个柱体积中约30mM至约50mM、在5个柱体积中约30mM至约40mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，一旦评价了特定构建体(如，AAV构建体)的精确分离特性，就可以减少柱体积的量。举例来说，但不限于，如果平衡缓冲液和洗脱缓冲液之间单价阳离子的摩尔浓度差为例如5mM至10mM(如，5个柱体积中30mM Na⁺至40mM Na⁺的梯度)，则梯度的柱体积可减少至5个柱体积(或可低于5个柱体积)。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括Na⁺的总浓度的连续线性增加。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约200mM、在40个柱体积中约40mM至约200mM、在40个柱体积中约50mM至约200mM、在40个柱体积中约75mM至约200mM、在40个柱体积中约100mM至约200mM、在40个柱体积中约125mM至约200mM、在40个柱体积中约150mM至约200mM、在40个柱体积中约175mM至约200mM、在40个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在40个柱体积中约30mM至约125mM、在40个柱体积中约30mM至约100mM、在40个柱体积中约30mM至约80mM、在40个柱体积中约30mM至约75mM、在40个柱体积中约30mM至约50mM、在40个柱体积中约30mM至约40mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约200mM、在40个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约50mM至约200mM、在30个柱体积中约75mM至约200mM、在30个柱体积中约100mM至约200mM、在30个柱体积中约125mM至约200mM、在30个柱体积中约150mM至约200mM、在30个柱体积中约175mM至约200mM、在30个柱体积中约30mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约30mM至约125mM、在30个柱体积中约30mM至约100mM、在30个柱体积中约30mM至约80mM、在30个柱体积中约30mM至约75mM、在30个柱体积中约30mM至约50mM、在40个柱体积中约30mM至约30mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约20mM至约200mM、在40个柱体积中约20mM至约200mM、在20个柱体积中约50mM至约200mM、在20个柱体积中约75mM至约200mM、在20个柱体积中约100mM至约200mM、在20个柱体积中约125mM至约200mM、在20个柱体积中约150mM至约200mM、在20个柱体积中约175mM至约200mM、在30个柱体积中约20mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约20mM至约125mM、在30个柱体积中约20mM至约100mM、在30个柱体积中约20mM至约80mM、在30个柱体积中约20mM至约75mM、在30个柱体积中约20mM至约50mM、在40个柱体积中约30mM至约20mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约10mM至约200mM、在40个柱体积中约10mM至约200mM、在10个柱体积中约50mM至约200mM、在10个柱体积中约75mM至约200mM、在10个柱体积中约100mM至约200mM、在10个柱体积中约125mM至约200mM、在10个柱体积中约150mM至约200mM、在10个柱体积中约175mM至约200mM、在30个柱体积中约10mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约10mM至约125mM、在30个柱体积中约10mM至约100mM、在30个柱体积中约10mM至约80mM、在30个柱体积中约10mM至约75mM、在30个柱体积中约10mM至约50mM、在40个柱体积中约30mM至约10mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约5mM至约200mM、在40个柱体积中约5mM至约200mM、在5个柱体积中约50mM至约200mM、在5个柱体积中约75mM至约200mM、在5个柱体积中约100mM至约200mM、在5个柱体积中约125mM至约200mM、在5个柱体积中约150mM至约200mM、在5个柱体积中约175mM至约200mM、在30个柱体积中约5mM至约175mM、在150个柱体积中约30mM至约200mM、在30个柱体积中约5mM至约125mM、在30个柱体积中约5mM至约100mM、在30个柱体积中约5mM至约80mM、在30个柱体积中约5mM至约75mM、在30个柱体积中约5mM至约50mM、在40个柱体积中约30mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约30mM至约40 0。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约200mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约80mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Na⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约40mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约30mM、在40个柱体积中5mM至约30mM、在40个柱体积中10mM至约30mM、在40个柱体积中15mM至约30mM、在40个柱体积中20mM至约30mM、在40个柱体积中25mM至约30mM、在40个柱体积中1mM至约25mM、在40个柱体积中1mM至约20mM、在40个柱体积中1mM至约15mM、在40个柱体积中1mM至约10mM、在40个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约30mM、在30个柱体积中5mM至约30mM、在30个柱体积中10mM至约30mM、在30个柱体积中15mM至约30mM、在30个柱体积中20mM至约30mM、在30个柱体积中25mM至约30mM、在30个柱体积中1mM至约25mM、在30个柱体积中1mM至约20mM、在30个柱体积中1mM至约15mM、在30个柱体积中1mM至约10mM、在30个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约30mM、在20个柱体积中5mM至约30mM、在20个柱体积中10mM至约30mM、在20个柱体积中15mM至约30mM、在20个柱体积中20mM至约30mM、在20个柱体积中25mM至约30mM、在20个柱体积中1mM至约25mM、在20个柱体积中1mM至约20mM、在20个柱体积中1mM至约15mM、在20个柱体积中1mM至约10mM、在20个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约1mM至约30mM、在10个柱体积中5mM至约30mM、在10个柱体积中10mM至约30mM、在10个柱体积中15mM至约30mM、在10个柱体积中20mM至约30mM、在10个柱体积中25mM至约30mM、在10个柱体积中1mM至约25mM、在10个柱体积中1mM至约20mM、在10个柱体积中1mM至约15mM、在10个柱体积中1mM至约10mM、在10个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约30mM、在5个柱体积中5mM至约30mM、在5个柱体积中10mM至约30mM、在5个柱体积中15mM至约30mM、在5个柱体积中20mM至约30mM、在5个柱体积中25mM至约30mM、在5个柱体积中1mM至约25mM、在5个柱体积中1mM至约20mM、在5个柱体积中1mM至约15mM、在5个柱体积中1mM至约10mM、在5个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，添加第二溶液包括Ca²⁺的总浓度的连续线性增加。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约30mM、在40个柱体积中5mM至约30mM、在40个柱体积中10mM至约30mM、在40个柱体积中15mM至约30mM、在40个柱体积中20mM至约30mM、在40个柱体积中25mM至约30mM、在40个柱体积中1mM至约25mM、在40个柱体积中1mM至约20mM、在40个柱体积中1mM至约15mM、在40个柱体积中1mM至约10mM、在40个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约30mM、在30个柱体积中5mM至约30mM、在30个柱体积中10mM至约30mM、在30个柱体积中15mM至约30mM、在30个柱体积中20mM至约30mM、在30个柱体积中25mM至约30mM、在30个柱体积中1mM至约25mM、在30个柱体积中1mM至约20mM、在30个柱体积中1mM至约15mM、在30个柱体积中1mM至约10mM、在30个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约30mM、在20个柱体积中5mM至约30mM、在20个柱体积中10mM至约30mM、在20个柱体积中15mM至约30mM、在20个柱体积中20mM至约30mM、在20个柱体积中25mM至约30mM、在20个柱体积中1mM至约25mM、在20个柱体积中1mM至约20mM、在20个柱体积中1mM至约15mM、在20个柱体积中1mM至约10mM、在20个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在10个柱体积中约1mM至约30mM、在10个柱体积中5mM至约30mM、在10个柱体积中10mM至约30mM、在10个柱体积中15mM至约30mM、在10个柱体积中20mM至约30mM、在10个柱体积中25mM至约30mM、在10个柱体积中1mM至约25mM、在10个柱体积中1mM至约20mM、在10个柱体积中1mM至约15mM、在10个柱体积中1mM至约10mM、在10个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约30mM、在5个柱体积中5mM至约30mM、在5个柱体积中10mM至约30mM、在5个柱体积中15mM至约30mM、在5个柱体积中20mM至约30mM、在5个柱体积中25mM至约30mM、在5个柱体积中1mM至约25mM、在5个柱体积中1mM至约20mM、在5个柱体积中1mM至约15mM、在5个柱体积中1mM至约10mM、在5个柱体积中1mM至约5mM，或这些范围之一内的值。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在30个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在20个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在0个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在0个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在0个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约30mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约15mM。

在一些实施方案中，第二溶液的Ca²⁺的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约5mM。

在一些实施方案中，AAV衣壳衍生自由以下各项组成的组：AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、遗传修饰的AAV、化学修饰的AAV、遗传和化学修饰的AAV及其组合。

