BR112019018216A2 - Métodos para determinar a potência de preparações de vírus adeno-associados - Google Patents

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Abstract

Proporcionam-se no presente documento métodos de medição dos atributos qualitativos e/ou quantitativos de preparações de vetor de terapia gênica. Em determinadas modalidades, as preparações de vetor de terapia gênica são preparações de AAV (por exemplo, AAV8). Em determinadas modalidades os métodos compreendem determinar a potência ou dose da preparação do AAV usando ELISA ou ELISA em combinação com CryoTEM.

Description

MÉTODOS PARA DETERMINAR A POTÊNCIA DE PREPARAÇÕES DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade sobre o pedido de patente provisional estadunidense n.º 62/467.045 apresentado em 3 de março de 2017, que se incorpora pelo presente documento como referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0002] Vírus adeno-associado (AAV) é um vírus não envelopado, pequeno que empacota um genoma de DNA monocatenário linear. AAV pertence à família Parvoviridae e o gênero Dependovirus, posto que a infecção produtiva por AAV ocorra apenas na presença de um vírus auxiliar, tais como, por exemplo, adenovírus ou vírus do herpes. Inclusive na ausência de um vírus auxiliar, AAV (serotipo 2) pode alcançar latência integrando no cromossomo 19q13.4 de um genoma humano hospedeiro. É o único vírus de DNA de mamífero conhecido por ser capaz de integração específica do local (Daya e Berns, Clinical Microbiology Reviews, páginas 583 -593 (2008)).
[0003] Para que o AAV seja utilizado de maneira segura na clínica, AAV foi modificado geneticamente em várias localizações dentro do seu genoma. Por exemplo, o gene Rep, que é requerido para replicação viral, e o elemento requerido para integração específica do local foram eliminados do genoma AAV em muitos vetores virais. Este AAV recombinante (rAAV) existe em um estado extracromossômico e tem eficiência de integração muito baixa no DNA genômico. Portanto, a possibilidade de rAAV induzir a mutagênese aleatória em uma célula hospedeira é reduzida, se não eliminada por completo. Devido a estas propriedades e a falta de patogenicidade, rAAV mostrou-se muito promissor como um vetor de terapia gênica em múltiplos aspectos de aplicações pré-clínicas e clínicas. Novos serotipos e vetores auto complementares estão sendo testados na clínica. Junto com estes desenvolvimentos de vetores em andamento, foca-se esforço contínuo nos processos de fabricação escalonáveis que podem gerar de maneira eficiente quantidades altas de título de vetores rAAV com alta pureza e potência.
[0004] Embora o esforço para projetar métodos de larga escala, eficientes para purificar um produto do AAV adequado para administração humana tenha avançado, ainda permanece uma necessidade de métodos analíticos para medir atributos de qualidade de preparações de vetor de terapia gênica baseadas em rAAV recombinante, para permitir a liberação do produto e a dosagem clínica precisa. Por exemplo, os métodos atuais de geração de AAV em cultura celular dão como resultado a formação de capsídeos “vazios”, que não tem o genoma do vetor e mostraram levar a respostas imunes mediadas por células T. Além disso, capsídeos vazios não podem proporcionar um benefício terapêutico associado com produção transgênica, e existe um potencial para aumentar as respostas imunes inatas ou adaptativas ao vetor (por exemplo, mediadas pela célula T), que então torna capsídeos vazios uma preocupação em contextos de terapia gênica. Wright, Molecular Therapy 22: 1–2 (2014).
[0005] Classicamente, o uso de PCR quantitativo (qPCR) é o mais amplamente aceito e preferido para método para a determinação da dose de preparações de AAV devido a que proporciona uma medida dos genomas do vetor (por exemplo, genoma do vetor (vg)/kg sujeito). Veja-se Halbert CL et al., J Virol 1997;71:5932–5941; Samulski RJ et al., J Virol 1989;63:3822– 3828; Clark KR et al., Hum Gene Ther 1999;10:1031–1039; e Wright JF, Hum Gene Ther 2011;22:519–521. Sem embargo, o uso de qPCR é limitado pelo fato de que apenas o DNA total é medido, o que pode levar a problemas significantes. Por exemplo, a leitura de qPCR pode ser impactada por problemas tais como, o uso de iniciadores ineficientes, problemas com padrões de calibração, ou estruturas terciárias de DNA (por exemplo, estruturas em grampo, circular, ou superenrolado). Portanto, o uso de qPCR pode levar a determinação imprecisa da dose e finalmente a potência da preparação final do AAV devido à inclusão de capsídeos que contêm mais que uma cópia de DNA e/ou capsídeos fraturados no cálculo da dose. Isto é devido a que a potência de uma preparação do AAV consiste em duas partes: 1) a capacidade do capsídeo do AAV para transduzir células e 2) a capacidade de DNA em AAV produzir produto desejado. Os capsídeos inoperáveis, que não seriam representados com qPCR, não transduzem de maneira efetiva as células. Além disso, qPCR também é limitado devido à sua variabilidade inerente (ou seja, alta variabilidade até 0,5 etapas de log) que pode levar a uma determinação imprecisa de dose da preparação do AAV final. A variabilidade inerente também pode ser composta pela variabilidade entre ensaios observada com qPCR devido à preparação da amostra, que envolve várias etapas, incluindo, digestão proteica de capsídeo, extração de DNA, e purificação de DNA. Se a dose e/ou potência não é determinada de maneira precisa, os pacientes podem receber a dose errada e/ou doses amplamente variadas de tratamento a tratamento. Portanto, uma ferramenta precisa para medir a dose e finalmente a potência de preparações de AAV, e monitorar a qualidade e potência do vetor de terapia gênica é, portanto, necessária.
SUMÁRIO
[0006] Proporcionam-se no presente documento métodos de medição dos atributos de quantidade de preparações de vetor de terapia gênica. Em determinadas modalidades, as preparações de vetor de terapia gênica são preparações do vírus adeno-associado (AAV). Os métodos revelados no presente documento podem ser usados em qualquer ponto de purificação. Em determinadas modalidades, os métodos podem ser usados antes da preparação ou do empacotamento dos capsídeos do AAV para o seu uso. Os métodos revelados no presente documento podem ser usados para melhorar a determinação da concentração, dose, e/ou potência de uma preparação do AAV.
[0007] Uma característica de geração de vetor do AAV em cultura celular é a formação de um excesso de capsídeos “vazios”, que não tem o genoma do vetor. Em determinadas modalidades, a quantidade de capsídeos vazios é avaliada com o fim de determinar de maneira precisa a concentração, dose, e/ou potência de uma preparação do AAV. Os capsídeos vazios também podem ser considerados como impurezas relacionadas ao produto, que devem ser reduzidos durante a purificação. Em determinadas modalidades, é importante determinar a quantidade total de capsídeos vazios para reduzir uma resposta imune inata e/ou adaptativa contra o antígeno do capsídeo.
[0008] Classicamente, a concentração, dose, e/ou potência de uma preparação do AAV depende de uma determinação quantitativa mediante PCR quantitativo (qPCR). Surpreendentemente, os inventores encontraram que um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) do AAV específico apenas pode ser usado para a determinação quantitativa da preparação do AAV e o seu uso pode melhorar a medida da concentração e/ou dose de uma preparação do AAV e finalmente a potência. Os métodos da presente descrição são vantajosos em relação com os conhecidos na técnica devido a que a determinação do antígeno com ELISA proporciona resultados altamente confiáveis, surpreendentemente mais precisos que os de qPCR. Em determinadas modalidades, o método não inclui uma etapa de medição da concentração, dose, e/ou potência através de qPCR. Em determinadas modalidades, a concentração, dose, e/ou potência podem ser determinadas pela concentração de capsídeos do AAV em uma preparação do AAV. Em determinadas modalidades,
os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com pelo menos aproximadamente 10% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR. Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com pelo menos aproximadamente 20% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR. Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com aproximadamente de 10% a aproximadamente 80% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR. Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com aproximadamente de 15% a aproximadamente 50% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR. Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com aproximadamente de 20% a aproximadamente 33% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR.
[0009] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a quantificação da dose e/ou potência de uma preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende testar uma preparação do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico para quantificar o número total de capsídeos do AAV na preparação do AAV. Então, o número de capsídeos pode ser usado para determinar a dose para administrar a um sujeito. A dose pode ser usada para determinar a potência (ou seja, a dose ou concentração requerida para produzir um determinado efeito (por exemplo, EC50)). Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da dose e/ou potência através de qPCR.
[0010] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a medição da concentração de capsídeos do AAV em uma preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende testar uma preparação ou fração do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico para quantificar o número total de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da concentração através de qPCR.
[0011] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a medição da concentração de capsídeos do AAV cheios em uma preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende testar uma preparação ou fração do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico para quantificar o número total de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV e avaliar a porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus vazios na preparação do AAV (por exemplo, usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM)). Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da concentração através de qPCR.
[0012] Em determinadas modalidades, os capsídeos vazios são removidos da preparação ou fração do AAV dando como resultando uma preparação ou fração do AAV com uma concentração específica de capsídeos cheios e/ou uma proporção específica de capsídeos cheios:vazios. Em determinadas modalidades, a concentração ou proporção é constante entre lotes de modo que um ensaio de ELISA do AAV específico é suficiente para determinar a concentração, dose, e/ou potência da preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da concentração, dose, e/ou potência através de qPCR.
[0013] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a quantificação da dose e/ou potência de uma preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende testar uma preparação do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico em combinação com um método que avalia ou confirma a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da dose e/ou potência através de qPCR.
[0014] Em determinadas modalidades, o método compreende medir a concentração de capsídeos do AAV em uma preparação ou fração do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico em combinação com um método que avalia ou confirma a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da concentração através de qPCR.
[0015] Em determinadas modalidades, o método para a quantificação da dose e/ou potência de uma preparação do AAV compreende confirmar a atividade biológica da preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende confirmar a atividade biológica da preparação do AAV usando um método in vitro. Em determinadas modalidades, o método compreende confirmar a atividade biológica da preparação do AAV usando um método in vivo. Em determinadas modalidades, os métodos da invenção não requerem confirmação usando um ensaio biológico se o ensaio de ELISA do AAV específico está emparelhado com um método para confirmar a qualidade do produto (por exemplo, medição da proporção de cheio:vazio). Por exemplo, em determinadas modalidades, os métodos da invenção não requerem confirmação usando um ensaio biológico se o ensaio de ELISA do AAV específico é combinado com CryoTEM. Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da dose e/ou potência através de qPCR.
[0016] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a produção de uma preparação do AAV, que compreende: (i) transfectar células hospedeiras com pelo menos um plasmídeo que compreende o gene de interesse; (ii) coletar o sobrenadante ou suspensão celular da cultura celular que compreende capsídeos do AAV para criar uma fração do AAV; (iii) quantificar o número total de capsídeos do AAV na fração do AAV usando um ensaio de ELISA do AAV específico; e (iv) preparar uma preparação do AAV com uma concentração desejada de capsídeos do AAV baseada no número total de capsídeos do AAV determinado na etapa (iii). Em determinadas modalidades, o método compreende concentrar a fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende remover pelo menos uma porção de capsídeos vazios da fração do AAV. Em determinadas modalidades, pelo menos uma porção dos capsídeos vazios são removidos para criar uma preparação ou fração do AAV com uma concentração específica de capsídeos cheios e/ou uma proporção específica de capsídeos cheios:vazios. Em determinadas modalidades, o método compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui uma etapa de medição da concentração, dose, e/ou potência através de qPCR. Em determinadas modalidades, o método compreende ainda liofilizar a preparação ou fração do AAV.
[0017] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a administração de uma preparação do AAV a um sujeito em necessidade da mesma, que compreende (i) obter uma preparação do AAV purificada; (ii) medir a concentração dos capsídeos do AAV na preparação do AAV purificada usando um ensaio de ELISA do AAV específico; (iii) administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva da preparação do AAV purificada ao sujeito. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV nas etapas (i) e (ii) é uma fração do AAV que pode ser usada para gerar uma preparação do AAV final, em que a fração do AAV é purificada ou diluída para formar a preparação do AAV para as etapas (i), (ii), e/ou (iii). Em determinadas modalidades, a dose e/ou potência da preparação ou fração do AAV purificada é medida quantificando o número total de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui a etapa de medição da concentração, dose, e/ou potência através de qPCR.
[0018] Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a administração de uma preparação do AAV a uma dose específica a um sujeito em necessidade da mesma, que compreende (i) obter uma preparação do AAV purificada; (ii) medir a concentração de capsídeos do AAV na preparação do AAV purificada usando um ensaio de ELISA do AAV específico; (iii) administrar uma dose específica da preparação do AAV ao sujeito. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV nas etapas (i) e (ii) é uma fração do AAV que pode ser usada para gerar uma preparação do AAV final, em que a fração do AAV é purificada ou diluída para formar a preparação do AAV para as etapas (i), (ii), e/ou (iii). Em determinadas modalidades, a dose da preparação ou fração do AAV purificada é medida quantificando o número total de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método não inclui uma etapa de medição da concentração, dose, e/ou potência através de qPCR.
