KR102590519B1 - 아데노-연관 바이러스 제제의 효력을 결정하는 방법 - Google Patents

아데노-연관 바이러스 제제의 효력을 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

유전자 요법 벡터 제제의 정성적 및/또는 양적 속성을 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터 제제는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 제제 (예를 들어, AAV8)이다. 특정 실시양태에서, 방법은 ELISA, 또는 극저온 투과 전자 현미경검사 (CryoTEM)와 조합된 ELISA를 사용하여 AAV 제제의 효력 또는 용량을 결정하는 것을 포함한다.

Description

아데노-연관 바이러스 제제의 효력을 결정하는 방법
관련 출원
본 출원은 2017년 3월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/467,045에 대한 우선권을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 선형 단일-가닥 DNA 게놈을 패키징하는 소형 비-외피보유 바이러스이다. AAV에 의한 증식성 감염이 헬퍼 바이러스, 예컨대, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스의 존재 하에서만 발생하므로, AAV는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과 및 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속한다. 심지어 헬퍼 바이러스의 부재 하에서도, AAV (혈청형 2)는 숙주 인간 게놈의 19q13.4 염색체 내로 통합됨으로써 잠복기를 달성할 수 있다. 이는 부위-특이적 통합이 가능한 것으로 공지된 유일한 포유동물 DNA 바이러스이다 (Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, pages 583-593 (2008)).
AAV가 임상에서 안전하게 사용되기 위해, AAV는 그의 게놈 내 여러 위치에서 유전자 변형된 바 있다. 예를 들어, 바이러스 복제에 요구되는 Rep 유전자 및 부위-특이적 통합에 요구되는 요소가 많은 바이러스 벡터에서 AAV 게놈으로부터 제거된 바 있다. 이러한 재조합 AAV (rAAV)는 염색체외 상태로 존재하며 게놈 DNA 내로의 매우 낮은 통합 효율을 갖는다. 따라서, rAAV가 숙주 세포에서 무작위 돌연변이유발을 유도할 가능성이 전적으로 제거되지는 않더라도 감소된다. 이들 특성 및 병원성 결여로 인해, rAAV는 전임상 및 임상 적용의 다수의 측면에서 유전자 요법 벡터로서의 큰 가능성을 제시한 바 있다. 새로운 혈청형 및 자기-상보적 벡터가 임상에서 테스트 중이다. 이들 진행 중인 벡터 개발과 함께, 높은 순도 및 효력의 rAAV 벡터를 높은 역가량으로 효율적으로 생성할 수 있는 확장가능한 제조 공정에 지속적인 노력이 집중되어 왔다.
인간 투여에 적합한 AAV 산물을 정제하는 효율적인 대규모 방법을 설계하기 위한 노력이 진행되어 왔지만, 산물 방출 및 정확한 임상 투약을 가능하게 하기 위해 재조합 rAAV에 기반한 유전자 요법 벡터 제제의 품질 속성을 측정하기 위한 분석 방법이 여전히 필요하다. 예를 들어, 세포 배양물에서 AAV를 생성하는 통용되는 방법은, 벡터 게놈이 결여되어 있으며 T-세포-매개 면역 반응을 유도하는 것으로 제시된 바 있는 "비어있는" 캡시드의 형성을 초래한다. 더욱이, 비어있는 캡시드는 트랜스진 생산과 연관된 치료 이익을 제공할 수 없고, 벡터에 대한 선천성 또는 적응성 면역 반응 (예를 들어, T-세포 매개)을 증가시키는 잠재력이 있어, 결국에는 비어있는 캡시드가 유전자 요법 상황에서 우려가 된다. 문헌 [Wright, Molecular Therapy 22: 1-2 (2014)] 참조.
전형적으로, 정량적 PCR (qPCR)의 사용은 그것이 벡터 게놈의 측정가 (예를 들어, 벡터 게놈 (vg)/kg 대상체)를 제공하기 때문에 AAV 제제의 용량을 결정하는 방법에 가장 널리 용인되며 선호된다. 문헌 [Halbert CL et al., J Virol 1997;71:5932-5941; Samulski RJ et al., J Virol 1989;63:3822-3828; Clark KR et al., Hum Gene Ther 1999;10:1031-1039; 및 Wright JF, Hum Gene Ther 2011;22:519-521]을 참조한다. 그러나, qPCR의 사용은, 단지 총 DNA만이 측정되므로 중요한 문제를 유도할 수 있다는 사실에 의해 제한적이다. 예를 들어, qPCR의 판독은 비효율적인 프라이머의 사용, 보정 표준에서의 문제, 또는 DNA 3차 구조 (예를 들어, 헤어핀 구조, 원형 또는 고차코일형)와 같은 문제에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, qPCR의 사용은 용량 계산에 DNA의 1개 초과의 카피를 함유하는 캡시드 및/또는 파열된 캡시드가 포함됨으로 인해 최종 AAV 제제의 용량 및 궁극적으로 효력의 부정확한 결정으로 이어질 수 있다. 이는 AAV 제제의 효력이 2개 파트로 이루어지기 때문이다: 1) 세포에 형질도입되는 AAV 캡시드의 능력 및 2) 목적 산물을 생산하는 AAV 내 DNA의 능력. qPCR로 설명되지 않을, 작동불가능한 캡시드는 세포에 효과적으로 형질도입되지 않는다. 더욱이, qPCR은 또한 최종 AAV 제제의 용량의 부정확한 결정으로 이어질 수 있는 그의 고유 변동성 (즉, 최대 0.5 로그 스텝의 높은 변동성)으로 인해 제한적이다. 고유 변동성은 또한, 캡시드 단백질 소화, DNA 추출, 및 DNA 정제를 포함한 여러 단계를 수반하는 샘플 제조로 인한 qPCR에서 확인되는 검정간 변동성에 의해 더 심각해질 수 있다. 용량 및/또는 효력이 정확하게 결정되지 않으면, 환자는 치료마다 잘못된 용량 및/또는 광범위하게 달라지는 용량을 제공받을 수 있다. 따라서, AAV 제제의 용량 및 궁극적으로 효력을 측정하고 유전자 요법 벡터 품질 및 효력을 모니터링하기 위한 정확한 도구가 이와 같이 필요하다.
유전자 요법 벡터 제제의 양적 속성을 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터 제제는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 제제이다. 본원에 개시된 방법은 정제의 임의의 시점에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 사용을 위해 AAV 캡시드를 제조하거나 또는 패키징하기 전에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 AAV 제제의 농도, 용량 및/또는 효력의 결정을 개선시키는데 사용될 수 있다.
세포 배양물에서의 AAV 벡터 생성의 특색은 벡터 게놈이 결여되어 있는, 과량의 "비어있는" 캡시드의 형성이다. 특정 실시양태에서, AAV 제제의 농도, 용량 및/또는 효력을 정확하게 결정하기 위해 비어있는 캡시드의 양이 산정된다. 비어있는 캡시드는 또한 정제 동안 감소되어야 하는, 산물 관련된 불순물로 간주될 수 있다. 특정 실시양태에서, 캡시드 항원에 대한 선천성 및/또는 적응성 면역 반응을 감소시키기 위해 비어있는 캡시드의 총량을 결정하는 것이 중요하다.
전형적으로, AAV 제제의 농도, 용량 및/또는 효력은 정량적 PCR (qPCR)에 의한 정량적 결정을 필요로 한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 AAV-특이적 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)이 단독으로 AAV 제제의 정량적 결정을 위해 필요할 수 있으며, 그의 사용이 AAV 제제의 농도 및/또는 용량 및 궁극적으로 효력의 측정을 개선시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다. 본 개시내용의 방법은, ELISA로의 항원 결정이 qPCR의 결과보다 놀라울 정도로 더 정확한 대단히 신뢰할 수 있는 결과를 제공하기 때문에 관련 기술분야에 공지된 방법에 비해 유리하다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도, 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 농도, 용량 및/또는 효력은 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 농도에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 적어도 약 10% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 적어도 약 20% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 약 10% 내지 약 80% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 약 15% 내지 약 50% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 약 20% 내지 약 33% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 AAV 제제의 용량 및/또는 효력을 정량화하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV 제제를 테스트하여 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화하는 것을 포함한다. 캡시드의 수는 이어서 대상체에게 투여하는 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 용량은 효력 (즉, 특정 효과를 발생시키는데 요구되는 용량 또는 농도 (예를 들어, EC50))을 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV 분획 또는 제제를 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도를 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV 분획 또는 제제를 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화하고, AAV 제제 중 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율을 평가하는 것 (예를 들어, 극저온 투과 전자 현미경검사 (CryoTEM)를 사용함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도를 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 비어있는 캡시드는 AAV 분획 또는 제제로부터 제거되어, 특정한 농도의 채워진 캡시드 및/또는 특정한 비의 채워진:비어있는 캡시드를 갖는 AAV 분획 또는 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, 농도 또는 비는 AAV-특이적 ELISA 검정이 AAV 분획 또는 제제의 농도, 용량 및/또는 효력을 결정하기에 충분하도록 배치 사이에 일정하다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도, 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 AAV 제제의 용량 및/또는 효력을 정량화하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법과 조합하여, AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV 제제를 테스트하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법과 조합하여, AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도를 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, AAV 제제의 용량 및/또는 효력을 정량화하는 방법은 AAV 제제의 생물학적 활성을 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 시험관내 방법을 사용하여 AAV 제제의 생물학적 활성을 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 생체내 방법을 사용하여 AAV 제제의 생물학적 활성을 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은, AAV-특이적 ELISA 검정이 산물 품질을 확증하는 방법 (예를 들어, 채워진:비어있는의 비를 측정함)과 페어링되면, 생물학적 검정을 사용하는 확증을 요구하지 않는다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은, AAV-특이적 ELISA 검정이 CryoTEM과 조합되면, 생물학적 검정을 사용하는 확증을 요구하지 않는다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는, AAV 제제의 생산을 수반한다: (i) 관심 유전자를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; (ii) AAV 캡시드를 포함하는 세포 배양물의 상청액 또는 세포 현탁액을 수집하여 AAV 분획을 창출하는 단계; (iii) AAV-특이적 ELISA 검정을 사용하여 AAV 분획 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 결정된 AAV 캡시드의 총수에 기초하여 목적하는 농도의 AAV 캡시드를 갖는 AAV 제제를 제조하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획을 농축시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 비어있는 캡시드의 적어도 일부를 AAV 분획으로부터 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비어있는 캡시드의 적어도 일부는 제거되어, 특정한 농도의 채워진 캡시드 및/또는 특정한 비의 채워진:비어있는 캡시드를 갖는 AAV 분획 또는 제제를 창출한다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도, 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획 또는 제제를 동결건조시키는 것을 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는, AAV 제제의 그를 필요로 하는 대상체로의 투여를 수반한다: (i) 정제된 AAV 제제를 수득하는 단계; (ii) AAV-특이적 ELISA 검정을 사용하여 정제된 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 단계; (iii) 정제된 AAV 제제의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계. 특정 실시양태에서, 단계 (i) 및 (ii)의 AAV 제제는 최종 AAV 제제를 생성하는데 사용될 수 있는 AAV 분획이며, 여기서 AAV 분획은 단계 (i), (ii) 및/또는 (iii)을 위한 AAV 제제를 형성하기 위해 정제되거나 또는 희석된다. 특정 실시양태에서, 정제된 AAV 분획 또는 제제의 용량 및/또는 효력은 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도, 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는, 특정한 용량의 AAV 제제의 그를 필요로 하는 대상체로의 투여를 수반한다: (i) 정제된 AAV 제제를 수득하는 단계; (ii) AAV-특이적 ELISA 검정을 사용하여 정제된 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 단계; (iii) 특정한 용량의 AAV 제제를 대상체에게 투여하는 단계. 특정 실시양태에서, 단계 (i) 및 (ii)의 AAV 제제는 최종 AAV 제제를 생성하는데 사용될 수 있는 AAV 분획이며, 여기서 AAV 분획은 단계 (i), (ii) 및/또는 (iii)을 위한 AAV 제제를 형성하기 위해 정제되거나 또는 희석된다. 특정 실시양태에서, 정제된 AAV 분획 또는 제제의 용량은 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도, 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, ELISA 검정은 샌드위치 ELISA, 직접 ELISA, 간접 ELISA 또는 경쟁적 ELISA 검정일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 대해, AAV-특이적 ELISA 검정은 AAV 항원에 대해 특이적인 샌드위치 ELISA 검정이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 키메라 AAV 항원이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 AAV8 항원이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 재조합 AAV (rAAV)로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 유전자 조작된 AAV, 또는 화학적으로 변형된 AAV, 또는 이들 둘 다로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, ELISA는 항원의 AAV 에피토프에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 에피토프는 어셈블리된 AAV 캡시드 상에 존재하는 입체형태적 에피토프이다. 특정 실시양태에서, AAV 에피토프는 어셈블리된 AAV 캡시드 상에 존재하는 선형 에피토프이다. 이러한 에피토프의 예는 캡시드 비리온 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, AAV는 캡시드의 표면 상에서 추가의 비리온 단백질을 발현하도록 유전자 조작되고, 이들 조작된 단백질은 ELISA 검정에서 사용/검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV는 비리온 단백질의 변이체를 발현하도록 화학적으로 변형되며, 이는 ELISA 검정에서 사용/검출될 수 있다 (예를 들어, VP1', VP2', VP3' 등). 특정 실시양태에서, 항체는 혈청형 특이적 캡시드 비리온 단백질을 식별한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 대해, AAV 분획 또는 제제 중 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법은 CryoTEM, 음성 염색 TEM, 모세관 전기영동, 분석용 초원심분리, 또는 그의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율을 평가 또는 확증하는 방법은 CryoTEM이다. 특정 실시양태에서, 평가는 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 정량화하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, CryoTEM 단계는 하기 단계를 포함한다: (i) 불활성 지지체에 AAV 분획 또는 제제를 기질 중에 포매하는 단계; (ii) 포매된 AAV 분획 또는 제제를 급속-동결시키는 단계; (iii) 극저온 투과 전자 현미경검사를 사용하여 포매된 AAV 분획 또는 제제를 영상화하는 단계; 및 (iv) AAV 분획 또는 제제 중 채워진 AAV 캡시드 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율을 정량화하는 단계. 특정 실시양태에서, 기질은 무정형 비-결정질 아이스이다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제는 세포 파편을 함유하지 않는다. 예를 들어, 벡터 샘플은 >2%의 불분명 입자를 함유하지 않으며 >2%의 파괴 또는 올리고머화된 입자를 함유하지 않는다.