在一些实施方案中，AAV衣壳衍生自AAV8。

在一些实施方案中，AAV衣壳衍生自AAV9。

在一些实施方案中，AAV衣壳衍生自AAV6。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如第一溶液或第二溶液)选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛、还原Triton N-101、Triton X-100及其组合。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如，第一溶液或第二溶液)选自由聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆124及其组合组成的组。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如，第一溶液或第二溶液)是聚山梨酯80。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如，第一溶液或第二溶液)是聚山梨酯20。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如，第一溶液或第二溶液)是聚山梨酯124。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如，第一溶液或第二溶液)的总量为约0.0025w/w％至约0.0075w/w％、约0.003w/w％至约0.0075w/w％、约0.0035w/w％至约0.0075w/w％、约0.004w/w％至约0.0075w/w％、约0.0045w/w％至约0.0075w/w％、约0.005w/w％至约0.0075w/w％、约0.0055w/w％至约0.0075w/w％、约0.006w/w％至约0.0075w/w％、约0.0065w/w％至约0.0075w/w％、约0.007w/w％至约0.0075w/w％、约0.0025w/w％至约0.0070w/w％、约0.0025w/w％至约0.0065w/w％、约0.0025w/w％至约0.006w/w％、约0.0025w/w％至约0.0065w/w％、约0.0025w/w％至约0.006w/w％、约0.0025w/w％至约0.0055w/w％、约0.0025w/w％至约0.005w/w％、约0.0025w/w％至约0.0045w/w％、约0.0025w/w％至约0.004w/w％、约0.0025w/w％至约0.0035w/w％、约0.0025w/w％至约0.003w/w％，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约0.0025w/w％、约0.003w/w％、约0.0035w/w％、约0.004w/w％、约0.0045w/w％、约0.005w/w％、约0.0055w/w％、约0.006w/w％、约0.0065w/w％、约0.007w/w％、约0.0075w/w％或这些值中任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(如，第一溶液或第二溶液)的总量为约0.005w/w％。

在某些实施方案中，从包含空AAV衣壳和完整AAV衣壳的AAV配制物或级分纯化空AAV衣壳以提供基本上不含完整AAV衣壳的AAV产物、制剂或组合物的方法包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述空AAV衣壳和所述完整AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述完整AAV衣壳中纯化出所述空AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

在一些实施方案中，纯化的AAV产物、制剂或组合物包含小于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的空AAV衣壳。在一些实施方案中，纯化的AAV产物、制剂或组合物包含少于约30％的空AAV衣壳。在一些实施方案中，纯化的AAV产物、制剂或组合物包含少于约20％的空AAV衣壳。在一些实施方案中，纯化的AAV产物、制剂或组合物包含少于约6％的空AAV衣壳。

在某些实施方案中，分离AAV配制物或级分中的空AAV衣壳和完整AAV衣壳的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述空AAV衣壳和所述完整AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述完整AAV衣壳中分离出所述空AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

在某些实施方案中，在低电导率区域，可以选择完整的衣壳或基本上完整的衣壳，并且在较高电导率区域中，可以选择空衣壳或基本上空的衣壳。

在一些实施方案中，空AAV衣壳衍生自由以下各项组成的组：AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、遗传修饰的AAV、化学修饰的AAV、遗传和化学修饰的AAV及其组合。

在一些实施方案中，空AAV衣壳衍生自AAV8。

在一些实施方案中，空AAV衣壳衍生自AAV9。

在一些实施方案中，空AAV衣壳衍生自AAV6。

一些实施方案涉及一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过超滤浓缩本文公开的任何实施方案的空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将空AAV衣壳固定在活化树脂上。

一些实施方案涉及一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过阴离子交换剂浓缩本文公开的任何实施方案的空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将空AAV衣壳固定在活化树脂上。

一些实施方案涉及一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过阳离子交换剂浓缩本文公开的任何实施方案的空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将空AAV衣壳固定在活化树脂上。

一些实施方案涉及一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过超滤浓缩本文公开的任何实施方案的完整AAV衣壳；和

(b)将缓冲液交换为适用于治疗患者的缓冲液。

一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过阴离子交换剂浓缩本文公开的任何实施方案的完整AAV衣壳；和

(b)将缓冲液交换为适用于治疗患者的缓冲液。

一些实施方案涉及一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过阳离子交换剂浓缩本文公开的任何实施方案的完整AAV衣壳；和

(b)将缓冲液交换为适用于治疗患者的缓冲液。

在一些实施方案中，将空AAV衣壳固定在活化树脂上发生的温度为约2℃至约37℃、约5℃至约37℃、约10℃至约37℃、约15℃至约37℃、约20℃至约37℃、约25℃至约37℃、约30℃至约37℃、约35℃至约37℃、约2℃至约35℃、约2℃至约30℃、约2℃至约25℃、约2℃至约20℃、约2℃至约15℃、约2℃至约10℃、约2℃至约5℃、约5℃至约35℃、约10℃至约30℃、约15℃至约25℃或这些范围之一内的值。具体实例可包括约2℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，将空AAV衣壳固定在活化树脂上进行的反应时间为约2小时(hr)至约20小时、约2小时至约19小时、约2小时至约18小时、约2小时至约17小时、约2小时至约16小时、约2小时至约15小时、约2小时至约14小时、约2小时至约13小时、约2小时至约12小时、约2小时至约11小时、约2小时至约10小时、约2小时至约9小时、约2小时至约8小时、约2小时至约7小时、约2小时至约6小时、约2小时至约5小时、约2小时至约4小时、约2小时至约3小时、约3小时至约20小时、约4小时至约20小时、约5小时至约20小时、约6小时至约20小时、约7小时至约20小时、约8小时至约20小时、约9小时至约20小时、约10小时至约20小时、约11小时至约20小时、约12小时至约20小时、约13小时至约20小时、约14小时至约20小时、约15小时至约20小时、约16小时至约20小时、约17小时至约20小时、约18小时至约20小时、约19小时至约20小时，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，无胺缓冲液选自由磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)及其组合组成的组。

在一些实施方案中，无胺缓冲液的浓度为约50mM至约150mM、约50mM至约125mM、约50mM至约100mM、约75mM至约150mM、约100mM至约150mM、约75mM至约125mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，无胺缓冲液浓度的浓度为约100mM。

在一些实施方案中，无胺缓冲液还包含NaCl。

在一些实施方案中，NaCl的浓度为约100mM至约200mM、约125mM至约200mM、约150mM至约200mM、约100mM至约175mM、约100mM至约150mM、约125mM至约175mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，NaCl的浓度为约150mM。

在一些实施方案中，无胺缓冲液的pH为约7.0至约8.5、约7.25至约8.5、约7.5至约8.5、约7.75至约8.5、约8.0至约8.5、约8.25至约8.5、约7.0至约8.25、约7.0至约8、约7.0至约7.75、约7.0至约7.5、约7.0至约7.25，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约7.0、约7.25、约7.5、约7.75、约8.0、约8.25、约8.5或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，无胺缓冲液具有约8.0至约8.5的pH。

在一些实施方案中，活化树脂选自由CNBr-Sepharose FF、NHS-Sepharose FF、CNBr、Poros EP和Poros AL组成的组。

在一些实施方案中，无胺缓冲液的pH为约6.5、约7、约7.5、约8或这些值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，无胺缓冲液的pH为约7.5。

在一些实施方案中，阴离子交换剂选自由Fractogel TMAE、PorosPI、Q SepharoseHP、Poros HQ、Toyopearl GigaCap Q 650、Cellufine Max Q和Praesto Q组成的组。

在一些实施方案中，阴离子交换剂选自由Fractogel TMAE、Poros PI和Poros HQ组成的组。

在一些实施方案中，阴离子交换剂是Fractogel TMAE。

在一些实施方案中，阴离子交换剂是Poros PI。

在一些实施方案中，阴离子交换剂是Poros HQ。

在一些实施方案中，阳离子交换剂选自由Capto S、Eshmuno S、Mustang S、cellufinesulfate、cellufinephosphate、Toyopearl sulfate 650、Poros XS、Poros HS和Praesto SP组成的组。

在一些实施方案中，阳离子交换剂选自由Capto S和Eshmuno S组成的组。

在一些实施方案中，阳离子交换剂是Capto S。

在一些实施方案中，阳离子交换剂是Eshmuno S。

作为示例而非限制，适用于治疗患者的潜在缓冲液可以在WO2018128689A1和WO2020014479A1中找到，出于所有预期目的将其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，适用于治疗患者的缓冲液是L-组氨酸。

在一些实施方案中，适用于治疗患者的缓冲液的浓度为约5mM至约25mM、约5mM至约15mM、约10mM至约20mM，或约15mM至约25mM，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，适用于治疗患者的缓冲液还包含NaCl。

在一些实施方案中，NaCl的浓度为约100mM至约200mM、约125mM至约200mM、约150mM至约200mM、约100mM至约175mM、约100mM至约150mM、约125mM至约175mM，或这些范围之一内的值。具体实例可以包括约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，NaCl的浓度为约150mM。