[0019] Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA pode ser um ensaio de ELISA sanduíche, ELISA direto, ELISA indireto, ou de ELISA competitivo. Em determinadas modalidades, para os métodos revelados no presente documento, o ensaio de ELISA do AAV específico é um ensaio de ELISA sanduíche específico para um antígeno do AAV. Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, ou um antígeno do AAV quimérico. Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é um antígeno do AAV8. Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é de um AAV recombinante (rAAV). Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é de um AAV geneticamente modificado por engenharia, ou AAV quimicamente modificado, ou ambos.
[0020] Em determinadas modalidades, o ELISA compreende um anticorpo específico para um epítopo do AAV do antígeno. Em determinadas modalidades, o epítopo do AAV é um epítopo conformacional presente nos capsídeos do AAV montados. Em determinadas modalidades, o epítopo do AAV é um epítopo linear presente nos capsídeos do AAV montados. Exemplos de tais epítopos incluem, mas não são limitados a, proteínas do virião do capsídeo VP1, VP2, e/ou VP3. Em determinadas modalidades, os AAVs são modificados geneticamente por engenharia para expressar adicionalmente proteínas do virião sobre a superfície do capsídeo, e as proteínas modificadas por engenharia podem ser usadas/detectadas em um ensaio de ELISA. Em determinadas modalidades, os AAV são modificados quimicamente para expressar variantes da proteína do virião, que pode ser usada/detectada em um ensaio de ELISA (por exemplo, VP1’, VP2’, VP3’, etc…). Em determinadas modalidades, os anticorpos identificam proteínas do virião do capsídeo específicas do serotipo.
[0021] Em determinadas modalidades, para os métodos revelados no presente documento, o método para a avaliação ou confirmação da porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios em uma preparação ou fração do AAV pode ser CryoTEM, TEM de coloração negativa, eletroforese capilar, ultracentrifugação analítica, ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, o método para a avaliação ou confirmação da porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) em uma preparação ou fração do AAV é CryoTEM. Em determinadas modalidades, a avaliação compreende a quantificação da porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios.
[0022] Em determinadas modalidades, a etapa de CryoTEM compreende: (i) embutir uma preparação ou fração do AAV em um substrato em um suporte inerte; (ii) congelar de maneira instantânea a preparação ou fração do AAV embutida; (iii) obter imagens da preparação ou fração do AAV embutida usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica; e (iv) quantificar a porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus capsídeos do AAV vazios na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o substrato é gelo não cristalino, amorfo. Em determinadas modalidades, a preparação ou fração do AAV é livre de detritos celulares. Por exemplo, as amostras do vetor não contêm partículas indeterminadas >2%, não contêm partículas quebradas ou oligomerizadas >2%.
[0023] O uso de CryoTEM em combinação com um ensaio de ELISA do AAV específico é vantajoso em relação com os conhecidos na técnica devido a que CryoTEM proporciona uma medida direta de capsídeos cheios:vazios, ao contrário do PCR quantitativo (qPCR). Em determinadas modalidades, o método não inclui uma etapa de medição da concentração ou dose através de qPCR.
[0024] Em determinadas modalidades, para os métodos revelados no presente documento, o ensaio de ELISA é realizado antes da quantificação de capsídeos do AAV cheios:vazios. Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA é realizado antes de CryoTEM. Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA é realizado para diluir o número de capsídeo do AAV total a um intervalo validado (por exemplo, os intervalos de cp/ml como revelados no presente documento). Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA é realizado após a quantificação de capsídeos do AAV cheios:vazios. Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA é realizado após CryoTEM. Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA é realizado para diluir o número total de capsídeo do AAV cheio a um intervalo validado. Em determinadas modalidades, a quantificação de cheio:vazio é realizada apenas uma vez. Por exemplo, a etapa de CryoTEM pode ser usada uma vez para testar que o lote tem uma proporção vazio:cheio consistente como o dos lotes anteriores.
[0025] Em determinadas modalidades, para os métodos revelados no presente documento, o uso tanto de ELISA como CryoTEM dá como resultado um método que pode ser aplicado para todos os serotipos do AAV independente do DNA do vetor. Isto é vantajoso para permitir o ensaio a ser realizado sobre todas as plataformas.
[0026] Em determinadas modalidades, para os métodos, frações ou preparações reveladas no presente documento, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios na preparação ou fração do AAV em comparação com capsídeos vazios é desde aproximadamente 40% até aproximadamente 100%. Em determinada modalidade, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é desde aproximadamente 40% até aproximadamente 95%, desde aproximadamente 40% até aproximadamente 90%, desde aproximadamente 40% até aproximadamente 85%, desde aproximadamente 40% até aproximadamente 80%, desde aproximadamente 45% até aproximadamente 75%, desde aproximadamente 50% até aproximadamente 70%, ou desde aproximadamente 55% até aproximadamente 65%. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 60% do capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, pelo menos de aproximadamente 40%, pelo menos de aproximadamente 50%, pelo menos de aproximadamente 60%, pelo menos de aproximadamente 70%, pelo menos de aproximadamente 80%, pelo menos de aproximadamente 85%, pelo menos de aproximadamente 90%, pelo menos de aproximadamente 91%, pelo menos de aproximadamente 92%, pelo menos de aproximadamente 93%, pelo menos de aproximadamente 94%, pelo menos de aproximadamente 95%, pelo menos de aproximadamente 96%, pelo menos de aproximadamente 97%, pelo menos de aproximadamente 98%, pelo menos de aproximadamente 99%, ou pelo menos de aproximadamente 100% do capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, os métodos como revelados no presente documento são usados para gerar preparações ou frações do AAV com quantidades consistentes de capsídeos cheios entre lotes de preparações ou frações do AAV.
[0027] Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a concentração das preparações do AAV é entre aproximadamente 1x1010 cp/ml e aproximadamente 1x1020 cp/ml. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a concentração das preparações do AAV é entre aproximadamente 1x1011 cp/ml e aproximadamente 1x1019 cp/ml, aproximadamente 1x1012 cp/ml e aproximadamente 1x1018 cp/ml, aproximadamente 1x1013 cp/ml e aproximadamente 1x1017 cp/ml, ou aproximadamente 1x1014 cp/ml e aproximadamente 1x1016 cp/ml. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a concentração das preparações do AAV é entre aproximadamente 1x1012 cp/ml e aproximadamente 1x1015 cp/ml, aproximadamente 1x1013 cp/ml e aproximadamente 1x1015 cp/ml, ou aproximadamente 1x1012 cp/ml e aproximadamente 1x1013 cp/ml. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a concentração das preparações do AAV é entre aproximadamente 1x1014 cp/ml e aproximadamente 5x1014 cp/ml, aproximadamente 2x1014 cp/ml e aproximadamente 3x1014 cp/ml, ou aproximadamente 3.5x1014 cp/ml e aproximadamente 5x1015 cp/ml. Em determinadas modalidades, cp/ml pode ser capsídeos totais por ml ou capsídeos cheios por ml. Em determinadas modalidades, o cp/ml é capsídeos totais por ml.
[0028] Em determinadas modalidades, para os métodos ou preparações revelados no presente documento, a dose da preparação do AAV é entre aproximadamente 1 x 105 cp/kg e aproximadamente 1 x 1025 cp/kg. Em determinadas modalidades, para os métodos, frações, ou preparações revelados no presente documento, a dose da preparação ou fração do AAV é entre aproximadamente 1 x 1010 cp/kg e aproximadamente 1 x 1020 cp/kg. Em determinadas modalidades, para os métodos, frações, ou preparações revelados no presente documento, a dose da preparação ou fração do AAV é entre aproximadamente 1 x 1010 cp/kg e aproximadamente 1 x 1016 cp/kg. Em determinadas modalidades, cp/kg pode ser capsídeos totais por kg do sujeito ou capsídeos cheios por kg do sujeito. Em determinadas modalidades, o cp/kg é capsídeos totais por kg do sujeito.
[0029] Em determinadas modalidades, para todos os métodos revelados no presente documento, o sujeito é um animal humano ou não humano (por exemplo, chimpanzés e outras espécies de símios e macacos; animais de fazenda tais como gado, ovelha, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos tais como cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores tais como camundongo, ratos e porquinhos-da-índia; aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça tais como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, ou ganso). Em determinadas modalidades, o sujeito é um ser humano.
[0030] Em determinadas modalidades, para todos os métodos revelados no presente documento, o AAV é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, ou um vetor de AAV quimério. Em determinadas modalidades, o AAV é AAV8. Em determinadas modalidades, o AAV é AAV9. Em determinadas modalidades, o AAV é um AAV recombinante (rAAV). Em determinadas modalidades, o AAV é modificado por engenharia genética, quimicamente modificado, ou ambos.
[0031] Em determinados aspectos, a invenção inclui uma preparação ou fração do AAV, em que a concentração, dose, e/ou potência da fração ou preparação é medida mediante um ensaio de ELISA do AAV específico. Em determinados aspectos, a invenção inclui uma preparação ou fração do AAV, em que a concentração, dose, e/ou potência da fração ou preparação é medida mediante um ensaio de ELISA do AAV específico em combinação com um ensaio que mede a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios na preparação ou fração do AAV. Em determinados aspectos, a invenção inclui uma preparação ou fração do AAV, em que a concentração, dose, e/ou potência da fração ou preparação é medida mediante um ensaio de ELISA do AAV específico em combinação com CryoTEM. Em determinadas modalidades, a concentração, dose, e/ou potência da preparação do AAV não é medida através de qPCR.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0032] A figura 1 é um gráfico que compara a porcentagem de erros para a medição do número de vetor do AAV e conteúdo do genoma do vetor usando ELISA ou qPCR do antígeno, respectivamente. ELISA do AAV (QC (“Controle de Qualidade”)): n=60; AAV ELISA (R&D (“Pesquisa e Desenvolvimento”)): n=83; ITR-qPCR (R&D): n=64; FIX-qPCR (QC): n=40; FIX- qPCR (R&D): n=135.
[0033] A figura 2 é o resultado de um estudo de eletroforese de gel de agarose que examina a capacidade de ELISA e qPCR do antígeno para estimar a dose de capsídeos do AAV carregada no gel de agarose (2,0x1010 capsídeos/faixa).
[0034] A figura 3 é um gráfico que verifica o uso do método de ELISA do antígeno para determinar a dose da preparação do AAV administrada em um ensaio de biopotência in vivo usando um modelo de rato (n=7).
[0035] A figura 4 é um gráfico que compara a variação lote a lote de DNA monocatenário de FVIII de AAV8 usando ELISA do AAV específico versus ITR-qPCR. AAV8: Antígeno – Mediano : 3,03 cp/ml ± 0,66 cp/ml. ITR-qPCR – Mediano: 9,11 vg/ml ± 3,01 vg/ml.
[0036] A figura 5A-5B: A figura 5A é um gráfico que demonstra a proporção de genomas do vetor do AAV (vg) por partículas do capsídeo de ELISA do antígeno do AAV8 (cp). A figura 5B é um gráfico que demonstra a alta consistência de capsídeos na preparação do AAV “cheio” (por exemplo, veja-se o processo como discutido na publicação de pedido internacional n.º PCT/US2017/059967, incorporado no presente documento em sua totalidade para todos os fins).
[0037] A figura 6A-6C: A figura 6A é uma imagem de CryoTEM de um capsídeo do AAV8 cheio e um capsídeo do AAV8 vazio. A figura 6B é uma imagem de CryoTEM de um capsídeo do AAV8 oligomerizado (ou seja, o capsídeo do AAV está na forma de uma estrutura trimérica, que pode estar vazia ou cheia). A figura 6C é uma imagem de CryoTEM de um capsídeo do AAV8 quebrado.
[0038] A figura 7 é um gráfico de uma análise de fração do AAV8 que usa CryoTEM. As imagens de CryoTEM foram adquiridas a uma ampliação de 38k e submetidas a análise de densidade interna. A análise do componente principal para gerar os aglomerados de cada perfil de densidade radial de partículas do AAV revelou aglomerados de níveis de empacotamento: cheio (esquerda), azul (direito), indeterminado (meio) (marcas mais escuras indicam pontos de dados de sobreposição); Anéis tracejados: intervalos de confiança a 99%. 5 imagens analisadas, 1568 partículas.
[0039] A figura 8 é um gráfico que valida o uso de CryoTEM para medir a porcentagem de capsídeos do vetor do AAV8 cheio.
[0040] A figura 9 é um gráfico que demonstra a correlação de genomas do vetor em relação com partículas de capsídeo com porcentagem de capsídeos cheios.