AAV-특이적 ELISA 검정과 조합된 CryoTEM의 사용은 CryoTEM이, 정량적 PCR (qPCR)과는 달리, 채워진:비어있는 캡시드의 직접 측정을 제공하기 때문에 관련 기술분야에 공지된 것들에 비해 유리하다. 특정 실시양태에서, 방법은 qPCR을 통해 농도 또는 용량을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 대해, ELISA 검정은 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 정량화 전에 수행된다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 CryoTEM 전에 수행된다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 총 AAV 캡시드 수를 밸리데이션 범위 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 cp/ml 범위)로 희석하기 위해 수행된다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 정량화 후에 수행된다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 CryoTEM 후에 수행된다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 총 채워진 AAV 캡시드 수를 밸리데이션 범위로 희석하기 위해 수행된다. 특정 실시양태에서, 채워진:비어있는의 정량화는 단지 1회 수행된다. 예를 들어, CryoTEM 단계는 배치가 이전 배치의 것과 일관된 비어있는:채워진 비를 갖는지를 테스트하기 위해 1회 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 대해, ELISA 및 CryoTEM 둘 다의 사용은 벡터 DNA로부터 독립적인 모든 AAV 혈청형에 대해 적용될 수 있는 방법을 초래한다. 이는 검정이 모든 플랫폼에 걸쳐 수행되는 것을 가능하게 하므로 유리하다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법, 분획 또는 제제에 대해, AAV 분획 또는 제제 중 채워진 AAV 캡시드의 백분율은, 비어있는 캡시드와 비교 시, 약 40% 내지 약 100%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 또는 약 55% 내지 약 65%이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 60%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 AAV 분획 또는 제제의 배치 사이에 일관된 양의 채워진 캡시드를 갖는 AAV 분획 또는 제제를 생성하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1010 cp/ml 내지 약 1x1020 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1011 cp/ml 내지 약 1x1019 cp/ml, 약 1x1012 cp/ml 내지 약 1x1018 cp/ml, 약 1x1013 cp/ml 내지 약 1x1017 cp/ml, 또는 약 1x1014 cp/ml 내지 약 1x1016 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1012 cp/ml 내지 약 1x1015 cp/ml, 약 1x1013 cp/ml 내지 약 1x1015 cp/ml, 또는 약 1x1012 cp/ml 내지 약 1x1013 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1014 cp/ml 내지 약 5x1014 cp/ml, 약 2x1014 cp/ml 내지 약 3x1014 cp/ml, 또는 약 3.5x1014 cp/ml 내지 약 5x1015 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, cp/ml는 ml당 총 캡시드 또는 ml당 채워진 캡시드일 수 있다. 특정 실시양태에서, cp/ml는 ml당 총 캡시드이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 제제 대해, AAV 제제의 용량은 약 1 x 105 cp/kg 내지 약 1 x 1025 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법, 분획 또는 제제에 대해, AAV 분획 또는 제제의 용량은 약 1 x 1010 cp/kg 내지 약 1 x 1020 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법, 분획 또는 제제에 대해, AAV 분획 또는 제제의 용량은 약 1 x 1010 cp/kg 내지 약 1 x 1016 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, cp/kg은 대상체의 kg당 총 캡시드 또는 대상체의 kg당 채워진 캡시드일 수 있다. 특정 실시양태에서, cp/kg은 대상체의 kg당 총 캡시드이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 모든 방법에 대해, 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 가축 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완용 포유동물 예컨대 개 및 고양이; 설치류 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함한 실험실 동물; 애완용, 야생 및 사냥용 조류 예컨대 닭, 칠면조 및 다른 가금 조류, 오리, 또는 거위를 포함한 조류)이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 모든 방법에 대해, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 키메라 AAV 벡터이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV8이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV9이다. 특정 실시양태에서, AAV는 재조합 AAV (rAAV)이다. 특정 실시양태에서, AAV는 유전자 조작된 것, 화학적으로 변형된 것, 또는 이들 둘 다이다.
특정 측면에서, 본 발명은 AAV 분획 또는 제제를 포함하며, 여기서 분획 또는 제제의 농도, 용량 및/또는 효력은 AAV-특이적 ELISA 검정에 의해 측정된다. 특정 측면에서, 본 발명은 AAV 분획 또는 제제를 포함하며, 여기서 분획 또는 제제의 농도, 용량 및/또는 효력은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 측정하는 검정과 조합하여 AAV-특이적 ELISA 검정에 의해 측정된다. 특정 측면에서, 본 발명은 AAV 분획 또는 제제를 포함하며, 여기서 분획 또는 제제의 농도, 용량 및/또는 효력은 CryoTEM과 조합하여 AAV-특이적 ELISA 검정에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, AAV 제제의 농도, 용량 및/또는 효력은 qPCR을 통해 측정되지 않는다.
도 1은 각각 항원 ELISA 또는 qPCR을 사용하는 AAV 벡터 수 및 벡터 게놈 함량의 측정에 있어서의 오차의 백분율을 비교하는 그래프이다. AAV ELISA (QC ("품질 관리")): n=60; AAV ELISA (R&D ("연구 개발")): n=83; ITR-qPCR (R&D): n=64; FIX-qPCR (QC): n=40; FIX-qPCR (R&D): n=135.
도 2는 아가로스 겔 상에 로딩된 AAV 캡시드의 용량 (2.0x1010 캡시드/레인)을 추정하는 항원 ELISA 및 qPCR의 능력을 조사하는 아가로스 겔 전기영동 연구로부터의 결과이다.
도 3은 마우스 모델 (n=7)을 사용하는 생체내 생물효력 검정에서의 투여된 AAV 제제의 용량을 결정하기 위한 항원 ELISA 방법의 사용을 검증하는 그래프이다.
도 4는 AAV-특이적 ELISA 대 ITR-qPCR을 사용한 AAV8 FVIII 단일 가닥 DNA의 배치별 변동을 비교하는 그래프이다. AAV8 : 항원 - 중앙값 : 3.03cp/ml ± 0.66cp/ml. ITR-qPCR - 중앙값 : 9.11vg/ml ± 3.01vg/ml.
도 5A-5B: 도 5A는 AAV8 항원 ELISA 캡시드 입자 (cp)당 AAV 벡터 게놈 (vg)의 비를 입증하는 그래프이다. 도 5B는 AAV 제제 중 "채워진" 캡시드의 높은 일관성을 입증하는 그래프이다 (예를 들어, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 포함된 국제 출원 번호 PCT/US2017/059967의 공보에 논의된 바와 같은 방법을 참조함).
도 6A-6C: 도 6A는 하나의 채워진 AAV8 캡시드 및 하나의 비어있는 AAV8 캡시드의 CryoTEM 영상이다. 도 6B는 하나의 올리고머화된 AAV8 캡시드 (즉, AAV 캡시드가 삼량체 구조의 형태이며, 이는 비어있을 수 있거나 또는 채워져 있을 수 있음)의 CryoTEM 영상이다. 도 6C는 하나의 파괴된 AAV8 캡시드의 CryoTEM 영상이다.
도 7은 CryoTEM을 사용하는 AAV8 분획 분석의 그래프이다. CryoTEM 영상은 38k 배율로 획득되었고, 내부 밀도 분석에 적용되었다. 각각의 AAV 입자의 방사상 밀도 프로파일의 클러스터를 생성하는 주성분 분석이 패키징 수준의 클러스터를 나타내었다: 채워진 (좌측), 청색 (우측), 불분명 (중간) (더 어두운 마크는 중첩된 데이터 포인트를 나타냄); 파선 링: 99% 신뢰 구간. 5개 영상 분석, 1568개 입자.
도 8은 채워진 AAV8 벡터 캡시드의 백분율을 측정하기 위한 CryoTEM의 사용을 밸리데이션하는 그래프이다.
도 9는 캡시드 입자에 대한 벡터 게놈의 채워진 캡시드의 퍼센트와의 상관관계를 입증하는 그래프이다.
도 10은 인자 IX-녹아웃 마우스 모델에서의 생체내 효력에 대한 채워진 AAV8 캡시드 입자의 백분율의 영향을 입증하는 그래프이다. 혈장 샘플은 14일 후에 채취되었고, 인간 인자 IX 응고 활성이 측정되었다.
도 11은 시험관내 생물효력에 대한 채워진 AAV8 캡시드 입자의 백분율의 영향을 입증하는 그래프이다. 생물효력은 세포-기반 검정으로 측정되었고, cp에 대해 관련되며, 퍼센트 채워진 입자에 대해 플롯팅되었다.
도 12는 배치 17004-17013에 대해 AAV-특이적 ELISA 대 ITR-qPCR을 사용한 AAV8 FVIII 단일 가닥 DNA의 배치별 변동을 비교하는 그래프이다 (표 7 참조).
도 13은 배치 17004-17013에 대해 AAV 제제 중 "채워진" 캡시드의 높은 일관성을 입증하는 그래프이다 (예를 들어, 국제 출원 번호 PCT/US2017/059967의 공개에 논의된 바와 같은 방법을 참조함) (표 7 참조).
추가로 첨부된 도면은 단지 본 개시내용을 더욱 분명히 하기 위해 의도된 것으로, 달리 청구되지 않는 한 본 개시내용의 범주에 제한을 부여하지 않는다.
유전자 요법 벡터 제제의 정성적 및/또는 양적 속성을 측정하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터 제제는 AAV 제제, 예를 들어, AAV8 또는 AAV9이다. 본원에 개시된 모든 방법은 AAV 제제에 또는 그를 생성하는데 사용될 수 있다.
유전자 요법 벡터의 사용은 그의 효력을 위해 적어도 2종의 생물학적 활성을 필요로 한다: 1) DNA 서열을 세포에 전달하는 능력, 및 2) 발현된 유전자 서열의 생물학적 효과. 이들 활성을 달성하기 위해, 게놈 서열을 함유하는 AAV 캡시드의 적절한 농도 또는 용량이 요구된다. 이는 "비어있는" 캡시드는 트랜스진 생산과 연관된 치료 이익을 제공할 수 없기 때문이다. 따라서, 적절한 및/또는 일관된 수의 채워진 AAV 벡터 입자가 전달되도록 보장하기 위해 AAV 제제의 농도 또는 용량을 정확하게 측정하는 것이 중요하다. 이는 재조합 단백질의 경우에 로트/투여량 양 사이의 적절한 분산 계수가 ≤ 10% 내지 20%, 보다 이상적으로는 ≤ 10%이기 때문에 특히 그러하다. 용량의 적절한 결정은 AAV 제제의 효력을 확인하는데 있어서 중요하다. 이는 효력이 단계형 또는 실무형 용량-반응 곡선에 의해 결정되기 때문이다. 용량이 부정확하면, 부정확도가 측정된 효력으로 전달될 것이다. 부정확한 효력은 환자 집단의 불충분한 치료 또는 과잉 치료로 이어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡시드", "캡시드 입자", 및 "입자"는 상호교환가능하게 사용되며 적어도 하나의 무손상 AAV 캡시드 쉘로 구성된 AAV 입자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, AAV 또는 AAV 캡시드와 관련하여 용어 "비어있는"은 완전한 (즉, 전체) 벡터 게놈이 결여되어 있는 것들을 지칭한다. 비어있는 AAV 또는 비어있는 AAV 캡시드 또는 비어있는 AAV 입자는 치료 이익을 제공할 수 없다. 본원에 사용된 바와 같이, AAV 또는 AAV 캡시드 또는 AAV 입자와 관련하여 용어 "채워진 AAV 캡시드"는 완전한 벡터 게놈의 대부분을 함유하는 것들을 지칭한다. 채워진 AAV 캡시드는 수용 환자에게 치료 이익을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, "채워진"은 또한 "불완전한 벡터 DNA" 또는 "말단절단된 벡터 DNA"를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 완전한 대 불완전한 및/또는 말단절단된 벡터 DNA는 추가의 분석 방법으로 구별될 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로, 모세관 전기영동에 의한 DNA 사이징, AUC (분석용 초원심분리), % 아가로스 DNA (천연 또는 알칼리성), 겔, 서던 블롯, 도트-블롯 혼성화, UV 분광광도측정법, 약한 음이온 교환 크로마토그래피, 및 질량 분광측정법 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 포함된 문헌 [Resolving Adeno-Associated Viral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry Elizabeth E. Piersonet al. Anal. Chem., 2016, 88 (13), pp 6718-6725] 참조)을 포함한다.