在一些实施方案中，适合于治疗患者的缓冲液具有约6.5至约9.0、约6.5至约8.0、约6.9至约7.7，或约7.0至约7.5的pH，或这些范围之一内的值。具体实例可包括约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、约9.0，或这些值中任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，适用于治疗患者的缓冲液具有约7.0的pH。

在一些实施方案中，无胺缓冲液的pH为约8.0至约7.5。

一些实施方案涉及用于从AAV配制物或级分纯化空AAV衣壳的方法，其中纯化的AAV产物、制剂、组合物等包含约小于40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的空AAV衣壳。在一些实施方案中，纯化的AAV产物、制剂或组合物包含约1％至约30％、约4％至约30％、约1％至约20％、约1％至约6％、约2％至约20％、约3％至约20％、约4％至约20％、约5％至约20％、约6％至约20％、约4％至约19％、约5％至约19％、约4％至约12％、约5％至约12％、约4％至约11％，或约5％至约11％的空AAV衣壳。

AAV制剂和AAV产物

本文提供了包含根据如本文所述的方法纯化的完整AAV衣壳的AAV制剂。

本文还提供了药物组合物，其包含通过如本文所述的方法产生的AAV产物。

在示例性实施方案中，本公开的AAV制剂或AAV组合物或AAV产物包含另外的药学上可接受的成分。在示例性方面，AAV制剂或AAV组合物或AAV产物包含以下任何一种或其组合：酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶推进剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、基质、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解促进剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、薄膜成型剂、风味增强剂、矫味剂、流动增强剂、胶凝剂、造粒剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘合剂、软膏基质、软膏、油性载体、有机基质、锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂、表面活性物质、助悬剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水溶性助溶剂、水软化剂或润湿剂。在一些实施方案中，本公开的AAV制剂或AAV组合物或AAV产物包括以下组分中的任一种或组合：阿拉伯树胶、乙酰磺酰胺钾、柠檬酸乙酰三丁酯、柠檬酸乙酰三乙酯、琼脂、白蛋白、酒精、脱水酒精、变性酒精、稀酒精、紫胶桐酸、藻酸、脂肪聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿斯巴甜、注射用抑菌水、膨润土、澎润土乳浆、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丁酯钠、海藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己基氨基磺酸钙、无水磷酸氢二钙、脱水磷酸氢二钙、磷酸三钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、半水合硫酸钙、菜籽油、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、卡拉胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、鲸脂硬脂醇、西曲溴铵、鲸脂醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、醋酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、氯二氟乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氯氟烃(CFC)氯苯氧乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖浆固体、无水柠檬酸、一水柠檬酸、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、环己基酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖、无水葡萄糖、二唑烷基脲、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精型化合物诸如二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、依地酸二钾(dipotassium edentate)、依地酸二钠(disodiumedentate)、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、没食子酸十二烷基酯、十二烷基三甲基溴化铵、依地酸钙二钠、依地酸(edtic acid)、乙葡胺、乙醇、乙基纤维素、没食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸乙酯钾、对羟基苯甲酸乙酯钠、乙基香草醛、果糖、果糖液体、碾磨果糖、无热原果糖、粉状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液态葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、甘氨酸、二醇、糖原质、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人血清白蛋白、碳氢化合物(HC)、稀盐酸、II型氢化植物油、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、咪脲、靛蓝胭脂红、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、普通碳酸镁、无水碳酸镁、碱式碳酸镁、氢氧化镁、十二烷基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糖糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露糖醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钾、对羟基苯甲酸甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱土、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、凡士林、凡士林和羊毛脂醇、药用釉、苯酚、液化苯酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林、波拉克林钾、泊洛沙姆、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、焦亚硫酸钾、单碱式磷酸钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯酯、丙二醇、丙二醇海藻酸酯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钾、对羟基苯甲酸丙酯钠、硫酸鱼精蛋白、菜籽油、林格氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶态二氧化硅(colloidalsilica)、胶态二氧化硅(colloidal silicon dioxide)、海藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己基磺酸钠、依地酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、焦亚硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、淀粉乙醇酸钠、富马酸硬脂酰钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨糖酯(山梨糖脂肪酯)、山梨糖醇、山梨糖醇溶液70％、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预糊化淀粉、可灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压缩糖、糖果剂糖、糖球、转化糖、Sugartab、Sunset Yellow FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、酒黄石、四氟乙烷(HFC)、可可油、硫柳汞、二氧化钛、α-生育酚、乙酸生育酚酯、α-生育酚琥珀酸、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黄蓍胶、三醋精、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基十四烷基溴化铵、tris缓冲液、依地酸三钠、香兰素、I型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、吸入用无菌水、注射用无菌水、冲洗用无菌水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、十六烷基酯蜡、微晶蜡、非离子乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白石油脂、羊毛脂肪、黄原胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌，或Handbook of Pharmaceutical Excipients,第三版，A.H.Kibbe(PharmaceuticalPress,London,UK,2000)中的任何赋形剂。其通过引用整体并入。Remington’sPharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)，为了所有预期目的通过引用整体并入，公开了用于配制药学上可接受的AAV配制物或AAV产物或AAV组合物所用的各种组分及其已知的制备技术。除非任何常规试剂与药物AAV制剂或AAV产物或AAV组合物不相容，否则考虑其在药物AAV制剂或AAV产物或AAV组合物中的用途。在示例性实施方案中，本公开的AAV制剂或AAV产物或AAV组合物不包含上述成分中的一种或组合。在示例性实施方案中，本公开的AAV制剂或AAV产物或AAV组合物不包含这些成分中的任一种。在示例性方面，本公开的药物AAV制剂或AAV产物或AAV组合物不包含葡聚糖。在示例性方面，本公开的药物AAV制剂或AAV产物或AAV组合物不包含氯化钙。

定量和/或定性方法

本公开的方法包括一个或多个质量控制步骤，如测量在纯化过程的一个或多个步骤之后(如，在每个步骤之后)获得的AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物的浓度、剂量和/或效力的步骤，包括制备用于施用的AAV配制物、产物、制剂或组合物的最终步骤。

本公开的方法可以包括对AAV(如，AAV抗原)特异性的ELISA测定，用于定量AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，ELISA测定可包括但不限于免疫吸附测定、直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和/或竞争性ELISA。在某些实施方案中，ELISA是夹心ELISA。

在某些实施方案中，AAV抗原是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或嵌合AAV抗原。在某些实施方案中，AAV抗原是AAV8抗原。在某些实施方案中，AAV抗原来自重组AAV(rAAV)。在某些实施方案中，AAV抗原来自基因工程化AAV，或化学修饰的AAV或两者。

在某些实施方案中，ELISA包含对AAV表位有特异性的抗体。在某些实施方案中，AAV表位是存在于组装的AAV衣壳上的构象表位。在某些实施方案中，AAV表位是存在于组装的AAV衣壳上的线性表位。此类表位的实例包括但不限于衣壳病毒体蛋白VP1、VP2和/或VP3。在某些实施方案中，AAV经过基因工程化以在衣壳表面表达额外的病毒体蛋白，并且那些工程化蛋白可在ELISA测定中使用/检测。在某些实施方案中，AAV经过化学修饰以表达病毒体蛋白的变体，其可以在ELISA测定中使用/检测(如，VP1'、VP2'、VP3'等)。在某些实施方案中，抗体鉴定血清型特异性衣壳病毒体蛋白。

ELISA可以替代qPCR作为确定AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物的剂量和/或效力的方式。本发明的ELISA技术比qPCR方法具有显著更小的变异性。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA评价AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物。在某些实施方案中，本文公开的所有方法不包括qPCR步骤。

在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA测试超速离心后获得的AAV级分或配制物以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA测试深层过滤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA，测试在使用超滤/渗滤系统浓缩AAV级分或配制物后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA测试切向流过滤(TFF)步骤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA测试负阴离子交换(AEX)色谱后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA测试在精细纯化(polish)步骤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA测试经纯化的AAV级分或配制物以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量。

用于定量AAV衣壳数量的其他方法包括但不限于表面等离子共振(SPR)(如BIACORE、OCTET)、差示扫描荧光测定法(如Prometheus NT48、Nanotemper)、磁免疫测定(MIA)和克隆酶供体免疫测定(CEDIA)。这些方法可补充或代替ELISA定量测定来使用。