[0041] A figura 10 é um gráfico que demonstra a influência da porcentagem de partículas do capsídeo do AAV8 cheio na potência in vivo em um modelo de rato deficiente-fator IX. Amostras de plasma foram tomadas após 14 dias e a atividade de coagulação do fator IX humano foi medida.
[0042] A figura 11 é um gráfico que demonstra a influência da porcentagem de partículas do capsídeo do AAV8 cheio na biopotência in vitro. A biopotência foi medida em um ensaio baseado em células, relacionado a cp, e traçado contra a porcentagem de partículas cheias.
[0043] A figura 12 é um gráfico que compara a variação lote a lote de DNA monocatenário de FVIII de AAV8 usando ELISA do AAV específico versus ITR-qPCR para lotes 17004-17013 (veja-se a tabela 7).
[0044] A figura 13 é um gráfico que demonstra a alta consistência de capsídeos na preparação do AAV “completo” (por exemplo, veja-se o processo como discutido na publicação de pedido internacional n.º PCT/US2017/059967) para lotes 17004-17013 (veja-se a tabela 7).
[0045] As figuras adjuntas adicionais pretendem meramente esclarecer melhor a descrição e não apresentam nenhuma limitação no escopo da descrição ao menos que se reivindique o contrário.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0046] Proporcionam-se no presente documento métodos de medição dos atributos qualitativos e/ou de quantidade de preparações de vetor de terapia gênica. Em determinadas modalidades, as preparações de vetor de terapia gênica são preparações do AAV, por exemplo, AAV8 ou AAV9. Todos os métodos revelados no presente documento podem ser usados em ou para gerar uma preparação do AAV.
[0047] O uso de vetores de terapia gênica depende de pelo menos duas atividades biológicas para sua potência: 1) a capacidade de transferir uma sequência de DNA a uma célula, e 2) o efeito biológico da sequência genética expressada. Com o fim de alcançar estas atividades, é requerida a concentração ou dose de capsídeos do AAV apropriada que contém a sequência genômica. Isto é devido a que os capsídeos “vazios” não podem proporcionar um benefício terapêutico associado com produção transgênica. Portanto, é importante medir de maneira precisa a concentração ou dose da preparação do AAV para garantir que o número apropriado e/ou consistente de partículas do vetor do AAV cheio seja administrado. Isto é especialmente verdade devido a que para as proteínas recombinantes um coeficiente de variância apropriado entre lotes/quantidades de dosagem é de ≤ 10% a 20%, com ≤ 10% sendo mais ideal. A determinação apropriada da dose é importante para verificar a potência da preparação do AAV. Isto é devido a que a potência é determinada mediante curvas de resposta à dose graduais ou quantais. Se a dose é imprecisa, a imprecisão será transferida à potência medida. A potência imprecisa pode levar tratamento insuficiente ou excessivo da população de pacientes.
[0048] Tal como se usa no presente documento, os termos “capsídeo”, “partícula do capsídeo”, e “partícula” são usados de maneira intercambiável e se referem a uma partícula do AAV composta de pelo menos um invólucro do capsídeo do AAV intacto.
[0049] Tal como se usa no presente documento, o termo “vazio” com respeito ao AAV ou capsídeos do AAV se refere àqueles que não têm o genoma completo (ou seja, cheio) do vetor. O AAV vazio ou capsídeos do AAV vazios ou partículas do AAV vazio não podem proporcionar um benefício terapêutico. Tal como se usa no presente documento, o termo “capsídeos do AAV cheios” com respeito ao AAV ou capsídeos do AAV ou partículas do AAV se referem àqueles que contêm uma maioria do genoma do vetor completo. Os capsídeos do AAV cheios podem proporcionar um benefício terapêutico a pacientes receptores. Em determinadas modalidades, “cheio” também pode incluir “DNA do vetor incompleto” ou “DNA do vetor truncado”. Em determinadas modalidades, DNA do vetor completo versus incompleto e/ou truncado pode ser diferenciado com métodos analíticos adicionais. Tais métodos incluem, sem limitação, dimensionamento de DNA mediante eletroforese capilar, AUC (ultracentrifugação analítica), % de DNA em agarose (nativo ou alcalino), gel, transferência de Southern, hibridização dot-blot, espectrofotometria UV, cromatografia de troca aniônica fraca, e espectrometria de massas (Veja- se Resolving Adeno-Associated Viral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry Elizabeth E. Pierson et.al Anal. Chem., 2016, 88 (13), páginas 6718–6725, que é incorporado no presente documento em sua totalidade para todos os fins).
[0050] De acordo com as diretrizes do FDA publicado em janeiro de 2011 (Orientação para Indústria: Testes de Potência para Produtos de Terapia Celular e Genética), existem três maneira de medir a potência tal como: ensaios 1) biológicos in vivo; 2) não biológicos in vitro; e 3) múltiplos testes. Sem embargo, ensaios biológicos levam a uma grande quantidade de variabilidade devido à dosagem, ensaio, e variabilidade de leitura. Os ensaios não biológicos também têm problemas. Por exemplo, PCR quantitativo (qPCR) mede apenas o gene de interesse. Portanto, o uso de qPCR pode levar à determinação imprecisa da potência da preparação do AAV final devido à inclusão de capsídeos inoperáveis tais como aqueles que são oligomerizados, fraturados, e/ou contêm mais de uma cópia de DNA no cálculo da dose. Os capsídeos inoperáveis não transduziriam de maneira efetiva as células. Além disso, qPCR também é limitado devido a sua variabilidade intra e entre ensaio inerentemente alta (ou seja, alta variabilidade até 0,5 etapas de log) que pode levar à determinação de potência imprecisa. Se a concentração, dose e/ou potência não é determinada de maneira precisa, pacientes podem receber doses amplamente variadas de lote a lote e/ou de tratamento a tratamento. Sobre-estimar a dose ou potência pode levar a um tratamento inadequado da doença e/ou desordem. Sub-estimar a dose ou potência pode levar a efeitos colaterais (por exemplo, sobrecorreção (por exemplo, coágulos sanguíneos) ou uma resposta imune causada por um alto número de partículas de capsídeo no corpo).
[0051] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona métodos de quantificação da concentração, dose, e/ou potência de uma preparação do AAV, que compreende quantificar o número total de capsídeos do AAV em uma preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende a) quantificar o número total de capsídeos do AAV e opcionalmente b) avaliar e/ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV.
[0052] Em determinadas modalidades, a etapa de quantificação compreende determinar o número total de capsídeos do AAV através de ELISA, SPR (ressonância de plasma de superfície), tecnologia de fluorimetria de varredura diferencial, métodos de quantificação imunológica, ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, a etapa de quantificação compreende determinar o número total de capsídeos do AAV através de um ELISA do AAV específico. Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA pode ser um ensaio de ELISA sanduíche, ELISA direto, ELISA indireto, ou de ELISA competitivo. Em determinadas modalidades, para os métodos revelados no presente documento, o ensaio de ELISA do AAV específico é um ensaio de ELISA sanduíche específico para um antígeno do AAV.
[0053] Em determinadas modalidades, o método para avaliação ou confirmação da porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) em uma preparação ou fração do AAV pode ser microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM), TEM de coloração negativa, separação cromatográfica de capsídeos cheios e vazios (SEC, IEX, HIC, etc.), eletroforese capilar, ultracentrifugação analítica, ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, o método para avaliação ou confirmação da porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) em uma preparação ou fração do AAV pode ser CryoTEM. Em determinadas modalidades, os métodos incluem tanto um ELISA do AAV específico como CryoTEM.
[0054] Os métodos revelados no presente documento mede de maneira precisa a potência dentro de este intervalo estreito de variabilidade. Em determinadas modalidades, os métodos revelados dão como resultado um coeficiente de variação entre aproximadamente 30% e aproximadamente 1%, aproximadamente 27% e aproximadamente 2%, aproximadamente 25% e aproximadamente 5%, aproximadamente 22% e aproximadamente 7%, aproximadamente 20% e aproximadamente 10%, ou aproximadamente 17% e aproximadamente 12%. Em determinadas modalidades, os métodos revelados dão como resultado um coeficiente de variação de ≤ aproximadamente 30%, ≤ aproximadamente 29%, ≤ aproximadamente 28%, ≤ aproximadamente 27%, ≤ aproximadamente 26%, ≤ aproximadamente 25%, ≤ aproximadamente 24%, ≤ aproximadamente 23%, ≤ aproximadamente 22%, ≤ aproximadamente 21%, ≤ aproximadamente 20%, ≤ aproximadamente 19%, ≤ aproximadamente 18%, ≤ aproximadamente 17%, ≤ aproximadamente 16%, ≤ aproximadamente 15%, ≤ aproximadamente 14%, ≤ aproximadamente 13%, ≤ aproximadamente 12%, ≤ aproximadamente 11%, ≤ aproximadamente 10%, ≤ aproximadamente 9%, ≤ aproximadamente 8%, ≤ aproximadamente 7%, ≤ aproximadamente 6%, ≤ aproximadamente 5%, ≤ aproximadamente 4%, ≤ aproximadamente 3%, ≤ aproximadamente 2%, ≤ 1%, mas em todos os casos ≥ 0.
[0055] Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com aproximadamente de 10% a aproximadamente 80% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR. Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com aproximadamente de 10% a aproximadamente 75%, aproximadamente de 10% a aproximadamente 70%, aproximadamente de 10% a aproximadamente 65%, aproximadamente de 15% a aproximadamente 60%, aproximadamente de 15% a aproximadamente 55%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 48%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 46%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 44%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 42%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 38%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 36%, aproximadamente de 20% a aproximadamente 34%, ou aproximadamente de 20% a aproximadamente 32% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR.
Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com aproximadamente de 20% a aproximadamente 33% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR.
Em determinadas modalidades, os métodos revelados no presente documento que compreendem ELISA dão como resultado uma preparação do AAV com pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 11%, pelo menos aproximadamente 12%, pelo menos aproximadamente 13%, pelo menos aproximadamente 14%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 16%, pelo menos aproximadamente 17%, pelo menos aproximadamente 18%, pelo menos aproximadamente 19%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 21%, pelo menos aproximadamente 22%, pelo menos aproximadamente 23%, pelo menos aproximadamente 24%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 26%, pelo menos aproximadamente 27%, pelo menos aproximadamente 28%, pelo menos aproximadamente 29%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 31%, pelo menos aproximadamente 32%, pelo menos aproximadamente 33%, pelo menos aproximadamente 34%, pelo menos aproximadamente 35%, pelo menos aproximadamente 36%, pelo menos aproximadamente 37%, pelo menos aproximadamente 38%, pelo menos aproximadamente 39%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 41%, pelo menos aproximadamente 42%, pelo menos aproximadamente 43%, pelo menos aproximadamente 44%, pelo menos aproximadamente 45%, pelo menos aproximadamente 46%, pelo menos aproximadamente 47%,
pelo menos aproximadamente 48%, pelo menos aproximadamente 49%, ou pelo menos aproximadamente 50% menos variabilidade da concentração, dose, e/ou potência em comparação com um método que usa qPCR.
[0056] Em determinadas modalidades, os métodos compreendem testar uma preparação do AAV através de um ELISA do AAV específico. Em determinadas modalidades, o ELISA do AAV específico é suficiente para proporcionar uma leitura representativa sobre a dose ou potência da preparação do AAV, devido a que a maioria dos capsídeos na preparação do AAV é capsídeos completos. Por exemplo, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é uma maioria de desde aproximadamente 50% até aproximadamente 100%. Em determinadas modalidade, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é de desde aproximadamente 50% até aproximadamente 95%, aproximadamente 50% até aproximadamente 90%, aproximadamente 50% até aproximadamente 85%, aproximadamente 50% até aproximadamente 80%, aproximadamente 55% até aproximadamente 50%, aproximadamente 60% até aproximadamente 80%, ou aproximadamente 65% até aproximadamente 75%. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou pelo menos aproximadamente 100% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 60% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, o ELISA do AAV específico é suficiente para proporcionar uma leitura representativa sobre a potência da preparação do AAV, devido a que a proporção de capsídeos cheios versus vazios na preparação do AAV é consistente de lote a lote. Em determinadas modalidades, consistente se refere a um coeficiente de variação (CV) de aproximadamente 0% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2% a aproximadamente 12%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, aproximadamente 7% a aproximadamente 9%. Em determinadas modalidades, consistente se refere a um CV de aproximadamente 15% ou menos, aproximadamente 12% ou menos, aproximadamente 10% ou menos, aproximadamente 9% ou menos, aproximadamente 8% ou menos, aproximadamente 7% ou menos, aproximadamente 6% ou menos, aproximadamente 5% ou menos, aproximadamente
4% ou menos, aproximadamente 3% ou menos, aproximadamente 2% ou menos, ou aproximadamente 1% ou menos. Em determinadas modalidades, consistente se refere a um CV de aproximadamente 1% ou menos. Em determinadas modalidades, o ELISA do AAV específico em combinação com CryoTEM é requerido para testar a potência da preparação do AAV.