2011년 1월에 공개된 FDA 가이드라인 (Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products)에 따르면, 하기와 같은 효력을 측정하는 3가지 방식이 있다: 1) 생체내 생물학적 검정; 2) 시험관내 비-생물학적 검정; 및 3) 다중 테스트. 그러나, 생물학적 검정은 투약, 검정, 및 판독 변동성으로 인해 큰 변동량을 유도한다. 비-생물학적 검정은 또한 문제를 갖는다. 예를 들어, 정량적 PCR (qPCR)은 단지 관심 유전자만을 측정한다. 따라서, qPCR의 사용은 용량 계산에 작동불가능한 캡시드 예컨대 올리고머화되고/거나, 파열되고/거나, DNA의 1개 초과의 카피를 함유하는 것들이 포함됨으로 인해 최종 AAV 제제의 효력의 부정확한 결정으로 이어질 수 있다. 작동불가능한 캡시드는 세포에 효과적으로 형질도입되지 않을 것이다. 더욱이, qPCR은 또한 효력의 부정확한 결정으로 이어질 수 있는 그의 고유한 높은 검정내 및 검정간 변동성 (즉, 최대 0.5 로그 스텝의 높은 변동성)으로 인해 제한적이다. 농도, 용량 및/또는 효력이 정확하게 결정되지 않으면, 환자는 배치마다 및/또는 치료마다 광범위하게 달라지는 용량을 제공받을 수 있다. 용량 또는 효력의 과대 추정은 질환 및/또는 장애의 부적절한 치료로 이어질 수 있다. 용량 또는 효력의 과소 추정은 부작용 (예를 들어, 신체 내 다수의 캡시드 입자에 의해 유발되는 과잉 교정 (예를 들어, 혈병) 또는 면역 반응)으로 이어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화하는 것을 포함하는, AAV 제제의 농도, 용량 및/또는 효력을 정량화하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: a) AAV 캡시드의 총수를 정량화하는 단계 및 임의로 b) AAV 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 및/또는 확증하는 단계.
특정 실시양태에서, 정량화 단계는 ELISA, SPR (표면 플라즈몬 공명), 시차 주사 형광측정법 기술, 면역학적 정량화 방법, 또는 그의 조합을 통해 AAV 캡시드의 총수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 정량화 단계는 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 캡시드의 총수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 샌드위치 ELISA, 직접 ELISA, 간접 ELISA 또는 경쟁적 ELISA 검정일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 대해, AAV-특이적 ELISA 검정은 AAV 항원에 대해 특이적인 샌드위치 ELISA 검정이다.
특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법은 극저온 투과 전자 현미경검사 (CryoTEM), 음성 염색 TEM, 채워진 및 비어있는 캡시드의 크로마토그래피 분리 (SEC, IEX, HIC 등), 모세관 전기영동, 분석용 초원심분리, 또는 그의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법은 CryoTEM일 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM 둘 다를 포함한다.
본원에 개시된 방법은 이러한 좁은 범위의 변동성 내에서 효력을 정확하게 측정한다. 특정 실시양태에서, 개시된 방법은 약 30% 내지 약 1%, 약 27% 내지 약 2%, 약 25% 내지 약 5%, 약 22% 내지 약 7%, 약 20% 내지 약 10%, 또는 약 17% 내지 약 12%의 변동 계수를 초래한다. 특정 실시양태에서, 개시된 방법은 ≤ 약 30%, ≤ 약 29%, ≤ 약 28%, ≤ 약 27%, ≤ 약 26%, ≤ 약 25%, ≤ 약 24%, ≤ 약 23%, ≤ 약 22%, ≤ 약 21%, ≤ 약 20%, ≤ 약 19%, ≤ 약 18%, ≤ 약 17%, ≤ 약 16%, ≤ 약 15%, ≤ 약 14%, ≤ 약 13%, ≤ 약 12%, ≤ 약 11%, ≤ 약 10%, ≤ 약 9%, ≤ 약 8%, ≤ 약 7%, ≤ 약 6%, ≤ 약 5%, ≤ 약 4%, ≤ 약 3%, ≤ 약 2%, ≤ 1%이지만, 모든 경우에 ≥ 0인 변동 계수를 초래한다.
특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 약 10% 내지 약 80% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 48%, 약 20% 내지 약 46%, 약 20% 내지 약 44%, 약 20% 내지 약 42%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 38%, 약 20% 내지 약 36%, 약 20% 내지 약 34%, 또는 약 20% 내지 약 32% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 약 20% 내지 약 33% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다. 특정 실시양태에서, ELISA를 포함하는 본원에 개시된 방법은, qPCR을 사용하는 방법과 비교 시, 농도, 용량 및/또는 효력에 있어서 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%, 적어도 약 26%, 적어도 약 27%, 적어도 약 28%, 적어도 약 29%, 적어도 약 30%, 적어도 약 31%, 적어도 약 32%, 적어도 약 33%, 적어도 약 34%, 적어도 약 35%, 적어도 약 36%, 적어도 약 37%, 적어도 약 38%, 적어도 약 39%, 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 또는 약 50% 더 적은 변동성을 갖는 AAV 제제를 생성한다.
특정 실시양태에서, 방법은 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 제제를 테스트하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 제제 중 캡시드의 대부분이 채워진 캡시드이기 때문에, AAV-특이적 ELISA는 AAV 제제의 용량 또는 효력에 대한 대표적인 판독가를 제공하기에 충분하다. 예를 들어, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 50% 내지 약 100%의 과반수이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 85%, 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 50%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 65% 내지 약 75%이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 60%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, AAV 제제 중 채워진 대 비어있는 캡시드의 비가 배치마다 일관되기 때문에, AAV-특이적 ELISA는 AAV 제제의 효력에 대한 대표적인 판독가를 제공하기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 일관된 것이란 약 0% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 12%, 약 5% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 9%의 변동 계수 (CV)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 일관된 것이란 약 15% 이하, 약 12% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하의 CV를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 일관된 것이란 약 1% 이하의 CV를 지칭한다. 특정 실시양태에서, CryoTEM과 조합된 AAV-특이적 ELISA가 AAV 제제 효력을 테스트하는데 요구된다.
특정 실시양태에서, 방법은 CryoTEM을 통해 AAV 분획 또는 제제를 테스트하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, CryoTEM은 AAV 제제의 효력에 대한 대표적인 판독가를 제공하기에 충분하다. 특정 실시양태에서, AAV-특이적 ELISA와 조합된 CryoTEM이 AAV 제제 효력을 테스트하는데 요구된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산 및/또는 측정된 AAV 제제는 대상체에게 투여하기에 적합하다. 적용가능한 AAV 벡터는 하기에 보다 상세하게 기재된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 제제는 멸균되고/거나 우수 제조 관리기준 (GMP) 등급이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 제제는 유전자 요법 의약품에 대해 미국 약전 챕터 1046 또는 유럽 약전에 기재된 요건 또는 미국 식품 의약품국 (USFDA) 또는 유럽 의약품청 (EMA)에 의해 요구되는 바와 같은 요건을 준수한다.
본원에 사용된 바와 같이, 방법은 AAV 분획 및/또는 AAV 제제에 사용될 수 있다. 용어 "제제" 및 "분획"은 본 출원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용어 "분획"은 대상체에게 투여될 최종 AAV "제제"를 생성하는데 사용될 수 있는 AAV 샘플 또는 배치를 의미할 수 있다. 예를 들어, AAV 분획은 최종 AAV 제제를 형성하기 전에 추가의 가공, 정제 또는 부피 조정을 겪을 수 있다.
정량적 및/또는 정성적 방법
본 개시내용의 방법은 하나 이상의 품질 관리 단계, 예를 들어, 투여를 위한 제제를 제조하기 위한 최종 단계를 포함한, 정제 공정의 하나 이상의 단계 후에 (예를 들어, 각각의 단계 후에) 수득된 AAV 분획 또는 제제의 농도, 용량 및/또는 효력을 측정하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법은 AAV 캡시드의 수를 정량화하기 위한, AAV (예를 들어, AAV 항원)에 대해 특이적인 ELISA 검정을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, ELISA 검정은 면역흡착 검정, 직접 ELISA, 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA 및/또는 경쟁적 ELISA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, ELISA는 샌드위치 ELISA이다. ELISA 검정의 비제한적 예는 실시예 1에 제공된다.
특정 실시양태에서, AAV 항원은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 키메라 AAV 항원이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 AAV8 항원이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 재조합 AAV (rAAV)로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, AAV 항원은 유전자 조작된 AAV, 또는 화학적으로 변형된 AAV, 또는 이들 둘 다로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, ELISA는 AAV 에피토프에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 에피토프는 어셈블리된 AAV 캡시드 상에 존재하는 입체형태적 에피토프이다. 특정 실시양태에서, AAV 에피토프는 어셈블리된 AAV 캡시드 상에 존재하는 선형 에피토프이다. 이러한 에피토프의 예는 캡시드 비리온 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, AAV는 캡시드의 표면 상에서 추가의 비리온 단백질을 발현하도록 유전자 조작되고, 이들 조작된 단백질은 ELISA 검정에서 사용/검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV는 비리온 단백질의 변이체를 발현하도록 화학적으로 변형되며, 이는 ELISA 검정에서 사용/검출될 수 있다 (예를 들어, VP1', VP2', VP3' 등). 특정 실시양태에서, 항체는 혈청형 특이적 캡시드 비리온 단백질을 식별한다.
ELISA는 AAV 분획 또는 제제의 용량 및/또는 효력을 결정하는 방식으로서, qPCR을 대체할 수 있다. 도 1에 입증된 바와 같이, 본 발명의 ELISA 기술은 qPCR 방법보다 상당히 더 적은 변동성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획 또는 제제를 평가하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 모든 방법은 qPCR 단계를 포함하지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 초원심분리 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 심층 여과 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 한외여과/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획 또는 제제를 농축시킨 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 접선 유동 여과 (TFF) 단계 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 폴리시 단계 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 정제된 AAV 제제를 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 수를 결정하는 것을 포함한다.
AAV 캡시드의 수를 정량화하는 추가의 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (예를 들어 비아코어(BIACORE), 옥테트(OCTET)), 시차 주사 형광측정법 (예를 들어, 프로메테우스(Prometheus) NT48, 나노템퍼(Nanotemper)), 자기 면역 검정 (MIA), 및 클로닝 효소 공여자 면역검정 (CEDIA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 방법은 ELISA 정량화 검정에 추가하여 또는 그 대신에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드 (예를 들어, 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 비의 백분율)를 측정하는 것을 포함한다. AAV 분획 또는 제제 중 채워진:비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법은 극저온 투과 전자 현미경검사 (CryoTEM), 음성 염색 TEM, 모세관 전기영동, 분석용 초원심분리, 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드를 측정하는 방법은 CryoTEM이다 (도 6 참조). 특정 실시양태에서, 방법은 CryoTEM 및 상기 기재된 바와 같은 AAV-특이적 ELISA 둘 다를 사용하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, ELISA는 샌드위치 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 샌드위치 ELISA는 AAV 에피토프에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 에피토프는 어셈블리된 AAV 캡시드 상에 존재하는 입체형태적 에피토프이다. CryoTEM을 통해 채워진 대 비어있는 캡시드의 양을 측정하는 비제한적 방법이 실시예 2로서 본원에 기재된다.
CryoTEM을 사용하는 하나의 이점은 음성 염색을 필요로 하지 않는다는 것이다. CryoTEM은 또한 채워진 AAV 캡시드의 양을 정량화하는 능력을 초래한다. 특정 실시양태에서, CryoTEM의 사용은 가양성 신호로 인한 채워진 AAV 캡시드 양의 과대추정을 초래하지 않는다.