在某些实施方案中，本公开的方法包括测量完整AAV衣壳与空AAV衣壳(如，完整AAV衣壳与空AAV衣壳的比率的百分比)。用于评价或确认AAV级分或配制物中完整:空AAV衣壳的百分比或比率的方法包括但不限于低温透射电子显微术(CryoTEM)、负染色TEM、毛细管电泳、分析超速离心或其组合。

在某些实施方案中，用于测量完整AAV衣壳与空AAV衣壳的方法是CryoTEM。在某些实施方案中，该方法需要使用如上所述的CryoTEM和AAV特异性ELISA两者。在某些实施方案中，ELISA是夹心ELISA。在某些实施方案中，夹心ELISA包含对AAV表位有特异性的抗体。在某些实施方案中，AAV表位是存在于组装的AAV衣壳上的构象表位。

使用CryoTEM的一个优势是无需负染色。CryoTEM还导致能够定量完整AAV衣壳的量。在某些实施方案中，CryoTEM的使用不会导致由于假阳性信号而高估完整AAV衣壳量。

本公开的方法包括评价完整AAV衣壳与空AAV衣壳的数量或百分比的方法。在某些实施方案中，该方法包括CryoTEM。在某些实施方案中，该方法包括：(i)将AAV级分或配制物包埋在惰性支持物内的基质中；(ii)速冻包埋的AAV级分或配制物；(iii)使用低温透射电子显微术对包埋的AAV级分或配制物进行成像；和(iv)定量完整AAV衣壳与空AAV衣壳的百分比。

对于步骤(i)，用于该方法的合适基质的实例包括但不限于无定形、非结晶冰。用于该方法的适合惰性支持物的实例包括但不限于碳薄膜、热塑性树脂和聚乙烯醇缩甲醛(如，由聚乙烯醇和甲醛作为与聚乙酸乙烯酯的共聚物形成的聚合物，诸如但不限于Formvar或Vinylec，用碳稳定的聚乙烯醇缩甲醛，一氧化硅/聚乙烯醇缩甲醛，纯碳薄膜，A型碳：碳支持物薄膜(如，在网格的另一侧上可移除的聚乙烯醇缩甲醛)，B型碳：聚乙烯醇缩甲醛薄膜(如，涂有较厚的碳层)和一氧化硅/A型碳上)。在某些实施方案中，上述步骤(i)涉及在温度(如，(-196℃)或更低)和湿度受控环境中将样品沉积到碳支撑薄膜上。在某些实施方案中，湿度水平可以是相对湿度。对于步骤(ii)，可以将样品快速冷冻。在某些实施方案中，快速冷冻可能需要使用液态乙烷、液氮、液态丙烷或接近液氮温度的氦气。例如，液态乙烷、液氮、液态丙烷或氦气的容器被液氮包围。

在某些实施方案中，将AAV级分或配制物冷冻得如此之快(如，以每秒104至106K)以致冰晶无法形成。在某些实施方案中，无定形冰是通过液态水的快速冷却或通过在低温下压缩普通冰来产生的。在某些实施方案中，在除去过量的AAV级分或配制物并留下一些粘附的样本后，将网格在液态乙烷中玻璃化，然后储存在液氮中。有关执行CryoTEM的其他步骤的讨论，请参见Cabra和Samso,J.Visualized Experiments,(2015)95(e52311):1-11，其出于所有目的通过引用整体并入。

AAV颗粒的CryoTEM分析可用于评估总体样本形态，即各种AAV形态的存在(通常包括球形和变形的AAV颗粒、亚基结构和较大的结构不确定的形态)。例如，完整的衣壳显示出内部密度，壳和核之间没有明显的边界。显示独特外壳和微小内部密度的AAV衣壳被归类为空衣壳。

CryoTEM还可用于评估不确定的衣壳。例如，CryoTEM可用于对“完整”、“空”和“不确定”衣壳进行计数。

CryoTEM还可用于通过手动对颗粒进行分类或使用自动图像分析方法来确定颗粒的包装水平。

在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试超速离心后获得的AAV级分或配制物以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试深层过滤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试在使用超滤/渗滤系统浓缩AAV级分或配制物后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试切向流过滤(TFF)步骤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试负阴离子交换(AEX)后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试精细纯化步骤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由CryoTEM测试经纯化的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和/或质量。

在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV-特异性ELISA和CryoTEM测试超速离心后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA和CryoTEM测试深层过滤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA和CryoTEM测试在使用超滤/渗滤系统浓缩AAV级分或配制物后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA和CryoTEM测试切向流过滤(TFF)步骤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA和CryoTEM测试负阴离子交换(AEX)后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV特异性ELISA和CryoTEM测试在精细纯化步骤后获得的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。在某些实施方案中，本公开的方法包括经由AAV-特异性ELISA和CryoTEM测试经纯化的AAV级分或配制物，以确定AAV级分或配制物中的AAV衣壳的数量和质量。

分析超速离心(AUC)能够根据沉降系数分离蛋白质。对于相同的蛋白质，沉降系数可以与聚集状态相关。简言之，样品用相应的样品缓冲液稀释，然后转移到带有内置石英窗的池组件中，并装入转子中，然后以恒定速度旋转。不同大小的蛋白质分子以不同的沉降速度向细胞底部迁移，并在离心过程中通过280nm的UV检测进行连续监测。收集的数据集允许进行计算分析，对沉降和扩散过程进行解卷积，从而产生微分沉降系数分布c(s)。这区分了样品的不同物种，并显示它们的s值和种群。对沉降系数的分布进行积分，并给出相对面积百分比以及峰值最大值的S值作为分析结果。

AAV配制物

本文还提供了通过本公开的方法产生的AAV配制物。出于本公开的目的，AAV配制物和AAV级分可互换使用。在某些实施方案中，AAV级分是已被进一步浓缩的AAV配制物或从AAV配制物中去除的AAV的一部分。在某些实施方案中，用于产生AAV配制物的方法包括：(i)用至少一种包含目标基因的质粒转染宿主细胞；(ii)收集包含AAV衣壳的细胞培养物的上清液或细胞悬液以产生AAV级分或配制物；(iii)使用AAV特异性ELISA测定来定量AAV级分或配制物中AAV衣壳的总数；和(iv)基于步骤(iii)中确定的AAV衣壳总数制备具有所需浓度的AAV产物、制剂或组合物。在某些实施方案中，该方法包括浓缩AAV级分或配制物。在某些实施方案中，该方法包括从AAV级分或配制物中去除至少一部分空衣壳。在某些实施方案中，去除一定量的空衣壳以产生具有特定浓度的完整衣壳和/或特定比例的完整:空衣壳的AAV级分、配制物、产物、AAV配制物或AAV组合物。在某些实施方案中，用适当的缓冲液将AAV级分或配制物稀释至所需剂量。

在某些实施方案中，该方法包括评价或确认AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物中完整AAV衣壳与空AAV衣壳(完整:空)的百分比或比率。在某些实施方案中，该方法包括评价或确认完整与空AAV衣壳(完整:空)的百分比或比率是CryoTEM。在某些实施方案中，剂量和/或效力不是通过qPCR确定的。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约100％。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约45％至约75％、约50％至约70％，或约55％至约65％。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约60％至约80％。在某些实施方案中，至少约60％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。在某些实施方案中，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或者至少约100％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。在某些实施方案中，如本文公开的方法用于生成在AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物之间具有一致量的完整衣壳的AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物。

在某些实施方案中，该方法包括评价或确认AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物中完整AAV衣壳与空AAV衣壳(完整:空)的百分比或比率。在某些实施方案中，该方法包括评价或确认完整AAV衣壳与空AAV衣壳(完整:空)的百分比或比率是CryoTEM。在某些实施方案中，剂量和/或效力不是通过qPCR确定的。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约100％。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约45％至约75％、约50％至约70％，或约55％至约65％。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约60％至约80％。在某些实施方案中，至少约60％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。在某些实施方案中，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或者至少约100％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。在某些实施方案中，如本文公开的方法用于生成在AAV级分或配制物之间具有一致量的完整衣壳的AAV级分、配制物、产物、制剂或组合物。