[0057] Em determinadas modalidades, os métodos compreendem testar uma preparação ou fração do AAV através de CryoTEM. Em determinadas modalidades, a CryoTEM é suficiente para proporcionar uma leitura representativa sobre a potência da preparação do AAV. Em determinadas modalidades, a CryoTEM em combinação com ELISA do AAV específico é requerida para testar a potência da preparação do AAV.
[0058] Em determinadas modalidades, a preparação do AAV produzida e/ou medida através dos métodos da presente descrição é adequada para a administração a um sujeito. Os vetores do AAV aplicáveis são descritos em mais detalhes a seguir. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV produzida através dos métodos da presente descrição é estéril e/ou de qualidade de boas práticas de fabricação (GMP). Em determinadas modalidades, a preparação do AAV produzida através dos métodos da presente descrição conforma aos requisitos expostos no capítulo da farmacopeia estadunidense 1046 ou a farmacopeia europeia sobre produtos medicinais de terapia gênica ou como exigido pela Administração de Alimentos e Drogas dos EUA (USFDA) ou uma Agência Europeia de Medicamentos (EMA).
[0059] Tal como se usam no presente documento, os métodos podem ser usados sobre uma fração do AAV e/ou preparação do AAV. Os termos “preparação” e “fração” podem ser usados de maneira intercambiável neste pedido. Em determinadas modalidades, o termo “fração” pode significar uma amostra ou lote de AAV que pode ser usado para gerar uma “preparação” de AAV final que será administrada a um sujeito. Por exemplo, a fração do AAV pode submeter-se a processamento adicional, purificação, ou ajuste de volume antes da formação da preparação do AAV final.
[0060] Métodos quantitativos e/ou qualitativos
[0061] Os métodos da presente descrição compreendem uma ou mais etapas de controle de qualidade, por exemplo, etapas para medir a concentração, dose, e/ou potência das frações ou preparações do AAV obtidas após uma ou mais etapas (por exemplo, após cada etapa) do processo de purificação, incluindo a etapa final para fazer uma preparação para administração.
[0062] Os métodos da presente descrição podem compreender um ensaio de ELISA, específico para AAV (por exemplo, antígeno do AAV), para a quantificação do número de capsídeos do AAV. Em determinadas modalidades, o ensaio de ELISA pode incluir, mas não é limitado a, um ensaio imunosorvente, ELISA direto, ELISA indireto, ELISA sanduíche, e/ou um ELISA competitivo. Em determinadas modalidades, o ELISA é um ELISA sanduíche. Um exemplo não limitativo de um ensaio de ELISA se apresenta no exemplo 1.
[0063] Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, ou um antígeno do AAV quimérico. Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é um antígeno do AAV8. Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é de um AAV recombinante (rAAV). Em determinadas modalidades, o antígeno do AAV é de um AAV geneticamente modificado por engenharia, ou AAV quimicamente modificado, ou ambos.
[0064] Em determinadas modalidades, o ELISA compreende um anticorpo específico para um epítopo do AAV. Em determinadas modalidades, o epítopo do AAV é um epítopo conformacional presente nos capsídeos do AAV montados. Em determinadas modalidades, o epítopo do AAV é um epítopo linear presente nos capsídeos do AAV montados. Exemplos de tais epítopos incluem, mas não são limitados a, proteínas do virião do capsídeo VP1, VP2, e/ou VP3. Em determinadas modalidades, os AAVs são geneticamente modificados por engenharia para expressar proteínas do virião adicionais sobre a superfície do capsídeo, e as proteínas modificadas por engenharia podem ser usadas/detectadas em um ensaio de ELISA. Em determinadas modalidades, os AAV são modificados quimicamente para expressar variantes da proteína do virião, que pode ser usada/detectada em um ensaio de ELISA (por exemplo, VP1’, VP2’, VP3’, etc…). Em determinadas modalidades, os anticorpos identificam proteínas do virião do capsídeo específicas do serotipo.
[0065] O ELISA pode substituir qPCR como uma maneira de determinar a dose e/ou potência de uma preparação ou fração do AAV. Tal como se demonstra na figura 1, a técnica ELISA da invenção tem de maneira significante menos variabilidade que o método de qPCR. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem avaliar uma preparação ou fração do AAV através de um ELISA do AAV específico. Em determinadas modalidades, todos os métodos revelados no presente documento não incluem uma etapa de qPCR.
[0066] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após a ultracentrifugação através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após a filtração de profundidade através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após a concentração de uma preparação ou fração do AAV usando um sistema de ultra/diafiltração através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após uma etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF) através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após cromatografia de troca aniônica negativa (AEX) através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após uma etapa de polimento através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação do AAV purificada através de um ELISA do AAV específico para determinar o número de capsídeos do AAV na preparação do AAV.
[0067] Métodos adicionais para a quantificação do número de capsídeos do AAV incluem,mas não são limitados a, ressonância de plasma de superfície (SPR) (por exemplo BIACORE, OCTET), fluorimetria de varredura diferencial (por exemplo, Prometheus NT48, Nanotemper), imunoensaio magnético (MIA), e imunoensaio doador de enzimas clonadas (CEDIA). Estes métodos podem ser usados além de ou em lugar do ensaio de quantificação de ELISA.
[0068] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem medir capsídeos do AAV cheios versus vazios (por exemplo, porcentagem de proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios). Métodos para avaliação ou confirmação da porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios em uma preparação ou fração do AAV incluem, mas não são limitados a, microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM), TEM de coloração negativa, eletroforese capilar, ultracentrifugação analítica, ou combinações dos mesmos.
[0069] Em determinadas modalidades, o método para a medição de capsídeos do AAV cheios versus vazios é CryoTEM (veja-se afigura 6). Em determinadas modalidades, o método envolve o uso tanto de CryoTEM como um ELISA do AAV específico tal como se descreveu anteriormente. Em determinadas modalidades, o ELISA é um ELISA sanduíche. Em determinadas modalidades, o ELISA sanduíche compreende um anticorpo específico para um epítopo do AAV. Em determinadas modalidades, o epítopo do AAV é um epítopo conformacional presente nos capsídeos do AAV montados. Um método não limitativo de medição da quantidade de capsídeos cheios versus vazios através de CryoTEM é descrito no presente documento como o exemplo 2.
[0070] Uma vantagem do uso de CryoTEM é que não há necessidade de uma coloração negativa. CryoTEM também dá como resultado a capacidade de quantificar a quantidade de capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, o uso de CryoTEM dá como resultado a não sobre-estimação da quantidade de capsídeo do AAV cheio devido a um sinal falso-positivo.
[0071] Os métodos da presente descrição compreendem um método de avaliação do número ou uma porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus vazios. Em determinadas modalidades, os métodos compreendem CryoTEM. Em determinadas modalidades, os métodos compreendem: (i) embutir uma preparação ou fração do AAV em um substrato em um suporte inerte; (ii) congelar de maneira instantânea a preparação ou fração do AAV embutida; (iii) obter imagens da preparação ou fração do AAV embutida usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica; e (iv) quantificar a porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus capsídeos do AAV vazios.
[0072] Para a etapa (i), exemplos de substratos adequados para o seu uso no método inclui, mas não é limitado a gelo não cristalino, amorfo. Exemplos de suporte inerte adequado para o seu uso no método inclui, mas não é limitado a um filme de carbono, resinas termoplásticas, e poli(vinilformal) (por exemplo, polímeros formados a partir de poli(álcool vinílico) e formaldeído como copolímeros com poli(acetato vinílico), tal como, mas não é limitado a, Formvar ou Vinylec, poli(vinilformal) estabilizado com carbono, monóxido de silício sobre poli(vinilformal), filme de carbono puro, carbono tipo-A: filmes de suporte de carbono (por exemplo, poli(vinilformal) removíveis sobre o lado oposto da grade), carbono tipo-B: filme de poli(vinilformal) (por exemplo, revestido com uma camada mais pesada de carbono), e monóxido de silício sobre carbono tipo-
A). Em determinadas modalidades, a etapa (i) anterior envolve a deposição da amostra em um filme de carbono de apoio fino em uma temperatura (por exemplo, (−196ºC) ou abaixo) e ambiente controlado de umidade. Em determinadas modalidades, o nível de umidade pode ser humidade relativa. Para a etapa (ii), uma amostra pode ser congelada de maneira instantânea. Em determinadas modalidades, o congelamento instantâneo pode envolver o uso de etano líquido, nitrogênio líquido, propano líquido, ou hélio perto da temperatura do líquido de nitrogênio. Por exemplo, o recipiente de etano líquido, nitrogênio líquido, propano líquido, ou hélio está rodeado por nitrogênio líquido.
[0073] Em determinadas modalidades, a preparação ou fração do AAV é congelada de maneira muito rápida (por exemplo, a de 104 a 106 K por segundo) que cristais de gelo não podem ser formados. Em determinadas modalidades, o gelo amorfo é produzido ou mediante esfriamento rápido da água líquida ou mediante a compressão o gelo comum a temperaturas baixas. Em determinadas modalidades, após se remover o excesso da preparação ou fração do AAV deixando algum espécime aderido, o grau é vitrificado em etano líquido e logo é armazenado em nitrogênio líquido. Para a discussão de etapas adicionais para realizar a CryoTEM, veja-se Cabra e Samso, J. Visualized Experiments, (2015) 95(e52311):1-11, incorporado como referência no presente documento em sua totalidade para todos os fins.
[0074] A análise de CryoTEM de partículas de AAV pode ser utilizada para avaliar a morfologia do espécime global, ou seja presença de diversas morfologias de AAV (em geral incluindo partículas de AAV esféricas e deformadas, estruturas da subunidade e morfologias menos definidas estruturalmente maiores). A figura 6A proporciona um exemplo de como se pode discernir visualmente partícula do AAV “cheia” versus “vazia”. Por exemplo, o capsídeo cheio demonstra uma densidade interna com limite não distinto entre o invólucro e o núcleo. Os capsídeos do AAV que demonstram um invólucro externo distinto e densidade interna mínima são classificados como capsídeos vazios.
[0075] CryoTEM também pode ser usada para avaliar capsídeos indeterminados. As figuras 6B e 6C proporcionam exemplos de capsídeos deformados/indeterminados que não seriam incluídos como capsídeos cheios. Por exemplo, CryoTEM pode ser usada para contar capsídeos “cheios”, “vazios” e “indeterminados”.
[0076] CryoTEM também pode ser usada para determinar o nível de empacotamento das partículas mediante ou partículas de classificação de maneira manual ou uso de uma metodologia de análise de imagem automatizada.
[0077] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após ultracentrifugação através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após filtração de profundidade através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após a concentração de uma preparação ou fração do AAV usando um sistema de ultra/diafiltração através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após uma etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF) através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após cromatografia de troca aniônica negativa (AEX) através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após uma etapa de polimento através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação do AAV purificada através de CryoTEM para determinar a quantidade e/ou qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV.
[0078] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após ultracentrifugação através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após filtração de profundidade através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após a concentração de uma preparação ou fração do AAV usando um sistema de ultra/diafiltração através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após uma etapa de filtração de fluxo tangencial (TFF) através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após cromatografia de troca aniônica negativa (AEX) através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação ou fração do AAV obtida após uma etapa de polimento através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem testar uma preparação do AAV purificada através de um ELISA do AAV específico e CryoTEM para determinar a quantidade e qualidade dos capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV.
[0079] A ultracentrifugação analítica (AUC) pode separar proteínas de acordo com o coeficiente de sedimentação. Para as proteínas idênticas, o coeficiente de sedimentação pode estar correlacionado ao status de agregação. Em resumo, as amostras são diluídas com o correspondente tampão da amostra e logo transferidas a conjunto de células com janelas de quartzo incorporadas e carregadas no rotor, que então são giradas a uma velocidade constante. Moléculas de proteína de diferentes tamanhos migram a uma velocidade de sedimentação diferente para a parte inferior da célula e são monitoradas de maneira contínua durante a centrifugação mediante detecção UV a 280 nm. O conjunto de dados coletados permite uma análise computacional, que deconvoluta os processes de sedimentação e difusão, dando como resultado uma distribuição de coeficiente de sedimentação diferencial c(s). Isto resolve as diferentes espécies da amostra, e apresenta os seus valores s e populações. A distribuição de coeficientes de sedimentação é integrada e as porcentagens da área relativa assim como os valores S do pico máximo são dados como resultados da análise.