본 개시내용의 방법은 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 수 또는 백분율을 평가하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 CryoTEM을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 불활성 지지체에 AAV 분획 또는 제제를 기질 중에 포매하는 단계; (ii) 포매된 AAV 분획 또는 제제를 급속-동결시키는 단계; (iii) 극저온 투과 전자 현미경검사를 사용하여 포매된 AAV 분획 또는 제제를 영상화하는 단계; 및 (iv) 채워진 AAV 캡시드 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율을 정량화하는 단계.
단계 (i)에 대해, 방법에 사용하기 위한 적합한 기질의 예는 무정형 비-결정질 아이스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방법에 사용하기 위한 적합한 불활성 지지체의 예는 탄소, 열가소성 수지, 및 폴리비닐 포르말의 필름 (예를 들어, 폴리비닐 아세테이트와의 공중합체로서 폴리비닐 알콜 및 포름알데히드로부터 형성된 중합체, 예컨대, 비제한적으로, 포름바르 또는 비닐렉, 탄소로 안정화된 폴리비닐 포르말, 폴리비닐 포르말 상의 일산화규소, 순수한 탄소 필름, 탄소 유형-A: 탄소 지지체 필름 (예를 들어, 그리드의 반대측의 제거가능한 폴리비닐 포르말), 탄소 유형-B: 폴리비닐 포르말 필름 (예를 들어, 탄소의 더 무거운 층으로 코팅됨), 및 탄소 유형-A 상의 일산화규소)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 단계 (i)은 온도 (예를 들어, (-196℃) 이하) 및 습도 제어된 환경에서의 탄소의 얇은 지지 필름 상에의 샘플의 침착을 수반한다. 특정 실시양태에서, 습도 수준은 상대 습도일 수 있다. 단계 (ii)에 대해, 샘플은 급속-동결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 급속 동결은 액체 질소 온도 근처에서 액체 에탄, 액체 질소, 액체 프로판, 또는 헬륨을 사용하는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, 액체 에탄, 액체 질소, 액체 프로판, 또는 헬륨의 용기는 액체 질소에 의해 둘러싸여 있다.
특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제는 아이스 결정이 형성될 수 없도록 급속하게 (예를 들어, 초당 104 내지 106 K) 동결된다. 특정 실시양태에서, 무정형 아이스는 액체 물의 급속 냉각에 의해 또는 보통의 아이스를 저온에서 압축함으로써 생성된다. 특정 실시양태에서, 부착되어 있는 일부 시편을 남기면서 과량의 AAV 분획 또는 제제가 제거된 후, 그리드는 액체 에탄으로 유리화되고, 이어서 액체 질소 중에 저장된다. CryoTEM을 수행하기 위한 추가의 단계의 논의를 위해, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Cabra and Samso, J. Visualized Experiments, (2015) 95(e52311):1-11]을 참조한다.
AAV 입자의 CryoTEM 분석은 전반적인 시편 형태학, 즉, 다양한 AAV 형태학 (일반적으로, 구형 및 변형된 AAV 입자, 서브유닛 구조 및 보다 크며 구조적으로 덜 한정된 형태학을 포함함)의 존재를 산정하는데 활용될 수 있다. 도 6A는 "채워진" 대 "비어있는" AAV 입자를 시각적으로 식별할 수 있는 방법의 예를 제공한다. 예를 들어, 채워진 캡시드는 쉘과 코어 사이에 어떠한 뚜렷한 경계도 갖지 않는 내부 밀도를 보여준다. 뚜렷한 외부 쉘 및 미약한 내부 밀도를 보여주는 AAV 캡시드는 비어있는 캡시드로서 분류된다.
CryoTEM은 또한 불분명 캡시드를 산정하는데 사용될 수 있다. 도 6B 및 6C는 채워진 캡시드로서 포함되지 않을 변형/불분명 캡시드의 예를 제공한다. 예를 들어, CryoTEM은 "채워진", "비어있는", 및 "불분명" 캡시드를 계수하는데 사용될 수 있다.
CryoTEM은 또한 입자를 수동으로 분류함으로써 또는 자동화된 영상 분석 방법론을 사용함으로써 입자의 패키징의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 초원심분리 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 심층 여과 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 한외여과/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획 또는 제제를 농축시킨 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 접선 유동 여과 (TFF) 단계 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 폴리싱 단계 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 정제된 AAV 제제를 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및/또는 품질을 결정하는 것을 포함한다
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 초원심분리 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 심층 여과 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 한외여과/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획 또는 제제를 농축시킨 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 접선 유동 여과 (TFF) 단계 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 폴리싱 단계 후에 수득된 AAV 분획 또는 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 정제된 AAV 제제를 AAV-특이적 ELISA 및 CryoTEM을 통해 테스트하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 양 및 품질을 결정하는 것을 포함한다.
분석용 초원심분리 (AUC)는 침강 계수에 따라 단백질을 분리할 수 있다. 동일한 단백질에 대해, 침강 계수는 응집 상태와 상관관계가 있을 수 있다. 간략하게 설명하면, 샘플은 상응하는 샘플 완충제로 희석되고, 이어서 내장형 석영 윈도우를 갖는 셀 어셈블리에 전달되며 로터에 로딩되고, 이는 그 후에 일정한 속도로 회전된다. 상이한 크기의 단백질 분자는 셀의 저부를 향해 상이한 침강 속도로 이동하고, 원심분리 동안 280 nm에서의 UV 검출에 의해 연속적으로 모니터링된다. 수집된 데이터 세트는 침강 및 확산 과정을 디콘볼루션하는 컴퓨터 분석을 가능하게 하여, 미분 침강 계수 분포 c(s)를 초래한다. 이는 샘플의 상이한 종을 분리하며, 그의 s-값 및 모집단을 제공한다. 침강 계수의 분포는 적분되고, 피크 최대치의 S-값 뿐만 아니라 상대 면적 백분율이 분석의 결과로서 주어진다.
AAV 제제
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 AAV 제제가 추가로 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, AAV 제제를 생산하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 관심 유전자를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; (ii) AAV 캡시드를 포함하는 세포 배양물의 상청액 또는 세포 현탁액을 수집하여 AAV 분획 또는 제제를 창출하는 단계; (iii) AAV-특이적 ELISA 검정을 사용하여 AAV 분획 또는 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 결정된 AAV 캡시드의 총수에 기초하여 목적하는 농도를 갖는 AAV 제제를 제조하는 단계. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획을 농축시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 비어있는 캡시드의 적어도 일부를 AAV 분획으로부터 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 특정한 농도의 채워진 캡시드 및/또는 특정한 비의 채워진:비어있는 캡시드를 갖는 AAV 분획 또는 제제를 창출하도록 하는 양의 비어있는 캡시드는 제거된다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제는 목적하는 용량까지 적절한 완충제로 희석된다.
특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획 또는 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 CryoTEM을 통해 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용량 및/또는 효력은 qPCR에 의해 결정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 100%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 또는 약 55% 내지 약 65%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 60% 내지 약 80%이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 60%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 AAV 분획 또는 제제 사이에 일관된 양의 채워진 캡시드를 갖는 AAV 분획 또는 제제를 생성하는데 사용된다.
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 AAV 제제를 투여하는 방법이 추가로 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, AAV 제제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 정제된 AAV 제제를 수득하는 단계; (ii) AAV-특이적 ELISA 검정을 사용하여 정제된 AAV 제제의 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 단계; (iii) 정제된 AAV 제제의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계. 특정 실시양태에서, 단계 (i) 및 (ii)의 제제는 최종 AAV 제제를 생성하는데 사용될 수 있는 AAV 분획이며, 여기서 AAV 분획은 단계 (i), (ii) 및/또는 (iii)을 위한 AAV 제제를 형성하기 위해 추가로 정제되거나 또는 희석된다. 특정 실시양태에서, 정제된 AAV 제제의 농도, 용량 및/또는 효력은 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 총수를 정량화함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법은 CryoTEM이다. 특정 실시양태에서, 농도, 용량 및/또는 효력은 qPCR에 의해 결정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 100%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 또는 약 55% 내지 약 65%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 60% 내지 약 80%이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 60%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%는 채워진 AAV 캡시드이다.
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 AAV 제제를 투여하는 방법이 추가로 본원에 제공된다. 특정 측면에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는, 특정한 용량의 AAV 제제의 그를 필요로 하는 대상체로의 투여를 수반한다: (i) 정제된 AAV 제제를 수득하는 단계; (ii) AAV-특이적 ELISA 검정을 사용하여 정제된 AAV 제제 중 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 단계; (iii) 특정한 용량의 AAV 제제를 대상체에게 투여하는 단계. 특정 실시양태에서, 단계 (i) 및 (ii)의 제제는 최종 AAV 제제를 생성하는데 사용될 수 있는 AAV 분획이며, 여기서 AAV 분획은 단계 (i), (ii) 및/또는 (iii)을 위한 AAV 제제를 형성하기 위해 추가로 정제되거나 또는 희석된다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 제제 중 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 채워진 대 비어있는 (채워진:비어있는) AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가 또는 확증하는 방법은 CryoTEM이다. 특정 실시양태에서, 농도, 용량 및/또는 효력은 qPCR에 의해 결정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 100%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 85%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 또는 약 55% 내지 약 65%이다. 특정 실시양태에서, 채워진 AAV 캡시드의 백분율은 약 60% 내지 약 80%이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 60%는 채워진 AAV 캡시드이다. 특정 실시양태에서, AAV 캡시드의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%는 채워진 AAV 캡시드이다.
특정 실시양태에서, AAV 제제의 효력은 시험관내 및/또는 생체내 생물효력 검정에 의해 추가로 검증될 수 있다. 예를 들어, 단계는 하기를 수반할 수 있다: 1) 제제 중 AAV의 함량을 결정하는 것 (예를 들어, ELISA를 통해); 2) 채워진 캡시드의 백분율을 결정하는 것 (예를 들어, CryoTEM을 통해) 및 3) 생물학적 활성을 확증하는 것 (예를 들어, 생체내 및/또는 시험관내 생물효력 검정을 통해).
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법, 분획 또는 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1010 cp/ml 내지 약 1x1020 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법, 분획 또는 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1011 cp/ml 내지 약 1x1019 cp/ml, 약 1x1012 cp/ml 내지 약 1x1018 cp/ml, 약 1x1013 cp/ml 내지 약 1x1017 cp/ml, 또는 약 1x1014 cp/ml 내지 약 1x1016 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1012 cp/ml 내지 약 1x1015 cp/ml, 약 1x1013 cp/ml 내지 약 1x1015 cp/ml, 또는 약 1x1012 cp/ml 내지 약 1x1013 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 농도는 약 1x1014 cp/ml 내지 약 5x1014 cp/ml, 약 2x1014 cp/ml 내지 약 3x1014 cp/ml, 또는 약 3.5x1014 cp/ml 내지 약 5x1015 cp/ml이다. 특정 실시양태에서, cp/ml는 ml당 총 캡시드 또는 ml당 채워진 캡시드일 수 있다. 특정 실시양태에서, cp/ml는 ml당 총 캡시드이다.