本文还提供了施用通过本公开的方法产生的AAV产物、制剂或组合物的方法。在某些方面，本发明的方法需要向有需要的受试者施用特定剂量的AAV产物、制剂或组合物，其包括(i)获得经纯化的AAV配制物；(ii)使用AAV特异性ELISA测定法测量经纯化的AAV配制物中AAV衣壳的浓度；(iii)向受试者施用特定剂量的AAV产物、制剂或组合物。在某些实施方案中，步骤(i)和(ii)中的配制物是可用于产生最终AAV产物、制剂或组合物的AAV级分或配制物，其中AAV级分或配制物被进一步纯化或稀释以形成用于步骤(i)、(ii)和/或(iii)的AAV产物、制剂或组合物。在某些实施方案中，该方法包括评价或确认AAV配制物、产物、制剂或组合物中完整AAV衣壳与空AAV衣壳(完整:空)的百分比或比率。在某些实施方案中，该方法包括评价或确认完整与空AAV衣壳(完整:空)的百分比或比率是CryoTEM。在某些实施方案中，浓度、剂量和/或效力不是通过qPCR确定的。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约100％。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约95％、约40％至约90％、约40％至约85％、约40％至约80％、约45％至约75％、约50％至约70％，或约55％至约65％。在某些实施方案中，完整AAV衣壳的百分比为约60％至约80％。在某些实施方案中，至少约60％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。在某些实施方案中，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或者至少约100％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。

在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物的效力可以通过体外和/或体内生物效力测定进一步验证。例如，所述步骤可能需要，1)确定配制物中AAV的含量(如，经由ELISA)；2)确定完整衣壳的百分比(如，经由CryoTEM)和3)确认生物活性(如，经由体内和/或体外生物效能测定)。

在某些实施方案中，对于本文公开的方法、级分、配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物的浓度为约1x10¹⁰ cp/ml至约1x10²⁰ cp/ml。在某些实施方案中，对于本文公开的方法、级分、配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的浓度为约1x10¹¹cp/ml至约1x10¹⁹ cp/ml、约1x10¹² cp/ml至约1x10¹⁸ cp/ml、约1x10¹³ cp/ml至约1x10¹⁷cp/ml或约1x10¹⁴ cp/ml至约1x10¹⁶ cp/ml。在某些实施方案中，对于本文公开的方法和配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的浓度为约1x10¹² cp/ml至约1x10¹⁵ cp/ml、约1x10¹³ cp/ml至约1x10¹⁵ cp/ml或约1x10¹² cp/ml至约1x10¹³ cp/ml。在某些实施方案中，对于本文公开的方法和配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的浓度为约1x10¹⁴ cp/ml至约5x10¹⁴ cp/ml、约2x10¹⁴ cp/ml至约3x10¹⁴ cp/ml或约3.5x10¹⁴ cp/ml至约5x10¹⁵ cp/ml。在某些实施方案中，cp/ml可以是每ml总衣壳或每ml完整衣壳。在某些实施方案中，cp/ml是每ml总衣壳。

在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物包含由约1000L起始材料(如，细胞培养物)产生的至少约10¹²个病毒颗粒(vp)，或由约1000L起始材料(如，细胞培养物)产生的至少约10¹³个病毒颗粒(vp)。

在某些实施方案中，对于本文公开的方法或配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的剂量为约1x 10⁵cp/kg至约1x 10²⁵cp/kg。在某些实施方案中，对于本文公开的方法或配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的剂量为约1x 10⁶cp/kg至约1x 10²⁴cp/kg、约1x 10⁷cp/kg至约1x 10²³cp/kg、约1x 10⁸cp/kg至约1x 10²²cp/kg、约1x 10⁹cp/kg至约1x 10²¹cp/kg、约1x 10¹⁰cp/kg至约1x 10²⁰cp/kg、约1x10¹¹cp/kg至约1x 10¹⁹cp/kg、约1x 10¹²cp/kg至约1x 10¹⁸cp/kg、约1x 10¹³cp/kg至约1x10¹⁷cp/kg，或约1x 10¹⁴cp/kg至约1x 10¹⁶cp/kg。在某些实施方案中，对于本文公开的方法和配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的剂量为约1x 10¹²cp/kg至约1x 10²⁰cp/kg、约1x 10¹³cp/kg至约1x 10¹⁹cp/kg、约1x 10¹⁴cp/kg至约1x 10¹⁸cp/kg，或约1x10¹⁵cp/kg至约1x 10¹⁷cp/kg。在某些实施方案中，对于本文公开的方法和配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的剂量为约1x 10¹⁰cp/kg至约1x10¹⁶cp/kg。在某些实施方案中，对于本文公开的方法或配制物、产物、制剂或组合物，AAV配制物、产物、制剂或组合物的剂量为至少约1x 10⁶cp/kg、至少约1x 10⁷cp/kg、至少约1x10⁸cp/kg、至少约1x 10⁹cp/kg、至少约1x 10¹⁰cp/kg、至少约1x 10¹¹cp/kg、至少约1x10¹²cp/kg、至少约1x 10¹³cp/kg、至少约1x 10¹⁴cp/kg、至少约1x 10¹⁵cp/kg、至少约1x10¹⁶cp/kg、至少约1x 10¹⁷cp/kg、至少约1x 10¹⁸cp/kg、至少约1x 10¹⁹cp/kg、至少约1x10²⁰cp/kg、至少约1x 10²¹cp/kg、至少约1x 10²²cp/kg、至少约1x 10²³cp/kg、至少约1x10²⁴cp/kg或至少约1x 10²⁵cp/kg。在某些实施方案中，cp/kg可以是每kg受试者的总衣壳或每kg受试者的完整衣壳。在某些实施方案中，cp/kg是每kg受试者的总衣壳。

在某些实施方案中，本公开的AAV配制物、产物、制剂或组合物是高纯的、高效的并且适合在受试者中临床使用。在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物包含同质群体和高纯度的AAV衣壳颗粒。在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物包含全长载体DNA。在示例性实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物基本上不含不想要的污染物，包括但不限于含有截短或不完整载体DNA的AAV衣壳颗粒、具有不完整蛋白质组成和寡聚化结构的AAV颗粒，或污染性病毒，如非AAV脂质包膜病毒。在示例性实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物含有大量的编码目标蛋白质的cDNA。在某些实施方案中，本公开的AAV配制物、产物、制剂或组合物适合施用给受试者。在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物是无菌的和/或具有药品生产质量管理规范(GMP)等级。在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物符合美国药典第1046章或欧洲药典关于基因治疗药品的要求，或者符合美国食品和药物管理局(USFDA)或欧洲药品管理局(EMA)的要求。在某些实施方案中，AAV配制物、产物、制剂或组合物是用于直接施用给受试者的即用型配制物、产物、制剂或组合物，几乎不需要或不需要加工或处理。

AAV的来源

关于本公开的方法，AAV可以属于任何AAV血清型。在某些实施方案中，本文所述的AAV属于AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、AAV10血清型或嵌合AAV载体。在某些实施方案中，AAV是野生型。在某些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)。在某些实施方案中，AAV通过基因工程化进行修饰和/或经化学修饰。在某些实施方案中，AAV包含经修饰的衣壳，如经基因工程化或化学修饰的AAV衣壳。在某些实施方案中，AAV属于AAV8血清型。在某些实施方案中，AAV属于AAV9血清型。

关于本发明的方法，在示例性方面，AAV级分或配制物是浓缩的AAV级分或配制物。在某些实施方案中，AAV级分或配制物包含每mL至少约1x 10¹⁰、约1x 10¹¹、约1x 10¹²、约1x10¹³、约1x 10¹⁴、约1x 10¹⁵或约1x 10¹⁶AAV总衣壳。在某些实施方案中，AAV级分或配制物包含至少约1x 10¹²个AAV总衣壳/mL。AAV衣壳可包括空AAV衣壳和完整AAV衣壳。

在某些实施方案中，AAV表示由转染的宿主细胞产生的AAV级分或配制物。在某些实施方案中，AAV级分或配制物代表从包含用三重质粒系统转染的宿主细胞的细胞培养物中收获的上清液或细胞悬液，其中所述系统的一个质粒包含目标基因或cDNA，一个质粒编码衣壳蛋白VP1、衣壳蛋白VP2和/或衣壳蛋白VP3。在某些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3是AAV8 VP1、VP2和/或VP3。用于rAAV生产目的的三重质粒转染是本领域已知的。参见例如Qu等人，2015,同上和Mizukami等人，"A Protocol for AAV vector production andpurification."博士学位论文，Division of Genetic Therapeutics,Center forMolecular Medicine,1998；和Kotin等人，Hum Mol Genet 20(R1):R2-R6(2011)。在某些实施方案中，转染可使用无机化合物，例如磷酸钙，或有机化合物，聚乙烯亚胺(PEI)，或非化学手段，例如电穿孔来进行。

在某些实施方案中，宿主细胞是贴壁细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是悬浮细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞或Sf9细胞(例如杆状病毒感染的Sf9细胞)或HeLa或BHK(疱疹病毒系统)。在某些实施方案中，细胞培养物包含不含血清和蛋白质的培养基。在某些实施方案中，培养基是化学成分确定的，并且不含动物来源的组分，例如水解产物。