[0080] Preparação do AAV
[0081] Uma preparação do AAV produzida por um método da presente descrição é proporcionada adicionalmente no presente documento. Em determinadas modalidades, o método para a produção de uma preparação do AAV, que compreende: (i) transfectar células hospedeiras com pelo menos um plasmídeo que compreende o gene de interesse; (ii) coletar o sobrenadante ou suspensão celular da cultura celular que compreende capsídeos do AAV para criar uma preparação ou fração do AAV; (iii) quantificar o número total de capsídeos do AAV na preparação ou fração do AAV usando um ensaio de ELISA do AAV específico; e (iv) preparar uma preparação do AAV com uma concentração desejada baseada no número total de capsídeos do AAV determinado na etapa (iii). Em determinadas modalidades, o método compreende concentrar a fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende remover pelo menos uma porção de capsídeos vazios da fração do AAV. Em determinadas modalidades, a quantidade de capsídeos vazios são removidos para criar uma preparação ou fração do AAV com uma concentração específica de capsídeos cheios e/ou uma proporção específica de capsídeos cheios:vazios. Em determinada modalidade, a preparação ou fração do AAV é diluída com o tampão apropriado à dose desejada.
[0082] Em determinadas modalidades, o método compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação ou fração do AAV. Em determinadas modalidades, o método que compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) por CryoTEM. Em determinadas modalidades, a dose e/ou potência não é determinada por qPCR. Em determinadas modalidades, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é aproximadamente de 40% a aproximadamente 100%. Em determinada modalidade, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é de desde aproximadamente 40% até aproximadamente 95%, aproximadamente 40% até aproximadamente 90%, aproximadamente 40% até aproximadamente 85%, aproximadamente 40% até aproximadamente 80%, aproximadamente 45% até aproximadamente 75%, aproximadamente 50% até aproximadamente 70%, ou aproximadamente 55% até aproximadamente 65%. Em determinadas modalidades, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios está entre aproximadamente 60% e aproximadamente 80%. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 60% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou pelo menos aproximadamente 100% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, os métodos tal como se revelam no presente documento são usados para gerar frações ou preparações do AAV com quantidades consistentes de capsídeos cheios entre frações ou preparação do AAV.
[0083] Um método de administrar uma preparação do AAV produzida por um método da presente descrição é proporcionado adicionalmente no presente documento. Em determinadas modalidades, um método para a administração de uma preparação do AAV a um sujeito em necessidade da mesma, que compreende (i) obter uma preparação do AAV purificada; (ii) medir a concentração de capsídeos do AAV da preparação do AAV purificada usando um ensaio de ELISA do AAV específico; (iii) administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva da preparação do AAV purificada ao sujeito. Em determinadas modalidades, a preparação nas etapas (i) e (ii) é uma fração do AAV que pode ser usada para gerar uma preparação do AAV final, em que a fração do AAV é purificada ou diluída adicionalmente para formar a preparação do AAV para as etapas (i), (ii), e/ou (iii). Em determinadas modalidades, a concentração, dose, e/ou potência da preparação do AAV purificada é medida mediante quantificação do número total de capsídeos do AAV na preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método que compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) é CryoTEM. Em determinadas modalidades, a concentração, dose, e/ou potência não é determinada por qPCR. Em determinadas modalidades, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é aproximadamente de 40% a aproximadamente 100%. Em determinada modalidade, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é desde aproximadamente 40% até aproximadamente 95%, aproximadamente 40% até aproximadamente 90%, aproximadamente 40% até aproximadamente 85%, aproximadamente 40% até aproximadamente 80%, aproximadamente 45% até aproximadamente 75%, aproximadamente 50% até aproximadamente 70%, ou aproximadamente 55% até aproximadamente 65%. Em determinadas modalidades, a porcentagem de capsídeos do
AAV cheios está entre aproximadamente 60% e aproximadamente 80%. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 60% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou pelo menos aproximadamente 100% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios.
[0084] Um método de administração de uma preparação do AAV produzida por um método da presente descrição é proporcionado adicionalmente no presente documento. Em determinados aspectos, os métodos da invenção envolvem a administração de uma preparação do AAV da dose específica a um sujeito em necessidade da mesma, que compreende (i) obter uma preparação do AAV purificada; (ii) medir a concentração de capsídeos do AAV na preparação do AAV purificada usando um ensaio de ELISA do AAV específico; (iii) administrar uma dose específica da preparação do AAV ao sujeito. Em determinadas modalidades, a preparação nas etapas (i) e (ii) é uma fração do AAV que pode ser usada para gerar uma preparação do AAV final, em que a fração do AAV é purificada ou diluída adicionalmente para formar a preparação do AAV para as etapas (i), (ii), e/ou (iii). Em determinadas modalidades, o método compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV. Em determinadas modalidades, o método que compreende avaliar ou confirmar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) é CryoTEM. Em determinadas modalidades, a concentração, dose, e/ou potência não é determinada por qPCR. Em determinadas modalidades, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é aproximadamente de 40% a aproximadamente 100%. Em determinada modalidade, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é de desde aproximadamente 40% até aproximadamente 95%, aproximadamente 40% até aproximadamente 90%, aproximadamente 40% até aproximadamente 85%, aproximadamente 40% até aproximadamente 80%, aproximadamente 45% até aproximadamente 75%, aproximadamente 50% até aproximadamente 70%, ou aproximadamente 55% até aproximadamente 65%. Em determinadas modalidades, a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é entre aproximadamente 60% e aproximadamente 80%. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 60% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios. Em determinadas modalidades, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou pelo menos aproximadamente 100% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios.
[0085] Em determinadas modalidades, a potência de uma preparação do AAV pode ser verificada adicionalmente mediante um ensaio de biopotência in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, as etapas podem envolver, 1) determinar o conteúdo de AAV na preparação (por exemplo, através de ELISA); 2) determinar a porcentagem de capsídeos cheios (por exemplo, através de CryoTEM) e 3) confirmar a atividade biológica (por exemplo, através de um ensaio de biopotência in vivo e/ou in vitro).
[0086] Em determinadas modalidades, para os métodos, frações, ou preparações revelados no presente documento, a concentração das preparações do AAV é entre aproximadamente 1x1010 cp/ml e aproximadamente 1x1020 cp/ml. Em determinadas modalidades, para os métodos, frações, ou preparações reveladas no presente documento, a concentração das preparações do AAV é entre aproximadamente 1x1011 cp/ml e aproximadamente 1x1019 cp/ml, aproximadamente 1x1012 cp/ml e aproximadamente 1x1018 cp/ml, aproximadamente 1x1013 cp/ml e aproximadamente 1x1017 cp/ml, ou aproximadamente 1x1014 cp/ml e aproximadamente 1x1016 cp/ml. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a concentração da preparação do AAV é entre aproximadamente 1x1012 cp/ml e aproximadamente 1x1015 cp/ml, aproximadamente 1x1013 cp/ml e aproximadamente 1x1015 cp/ml, ou aproximadamente 1x1012 cp/ml e aproximadamente 1x1013 cp/ml. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a concentração da preparação do AAV é entre aproximadamente 1x1014 cp/ml e aproximadamente 5x1014 cp/ml, aproximadamente 2x1014 cp/ml e aproximadamente 3x1014 cp/ml, ou aproximadamente 3,5x1014 cp/ml e aproximadamente 5x1015 cp/ml. Em determinadas modalidades, cp/ml podem ser capsídeos totais por ml ou capsídeos cheios por ml. Em determinadas modalidades, o cp/ml é capsídeos totais per ml.
[0087] Em determinadas modalidades, a preparação do AAV compreende pelo menos aproximadamente 1012 de partículas do vírus (vp) produzidas a partir de aproximadamente 1000 L de matéria-prima (por exemplo, cultura celular) ou pelo menos aproximadamente 1013 de partículas do vírus (vp) produzidas a partir de aproximadamente 1000 L de matéria-prima (por exemplo, cultura celular).
[0088] Em determinadas modalidades, para os métodos ou preparações revelados no presente documento, a dose da preparação do AAV é entre aproximadamente 1 x 105 cp/kg e aproximadamente 1 x 1025 cp/kg. Em determinadas modalidades, para os métodos ou preparações revelados no presente documento, a dose da preparação do AAV é entre aproximadamente 1 x 106 cp/kg e aproximadamente 1 x 1024 cp/kg, aproximadamente 1 x 107 cp/kg e aproximadamente 1 x 1023 cp/kg , aproximadamente 1 x 108 cp/kg e aproximadamente 1 x 1022 cp/kg, aproximadamente 1 x 109 cp/kg e aproximadamente 1 x 1021 cp/kg, aproximadamente 1 x 1010 cp/kg e aproximadamente 1 x 1020 cp/kg, aproximadamente 1 x 1011 cp/kg e aproximadamente 1 x 1019 cp/kg, aproximadamente 1 x 1012 cp/kg e aproximadamente 1 x 1018 cp/kg, aproximadamente 1 x 1013 cp/kg e aproximadamente 1 x 1017 cp/kg, ou aproximadamente 1 x 1014 cp/kg e aproximadamente 1 x 1016 cp/kg. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a dose da preparação do AAV é entre aproximadamente 1 x 1012 cp/kg e aproximadamente 1 x 1020 cp/kg, aproximadamente 1 x 1013 cp/kg e aproximadamente 1 x 1019 cp/kg, aproximadamente 1 x 1014 cp/kg e aproximadamente 1 x 1018 cp/kg, ou aproximadamente 1 x 1015 cp/kg e aproximadamente 1 x 1017 cp/kg. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a dose da preparação do AAV é entre aproximadamente 1 x 1010 cp/kg e aproximadamente 1 x 1016 cp/kg. Em determinadas modalidades, para os métodos e preparações revelados no presente documento, a dose da preparação do AAV é pelo menos aproximadamente 1 x 106 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 107 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 108 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 109 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1010 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1011 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1012 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1013 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1014 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1015 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1016 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1017 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1018 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1019 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1020 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1021 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1022 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1023 cp/kg, pelo menos aproximadamente 1 x 1024 cp/kg, ou pelo menos aproximadamente 1 x 1025 cp/kg. Em determinadas modalidades, cp/kg pode ser capsídeos totais por kg do sujeito ou capsídeos cheios por kg do sujeito. Em determinadas modalidades, o cp/kg é capsídeos totais por kg do sujeito.
[0089] Em determinadas modalidades, a preparação do AAV da presente descrição é altamente pura, altamente potente e adequada para uso clínico em um sujeito. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV compreende partículas do capsídeo do AAV da população homogênea e alta pureza. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV compreende DNA de vetor de comprimento completo. Em modalidades a modo de exemplo, a preparação do AAV é substancialmente livre de contaminantes não desejados, incluindo, mas não limitado a, partículas do capsídeo do AAV que contêm DNA de vetor truncado ou incompleto, partículas do AAV com composição de proteína incompleta e estruturas oligomerizadas, ou vírus contaminantes, por exemplo, vírus com envelope de lípidos, não AAV. Em modalidades a modo de exemplo, a preparação do AAV contém uma alta quantidade de cDNA codificante da proteína de interesse. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV da presente descrição é adequada para a administração a um sujeito. Em determinadas modalidades, a preparação do AAV é estéril e/ou de qualidade de boas práticas de fabricação (GMP). Em determinadas modalidades, a preparação do AAV está em conformidade com os requisitos expostos no capítulo da farmacopeia estadunidense 1046 ou a farmacopeia europeia sobre produtos medicinais de terapia gênica ou como exigido pela Administração de Alimentos e Drogas dos EUA (USFDA) ou a Agência Europeia de Medicamentos (EMA). Em determinadas modalidades, a preparação do AAV é uma preparação pronta para uso para administração direta a um sujeito com de pouco a nenhum processamento ou manipulação.
[0090] Os termos “paciente” e “sujeito” são usados de maneira intercambiável e são usados em seu sentido convencional para referir a um organismo vivo que sofre de ou está propenso a um estado que pode ser prevenido ou tratado por administração da composição da presente descrição, e inclui animais tanto humanos como não humanos. Os exemplos de sujeitos incluem, mas não são limitados a, seres humanos, chimpanzés e outras espécies de símios e macacos; animais de fazenda tais como gado, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos tais como cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores tais como camundongos, ratos e porquinhos-da-índia; aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça tais como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, gansos, e similares. O termo não indica uma idade particular. Portanto, indivíduos adultos, juvenis e recém-nascidos são de interesse.
[0091] Fonte de AAV
[0092] Com respeito aos métodos da presente descrição, o AAV pode ser de qualquer serotipo do AAV. Em determinadas modalidades, o AAV descrito no presente documento são de serotipo do AAV1, serotipo do AAV2, serotipo do AAV3, serotipo do AAV4, serotipo do AAV5, serotipo do AAV6, serotipo do AAV7, serotipo do AAV8, serotipo do AAV9, serotipo do AAV10, ou vetor de AAV quimérios. Em determinadas modalidades, o AAV é de tipo natural. Em determinadas modalidades, o AAV é um AAV recombinante (rAAV). Em determinadas modalidades, o AAV é modificado por engenharia genética e/ou é quimicamente modificado. Em determinadas modalidades, o AAV compreende um capsídeo modificado, por exemplo, um capsídeo do AAV geneticamente modificado por engenharia ou quimicamente modificado. Em determinadas modalidades, o AAV é do serotipo do AAV8. Em determinadas modalidades, o AAV é do serotipo do AAV9.