특정 실시양태에서, AAV 제제는 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물) 약 1000 L로부터 생산된 적어도 약 1012개 바이러스 입자 (vp) 또는 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물) 약 1000 L로부터 생산된 적어도 약 1013개 바이러스 입자 (vp)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 제제에 대해, AAV 제제의 용량은 약 1 x 105 cp/kg 내지 약 1 x 1025 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 제제에 대해, AAV 제제의 용량은 약 1 x 106 cp/kg 내지 약 1 x 1024 cp/kg, 약 1 x 107 cp/kg 내지 약 1 x 1023 cp/kg, 약 1 x 108 cp/kg 내지 약 1 x 1022 cp/kg, 약 1 x 109 cp/kg 내지 약 1 x 1021 cp/kg, 약 1 x 1010 cp/kg 내지 약 1 x 1020 cp/kg, 약 1 x 1011 cp/kg 내지 약 1 x 1019 cp/kg, 약 1 x 1012 cp/kg 내지 약 1 x 1018 cp/kg, 약 1 x 1013 cp/kg 내지 약 1 x 1017 cp/kg, 또는 약 1 x 1014 cp/kg 내지 약 1 x 1016 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 용량은 약 1 x 1012 cp/kg 내지 약 1 x 1020 cp/kg, 약 1 x 1013 cp/kg 내지 약 1 x 1019 cp/kg, 약 1 x 1014 cp/kg 내지 약 1 x 1018 cp/kg, 또는 약 1 x 1015 cp/kg 내지 약 1 x 1017 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 용량은 약 1 x 1010 cp/kg 내지 약 1 x 1016 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제제에 대해, AAV 제제의 용량은 적어도 약 1 x 106 cp/kg, 적어도 약 1 x 107 cp/kg, 적어도 약 1 x 108 cp/kg, 적어도 약 1 x 109 cp/kg, 적어도 약 1 x 1010 cp/kg, 적어도 약 1 x 1011 cp/kg, 적어도 약 1 x 1012 cp/kg, 적어도 약 1 x 1013 cp/kg, 적어도 약 1 x 1014 cp/kg, 적어도 약 1 x 1015 cp/kg, 적어도 약 1 x 1016 cp/kg, 적어도 약 1 x 1017 cp/kg, 적어도 약 1 x 1018 cp/kg, 적어도 약 1 x 1019 cp/kg, 적어도 약 1 x 1020 cp/kg, 적어도 약 1 x 1021 cp/kg, 적어도 약 1 x 1022 cp/kg, 적어도 약 1 x 1023 cp/kg, 적어도 약 1 x 1024 cp/kg, 또는 적어도 약 1 x 1025 cp/kg이다. 특정 실시양태에서, cp/kg은 대상체의 kg당 총 캡시드 또는 대상체의 kg당 채워진 캡시드일 수 있다. 특정 실시양태에서, cp/kg은 대상체의 kg당 총 캡시드이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 AAV 제제는 고도로 순수하고, 고도로 강력하며, 대상체에서의 임상 용도에 적합하다. 특정 실시양태에서, AAV 제제는 균질한 집단 및 높은 순도의 AAV 캡시드 입자를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 제제는 전장 벡터 DNA를 포함한다. 예시적 실시양태에서, AAV 제제는 말단절단된 또는 불완전한 벡터 DNA를 함유하는 AAV 캡시드 입자, 불완전한 단백질 조성 및 올리고머화된 구조를 갖는 AAV 입자, 또는 오염 바이러스, 예를 들어, 비-AAV, 지질 외피보유 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 원치 않는 오염물을 실질적으로 함유하지 않는다. 예시적 실시양태에서, AAV 제제는 관심 단백질의 코딩 cDNA를 다량으로 함유한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 AAV 제제는 대상체에게 투여하기에 적합하다. 특정 실시양태에서, AAV 제제는 멸균되고/거나 우수 제조 관리기준 (GMP) 등급이다. 특정 실시양태에서, AAV 제제는 유전자 요법 의약품에 대해 미국 약전 챕터 1046 또는 유럽 약전에 기재된 요건 또는 미국 식품 의약품국 (USFDA) 또는 유럽 의약품청 (EMA)에 의해 요구되는 바와 같은 요건을 준수한다. 특정 실시양태에서, AAV 제제는 가공 또는 조작을 거의 내지 전혀 하지 않으면서 대상체에게 바로 투여하기 위한 즉시-사용가능한 제제이다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환가능하게 사용되고, 본 개시내용의 조성물의 투여에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 병태를 앓고 있거나 또는 그에 걸리기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭하는 그의 통상적인 의미로 사용되며, 인간 및 비-인간 동물 둘 다를 포함한다. 대상체의 예는 인간, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 가축 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완용 포유동물 예컨대 개 및 고양이; 설치류 예컨대 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함한 실험실 동물; 애완용, 야생 및 사냥용 조류 예컨대 닭, 칠면조 및 다른 가금 조류, 오리, 거위 등을 포함한 조류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어는 특정한 연령을 나타내지는 않는다. 따라서, 성체기, 발육기 및 신생기 개체가 관심의 대상이다.
AAV의 공급원
본 개시내용의 방법과 관련하여, AAV는 임의의 AAV 혈청형의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 AAV는 AAV1 혈청형, AAV2 혈청형, AAV3 혈청형, AAV4 혈청형, AAV5 혈청형, AAV6 혈청형, AAV7 혈청형, AAV8 혈청형, AAV9 혈청형, AAV10 혈청형, 또는 키메라 AAV 벡터의 것이다. 특정 실시양태에서, AAV는 야생형이다. 특정 실시양태에서, AAV는 재조합 AAV (rAAV)이다. 특정 실시양태에서, AAV는 유전적 조작에 의해 변형되고/거나 화학적으로 변형된다. 특정 실시양태에서, AAV는 변형된 캡시드, 예를 들어, 유전자 조작되거나 또는 화학적으로 변형된 AAV 캡시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV8 혈청형의 것이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV9 혈청형의 것이다.
본 발명의 방법과 관련하여, AAV 분획은 예시적인 측면에서 농축된 AAV 분획이다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 mL당 적어도 약 1 x 1010, 약 1 x 1011, 약 1 x 1012, 약 1 x 1013, 약 1 x 1014, 약 1 x 1015, 또는 약 1 x 1016개의 AAV 총 캡시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 mL당 적어도 약 1 x 1012개의 AAV 총 캡시드를 포함한다. AAV 캡시드는 비어있는 AAV 캡시드 및 채워진 AAV 캡시드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, AAV는 형질감염된 숙주 세포에 의해 생산된 AAV 분획 또는 제제를 나타낸다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 또는 제제는 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 수확된 상청액 또는 그로부터의 세포 현탁액을 나타내며, 여기서 시스템의 하나의 플라스미드는 관심 유전자 또는 cDNA를 포함하고, 하나의 플라스미드는 캡시드 단백질 VP1, 캡시드 단백질 VP2 및/또는 캡시드 단백질 VP3을 코딩한다. 특정 실시양태에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3은 AAV8 VP1, VP2, 및/또는 VP3이다. rAAV 생산을 목적으로 하는 삼중 플라스미드 형질감염이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Qu et al., 2015, supra, 및 Mizukami et al., "A Protocol for AAV vector production and purification." PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998; 및 Kotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 형질감염은 무기 화합물, 예를 들어, 인산칼슘, 또는 유기 화합물, 폴리에틸렌이민 (PEI), 또는 비-화학적 수단, 예를 들어, 전기천공을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 부착 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 현탁 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 Sf9 세포 (예를 들어, 바큘로바이러스 감염된 Sf9 세포) 또는 HeLa 또는 BHK (헤르페스 바이러스 시스템)이다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 혈청 및 단백질 무함유 배양 배지를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 화학적으로 한정되며, 동물 유래 성분, 예를 들어, 가수분해물을 함유하지 않는다.
특정 실시양태에서, rAAV 입자를 포함하는 분획은 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 HEK293 세포를 포함하는 분획을 나타낸다. 특정 실시양태에서, AAV 입자를 포함하는 분획은 HEK293 세포의 형질감염으로부터 약 2 내지 약 7일 후의 또는 세포 배양물이 약 5x106개 세포/mL 이상의 세포 밀도를 가지며 약 50% 이상의 세포 생존율을 가질 때의 수확물의 분획을 나타낸다.
특정 실시양태에서, AAV는 삼중 플라스미드 형질감염에 이어, 1 내지 7일 이후의 수확에 의해 제조된다. 특정 실시양태에서, AAV는 세포 파쇄로부터 제조된다.
특정 실시양태에서, AAV는 하기에 의해 제조된다: HEK293 세포를 화학적으로 한정될 수 있으며 동물-유래 성분, 예를 들어 혈청 및 단백질을 함유하지 않을 수 있는 상업적으로 입수가능한 배양 배지에서 부착 및 성장시킨다. 세포를 약 3 x 106 내지 약 12 x 106개 세포/ml, 예를 들어, 약 6 x 106 내지 약 10 x 106개 세포/ml의 세포 밀도까지 배양한다. 이어서, 세포 밀도가 약 3 - 5 x 106개 세포/ml이도록 세포를 약 1:2 비로 분할한다. 분할 후, 세포를 (1) AAV 생산에 필수적인 1종 이상의 헬퍼 바이러스 기능을 제공할 수 있는 헬퍼 플라스미드, (2) 바이러스의 캡시드 생성, 복제 및 패키징에 수반되는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 플라스미드, 및 (3) 생성된 rAAV 입자 내로 패키징되어야 할 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드를 포함하는 3개의 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, GOI는 단일 가닥의 자기-상보적 형태의 인간 응고 인자 IX 파두아(Padua)를 포함하는 벡터 DNA일 수 있으며, 여기서 벡터 DNA는 4.8 kB의 전장을 갖는다. 또 다른 예로서, GOI는 이중 가닥의 자기-상보적 형태의 인간 응고 인자 IX 파두아를 포함하는 벡터 DNA일 수 있으며, 여기서 벡터 DNA는 4.8 kB의 전장을 갖는다. 또 다른 예로서, GOI는 단일 가닥의 자기-상보적 형태의 B-도메인 결실된 인간 응고 인자 VIII을 포함하는 벡터 DNA일 수 있으며, 여기서 벡터 DNA는 4.8 kB의 전장을 갖는다. 다른 GOI가 사용될 수 있다. 형질감염은 일시적 방식으로, 예컨대 양이온성 중합체를 사용함으로써 수행될 수 있다. 용리하기에 앞서, HEK293 세포주는 수확 전 적어도 약 1일, 예를 들어, 3-5일 동안 배양될 수 있다.
특정 실시양태에서, AAV 입자를 포함하는 분획은 미국 가출원 번호 62/417,775 및 국제 출원 번호 PCT/US2017/059967의 공보에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 포함된다.
정제 단계
본 개시내용의 방법은 본원에 개시된 단계의 임의의 조합을 포함하고, 임의로 하나 이상의 추가의 단계와 조합될 수 있다.
예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 밀도 구배가 형성되는 초원심분리 단계를 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 초원심분리 단계는 채워진 AAV 캡시드가 비어있는 AAV 캡시드로부터 분리되도록 하는 것으로 생각된다. 초원심분리 프로토콜의 예는, 예를 들어, WO2008135229 및 PCT/US17/59967의 공보에서 찾아볼 수 있으며, 이들 문헌은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 포함된다.
본 개시내용의 방법은, AAV의 순도를 추가로 증가시킬 수 있으며, 후속 단계를 위해 다른 원치 않는 성분을 제거하고/거나 분획을 농축시키고/거나 분획을 컨디셔닝할 수 있는 또 다른 추가의 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 심층 여과 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 형질감염된 HEK293 세포 배양물 상청액의 분획을, 셀룰로스 및 펄라이트를 포함하고 약 500L/m2의 최소 투과율을 갖는 필터를 사용하는 심층 여과에 적용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 약 0.2 μm의 최소 세공 크기를 갖는 필터의 사용을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 심층 여과 후에 약 0.2 μm의 최소 세공 크기를 갖는 필터를 통한 여과가 이어진다. 특정 실시양태에서, 심층 필터 및 약 0.2 μm의 최소 세공 크기를 갖는 필터 중 하나 또는 둘 다를 세척하고, 세척물을 수집한다. 특정 실시양태에서, 세척물을 함께 풀링하고, 심층 여과 및 약 0.2 μm의 최소 세공 크기를 갖는 필터로의 여과 시에 수득된 여과물과 조합한다. 특정 실시양태에서, 심층 여과 단계 및 다른 여과 단계는 본원에 기재된 초원심분리 단계 전에 발생한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 음성 크로마토그래피 단계를 포함하며, 이에 의해 원치 않는 성분은 크로마토그래피 수지에 결합하고 목적하는 AAV는 크로마토그래피 수지에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 단계, 또는 "비-결합 모드"의 AEX 크로마토그래피 단계를 포함한다. "비-결합 모드"의 이점은 절차를 수행하고 후속 검정을 수행함에 있어서의 상대적 용이성을 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, AAV 입자를 정제하는 방법은 AAV가 AEX 크로마토그래피 칼럼 또는 막을 관류하도록 조건 하에 분획을 AEX 크로마토그래피 칼럼 또는 막에 적용하고 AAV 입자를 수집함으로써 AAV 입자를 포함하는 분획에 대해 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 분획은 약 100 mM 내지 약 150 mM 염, 예를 들어, NaCl을 포함하는 로딩 완충제와 함께 AEX 크로마토그래피 칼럼 또는 막에 적용되며, 임의로, 여기서 로딩 완충제의 pH는 약 8 내지 약 9이다. 특정 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 115 mM 내지 약 130 mM 염, 예를 들어, NaCl을 포함하며, 임의로, 여기서 로딩 완충제는 약 120 mM 내지 약 125 mM 염, 예를 들어, NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 음성 AEX 단계는 본원에 기재된 초원심분리 단계 전에 발생한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 한외여과/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획을 농축시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 접선 유동 여과 (TFF) 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 한외여과/투석여과를 겪는다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 음성 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 단계 전에, 음성 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 단계 후에, 또는 음성 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 단계 전 및 후에 한외여과/투석여과 시스템으로 농축된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 AAV 입자를 포함하는 분획을 용매 세제로 처리하여 지질 외피보유 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 rAAV 입자를 포함하는 분획을 여과하여 분획 중 rAAV 입자보다 더 큰 크기의 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 AAV를 포함하는 분획을 여과하여 약 35 nm 이상의 크기의 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 필터의 세공 크기는 나노미터 범위이고, 특정 실시양태에서, 방법은 나노여과를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은, 물 유동 방법에 의해 결정 시, 35 나노미터 ±2 나노미터 범위의 세공 크기의 나노필터를 사용하는 것을 포함한다. 필터 유형의 분류는 막 구조, 물질 및 판매업체에 따라 달라진다.