在某些实施方案中，包含rAAV颗粒的级分或配制物代表包含用三重质粒系统转染的HEK293细胞的级分或配制物。在某些实施方案中，包含AAV颗粒的级分或制剂代表HEK293细胞转染后约2至约7天后或当细胞培养物具有大于或约5x10⁶个细胞/mL的密度时的收获物的级分或配制物，并且具有大于或约50％的细胞存活力。

在某些实施方案中，AAV通过三重质粒转染、随后1至7天后收获来制备。在某些实施方案中，AAV通过细胞破碎来制备。

在某些实施方案中，AAV通过以下方法制备：HEK293细胞贴壁并在可商够获得的培养基中生长，所述培养基可以是化学成分确定的并且可以不含动物源性组分，如血清和蛋白质。将细胞培养至约3x 10⁶至约12x 10⁶个细胞/ml，如约6x 10⁶至约10x 10⁶个细胞/ml的细胞密度。然后将细胞按约1:2的比率进行分流，使细胞密度约为3–5x 10⁶个细胞/ml。分流后，可将细胞用包括以下的三种质粒转染：(1)辅助质粒，其能够提供AAV产生所必需的一种或多种辅助病毒功能，(2)编码参与病毒的衣壳生成、复制和包装的一种或多种基因的质粒，和(3)包含目标基因(GOI)的质粒，其被包装到所得的rAAV颗粒中。例如，GOI可以是包含与载体DNA呈单链自身互补形式的人凝血因子IX Padua的载体DNA。作为另一个实例，GOI可以是包含双链自互补形式的人凝血因子IX Padua的载体DNA，该载体DNA的全长为4.8kB。作为另一个实例，GOI可以是包含呈单链自身互补形式的B-结构域缺失的人凝血因子VIII的载体DNA，该载体DNA的全长为4.8kB。可以使用其他GOI。转染可以以瞬时方式进行，诸如通过使用阳离子聚合物。在洗脱之前，可以将HEK293细胞系培养至少约1天，如3-5天，然后收获。

实施例部分

实施例1：一般纯化程序

给出以下实施例仅仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

在用含有目标蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。将澄清的无细胞培养物上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。将获得的含有AAV8的流过液用作后续亲和纯化步骤的装载物。

首先，将包含POROS^TMCaptureSelect^TMAAV8亲和基质(目录号A30794，ThermoFisher)的ID为32mm，床高为60mm且体积约为200ml的柱用至少五个柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH 8.5)进行平衡。将装载物施加到含有POROS^TMCaptureSelect^TMAAV8亲和基质(目录号A30794.Thermo Fisher)的柱上。然后用5个柱体积的50mM TrisHCl和125mMNaCl(pH 8.5)对柱进行再平衡。然后用5个柱体积的洗涤液1(W1)：100mM乙酸钠和0.1％吐温80(pH 6.0)洗涤该柱。然后用5个柱体积的洗涤液2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH8.5)洗涤该柱。然后用5个柱体积的洗涤液3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇(pH 8.5)洗涤该柱。

通过将5个柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上进行洗脱：50mM TrisHCl,50％乙二醇和750mM NaCl(pH 8.0)。

上述程序总结于表1中。

表1：AAV8-亲和的一般纯化方案

使用VIVACELL100(10K)柱(Sartorius)将洗脱液缓冲液交换为30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)，以为阳离子交换剂(CEX)上的所有AAV亚型提供适当的结合特性。

实施例2：AAV8，载体基因组大小2.6kB，Capto S，在钙存在下

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。首先，将含有Capto S阳离子交换剂树脂(目录17-5441-01；Cytiva)ID 11mm、床高100mm、面积0.95cm²且体积约9.5ml的柱用5个柱体积的缓冲液平衡(活化)，所述缓冲液包含1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH6.0)。然后用至少五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下平衡柱。将装载物(AAV在30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)中调节)施加到含有Capto S阳离子交换剂树脂的柱上。

然后用五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下洗涤柱。

对于洗脱，然后进行梯度洗脱。使用40个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)至200mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)进行梯度。使用10个柱体积的1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下进行后洗脱。

对于所有步骤，线性流速均为60cm/h。缓冲液组成总结于表2中。

表2：CEX-Separation的缓冲液组成

表3显示了CEX-分离的色谱方案

表3

表4显示了ddPCR/AAV8:AG的比率

表4

ddPCR：使用AAV8抗原ELISA测定的FIX特异性ddPCR/AAV8:AG

表5显示了用AUC测定的完整衣壳和空衣壳的百分比。

表5

结果如图1-6所示，并且收率如表6所示。

图1-6代表了大多数级分数据的运行。装载，FT＝流过液，W＝洗涤液，E＝洗脱液，E1-E9＝池-根据色谱图的峰级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。比率vg/cp，表明AAV具有最高量的完整衣壳(完整衣壳级分)。值越高，完整衣壳的量就越高。

图1和2表示CEX运行的色谱图。它包含完整运行incl.再生程序的数据。显示了曲线的UV280nm、UV254nm、电导率、pH、压力、荧光和级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。

表6

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在钙的存在下，在阳离子交换剂Capto S上分离含有2.6kB载体基因组的AAV8，显示出空和完整AAV8衣壳的高分辨率分离。ddPCR中级分E1、E2和E3的收率为44.4％，并且在AAV8抗原中为9.1％。

实施例3：AAV8，载体基因组大小2.6kB，Capto S，不存在/或螯合二价阳离子

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。首先，将含有Capto S阳离子交换剂树脂(目录17-5441-01；Cytiva)ID 11mm，床高100mm、面积0.95cm²并且体积约9.5ml的柱，用5个柱体积的缓冲液平衡(活化)，所述缓冲液包含1000mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80(pH6.0)。然后用至少五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下平衡柱。将装载物(AAV在30mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)中调节)施加到含有Capto S阳离子交换剂树脂的柱上。

然后用五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下洗涤柱。

对于洗脱，然后进行梯度洗脱。使用40个柱体积的30mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)至200mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)进行梯度。

使用10个柱体积的1000mM乙酸钠、2mM EDTA、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下进行后洗脱。

对于所有步骤，线性流速均为60cm/h。

缓冲液组成总结于表7中。

表7：CEX-Separation的缓冲液组成

表8显示了CEX-分离的色谱方案

表8

表9显示了ddPCR/AAV8:AG的比率

表9

ddPCR：使用AAV8抗原ELISA测定的FIX特异性ddPCR/AAV8:AG

表10显示了用AUC测定的完整衣壳和空衣壳的百分比。

表10

结果如图7-11所示，并且收率如表11所示。

图7-11表示包含最感兴趣的级分数据的运行：L_nativ＝亲和洗脱液，装载物(起始材料＝针对平衡缓冲液透析的亲和洗脱液)，FT＝流过液，W＝洗涤液，E＝洗脱液，E1-E3＝峰级分(色谱图)。比率vg/cp，表明AAV具有最高量的完整衣壳(完整衣壳级分)。值越高，完整衣壳的量就越高。

图7和8表示CEX运行的色谱图。它包含完整运行incl.再生程序的数据。显示了曲线的UV280nm、UV254nm、电导率、pH、压力、荧光和级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。

表11

添加EDTA代替钙显示出分辨率显著降低，并且显示出AAV8构建体结合至Capto S上的能力降低。在流过液中发现大量AAV8。

实施例4：AAV8，载体基因组大小>4.8kB，Capto S，在钙存在下

装载材料的制备

在用含有目标蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。将澄清的无细胞培养物上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。将获得的含有AAV8的流过液用作后续亲和纯化步骤的装载物。

首先，将包含POROS^TMCaptureSelect^TMAAV8亲和基质(目录号A30794，ThermoFisher)的ID为32mm，床高为60mm且体积约为200ml的柱用至少五个柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH 8.5)进行平衡。将装载物施加到含有POROS^TMCaptureSelect^TMAAV8亲和基质(目录号A30794.Thermo Fisher)的柱上。然后用5个柱体积的50mM TrisHCl和125mMNaCl(pH 8.5)对柱进行再平衡。然后用5个柱体积的洗涤液1(W1)：100mM乙酸钠和0.1％吐温80(pH 6.0)洗涤该柱。然后用5个柱体积的洗涤液2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH8.5)洗涤该柱。然后用5个柱体积的洗涤液3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇(pH 8.5)洗涤该柱。

通过将5个柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上进行洗脱：50mM TrisHCl,50％乙二醇和750mM NaCl(pH 8.0)，并在表A中更详细地描述。