[0093] Com respeito aos métodos da invenção, a fração do AAV é em aspectos a modo de exemplo uma fração do AAV concentrada. Em determinadas modalidades, a fração do AAV compreende pelo menos aproximadamente 1 x 1010, aproximadamente 1 x 1011, aproximadamente 1 x 1012, aproximadamente 1 x 1013, aproximadamente 1 x 1014, aproximadamente 1 x 1015, ou aproximadamente 1 x 1016, AAV capsídeos totais por mL. Em determinadas modalidades, a fração do AAV compreende pelo menos aproximadamente 1 x 1012 AAV de capsídeos totais por mL. Os capsídeos do AAV podem incluir capsídeos do AAV vazios e capsídeos do AAV cheios.
[0094] Em determinadas modalidades, o AAV representa uma preparação ou fração do AAV produzida por células hospedeiras transfectadas. Em determinadas modalidades, a preparação ou fração do AAV representa um sobrenadante coletado ou suspensão celular de uma cultura celular que compreende células hospedeiras transfectadas com um sistema de plasmídeo triplo, em que um plasmídeo do sistema compreende um gene ou cDNA de interesse, um plasmídeo codifica a proteína do capsídeo VP1, proteína do capsídeo VP2 e/ou proteína do capsídeo VP3. Em determinadas modalidades, VP1, VP2, e/ou VP3 são AAV8 VP1, VP2, e/ou VP3. A transfecção do plasmídeo tripla para fins de produção de rAAV é conhecida na técnica. Veja-se, por exemplo, Qu et al., 2015, citado anteriormente, e Mizukami et al., “A Protocol for AAV vector production and purification”. PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998; e Kotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011). Em determinadas modalidades, a transfecção pode ser levada a cabo usando compostos inorgânicos, por exemplo, fosfato de cálcio, ou compostos orgânicos, polietilenoimina (PEI), ou meios não químicos, por exemplo, eletroporação.
[0095] Em determinadas modalidades, as células hospedeiras são células aderentes. Em determinadas modalidades, as células hospedeiras são células em suspensão. Em determinadas modalidades, as células hospedeiras são células HEK293 ou células Sf9 (por exemplo, células Sf9 infectadas por baculovírus) ou HeLa ou BHK (sistema do vírus da herpes). Em determinadas modalidades, a cultura celular compreende meio de cultura que é livre de soro e proteína. Em determinadas modalidades, o meio é definido quimicamente e é livre de componentes derivados de animais, por exemplo, hidrolisados.
[0096] Em determinadas modalidades, a fração que compreende partículas do rAAV representa uma fração que compreende células HEK293 transfectadas com um sistema de plasmídeo triplo. Em determinadas modalidades, a fração que compreende partículas do AAV representa uma fração da coleta após aproximadamente de 2 a aproximadamente 7 dias após a transfecção das células HEK293 ou quando a cultura celular tem uma densidade celular de maior que ou aproximadamente de 5x106 células/mL e tem uma viabilidade celular de maior que ou aproximadamente de 50%.
[0097] Em determinadas modalidades, o AAV é preparado por uma transfecção de plasmídeo tripla seguido por coleta de desde um hasta 7 dias depois. Em determinadas modalidades, o AAV é preparado a partir perturbação celular.
[0098] Em determinadas modalidades, o AAV é preparado pelo seguinte: As células HEK293 são aderentes e crescem em um meio de cultura disponível comercialmente que pode ser definido quimicamente e pode ser livre de componentes derivados de animais, por exemplo, soro e proteínas. As células são cultivadas a uma densidade celular de aproximadamente 3 x 106 a aproximadamente 12 x 106 células/ml, por exemplo, aproximadamente 6 x 106 a aproximadamente 10 x 106 células/ml. Então as células são divididas em aproximadamente uma proporção 1:2 de modo que a densidade celular é aproximadamente de 3 - 5 x 106 células/ml. Após a divisão, as células podem ser transfectadas com três plasmídeos que incluem (1) um plasmídeo auxiliar que pode proporcionar uma ou mais funções virais do auxiliar essenciais para a produção do AAV, (2) um plasmídeo que codifica para um ou mais genes envolvidos na geração do capsídeo, replicação e empacotamento do vírus, e (3) um plasmídeo que compreende um gene de interesse (GOI) a ser empacotado na partícula de rAAV resultante. Por exemplo, o GOI pode ser um DNA do vetor que compreende o fator IX Padua da coagulação humana em uma forma auto complementar monocatenária, com o DNA do vetor. Como outro exemplo, o GOI pode ser um DNA do vetor que compreende o fator IX Padua da coagulação humana em uma forma auto complementar bicatenária, com o DNA do vetor que tem um comprimento completo de 4,8 kB. Como outro exemplo, o GOI pode ser um DNA do vetor que compreende um fator VIII de coagulação excluído pelo domínio B em uma forma auto complementar monocatenária, com o DNA do vetor que tem um comprimento completo de 4,8 kB. Outro GOI pode ser usado. A transfecção pode ser levada a cabo de maneira transitória, tal como usando polímeros catiônicos. Antes da eluição, a linha celular HEK293 pode ser cultivada por pelo menos aproximadamente 1 dia, por exemplo, 3-5 dias, antes da coleta.
[0099] Em determinadas modalidades, a fração que compreende partículas do AAV é descrita no pedido provisional estadunidense n.º 62/417.775 e a publicação de pedido internacional n.º PCT/US2017/059967, cada um dos quais são incorporados no presente documento em sua totalidade.
[00100] Etapas de purificação
[00101] Os métodos da presente descrição compreendem qualquer combinação de etapas reveladas no presente documento, e podem ser combinados opcionalmente com uma ou mais etapas adicionais.
[00102] Em modalidades a modo de exemplo, os métodos da presente descrição compreendem uma etapa de ultracentrifugação durante a qual um gradiente de densidade é formado. Apesar de não querer estar ligado a uma teoria, acredita-se que a etapa de ultracentrifugação permite que os capsídeos do AAV cheios sejam separados dos capsídeos do AAV vazios. Os protocolos dos exemplos de ultracentrifugação podem ser encontrados em, por exemplo, o documento
WO2008135229 e a publicação de PCT/US17/59967, cada um dos quais são incorporados no presente documento em sua totalidade para todos os fins.
[00103] Os métodos da presente descrição podem compreender ainda outras etapas adicionais, que podem aumentar adicionalmente a pureza do AAV e remover outros componentes não desejados e/ou concentrar a fração e/ou condição da fração para uma etapa posterior.
[00104] Em determinadas modalidades, o método compreende um etapa de filtração de profundidade. Em determinadas modalidades, o método compreende submeter uma fração do sobrenadante da cultura da célula HEK293 transfectada a filtração de profundidade usando um filtro que compreende celulose e perlites e que tem uma permeabilidade mínima de aproximadamente 500 L/m2. Em determinadas modalidades, o método compreende ainda o uso de um filtro que tem um tamanho de poro mínimo de aproximadamente 0,2 m. Em determinadas modalidades, a filtração de profundidade é seguida por filtração através do filtro que tem um tamanho de poro mínimo de aproximadamente 0,2 m. Em determinadas modalidades, um ou ambos dos filtros de profundidade e filtros que têm um tamanho de poro mínimo de aproximadamente 0,2 m são lavados e as lavagens são coletadas. Em determinadas modalidades, as lavagens são agrupadas em conjunto e combinadas com a filtragem obtida com filtração de profundidade e filtração com o filtro que tem um tamanho de poro mínimo de aproximadamente 0,2 m. Em determinadas modalidades, a etapa filtração de profundidade e outra etapa de filtração ocorre antes da etapa de ultracentrifugação descrita no presente documento.
[00105] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem uma ou mais etapas de cromatografia. Em determinadas modalidades, os métodos compreendem uma etapa de cromatografia negativa pela qual os componentes não desejados unem-se à resina de cromatografia e o AAV desejado não se une à resina de cromatografia. Em determinadas modalidades, os métodos compreendem uma etapa de cromatografia de troca aniônica negativa (AEX), ou uma etapa de cromatografia AEX no “modo sem união”. Vantagens de “modo sem união” incluem relativa facilidade de levar a cabo o procedimento e na realização de ensaios posteriores. Por conseguinte, em determinadas modalidades, os métodos de purificação de partículas do AAV compreendem realizar cromatografia de troca aniônica negativa (AEX) em uma fração que compreende partículas do AAV mediante aplicação da fração a uma coluna de cromatografia AEX ou membrana sob condições que permitem que o AAV flua através da membrana ou coluna de cromatografia AEX e colete partículas do AAV. Em determinadas modalidades, a fração é aplicada à membrana ou coluna de cromatografia AEX com um tampão de carga que compreende aproximadamente de 100 mM a aproximadamente 150 mM de sal, por exemplo, NaCl, opcionalmente, em que o pH do tampão de carga é de aproximadamente 8 a aproximadamente 9. Em determinadas modalidades, o tampão de carga compreende aproximadamente de 115 mM a aproximadamente 130 mM de sal, por exemplo, NaCl, opcionalmente, em que o tampão de carga compreende aproximadamente de 120 mM a aproximadamente 125 mM de sal, por exemplo, NaCl. Em determinadas modalidades, a etapa de AEX negativa ocorre antes da etapa de ultracentrifugação descrita no presente documento.
[00106] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem concentrar uma fração do AAV usando um sistema de ultra/diafiltração. Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem uma ou mais etapas de filtração de fluxo tangencial (TFF). Em determinadas modalidades, a fração do AAV experimenta ultra/diafiltração. Em determinadas modalidades, a fração do AAV é concentrada com o sistema de ultra/diafiltração antes de uma etapa que compreende realizar cromatografia AEX negativa, após uma etapa que compreende realizar cromatografia AEX negativa, ou antes e depois de compreender a realização de cromatografia AEX negativa.
[00107] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem tratar uma fração que compreende partículas do AAV com um detergente solvente para inativar vírus com envelope lipídico.
[00108] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem filtração da fração que compreende partículas do rAAV para remover vírus de maior tamanho que as partículas do rAAV na fração. Em determinadas modalidades, o método da presente descrição compreende filtração da fração que compreende AAV para remover vírus com tamanho maior que ou aproximadamente 35 nm. Em determinadas modalidades, o tamanho de poro do filtro está no intervalo nanométrico, e, em determinadas modalidades, o método compreende nanofiltração. Em determinadas modalidades, o método da presente descrição compreende o uso do nanofiltro de tamanho de poro no intervalo de 35 nanômetros ±2 nanômetros, tal como se determina um método de fluxo de água. Classificação do tipo de filtro é dependente da estrutura da membrana, material e fornecedor.
[00109] Em determinadas modalidades, durante a etapa de filtração, uma diferença de pressão com respeito ao filtro é mantida. Em determinadas modalidades, a pressão (queda da pressão através do filtro) é aproximadamente de 0,02 MPa a aproximadamente 0,1 MPa. Em determinadas modalidades, a pressão (por exemplo, queda da pressão através do filtro) é aproximadamente de 0,02 MPa a aproximadamente 0,08 MPa. Em caso de que o filtro seja executado em modo sem saída, a diferença de pressão pode ser afetada pela pressão de alimentação da amostra aplicada (ou seja, mediante ajuste da bomba a um fluxo específico, que afeta à pressão de alimentação).
[00110] Em determinadas modalidades, a etapa de filtração para remoção de vírus maiores que as partículas do rAAV ocorre uma vez durante o processo da presente descrição. Em determinadas modalidades, a etapa de filtração ocorre duas vezes durante o processo. Em determinadas modalidades, a etapa de filtração para a remoção de vírus maiores que as partículas do rAAV ocorre após a etapa de ultracentrifugação descrita no presente documento. Em determinadas modalidades, a etapa de filtração para a remoção de vírus maiores que as partículas do rAAV ocorre após uma etapa de polimento.
[00111] Em determinadas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem uma etapa de polimento que compreende realizar cromatografia AEX, opcionalmente com uma coluna que compreende gel de tentáculo.
[00112] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes, e patentes, citadas no presente documento são incorporadas pelo presente documento como referência na mesma medida como se cada referência fosse indicada individual e especificamente para ser incorporada como referência e fosse exposta em sua totalidade no presente documento.