특정 실시양태에서, 여과 단계 동안, 필터에 걸쳐 압력 차이가 유지된다. 특정 실시양태에서, 압력 (필터를 가로질러서의 압력 강하)은 약 0.02 MPa 내지 약 0.1 MPa이다. 특정 실시양태에서, 압력 (예를 들어, 필터를 가로질러서의 압력 강하)은 약 0.02 MPa 내지 약 0.08 MPa이다. 필터가 전량 여과 모드로 실행되는 경우에, 압력 차이는 적용되는 샘플의 공급 압력에 의해 (즉, 공급 압력에 영향을 미치는, 고유 유동으로의 펌프의 조정에 의해) 영향을 받을 수 있다.
특정 실시양태에서, rAAV 입자보다 더 큰 바이러스의 제거를 위한 여과 단계는 본 개시내용의 공정 동안 1회 발생한다. 특정 실시양태에서, 여과 단계는 공정 동안 2회 발생한다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자보다 더 큰 바이러스의 제거를 위한 여과 단계는 본원에 기재된 초원심분리 단계 후에 발생한다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자보다 더 큰 바이러스의 제거를 위한 여과 단계는 폴리시 단계 후에 발생한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은, 임의로 텐타클 겔을 포함하는 칼럼으로 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 폴리시 단계를 포함한다.
본원에 인용된 공보, 특허 출원 및 특허를 포함한 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조로 포함된 것으로 나타내어지고 그 전문이 본원에 제시된 것처럼 동일한 정도로, 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용을 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에 달리 나타내지 않거나 또는 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은, 달리 나타내지 않는 한, 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위의 열거는, 본원에 달리 나타내지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값 및 각각의 종점을 개별적으로 언급하는 것의 약기 방법으로서 기능하도록 의도될 뿐이고, 각각의 별개의 값 및 종점은 개별적으로 본원에 열거된 것처럼 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 나타내지 않거나 또는 달리 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 어휘 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시내용을 더욱 분명히 하기 위해 의도된 것으로, 달리 청구되지 않는 한 본 개시내용의 범주에 제한을 부여하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 어휘도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 개시내용의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 개시내용의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변경은 상기 기재를 정독하면 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변경을 적절한 경우에 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 적용가능한 법에 의해 허용되는 경우에, 여기에 첨부된 청구범위에 열거된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에 달리 나타내지 않거나 또는 달리 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 그의 모든 가능한 변경에서의 상기 기재된 요소의 임의의 조합이 본 개시내용에 포괄된다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로도 그의 범주를 제한하지 않아야 한다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 AAV-특이적 ELISA를 입증한다. ELISA는 테스트된 분획 또는 제제에 존재하는 AAV8 입자의 양을 결정한다.
AAV-함유 분획을 식별하기 위해 AAV-특이적 ELISA를 수행하였다. 입체형태-특이적 모노클로날 항체가 어셈블리된 AAV-8 입자 상에서 반복적으로 발현되는 에피토프의 검출에 사용된다.
AAV8 ELISA를 테칸 로보터(TECAN Roboter) 시스템 상에서 AAV-8 적정 ELISA 키트 (물품 번호 PRAAV8; 프로젠(Progen) (독일 하이델베르크))로 수행하였다. 간략하게 설명하면, 어셈블리된 AAV8 캡시드 상의 입체형태적 에피토프에 대해 특이적인 모노클로날 항체 (ADK8)를 마이크로타이터 스트립 상에 코팅하여, AAV 분획으로부터 AAV8 입자를 포획하는데 사용하였다. 포획 AAV8 입자를 2 단계에 의해 검출하였다. 제1 단계에서, ADK8 항체에 대해 특이적인 비오틴-접합된 모노클로날 항체를 면역 복합체 (ADK8 및 ADK8 항체의 복합체)에 결합시켰다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제 접합체를 비오틴-접합된 모노클로날 항체에 결합된 면역 복합체에 첨가하였고, 스트렙타비딘 퍼옥시다제 접합체는 비오틴과 반응하였다. 표지된 AAV-8 입자를 설정 농도로 함유하는 AAV2/8 입자 제제 WL217S를 표준으로서 사용하였다. 퍼옥시다제 기질 용액을 첨가하여, 결합된 AAV 캡시드 입자의 양에 비례하는 발색 반응을 초래하였다. 발색 반응을 광도계로 450 nm에서 측정하였다.
사전-코팅된 플레이트를 100 μL/웰의 희석 완충제로 충전하였다. 이어서, 검정 표준, 검정 대조군 및 샘플을 위한 연속 희석물을 플레이트 상에서 직접 제조하였다. 용해된 검정 표준은 100 μL를 웰에 이미 존재하는 희석 완충제 100 μL와 혼합함으로써 플레이트 상에서 직접 이중으로 6회 1+1 희석하는 한편, 검정 대조군은 1/200 희석한 다음, 6회 연속 희석물을 플레이트 상에서 직접 제조하였다. 샘플의 경우에는, 2회 연속 희석물을 독립적 이중으로 제조하였다. 이어서, 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기 상 +37℃ (설정점)에서 60 ± 10 min 인큐베이션하며, 30 ± 5 min 후에 플레이트를 180° 회전하였다. 세척 단계 (세척 완충제: 트윈 20 함유 포스페이트-완충 염수 (PBS), 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02% KH2PO4, 0.126% Na2HPO4x2H2O, 0.05% 트윈 20, pH 중성 (지시 종이로 체크됨)) 후에, 100 μL/웰의 검출 항체를 첨가하고, 플레이트를 첨가 후 30 ± 5 min 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션은 세척 단계에 의해 종료하였다. 이어서, 100 μL/웰의 테트라메틸벤지딘 기질을 첨가하였다. 발색 반응이 실온에서 25 ± 5 min 동안 진행되도록 한 다음, 정지 용액의 첨가에 의해 정지시켰다. 플레이트를 30 min 이내에 ELISA 판독기를 사용하여 450 nm 및 참조 파장으로서의 620 nm에서 측정하였다. 이어서, 보정 곡선을 로그-로그 피팅 후에 입수하였다.
실시예 2
본 실시예는 극저온 투과 전자 현미경검사 (CryoTEM)를 입증한다.
CryoTEM은 나노크기의 입자 예컨대 AAV의 가시화를 가능하게 한다. 기술은 온도 및 습도 제어된 환경에서의 탄소의 얇은 지지 필름 상에의 AAV 제제의 침착을 수반한다. 부착되어 있는 일부 AAV 제제를 남기면서 과량의 AAV 제제의 제거 후, 그리드를 액체 에탄으로 유리화시키고, 이어서 액체 질소 중에 저장하였다. AAV 캡시드 입자의 CryoTEM 분석은 전반적인 시편 형태학, 즉, 다양한 AAV 형태학 (일반적으로, 구형 및 변형된 AAV 입자, 서브유닛 구조 및 보다 크며 구조적으로 덜 한정된 형태학을 포함함)의 존재, 및 자동화된 영상 분석 방법론에 의한 입자의 패키징 수준의 산정에 활용되었다.
AAV 분획 또는 제제를 불활성 지지체 상의 무정형 비-결정질 아이스 중에 포매하고, 극저온 조건 하에 급속-동결시킴으로써 이들을 그의 천연 상태에 가깝게 보존하였다. 기반이 되는 영상 분석은 비로노바 애널라이저 소프트웨어 (VAS)를 사용하는 자동화된, 객관 분석 방법을 사용하여 행해졌다.
쉘과 코어 사이에 어떠한 뚜렷한 경계도 갖지 않는 내부 밀도를 보여주는 AAV 캡시드 입자는 채워진 입자로서 분류된다 (도 6A). 뚜렷한 외부 쉘 및 미약한 내부 밀도를 보여주는 AAV 캡시드 입자는 비어있는 입자로서 분류된다 (도 6A). 불분명 입자는 삼량체 구조 형태의 AAV 캡시드를 포함하며 (도 6B), 이는 비어있는 또는 채워진, 및 파괴된 AAV 캡시드일 수 있다 (도 6C).
CryoTEM은 AAV 제제의 완전한 채워진 대 비어있는 캡시드의 양을 결정한다.
실시예 3
본 실시예는 AAV-특이적 ELISA의 사용이 qPCR 기술의 사용보다 더 적은 변동성을 초래한다는 것을 입증한다.
AAV8 ELISA: 총 AAV8 캡시드 입자 역가를 캡시드 입자 (cp) 농도에 대해 ATCC® AAV8 참조 표준 물질로 보정된 상업용 키트 (프로젠)를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
qPCR: 택맨(Taqman)® 화학에 기반한 정량적 PCR 검정이 트랜스진 DNA의 벡터 게놈 카피 농도를 측정하기 위해 개발되었다. FVIII에 대한 ITR-qPCR을 위해, 밀리리터 (ml)당 벡터 게놈 역가 (vg)를 벡터 게놈의 ITR 서열 내 서열을 검출하는 형광 표지된 프로브 및 프라이머와 함께 택맨 기반 qPCR을 사용하여 결정하였다. AAV 입자 내 ITR-특이적 서열을 검출하기 위해 샘플을 DNAse I로 처리하고, 후속 프로테이나제 K 단계 후, scAAV 게놈을 캡시드로부터 방출시켰다. 최종적으로, 제한 효소 소화를 수행하여 AAV ITR T-형상 구조를 분리하였다.
참조로서 사용된 플라스미드를 단일 커터 제한 효소로 선형화하고, 아가로스 겔로부터 추가로 정제하였다. 겔 추출된 DNA의 UV A260 흡광도를 UV 분광광도계로 3회 측정하고, DNA 농도의 평균 값을 ml당 μg 단위로 계산하였다.
선형화된 표준 플라스미드에 대한 ml당 카피 수를 결정하기 위해, ds DNA의 분자량을 원 서열의 각각의 개별 뉴클레오티드의 정확한 질량을 고려하여 mol당 그램 단위로 계산하였다.
테스트 물품 내 벡터 게놈 역가 (mL당 벡터 게놈 단위)를 선형 회귀로의 플라스미드 표준 곡선 피팅을 통해 계산하였다.
CryoTEM: 샘플을 실시예 2에 기재된 바와 같이 불활성 지지체 상의 무정형 비-결정질 아이스 중에 포매하고, 극저온 조건 하에 급속-동결시킴으로써 이들을 그의 천연 상태에 가깝게 보존하였다.
겔 전기영동: 전기영동을 기재된 바와 같이 (Fagone et al., 2012) 수행하였다. 간략하게 설명하면, AAV 샘플을 0.5% SDS (소듐도데실술페이트)의 존재 하에 75℃에서 10분 동안 처리하고, 이어서 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 샘플 (대략 1.5E10 벡터 게놈 (vg)/레인)을 1% 1xTAE 아가로스 겔 상에 로딩하고, 전기장 (7 V/cm 겔 길이로 60 min) 하에 분리시켰다. 이어서, 겔을 2x 겔레드(GelRed) (바이오티움(Biotium)) 용액으로 염색하고, 케미독(ChemiDoc)TMMP (바이오라드(Biorad))에 의해 영상화하였다.
생체내 생물효력: 항원 ELISA 검정을 사용하여 평가된 AAV8 제제를 사용하여 AAV-특이적 생체내 생물효력 검정을 수행하여 ml당 캡시드 입자 - cp/ml를 결정하였다. 샘플을 테스팅 시설로 운송하고 (동결됨, ≤-60℃), 해동시키고, 제제 완충제를 사용하여 4x1011cp/ml로 희석하였다. 생체내 생물효력 테스팅은 군당 최대 8마리의 수컷 FVIII 녹아웃 마우스 ((B6;129S4-F8 tm2Kaz); 찰스 리버 게엠베하(Charles River GmbH), 독일 슐츠펠트)를 포함한다. 동물은, 샘플을 해동시킨 직후에, 4x1012 cp/kg의 테스트 또는 대조군 샘플의 단일 정맥내 볼루스 주사를 제공받았다. 테스트 샘플은 AAV8-FVIII 유전자 요법 벡터였다. 수집된 마우스 시트레이트 혈장이 FVIII 활성 검정을 사용하여 FVIII 활성을 평가하는데 사용된다. FVIII 활성 검정은 칼슘 이온 및 인지질의 존재 하에 수행된다. 인자 X는 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화된다. 이러한 활성화는 이러한 반응에서 보조인자로서 작용하는 인자 VIII에 의해 자극된다. 최적의 양의 Ca2+, 인지질 및 인자 IXa, 및 과량의 인자 X를 사용함으로써, 인자 X의 활성화의 속도를 인자 VIII의 양과 선형으로 관련시킨다. 인자 Xa는 발색원성 기질을 가수분해하며, 따라서 발색단을 유리시킨다. 이어서, 발색을 광도계로 405 nm에서 판독한다. 생성된 인자 Xa 및 따라서 발색 강도는 샘플 내 인자 VIII 활성에 비례한다.