表A

使用VIVACELL100(10K)柱(Sartorius)将洗脱液缓冲液交换为30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)，以为阳离子交换剂(CEX)上的所有AAV亚型提供适当的结合特性。

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。首先，将含有Capto S阳离子交换剂树脂(目录17-5441-01；Cytiva)ID 11mm，床高101mm、面积0.95cm²并且体积约9.6ml的柱用5个柱体积的缓冲液平衡(活化)，所述缓冲液包含1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH6.0)。然后用至少五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下平衡柱。将装载物(AAV在30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)中调节)施加到含有Capto S阳离子交换剂树脂的柱上。

然后用五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下洗涤柱。

对于洗脱，然后进行梯度洗脱。使用40个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)至200mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)进行梯度。使用10个柱体积的1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下进行后洗脱。

对于所有步骤，线性流速均为60cm/h。

缓冲液组成总结于表12中。

表12：CEX-Separation的缓冲液组成

表13显示了CEX-分离的色谱方案

表13

表14显示了ddPCR/AAV8:AG的比率

表14

ddPCR：使用AAV8抗原ELISA测定的人凝血VIII特异性ddPCR/AAV8:AG

表15显示了用AUC测定的完整衣壳和空衣壳的百分比。

表15

结果如图12-17所示，并且收率如表16所示。

图12-17表示使用大多数级分数据进行的运行：L nativ＝亲和洗脱液。装载物＝(起始物质)，FT＝流过液，W＝洗涤液，E＝洗脱液，E1-E5＝峰级分(色谱图)。比率vg/cp，表明AAV具有最高量的完整衣壳(完整衣壳级分)。值越高，完整衣壳的量就越高。

图12和13表示了CEX运行的色谱图。它包含完整运行incl.再生程序的数据。显示了曲线的UV280nm、UV254nm、电导率、pH、压力、荧光和级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。

表16

实施例5：AAV8载体基因组大小2.6kB，Eshmuno S，在钙的存在下

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。首先，将含有Eshmuno S阳离子交换剂树脂(目录1.20078；Merck-Millipore)ID 11mm，床高100mm、面积0.95cm²并且体积约9.5ml的柱，用5个柱体积的缓冲液平衡(活化)，所述缓冲液包含1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)。然后用至少五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH6.0下平衡柱。将装载物(AAV在30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)中调节)施加到含有Eshmuno S阳离子交换剂树脂的柱上。

然后用五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下洗涤柱。

对于洗脱，然后进行梯度洗脱。使用40个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)至200mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)进行梯度。使用10个柱体积的1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下进行后洗脱。

对于所有步骤，线性流速均为60cm/h。

缓冲液组成总结于表17中。

表17：CEX-Separation的缓冲液组成

表18显示了CEX-分离的色谱方案

表18

表19显示了ddPCR/AAV8:AG的比率

表19

dPCR：使用AAV8抗原ELISA测定的FIX特异性ddPCR/AAV8:AG

表20显示了用AUC测定的完整衣壳和空衣壳的百分比。

表20

结果如图18-24所示，并且收率如表21所示。

图18-24代表了大多数级分数据的运行：L nativ＝AAV8亲和力洗脱液。装载物(起始物质，在透析至平衡缓冲液之后)，FT＝流过液，W＝洗涤液，E＝洗脱液，E1-E9＝峰级分(色谱图)。比率vg/cp，表明AAV具有最高量的完整衣壳(完整衣壳级分)。值越高，完整衣壳的量就越高。

图18和19表示CEX运行的色谱图。它包含完整运行incl.再生程序的数据。显示了曲线的UV280nm、UV254nm、电导率、pH、压力、荧光和级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。

表21

实施例6：AAV8，载体基因组大小2.6kB，Capto S，在钙的存在下

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。首先，将含有Capto S阳离子交换剂树脂(目录17-5441-01；Cytiva)ID 11mm、床高100mm、面积0.95cm²且体积约9.5ml的柱用5个柱体积的缓冲液平衡(活化)，所述缓冲液包含1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH6.0)。然后用至少五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下平衡柱。将装载物(AAV在30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)中调节)施加到含有Capto S阳离子交换剂树脂的柱上。

然后用五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下洗涤柱。

对于洗脱，然后进行梯度洗脱。使用40个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)至80mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)进行梯度。使用10个柱体积的1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下进行后洗脱。

对于所有步骤，线性流速均为60cm/h。

缓冲液组成总结于表22中。

表22：CEX-Separation的缓冲液组成

表23显示了CEX-分离的色谱方案

表23

表24显示了ddPCR/AAV8:AG的比率

表24

ddPCR：使用AAV8抗原ELISA测定的FIX特异性ddPCR/AAV8:AG

表25显示了用AUC测定的完整衣壳和空衣壳的百分比。

表25

结果如图25-32所示，并且收率如表26所示。

图25-32表示使用大多数基分装载数据的运行(起始材料，FT＝流过液，W＝洗涤液，E＝洗脱液，E1-E6＝峰级分(色谱图)。比率vg/cp，表明AAV具有最高量的完整衣壳(完整衣壳级分)。值越高，完整衣壳的量就越高。

图25和26表示了CEX运行的色谱图。它包含完整运行incl.再生程序的数据。显示了曲线的UV280nm、UV254nm、电导率、pH、压力、荧光和级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。

表26

实施例7：AAV9，载体基因组大小2.6kB，Eshmuno S，在钙的存在下

装载材料的制备

在用含有目标蛋白质和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。将澄清的无细胞培养物上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。将获得的含有AAV9的流过液用作后续亲和纯化步骤的装载物。

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。将包含POROS^TMCaptureSelect^TMAAVX亲和基质(目录号A36742，Thermo Fisher)的ID为11mm，床高为57mm并且体积约为5.4ml的柱用至少五个柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH 8.5)进行平衡。将装载物施加到含有POROS^TMCaptureSelect^TMAAVX亲和基质(目录号A36742 Thermo Fisher)的柱上。然后用5个柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH 8.5)对柱进行再平衡。然后用5个柱体积的洗涤液1(W1)：100mM乙酸钠和0.1％吐温80(pH 6.0)洗涤该柱。然后用5个柱体积的洗涤液2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl(pH 8.5)洗涤该柱。使用5个柱体积的100mM乙酸钠和0.1％吐温80(pH 6.0)施加进一步洗涤。所有实验步骤均在室温下执行。

通过将10个柱体积的100mM乙酸钠和0.1％吐温80(pH 6.0)施加到柱，来将温度降低至+2℃至+8℃并且流速降低至5cm/h进行洗脱，并且该程序更详细显示在表B中。

表B：AAVX-亲和(AAV9)的纯化方案“冷洗脱方案”

RT：室温+18℃至+26℃

使用VIVACELL100(10K)柱(Sartorius)将洗脱液缓冲液交换为30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)，以为阳离子交换剂(CEX)上的所有AAV亚型提供适当的结合特性。

进行了以下测试程序。请注意，本实施例中公开的所有缓冲液均在室温下制备，并且所有缓冲液的pH均在室温下测量。首先，将含有Eshmuno S阳离子交换剂树脂(目录1.20078；Merck-Millipore)ID 11mm，床高100mm、面积0.95cm²并且体积约9.5ml的柱，用5个柱体积的缓冲液平衡(活化)，所述缓冲液包含1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)。然后用至少五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH6.0下平衡柱。将装载物(AAV在30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)中调节)施加到含有Eshmuno S阳离子交换剂树脂的柱上。

然后用五个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下洗涤柱。

对于洗脱，然后进行梯度洗脱。使用40个柱体积的30mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)至200mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80(pH 6.0)进行梯度。使用10个柱体积的1000mM乙酸钠、2mM乙酸钙、0.005％聚山梨酯80在pH 6.0下进行后洗脱。

对于所有步骤，线性流速均为60cm/h。

缓冲液组成总结于表27中。

表27：CEX-Separation的缓冲液组成

表28显示了CEX-分离的色谱方案

表28

表29显示了ddPCR/AAV9:AG的比率

表29

ddPCR：使用AAV9抗原ELISA测定的HT2 ddPCR/AAV9:AG表30显示了用AUC测定的完整衣壳和空衣壳的百分比。

表30

结果如图33-38所示，并且收率如表31所示。

图33-38表示使用大多数级分装载数据的运行(起始材料，FT＝流过液，W＝洗涤液，E＝洗脱液，E1-E6＝峰级分(色谱图)。比率vg/cp，表明AAV具有最高量的完整衣壳(完整衣壳级分)。值越高，完整衣壳的量就越高。