[00113] O uso dos termos “um” e “uma” e “o/a” e referentes similares no contexto da descrição da descrição (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) devem ser interpretados para cobrir tanto o singular como o plural, a menos que seja indicado o contrário no presente documento ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “que compreende”, “que tem” “que inclui”, e “que contém” devem ser interpretados como termos abertos (ou seja, que significa “que inclui, mas não é limitado a,”) a menos que seja indicado o contrário.
[00114] A recitação de intervalos de valores no presente documento é destinada meramente para servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que se apresenta dentro do intervalo e cada critério de avaliação, a menos que seja indicado o contrário no presente documento, e cada valor separado e critério de avaliação é incorporado na memória descritiva da patente como si fosse recitado individualmente no presente documento.
[00115] Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que seja indicado o contrário no presente documento ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem a modo de exemplo (por exemplo, “tal como”) proporcionado no presente documento, é destinado meramente a esclarecer melhor a descrição e não apresenta nenhuma limitação no escopo da descrição a menos que seja reivindicado o contrário. Nenhuma linguagem na memória descritiva deve ser interpretada como que indica qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da descrição.
[00116] As modalidades de esta descrição são descritas no presente documento. Variações de estas modalidades podem resultar evidentes para os técnicos habituais no assunto ao ler a descrição anterior. Os inventores esperam que os técnicos empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a descrição seja praticada de outra forma distinta de como descrita especificamente no presente documento. Por conseguinte, esta descrição inclui todas as modificações e equivalentes do conteúdo recitado nas reivindicações adjuntas aqui conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos anteriormente em todas as variações possíveis dos mesmos é abarcada pela descrição a menos que seja indicado o contrário no presente documento ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.
[00117] Os seguintes exemplos são dados meramente para ilustrar a presente invenção e não para limitar de qualquer forma seu escopo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[00118] Este exemplo demonstra um ELISA do AAV específico. O ELISA determina a quantidade de partículas do AAV8 presente na fração ou preparação testada.
[00119] Um ELISA do AAV específico foi levado a cabo para identificar frações que contêm AAV. Um anticorpo monoclonal específico - conformacional é usado para a detecção de um epítopo, expressado de maneira repetida em partículas do AAV-8 montadas.
[00120] ELISA do AAV8 foi levado a cabo com um kit de ELISA de titulação do AAV-8 (art. n.º PRAAV8; Progen (Heidelberg, Alemanha)) em um sistema de robô TECAN. Em resumo, um anticorpo monoclonal específico para um epítopo conformacional em capsídeos do AAV8 montados (ADK8) foi coberto com tiras de microtitulação e foi usado para capturar partículas do AAV8 da fração do AAV. As partículas do AAV8 de captura foram detectadas mediante duas etapas. Em uma primeira etapa, um anticorpo monoclonal conjugado com biotina específico para o anticorpo ADK8 foi unido ao complexo imune (de ADK8 e um anticorpo ADK8). Conjugados de estreptavidina peroxidase foram adicionados aos complexos imunes unidos ao anticorpo monoclonal conjugado com biotina e os conjugados de estreptavidina peroxidase reagiram com a biotina. Uma preparação de partícula do AAV2/8, WL217S, que contém partículas do AAV-8 marcado a concentrações estabelecidas, foi usada como padrão. Uma solução de substrato de peroxidase foi adicionada dando como resultado uma reação de coloração proporcional à quantidade de partículas do capsídeo do AAV unidas. A reação de coloração foi medida fotometricamente a 450 nm.
[00121] Encheu-se a placa pré-revestida com tampão de diluição 100 L/poço. Então a série de diluição para o ensaio padrão, o controle do ensaio e as amostras foram preparadas diretamente na placa. O padrão do ensaio dissolvido foi diluído em duplicatas seis vezes 1+1 diretamente na placa misturando 100 L com tampão de diluição 100 L já presente nos poços, enquanto o controle do ensaio foi diluído 1/200 antes que as seis diluições em série fossem preparadas diretamente sobre a placa. Para as amostras, duas diluições em série foram preparadas em duplicatas independentes. Então a placa foi incubada 60 ± 10 min a +37°C (ponto estabelecido) no agitador da microplaca, girando a placa em 180º após 30 ± 5 min. Após uma etapa de lavagem (tampão de lavagem: Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Tween 20, NaCl a 0,8%, KCl a 0,02%, KH2PO4 a 0,02%, Na2HPO4 a 0,126%×2H2O, Tween 20 0,05%, pH neutro (verificado com papel indicador), anticorpo de detecção 100 L/poço foi adicionado e a placa foi incubada 30 ± 5 min após a adição. Esta incubação foi terminada por uma etapa de lavagem. Então, foi adicionado substrato de tetrametilbenzidina 100 L/poço. Permitiu-se que a reação de coloração prosseguisse a temperatura ambiente durante 25 ± 5 min, antes de ser detida pela adição da solução de detenção. A placa foi medida no prazo de 30 min usando o leitor de ELISA a 450 nm e 620 nm como comprimento de onda de referência. Então a curva de calibração foi obtida após um ajuste bilogarítmico.
EXEMPLO 2
[00122] Este exemplo demonstra a microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM).
[00123] CryoTEM permite a visualização de partículas nanométricas tais como AAV. A técnica envolve deposição de uma preparação do AAV com um filme de carbono de apoio fino em uma temperatura e ambiente controlado de umidade. Após a remoção do excesso da preparação do AAV deixando algo da preparação do AAV aderida, o grau foi vitrificado em etano líquido e logo armazenado em nitrogênio líquido. A análise de CryoTEM de partículas do capsídeo do AAV foi utilizada para avaliar a morfologia do espécime global, ou seja presença de diversas morfologias do AAV (em geral incluindo partículas de AAV esféricas e deformadas, estruturas da subunidade e morfologias menos definidas estruturalmente maiores), e o nível de empacotamento das partículas por uma metodologia de análise de imagem automatizada.
[00124] Preservaram-se a preparação ou fração do AAV perto do seu estado nativo embutindo- as em gelo não cristalino, amorfo em um suporte inerte mediante congelamento de maneira instantânea sob condições criogênicas. A análise de imagem baseada foi realizada usando um método de análise objetivo, automatizado usando software analisador Vironova (VAS).
[00125] As partículas do capsídeo do AAV que apresentam uma densidade interna com limite não distinto entre o invólucro e o núcleo são classificadas como partículas cheias (figura 6A). As partículas do capsídeo do AAV que apresentam um invólucro externo distinto e densidade interna mínima são classificadas como partículas vazias (figura 6A). As partículas indeterminadas incluem capsídeos do AAV na forma da estrutura trimérica (figura 6B), que poderiam estar vazias ou cheias, e capsídeos do AAV quebrados (figura 6C).
[00126] A CryoTEM determina a quantidade de capsídeos cheios completos versus vazios em preparações do AAV.
EXEMPLO 3
[00127] Este exemplo demonstra que o uso de ELISA do AAV específico dá como resultado menos variabilidade que o uso da técnica de qPCR.
[00128] ELISA do AAV8: O título da partícula do capsídeo do AAV8 total foi medido usando um kit comercial (Progen) calibrado com respeito ao material padrão de referência do AAV8 ATCC® para as concentrações de partículas (cp) do capsídeo tal como foi descrito no exemplo 1.
[00129] qPCR: Um ensaio quantitativo de PCR baseado na química Taqman® foi desenvolvido para medir as concentrações da cópia do genoma do vetor do DNA transgênico. Para ITR-qPCR por FVIII, o título do genoma do vetor (vg) por mililitro (ml) foi determinado usando um qPCR baseado em TaqMan com iniciadores e uma sonda marcada de maneira fluorescente que detecta uma sequência dentro das sequências de ITR do genoma do vetor. Para a detecção da sequência de ITR-específico na partícula de AAV, as amostras foram tratadas com DNAse I e, após uma posterior etapa de proteinase K, o genoma do scAAV foi liberado do capsídeo. Finalmente, uma digestão com enzima de restrição foi realizada para resolver as estruturas em forma de T de ITR do AAV.
[00130] O plasmídeo usado como uma referência foi linearizado com uma enzima de restrição de cortador único e purificado adicionalmente a partir de um gel de agarose. A absorvância UV A260 do DNA extraído do gel foi medida três vezes em um espectrofotômetro UV e o valor médio da concentração de DNA foi calculado em g por ml.
[00131] Para determinar o número de cópias por ml para o plasmídeo padrão linearizado, o peso molecular de dsDNA foi calculado em gramas por mol considerando a massa exata para cada nucleotídeo individual da sequência subjacente.
[00132] O título do genoma do vetor no artigo de teste (em genomas do vetor por mL) foi calculado através do ajuste de curva padrão do plasmídeo com regressão linear.
[00133] CryoTEM: Preservaram-se as amostras perto do seu estado nativo embutindo-as em gelo não cristalino, amorfo em um suporte inerte mediante congelamento de maneira instantânea sob condições criogênicas tal como foi descrito no exemplo 2.
[00134] Eletroforese em gel: A eletroforese foi realizada tal como foi descrita (Fagone et al., 2012). Em resumo, as amostras do AAV foram tratadas durante 10 minutes a 75ºC em presença de SDS a 0,5% (dodecilsulfato de sódio) e então esfriaram até temperatura ambiente. Então as amostras (aproximadamente 1,5E10 genomas do vetor (vg)/faixa) foram carregadas sobre um gel de agarose 1xTAE a 1% e separaram em um campo elétrico (60 min a 7 V/cm de comprimento de). Então o gel foi tingido em uma solução 2x GelRed (Biotium) e foram obtidas imagens mediante ChemiDocTMMP (Biorad).
[00135] Biopotência in vivo: Um ensaio de biopotência in vivo do AAV-específico foi realizado usando uma preparação do AAV8 avaliada usando o ensaio de ELISA do antígeno para determinar as partículas do capsídeo por ml - cp/ml. As amostras foram enviadas à instalação de teste (congeladas, ≤-60°C), descongeladas e diluídas com o tampão de formulação a 4x1011cp/ml. O teste de biopotência in vivo inclui até oito camundongos deficientes FVIII machos por grupo ((B6;129S4-F8 tm2Kaz); Charles River GmbH, Sulzfeld, Alemanha). Os animais receberam uma injeção em bolus intravenosa única de 4x1012 cp/kg das amostras de teste ou controle, logo depois de que as amostras foram descongeladas. As amostras de teste foram vetores de terapia gênica FVIII do AAV8. O plasma de citrato de rato coletado é usado para avaliar a atividade de FVIII usando um ensaio de atividade de FVIII. O ensaio de atividade de FVIII é levado a cabo na presença de iões de cálcio e fosfolipídios. O fator X é ativado para o fator Xa pelo fator IXa. Esta ativação é estimulada pelo fator VIII que atua como um cofator nesta reação. Ao usar ótimas quantidades de Ca2+, o fosfolípido e o fator IXa, e um excesso de fator X, a taxa de ativação de fator X esta relacionada de maneira linear com a quantidade de fator VIII. Portanto, o fator Xa hidrolisa um substrato cromogênico que libera o grupo cromóforo. Então a cor é lida fotometricamente a 405 nm. O fator Xa gerado e, portanto, a intensidade de cor é proporcional à atividade do fator VIII na amostra.
[00136] Biopotência in vitro: Um ensaio de biopotência in vitro do AAV-específico foi realizado usando uma preparação do AAV8 avaliada usando o ensaio de ELISA do antígeno para determinar as partículas do capsídeo por ml - cp/ml. O vetor viral AAV8 que compreende o fator VIII (FVIII) do gene de interesse (GOI) infectou uma linha celular alvo hepática, que posteriormente secretou proteína de FVIII funcional e mensurável no meio de cultura celular. A atividade do fator VIII do sobrenadante da cultura celular foi medida diretamente mediante um ensaio cromogênico de FVIII. A medição de uma amostra AAV8-FVIII é dada como porcentagem relativa a um material de referência. O método permite uma avaliação quantitativa da função biológica do vetor de terapia gênica AAV8-FVIII. O mesmo ensaio foi usado tal como se descreveu anteriormente para a biopotência in vivo.
[00137] Tal como é demonstrado na figura 1, o uso de métodos de qPCR deu como resultado maior variabilidade em comparação com o método de ELISA do AAV específico. Por exemplo, o método de qPCR baseado em ITR deu como resultado um coeficiente de variação de ≤ 43%, enquanto que o coeficiente de variação para o ELISA do AAV8-específico foi ≤ 10%. O método de ELISA foi aproximadamente de 20% a aproximadamente 33% menos variável que o método de qPCR. Esta diferença surpreendente permite que a dose de uma fração do AAV seja determinada pelo ensaio de ELISA do AAV específico sozinho. Esta abordagem não proporciona apenas um modo mais preciso para dosar uma fração do AAV, mas é mais rentável e eficiente no tempo.