시험관내 생물효력: 항원 ELISA 검정을 사용하여 평가된 AAV8 제제를 사용하여 AAV-특이적 시험관내 생물효력 검정을 수행하여 ml당 캡시드 입자 - cp/ml를 결정하였다. 관심 유전자 (GOI) 인자 VIII (FVIII)을 포함하는 바이러스 벡터 AAV8을 간 표적 세포주에 감염시켰고, 이는 후속적으로 세포 배양 배지로 기능적이며 측정가능한 FVIII 단백질을 분비하였다. 세포 배양물 상청액의 인자 VIII-활성을 FVIII 발색원성 검정에 의해 직접 측정하였다. AAV8-FVIII 샘플의 측정가는 참조 물질 대비 백분율로 주어진다. 이 방법은 AAV8-FVIII 유전자 요법 벡터의 생물학적 기능의 정량적 산정을 가능하게 한다. 생체내 생물효력에 대해 상기 기재된 바와 같이 동일한 검정을 사용하였다.
도 1에 입증된 바와 같이, qPCR 방법의 사용은 AAV-특이적 ELISA 방법과 비교 시 더 큰 변동성을 초래하였다. 예를 들어, ITR-기반 qPCR 방법은 ≤ 43%의 분산 계수를 초래한 반면, AAV8-특이적 ELISA에 대한 분산 계수는 ≤ 10%였다. ELISA 방법은 qPCR 방법보다 약 20% 내지 약 33% 더 적은 변동성을 가졌다. 이러한 놀라운 차이는 AAV 분획의 용량을 AAV-특이적 ELISA 검정 단독으로 결정할 수 있게 한다. 이러한 접근법은 AAV 분획을 투약하는 더 정확한 방식을 제공할 뿐만 아니라 보다 비용 효과적이며 시간 효율적이다.
ELISA 방법 또는 qPCR 방법이 AAV 제제의 캡시드 함량을 측정하는 정확한 방법을 초래하는지의 여부를 테스트하기 위해, AAV 제제를 생성하고 ELISA 및 개별적으로 qPCR을 사용하여 평가하였다. 이들 측정으로부터의 결과를 사용하여 각각의 레인에 로딩하기 위한 샘플 (2.0 x 1010 캡시드/레인)을 제조하였다. 제제가 양쪽 유형의 검정을 거쳐가는 동일한 로트로부터의 것임에도 불구하고, 도 2에 제시된 바와 같이, ELISA 연관된 샘플에 대한 신호가 qPCR 결과와 연관된 것들과 비교 시 더 일관되므로, ELISA로 평가된 샘플이 qPCR로 평가된 것들보다 일관되게 변동성이 더 적었다. 따라서, ELISA로 보조될 때의 투약이 qPCR과 연관된 투약보다 더 강건하였다.
AAV8 캡시드 ELISA 및 ITR-qPCR에 의한 전임상 및 GMP 벌크 약물 물질 (BDS), 및 최종 약물 제품 (FDP) 로트의 방출 테스팅으로부터 유래된 모든 결과가 제시되어 있고 (표 1 내지 4), 총 캡시드 입자당 벡터 게놈의 비가 계산되었다 (표 5). 비교를 위해, ITR-qPCR 값에 대해 플롯팅된 AAV8 ELISA 값이 또한 제시되어 있다 (도 4). 도 5는 AAV8 항원 ELISA 캡시드 입자 (cp)당 AAV 벡터 게놈 (vg)의 비를 평가한다. 도 5A는 AAV 항원당 벡터 게놈의 비에 기초하여 qPCR 방법의 변동성을 제시한다. 도 5B는 50-55-60 방법을 사용하는 PCT/US2017/059967의 초원심분리에 따른 제조 공정으로부터 수득된 채워진 AAV의 백분율의 높은 일관성을 입증한다. 초원심분리 공정은 배치마다 일관된 채워진 vs 비어있는 캡시드 프로파일을 제공한다. 그러므로, 검정 사이의 변동성이 일관될 것이다 (예를 들어, 도 5B). 그러나, qPCR이 용량을 계산하는데 사용된 경우에는, 배치 사이에 높은 변동성이 있다 (예를 들어, 도 5A).
다음에, AAV 제제의 효력을 측정하기 위해 생체내 생물효력 검정에서 마우스에 ELISA 방법을 사용하여 투약하였다. 도 3은 마우스 모델을 사용하는 생체내 생물효력 검정을 사용함으로써 AAV 제제의 효력을 결정하기 위한 항원 ELISA 방법의 사용을 검증한다. 도 3에 나타내어진 바와 같이, 생물학적 검정은 모든 로트에서 생물학적 활성이 있었고 로트의 효력이 비슷하며 일관되었다는 것을 확증하였다. 상기 언급된 바와 같이, 생체내 생물효력 검정은 세포에 형질도입되고 관심 단백질 또는 유전자를 생산하는 AAV의 능력 둘 다를 평가한다.
표 1: 벌크 약물 물질 (BDS) 로트: ELISA에 의해 측정된 총 AAV8 캡시드 입자 역가, 및 ITR-qPCR에 의해 측정된 벡터 게놈 역가, 및 그의 비. 비의 평균, 표준 편차, 변동 계수 (CV), 및 3 표준 편차 한계가 또한 제시되어 있다. ITR-qPCR/AAV8 ELISA의 비는 AAV 제제의 "비활성"을 제공한다. 비 또는 "비활성"은 채워진 캡시드의 정보/수를 제공할 수 있지만, 이것이 qPCR 및 ELISA 둘 다로부터 유래하기 때문에 변동이 매우 크다. 변동은 주로 qPCR로부터 기인하며, 이는 AAV-ELISA 또는 AAV-ELISA/TEM 방법이 qPCR 방법에 비해 우월한 이유를 입증한다.
Figure 112019099651509-pct00001
표 2: 우수 제조 관리기준 (GMP) BDS 로트: ELISA에 의해 측정된 총 AAV8 캡시드 입자 역가, 및 ITR-qPCR에 의해 측정된 벡터 게놈 역가, 및 그의 비. 비의 평균, 표준 편차, 변동 계수 (CV), 및 3 표준 편차 한계가 또한 제시되어 있다.
Figure 112019099651509-pct00002
표 3: 최종 약물 제품 (FDP) 로트: ELISA에 의해 측정된 총 AAV8 캡시드 입자 역가, 및 ITR-qPCR에 의해 측정된 벡터 게놈 역가, 및 그의 비. 비의 평균, 표준 편차, 변동 계수 (CV), 및 3 표준 편차 한계가 또한 제시되어 있다.
Figure 112019099651509-pct00003
표 4: GMP FDP 로트: ELISA에 의해 측정된 총 AAV8 캡시드 입자 역가, 및 ITR-qPCR에 의해 측정된 벡터 게놈 역가, 및 그의 비. 비의 평균, 표준 편차, 변동 계수 (CV), 및 3 표준 편차 한계가 또한 제시되어 있다.
Figure 112019099651509-pct00004
표 5: 제시된 모든 BDS 및 FDP 배치에 대한 캡시드 입자당 벡터 게놈의 비.
Figure 112019099651509-pct00005
표 6: B-도메인 결실된 FVIII의 벡터 DNA를 함유하는 AAV8의 제조 배치의 시험관내 및 생체내 생물효력 데이터. AAV8의 투약은 AAV8 항원 ELISA에 기반하였고, % 채워진 캡시드는 CryoTEM에 의해 결정되었다. % 채워진 캡시드의 관점에서 배치별 일관성은 CV 2.7%로 입증된다.
Figure 112019099651509-pct00006
도 12 및 13은 배치 17004-17014로부터의 ELISA, qPCR, 및 CryoTEM 결과를 조사한다. 배치 17004-17013 (표 6)은 2x 500L 배치로부터의 동일한 배치 크기이다. 이들 10개의 배치는 최종 산물 중 비슷한 양의 AAV8 캡시드를 함유한다. 배치 17004-17013의 분석은 표 7에 제시되어 있다.
표 7: 배치 17004-17013에 대한 B-도메인 결실된 FVIII의 벡터 DNA를 함유하는 AAV8의 제조 배치의 시험관내 및 생체내 생물효력 데이터.
Figure 112019099651509-pct00007
실시예 4
본 실시예는 AAV 제제 중 채워진 및 비어있는 캡시드의 양을 측정하기 위한 도구로서의 CryoTEM을 밸리데이션한다.
산물 방출 및 정확한 임상 투약을 가능하게 하기 위해서는 재조합 AAV8 (rAAV8)에 기반한 유전자 요법 벡터 제제의 품질 속성을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 분석 방법의 조합이 요구된다. CryoTEM은 AAV8 유전자 요법 벡터 제제 중 채워진, 벡터 게놈-함유 및 비어있는 벡터 입자를 정량화하고 직교 방법을 사용하여 효력에 있어서의 이러한 파라미터의 유의성을 결정하는 것으로 확립되었다.
벡터 제제를 혼합함으로써, 또는 선택적으로 벡터 분획을 초원심분리에 의해 풍부화시킴으로써 생성된 40 - 80%의 채워진 입자의 함량을 갖는, 인간 응고 인자 IX (FIX)를 코딩하는 rAAV8 벡터 제제를 사용하여 CryoTEM을 채워진/비어있는 정량화에 대해 밸리데이션하였다. 밸리데이션은 1%의 상대 표준 편차 미만의 실험실내 및 검정간 정밀도를 초래하였다. 6회의 독립적 실험의 선형성이 각각 0.996보다 큰 r2으로 달성되었다. 동일한 벡터 벌크로부터 유래된 벡터 제제는 채워진-대-비어있는 비의 세포-기반 시험관내 검정 및 생체내 모델에서 측정된 효력과의 상관관계를 제시하였다.
방법 및 물질
CryoTEM: 벡터 샘플을 불활성 지지체 상의 무정형 비-결정질 아이스 중에 포매하고, 극저온 조건 하에 급속-동결시킴으로써 이들을 그의 천연 상태에 가깝게 보존하였다. 기반이 되는 영상 분석은 실시예 2에 기재된 바와 같이 비로노바 애널라이저 소프트웨어 (VAS)를 사용하는 자동화된, 객관 분석 방법을 사용하여 행해졌다.
AAV8 ELISA: 총 AAV8 캡시드 입자 역가를 캡시드 입자 (cp) 농도에 대해 ATCC® AAV8 참조 표준 물질로 보정된 상업용 키트 (프로젠)를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
시험관내 생물효력: FIX-AAV8로 감염된 HepG2 세포의 상청액 중 FIX의 발색원성 활성을 측정하여, 참조 제제 대비 임의 생물효력 단위로 제공하고, 캡시드 입자에 대해 정규화하였다. 시험관내 생물효력 검정에서, 바이러스 벡터 AAV8을 간 표적 세포주에 감염시켰고, 이는 후속적으로 배지로 기능적인, 측정가능한 코딩된 단백질을 분비한다. 제1 단계에서 HepG2 표적 세포를 AAV8에 의해 감염시켜 형질도입시킨다. 인큐베이션 동안, 코딩된 단백질이 상청액으로 방출되었다. 제2 단계에서, 상청액으로 분비된, 코딩된 단백질의 활성을 활성 검정에 의해 직접 측정하였다 (시험관내 생물효력 검정 효소적 검정 - ROX FIX (로식스(Rossix))를 사용하였음). AAV8 샘플의 측정가는 참조 물질 대비 백분율로 주어진다. 이 방법은 AAV8 유전자 요법 벡터의 생물학적 기능의 정량적 산정을 가능하게 한다. 참조는 WHO 표준 또는 인간 FIX에 대해 WHO 표준으로 보정된 표준 제제이다.
생체내 생물효력: AAV8 입자를 코딩하는 인간 FIX를 8마리의 인간 FIX-녹아웃 마우스 (찰스 리버 저머니 (독일 슐츠펠트 CR0))에 i.v. 주입하였다. AAV8 제제를 항원 ELISA에 의해 평가하여 ml당 캡시드 입자 - cp/ml를 결정하였다. 샘플을 테스팅 시설로 운송하고 (동결됨, ≤-60℃), 해동시키고, 제제 완충제를 사용하여 4.95E+10 cp/ml로 희석하였다. 동물은, 샘플을 해동시킨 직후에, 2.47E+11cp/kg의 테스트 또는 대조군 샘플의 단일 정맥내 볼루스 주사를 제공받았다. 혈장 중 FIX-활성을 국제 표준으로 보정된 인간 혈장 표준에 대해 1-스테이지 APTT 응고 검정에 의해 측정된 FIX-응고 활성을 통해 주기적으로 모니터링하였다. FIX 함유 샘플을 이미다졸 완충제 +1% 알부민으로 보정 곡선 내의 범위로 희석하였다. 희석된 샘플 50μl를 FIX 결핍 혈장 50μl에 첨가하고, 인지질 현탁액 (파트롬틴(Pathromtin) SL, 지멘스(Siemens)) 50μl와 접촉시키며, 240초 인큐베이션 후 25mM CaCl2 용액 50μl를 첨가함으로써 응고를 개시하고, 혈병 형성 발생까지의 시간을 BCS XP (지멘스) 또는 ACL 500 (베르펜(Werfen))스키드로 측정한다.
qPCR: 택맨® 화학에 기반한 정량적 PCR 검정이 트랜스진 DNA의 벡터 게놈 카피 농도를 측정하기 위해 개발되었다. FIX 벡터 DNA에 대해 2가지의 FIX 특이적 qPCR 방법을 사용하였다: 하나는 이중 가닥 DNA AAV 벡터에 대한 것 및 또 다른 하나는 단일 가닥 DNA AAV 벡터에 대한 것.