图33和34表示了CEX运行的色谱图。它包含完整运行incl.再生程序的数据。显示了曲线的UV280nm、UV254nm、电导率、pH、压力、荧光和级分。X轴：UV280nm(左)电导率(右)，Y轴：体积(ml)。

表31

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Claims (88)

1.一种用于从包含完整AAV衣壳和空AAV衣壳的AAV配制物中纯化完整AAV衣壳以提供基本上不含空AAV衣壳的AAV产物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含完整AAV衣壳、空AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述完整AAV衣壳和所述空AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述空AAV衣壳中纯化出所述完整AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

2.一种分离AAV配制物中的完整AAV衣壳和空AAV衣壳的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含完整AAV衣壳、空AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述完整AAV衣壳和所述空AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述空AAV衣壳中分离出所述完整AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺及其组合组成的组。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种单价阳离子是Na⁺。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约5mM至约1500mM。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度为约30mM。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Co²⁺及其组合组成的组。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约1mM至约30mM。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度为约2mM。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一溶液具有约5.0至约8.5的pH。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一溶液具有约6.0的pH。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一溶液还包含一种或多种表面活性剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛、还原Triton N-101、Triton X-100及其组合。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨酯80。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种表面活性剂的总量为约0.0025w/w％至约0.0075w/w％。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种表面活性剂的总量为约0.005w/w％。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换柱包含具有带电基团的树脂，其中带电基团是磺酸根、硫酸根、磺丙基、羧基、磷酸根或其组合。

19.如权利要求1-18错误！参考源未找到。中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换柱包含树脂，其中所述树脂是CaptoS、Eshmuno S、Mustang S、Poros 50HS、Poros 50XS、S-Sepharose FF、Source S、Capto MMC、Toyopearl Gigacap S、Gigacap CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、MacroPrep S、UNOsphereS、MacroprepCM、Fractogel EMD SO3、FractogelEMD COO、Fractogel EMD SE Hicap、Cellufine Sulfate、CM和SP Trisacryl、CM和SHyperD、S和CM Sepharose CL、CM Sepharose FF、S和CM CAPTO^TM、MonoS、Nuvia S、Cellufine phosphat、Cellufine MAX-Sr、Cellufine MAX-S h、Cellufine MAX DexS-HbP、Cellufine MAX DexS-VirS、Toyopearl Sulfate 650或Heparin Sepharose HighPerformance。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述树脂是CaptoS。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述树脂是Eshmuno S。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述树脂是Mustang S。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子选自由Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺、Cs⁺及其组合组成的组。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述第二溶液的单价阳离子是Na⁺。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子选自由Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺及其组合组成的组。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子是Ca²⁺。

27.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述第二溶液具有约5.0至约8.5的pH。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述第二溶液具有约6.0的pH。

29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述第二溶液还包含一种或多种表面活性剂。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述一种或多种表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚氧乙烯二醇叔辛基苯酚醚、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯(20)-脱水山梨醇-单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、克列莫佛、还原Triton N-101、Triton X-100及其组合。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨酯80。

32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述一种或多种表面活性剂的总量为约0.00w/w25％至约0.0075w/w％。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述一种或多种表面活性剂的总量为约0.005w/w％。

34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中添加所述第二溶液是在恒定总浓度的所述一种或多种单价阳离子下进行的。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约5mM至约1500mM。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的恒定总浓度为约30mM。

37.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中添加所述第二溶液是在恒定总浓度的所述一种或多种二价阳离子下进行的。

38.如权利要求37中任一项所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约1mM至约30mM。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的恒定总浓度为约2mM。

40.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中添加所述第二溶液包括所述一种或多种单价阳离子的总浓度的逐步增加。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约15mM至约60mM。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的初始总浓度为约30mM。

43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约100mM至约300mM。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的中间总浓度为约200mM。

45.如权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约500mM至约1500mM。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的最终总浓度为约1000mM。

47.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中添加所述第二溶液包括所述一种或多种二价阳离子的总浓度的逐步增加。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的初始总浓度为约1mM至约10mM。

49.如权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的中间总浓度为约10mM至约20mM。

50.如权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的最终总浓度为约20mM至约30mM。

51.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中添加所述第二溶液包括所述一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约200mM。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约80mM。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约30mM至约40mM。

55.如权利要求51所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约200mM。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约80mM。

57.如权利要求55所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种单价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约30mM至约80mM。

58.如权利要求1-33和51-54中任一项所述的方法，其中添加所述第二溶液包括所述一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约30mM。

60.如权利要求58所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约15mM。

61.如权利要求58所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在40个柱体积中约1mM至约5mM。

62.如权利要求58所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约30mM。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约15mM。

64.如权利要求62所述的方法，其中所述第二溶液的一种或多种二价阳离子的总浓度的连续线性增加为在5个柱体积中约1mM至约5mM。

65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳衍生自由以下各项组成的组：AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、遗传修饰的AAV、化学修饰的AAV、遗传和化学修饰的AAV及其组合。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述AAV衣壳衍生自AAV8。

67.如权利要求65所述的方法，其中所述AAV衣壳衍生自AAV9。

68.如权利要求65所述的方法，其中所述AAV衣壳衍生自AAV6。

69.一种AAV制剂，其包含在药学上可接受的载体中的根据如权利要求1-68中任一项所述的方法纯化的完整AAV衣壳，其中所述AAV制剂基本上不含空AAV衣壳。

70.一种药物组合物，其包含由根据如权利要求1-68中任一项所述的方法产生的AAV产物。

71.一种用于从包含空AAV衣壳和完整AAV衣壳的AAV配制物中纯化空AAV衣壳以提供基本上不含空AAV衣壳的AAV产物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述空AAV衣壳和所述完整AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述完整AAV衣壳中纯化出所述空AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

72.一种分离AAV配制物中的空AAV衣壳和完整AAV衣壳的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含空AAV衣壳、完整AAV衣壳、一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第一溶液；

(b)在所述空AAV衣壳和所述完整AAV衣壳与柱结合的条件下将所述第一溶液装载到阳离子交换柱上；和

(c)在从所述完整AAV衣壳中分离出所述空AAV衣壳的条件下，将包含一种或多种单价阳离子和一种或多种二价阳离子的第二溶液添加至所述阳离子交换柱。

73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述空AAV衣壳衍生自由以下各项组成的组：AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、遗传修饰的AAV、化学修饰的AAV、遗传和化学修饰的AAV及其组合。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述空AAV衣壳衍生自AAV8。

75.如权利要求73所述的方法，其中所述空AAV衣壳衍生自AAV9。

76.如权利要求73所述的方法，其中所述空AAV衣壳衍生自AAV6。

77.一种制备免疫吸收柱的方法，所述方法包括以下步骤

(a)通过超滤浓缩如权利要求71或72所述的空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将所述空AAV衣壳固定在活化树脂上。

78.一种制备免疫吸收柱的方法，所述方法包括以下步骤

(a)通过阴离子交换剂浓缩如权利要求71或72所述的空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将所述空AAV衣壳固定在活化树脂上。

79.一种制备免疫吸收柱的方法，其包括以下步骤

(a)通过阳离子交换剂浓缩如权利要求71或72所述的空AAV衣壳；

(b)将缓冲液交换为无胺缓冲液；和

(c)将所述空AAV衣壳固定在活化树脂上。

80.一种制备免疫吸收柱的方法，所述方法包括以下步骤

(a)通过超滤浓缩如权利要求1或2所述的完整AAV衣壳；和

(b)将缓冲液交换为适用于治疗患者的缓冲液。

81.一种制备免疫吸收柱的方法，所述方法包括以下步骤

(a)通过阴离子交换剂浓缩如权利要求1或2所述的完整AAV衣壳；和

(b)将缓冲液交换为适用于治疗患者的缓冲液。

82.一种制备免疫吸收柱的方法，所述方法包括以下步骤

(a)通过阳离子交换剂浓缩如权利要求1或2所述的完整AAV衣壳；和

(b)将缓冲液交换为适用于治疗患者的缓冲液。

83.如权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述AAV产物包含小于约30％的空AAV衣壳。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述AAV产物包含小于约20％的空AAV衣壳。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述AAV产物包含小于约6％的空AAV衣壳。

86.如权利要求69所述的AAV制剂或如权利要求70所述的组合物，其中所述AAV制剂或组合物包含小于约30％的空AAV衣壳。

87.如权利要求87所述的AAV制剂或组合物，其中所述AAV制剂或组合物包含小于约20％的空AAV衣壳。

88.如权利要求87所述的AAV制剂或组合物，其中所述AAV制剂或组合物包含小于约6％的空AAV衣壳。