밀리리터 (ml)당 벡터 게놈 역가 (vg)를 프라이머 및 FIX 서열 내 서열을 검출하는 형광 표지된 프로브 및 폴리아데닐화 신호와 함께 택맨 기반 qPCR을 사용하여 결정하였다. FIX-특이적 서열을 검출하기 위해 DNAse I로 처리하고, 후속 프로테이나제 K 단계 후, scAAV 게놈을 캡시드로부터 방출시켰다. 최종적으로, 제한 효소 소화를 수행하여 AAV ITR T-형상 구조를 분리하였다.
참조 물질로서 사용된 플라스미드를 단일 커터 제한 효소로 선형화하고, 아가로스 겔로부터 추가로 정제하였다. 겔 추출된 DNA의 UV A260 흡광도를 UV 분광광도계로 3회 측정하고, DNA 농도의 평균 값을 ml당 μg 단위로 계산하였다.
선형화된 표준 플라스미드에 대한 ml당 카피 수를 결정하기 위해, ds DNA의 분자량을 원 서열의 각각의 개별 뉴클레오티드의 정확한 질량을 고려하여 mol당 그램 단위로 계산하였다.
테스트 물품 내 벡터 게놈 역가 (mL당 벡터 게놈 단위)를 선형 회귀로의 플라스미드 표준 곡선 피팅을 통해 계산하였다.
결과
도 6은 CryoTEM이 채워진 및 비어있는 캡시드를 영상화하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 도 7은 샘플 분석의 예이다. 38k 배율로 획득된 CryoTEM 영상을 내부 밀도 분석에 적용하였다. 각각의 AAV 입자의 방사상 밀도 프로파일의 주성분 분석이 패키징 수준의 클러스터를 나타내었다: 채워진 (적색; 좌측), 청색 (비어있는; 우측), 불분명 (녹색; 중간); 파선 링: 99% 신뢰 구간. 결과물의 개요는 표 8을 참조한다.
표 8: 총 1568개의 입자를 분석한 5개 영상으로부터 입수된 데이터.
Figure 112019099651509-pct00008
도 8은 특이성, 반복성, 실험실내 정밀도, 선형성, 희석 정확도, 및 강건성을 포함한 ICH Q2(R1) (즉, 인간용 제약의 등록을 위한 기술적 요건의 국제 조화 회의)에 따른 CryoTEM의 밸리데이션이다. 6회의 독립적 실험의 세트로부터의 선형성에 대한 결과가 제시되어 있다. 도 8은 채워진 AAV8 입자의 이론적 및 측정된 함량 사이의 차이를 입증한다. 거의 80%의 채워진 캡시드를 함유하는 rAAV8 제제, 및 대부분 비어있는 캡시드를 갖는 또 다른 제제를 혼합하여 40 내지 80%의 채워진 캡시드의 백분율을 갖는 4개 샘플을 수득하였다. 이들 제제를 2개의 그리드 각각에서 측정하였으며, 여기서 x-축은 "채워진" 캡시드의 이론적 백분율을 나타내고, y-축은 CryoTEM에 의해 측정된 값을 나타낸다. 하나의 데이터 포인트는 2회 반복의 평균을 반영한다. 모두는 0.996 초과의 상관 계수로, 이론적 및 실험적 값의 우수한 상관관계를 입증하였다.
도 9는 초원심분리 분획 (국제 출원 PCT/US2017/059967의 공보 참조)으로부터 정제된, 채워진 캡시드의 정도가 증가하는 제제를 조사한다. 특히, 도 9는 "채워진" 캡시드의 백분율에 따른 qPCR 역가의 증가를 기재한다. x-축은 CryoTEM에 의해 측정된 "채워진" 캡시드의 백분율이고, y-축은 측정된 qPCR 값이다. "채워진" 캡시드의 백분율이 높아질수록 qPCR 역가도 높아진다. 도 9에서의 AAV8 항원당 qPCR의 비는 이러한 비가 "채워진" 입자의 양에 따라 증가하는 방식을 입증한다 - 채워진 캡시드의 백분율이 높아질수록 qPCR vs AAV8 항원-비 [Y:비 vg/cp / X:채워진 캡시드의 백분율 (CryoTEM)]도 높아진다. 채워진 캡시드의 보다 높은 백분율에서, qPCR의 변동성이 더 커지며, 따라서, 덜 정확해진다. 이는 대상체에게 제공된 산물이 채워진 캡시드의 보다 높은 범위 내에 있다면 특별히 중요하다. 캡시드 입자당 벡터 게놈 역가를 qPCR 및 AAV8 캡시드 입자 ELISA 결과로부터 계산하고, CryoTEM 데이터와 상호연관시켰다.
도 10 및 11은 생체내 및 시험관내 생물효력에 대한 % 채워진 FIX-AAV8 캡시드 입자의 영향을 입증한다. 도 10에서, 도 8에서 사용된 것과 동일한 AAV 벡터 제제를 인자 IX 녹아웃 마우스 (n=8)에 i.v. 투여하였다. 혈장 샘플을 14일 후에 채취하고, huFIX 응고 활성을 측정하였다. 도 11에 대해, 채워진 캡시드의 정도가 달라지는 제제 (도 9와 동일함)를 초원심분리 분획의 단리 및 후속 정제에 의해 제조하였다. 생물효력을 세포-기반 검정으로 측정하고, cp에 대해 관련시키며, 채워진 입자의 %에 대해 플롯팅하였다. 시험관내 생물효력은 채워진 캡시드의 정도가 높아질수록 증가한다.
표 9: ELISA에 의해 결정된 바와 같은 도 10을 위한 용량.
Figure 112019099651509-pct00009
% 채워진 캡시드를 CryoTEM을 사용하여 측정하였다. 이러한 경우에 FIX 파두아를 코딩하는 이중 가닥 DNA를 함유하는 AAV8을 사용하였다. 이러한 실험의 생체내 결과를 위해, 도 10에 제시된 바와 같이 상이한 함량의 채워진 및 비어있는 입자를 갖는 샘플을 채워진 캡시드 함유 BDS 제품을 비어있는 캡시드 BDS 제품과 혼합함으로써 제조하였다. 동물은 제0일에 단일 정맥내 볼루스 주사를 제공받았고, 혈액을 제7일, 제14일 및 제28일에 수집하였다. FIX의 활성을 FIX 스테이지 응고 검정 (APTT-기반 인자 검정이 인자 VIII, IX, XI 및 XI의 측정에 널리 사용됨)으로 분석하였다. 샘플을 인자 IX 결핍 혈장 및 인지질과 접촉시키고, 인큐베이션하고, 응고를 염화칼슘 용액으로 개시하고, 응고 시간을 측정하였다. 응고 시간은 응고 인자의 농도와 명백한 수학적 관계를 갖는다.
결론
CryoTEM은 치료 용도를 위한 유전자 요법 벡터 제제의 방출을 가능하게 할, AAV 제제의 효력을 정량화하기 위한 가치있는 도구이다. 이는 채워진 및 비어있는 캡시드 입자의 양 또는 벡터 정량화를 위한 벡터 게놈 역가를 측정하기 위한 직교 방법으로서 기능할 수 있다. CryoTEM은 유전자 요법 벡터 품질 및 효력의 모니터링을 가능하게 하는 이점을 갖는다.
CryoTEM은, 그의 샘플 제조 원리가 샘플의 천연 상태를 상당한 정도로 보존하기 때문에, 다른 전자 현미경 기반 방법보다 우월하다. 더욱이, 염색에 의존할 필요가 없다.
본원에 기재된 것들 이외의, 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다. 모든 특허, 특허 출원 및 비-특허 문헌을 포함한, 본 출원에 인용된 각각의 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (56)

  1. AAV를 포함하는 제제의 용량을 정량화하는 방법으로서, AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 AAV 캡시드의 총 수를 정량화하는 단계 및 극저온 투과 전자 현미경검사(CryoTEM)를 통해 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    평가 단계는 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획이 이전 제제 또는 분획의 것과 일관된 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 갖는지를 테스트하도록 1회 수행되는, 방법.
  3. AAV를 포함하는 제제 중 채워진 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 방법으로서, AAV-특이적 ELISA 검정을 통해 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 AAV 캡시드의 총 수를 정량화하는 단계 및 극저온 투과 전자 현미경검사(CryoTEM)를 통해 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    평가 단계는 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획이 이전 제제 또는 분획의 것과 일관된 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 갖는지를 테스트하도록 1회 수행되는, 방법.
  5. 특정 용량의 AAV를 포함하는 제제를 제조하는 방법으로서,
    (ⅰ) 정제된 AAV를 포함하는 분획을 수득하는 단계;
    (ⅱ) AAV-특이적 ELISA 검정을 이용하여 정제된 AAV를 포함하는 분획 중 AAV 캡시드의 농도를 측정하는 단계;
    (ⅲ) AAV 캡시드의 총 수에 기초하여 목적하는 농도를 갖는 AAV를 포함하는 제제를 제조하는 단계; 및
    (ⅳ) 극저온 투과 전자 현미경검사(CryoTEM)를 통해 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    평가 단계는 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획이 이전 제제 또는 분획의 것과 일관된 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 갖는지를 테스트하도록 1회 수행되는, 방법.
  7. AAV를 포함하는 제제를 생산하는 방법으로서,
    (ⅰ) 관심 유전자를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;
    (ⅱ) AAV 캡시드를 포함하는 세포 배양물의 상청액 또는 세포 현탁액을 수집하여 AAV를 포함하는 분획을 창출하는 단계;
    (ⅲ) AAV-특이적 ELISA 검정을 이용하여 AAV를 포함하는 분획 중 AAV 캡시드의 총 수를 정량화하는 단계;
    (ⅳ) AAV 캡시드의 총 수에 기초하여 목적하는 농도를 갖는 AAV를 포함하는 제제를 제조하는 단계; 및
    (ⅴ) 극저온 투과 전자 현미경검사(CryoTEM)를 통해 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 평가하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    평가 단계는 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획이 이전 제제 또는 분획의 것과 일관된 채워진 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 갖는지를 테스트하도록 1회 수행되는, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV를 포함하는 분획을 농축시키는 단계를 더 포함하고/거나 비어있는 캡시드의 적어도 일부를 AAV를 포함하는 분획으로부터 제거하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV를 포함하는 제제를 동결건조시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가 단계가 음성 염색 TEM, 모세관 전기영동, 분석용 초원심분리, 천연 아가로스 겔, 알칼리성 아가로스 겔, 서던 블롯, 도트-블롯 혼성화, UV 분광광도측정법, 약한 음이온 교환 크로마토그래피 또는 질량 분광측정법에 의해 AAV 캡시드의 백분율 또는 비를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    CryoTEM 단계가
    (ⅰ) 불활성 지지체 내 기질에 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획을 포매하는 단계;
    (ⅱ) 포매된 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획을 급속-동결시키는 단계;
    (ⅲ) 극저온 투과 전자 현미경검사를 이용하여 포매된 AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획을 영상화하는 단계; 및
    (ⅳ) AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획 중 채워진 AAV 캡시드 대 비어있는 AAV 캡시드의 백분율을 정량화하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    기질이 무정형 비-결정질 아이스인, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    AAV를 포함하는 제제 또는 AAV를 포함하는 분획은 세포 파편이 없는, 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가 단계가 ELISA 검정 전에 수행되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가 단계가 ELISA 검정 후에 수행되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    ELISA 검정이 AAV 항원에 대해 특이적인 샌드위치 ELISA, 직접 ELISA, 간접 ELISA 또는 경쟁적 ELISA 검정인, 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    AAV 항원이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 키메라 AAV, 유전자 조작된 AAV, 또는 화학적으로 변형된 AAV로부터의 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    정량적 PCR을 포함하지 않는, 방법.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    채워진 AAV 캡시드의 백분율이 40% 내지 100%인, 방법.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV 캡시드의 적어도 60%가 채워진 AAV 캡시드인, 방법.
  22. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    농도가 1×1010 cp/ml 내지 1×1020 cp/ml인, 방법.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 키메라 AAV 벡터인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    AAV가 AAV6, AAV8 또는 AAV9인, 방법.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV가 유전자 조작된 AAV, 화학적으로 변형된 AAV 또는 둘 다인, 방법.
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