[00138] Para testar se o método de ELISA ou o método de qPCR dá como resultado um método preciso de medição do conteúdo do capsídeo da preparação do AAV, foram geradas preparações do AAV e avaliadas usando ELISA e qPCR separadamente. Os resultados destas medições foram usados para preparar uma amostra para carregar em cada faixa (2,0 x 1010 capsídeos/faixa). Tal como é mostrado na figura 2, as amostras avaliadas com ELISA foram consistentemente menos variável que as avaliadas com qPCR pois o sinal para as amostras associadas com ELISA foi mais consistente em comparação com os associados com os resultados de qPCR, apesar de que as preparações foram a partir dos mesmos lotes para ambos os tipos de ensaios. Portanto, a dosagem com auxílio de ELISA foi mais robusta que a dosagem associada com qPCR.
[00139] Todos os resultados derivados do teste de liberação de substância medicinal a granel (BDS) por GMP e pré-clínica, e lotes de medicamento final (FDP) mediante ELISA do capsídeo do AAV8 e ITR-qPCR são mostrados (tabelas 1 a 4), e as proporções de genomas do vetor por partículas de capsídeo total foram calculadas (tabela 5). Para comparação, os valores de ELISA do AAV8 traçados contra os valores de ITR-qPCR também são mostrados (figura 4). A figura 5 avalia a proporção de AAV genomas do vetor (vg) por partículas do capsídeo de ELISA do antígeno do AAV8 (cp). A figura 5A mostra a variabilidade do método de qPCR com base na proporção de genomas do vetor per antígeno do AAV. A figura 5B demonstra a alta consistência da porcentagem de AAV cheio obtido a partir do processo de fabricação de acordo com a ultracentrifugação do documento PCT/US2017/059967 usando o método 50-55-60. O processo de ultracentrifugação proporciona um perfil de capsídeo cheio versus vazio consistente de lote a lote. Como tal, a variabilidade entre ensaios deve ser consistente (por exemplo, figura 5B). Sem embargo, quando qPCR, é usado para calcular a dose, existe alta variabilidade entre lotes (por exemplo, figura 5A).
[00140] A seguir, os camundongos foram dosados em um ensaio de biopotência in vivo usando o método de ELISA para medir a potência da preparação do AAV. A figura 3 verifica o uso do método de ELISA do antígeno para determinar a potência de uma preparação do AAV usando um ensaio de biopotência in vivo usando um modelo de rato. Tal como é indicado na figura 3, o ensaio biológico confirmou que existia atividade biológica em todos os lotes e que a potência dos lotes eram comparável e consistente. Tal como foi mencionado anteriormente, um ensaio de biopotência in vivo avalia tanto a capacidade do AAV para transduzir as células e como para produzir a proteína ou gene de interesse.
[00141] Tabela 1: Lotes de substâncias medicinais a granel (BDS): títulos de partículas do capsídeo do AAV8 total medidos por ELISA, e títulos do genoma do vetor medidos por ITR- qPCR, e as proporções. Médias, desvios padrões, coeficientes de variações (CVs), e 3 limites de desvio padrão da proporções também são mostrados. A proporção de ITR-qPCR/ ELISA do AAV8 proporciona a “atividade específica” da preparação do AAV. A proporção ou “atividade específica” pode proporcionar informação/número de capsídeos cheios, mas a variação é muito alta devido a que é derivada tanto do qPCR como do ELISA. A variação vem principalmente a partir do qPCR, que demonstra porque o método de ELISA do AAV ou o ELISA do AAV/TEM é superior com respeito ao método de qPCR.
Lote de BDS n.º ELISA de partícula Genomas do vetor Proporção ITR-qPCR/ de capsídeo do mediante ITR-qPCR ELISA do AAV8 [vg/cp] AAV8 total [cp/ml] [vg/ml] 1 1,55E+13 3,53E+13 2,28 2 9,99E+12 2,45E+13 2,45 3 1,41E+13 1,80E+13 1,28 4 1,21E+13 1,39E+13 1,15 5 1,07E+13 9,20E+12 0,86 6 1,09E+13 1,28E+13 1,17 Média (n=6) 1,53 Desvio padrão DP 0,66 CV [%] 43
[00142] Tabela 2: Lotes de boas práticas de fabricação BDS (GMP): títulos de partículas do capsídeo do AAV8 total medidos por ELISA, e títulos do genoma do vetor medidos por ITR- qPCR, e suas proporções. Médias, desvios padrão, coeficientes de variações (CVs), e 3 limites de desvio padrão de as proporções também são mostradas.
Lote de BDS por GMP ELISA de partícula de Genomas do vetor Proporção ITR- n.º capsídeo do AAV8 mediante ITR-qPCR qPCR/ ELISA do total [cp/ml] [vg/ml] AAV8 [vg/cp] 1 1,07E+13 1,15E+13 1,07 2 6,39E+13 7,31E+13 1,14 3 1,76E+13 4,05E+13 2,30 4 3,69E+13 4,73E+13 1,28 5 1,98E+13 5,76E+13 2,91 6 1,45E+13 4,69E+13 3,23 7 1,15E+13 2,56E+13 2,23 Média (n=7) 2,02 Desvio padrão DP 0,87 CV [%] 43
[00143] Tabela 3: Lotes de produtos medicinais finais (FDP): títulos de partículas do capsídeo do AAV8 total medidos por ELISA, e títulos do genoma do vetor medidos por ITR-qPCR, e suas proporções. Médias, desvios padrão, coeficientes de variações (CVs), e 3 limites de desvio padrão de as proporções também são conhecidos.
Lote de FDP ELISA de partícula de Genomas do vetor Proporção ITR- n.º capsídeo do AAV8 mediante ITR-qPCR qPCR/ ELISA do total [cp/ml] [vg/ml] AAV8 [vg/cp] 1 1,36E+13 2,83E+13 2,08 2 1,05E+13 3,09E+13 2,94 3 1,18E+13 1,93E+13 1,64 4 2,35E+12 2,45E+12 1,04 5 2,20E+12 2,22E+12 1,01 6 8,98E+13 1,74E+13 0,19 Média (n=6) 1,48 Desvio padrão DP 0,96 CV [%] 65
[00144] Tabela 4: Lotes de FDP por GMP: títulos de partículas do capsídeo do AAV8 total medidos por ELISA, e títulos do genoma do vetor medidos por ITR-qPCR, e suas proporções. Médias, desvios padrão, coeficientes de variações (CVs), e 3 limites de desvio padrão das proporções também são conhecidos.
Lote de FDP por GMP ELISA de partícula de Genomas do vetor Proporção ITR- n.º capsídeo do AAV8 mediante ITR-qPCR qPCR/ ELISA do total [cp/ml] [vg/ml] AAV8 [vg/cp] 1 6,38E+12 7,35E+12 1,15 2 8,64E+12 1,32E+13 1,53 3 2,40E+12 2,15E+12 0,90 4 1,08E+13 3,01E+13 2,79 Média (n=4) 1,59 Desvio padrão DP 0,84 CV [%] 53
[00145] Tabela 5: Proporção de genomas do vetor por partículas do capsídeo para todos os lotes de BDS e FDP mostrados.
Todos os lotes de BDS por Proporção ITR-qPCR/ ELISA GMP e pré-clinicas do AAV8 [vg/cp] Média (n=23) 1,68 Desvio padrão DP 0,82 CV [%] 49
[00146] Tabela 6: Dados de biopotência in vitro e in vivo de lotes de fabricação de AAV8 contendo DNA do vetor de FVIII deletado do domínio B. A dosagem de AAV8 foi baseada no ELISA do antígeno do AAV8, e a % dos capsídeos completos foi determinada mediante CryoTEM. A consistência lote a lote quanto a % de capsídeos cheios é demonstrada com 2,7% de CV.
Antígeno do AAV8 ITR - qPCR BP in vitro BP in vivo CryoTEM Lote n.º: cheia cp/ml vg/ml BPU IU/ml % 17001 2,12E+13 4,27E+13 0,88 1,23±1,05 82 17002 2,13E+13 5,30E+13 0,86 2,09±1,15 78 17003 4,12E+13 1,35E+14 0,82 2,06±1,61 83 17004 3,56E+13 2,15E+13 1,04 2,1±0,65 84
17005 2,91E+13 8,06E+13 0,68 1,19±0,46 84 17006 3,36E+13 1,10E+14 1,01 1,74±0,81 85 17007 2,65E+13 7,74E+13 0,77 1,72±1,36 82 17008 2,46E+13 8,48E+13 0,84 1,66±0,48 82 17009 3,58E+13 9,73E+13 0,89 1,10±0,44 78 17010 2,99E+13 9,96E+13 1,23 2,27±1,12 81 17011 3,30E+13 9,96E+13 0,86 1,5±0,93 83 17012 3,11E+13 1,06E+14 0,96 2,03±1,03 83 17013 3,06E+13 1,03E+14 0,98 0,82±0,23 85 17014 1,71E+13 6,52E+13 1,98 1,28±0,90 80 Média (n=14) 82,1 Desvio padrão 2,2
DP CV [%] 2,7%
[00147] As figuras 12 e 13 examinam os resultados de ELISA, qPCR, e CryoTEM dos lotes 17004-17013. Os lotes 17004-17013 (tabela 6) são o mesmo tamanho de lote, que são de 2 vezes lotes de 500 L. Estes dez lotes contêm quantidade comparável de capsídeos do AAV8 no produto final. A análise dos lotes 17004-17013 é apresentada na tabela 7.
[00148] Tabela 7: Dados de biopotência in vitro e in vivo da fabricação de lotes de AAV8 que contém DNA do vetor de FVIII deletado do domínio B para os lotes 17004-17013.
Antígeno do AAV8 ITR - qPCR BP in vitro BP in vivo CryoTEM Lotes 17004-17013 cheia cp/ml vg/ml BPU IU/ml % MEDIANA 3,09E+13 9,85E+13 0,93 1,69 83 Desvio padrão DP 3,67E+12 2,58E+13 0,15 0,46 2,1 EXEMPLO 4
[00149] Este exemplo valida CryoTEM como uma ferramenta para medir as quantidades de capsídeos cheios e vazios em uma preparação do AAV.
[00150] Uma combinação de métodos analíticos confiáveis é requerida para medir os atributos de qualidade de preparações de vetor de terapia gênica baseadas no AAV8 recombinante (rAAV8), para permitir a liberação do e a dosagem clínica precisa. CryoTEM foi estabelecida para quantificar as partículas do vetor vazias e que contêm genoma do vetor, cheias em preparações do AAV8 do vetor de terapia gênica, e para determinar a significância deste parâmetro para potência usando métodos ortogonais.
[00151] CryoTEM foi validada para quantificação cheio/vazio usando preparações do vetor do rAAV8 que codifica um fator IX de coagulação humana (FIX) com conteúdo de partículas cheias de 40 - 80% geradas ao misturar preparações de vetor, ou ao enriquecer de maneira seletiva as frações do vetor mediante ultracentrifugação. A validação deu como resultado precisão intermediaria e entre ensaios abaixo de um desvio padrão relativo de 1%. A linearidade de seis experiências independentes foi alcançada com cada r2 maior que 0,996. As preparações de vetor derivadas do mesmo volume de vetor mostraram uma correlação da proporção de cheio e vazio com a potência medida em um ensaio in vitro baseado em células e em um modelo in vivo.
[00152] Métodos e materiais
[00153] CryoTEM: Preservaram-se amostras do vetor perto do seu estado nativo embutindo- as em gelo não cristalino, amorfo em um suporte inerte mediante congelamento de maneira instantânea sob condições criogênicas. A análise de imagem baseada foi realizada usando um método de análise objetivo, automatizado usando software analisador Vironova (VAS) tal como foi descrito no exemplo 2.
[00154] ELISA do AAV8: O título da partícula do capsídeo do AAV8 total foi medido usando um kit comercial (Progen) calibrado com respeito ao material padrão de referência do AAV8 ATCC® para as concentrações de partículas (cp) do capsídeo tal como foi descrito no exemplo 1.
[00155] Biopotência in vitro: A atividade cromogênica de FIX no sobrenadante de células HepG2 infectadas com FIX-AAV8 foi medida, dada como unidade de biopotência arbitraria relativa a uma preparação de referência, e normalizada em relação com as partículas de capsídeo. No ensaio de biopotência in vitro, o vetor viral AAV8 infectou uma linha celular alvo hepática, que posteriormente secreta proteína codificada mensurável, funcional no meio. Em uma primeira etapa, as células alvo HepG2 são transduzidas infectadas mediante AAV8. Durante a incubação, a proteína codificada foi liberada no sobrenadante. Em uma segunda etapa, a atividade da proteína codificada secretada no sobrenadante foi medida diretamente por um ensaio de atividade (foi usado ensaio de biopotência in vitro um ensaio enzimático – ROX FIX (Rossix)). A medição de uma amostra do AAV8 é dada como uma porcentagem relativa a um material de referência. O método permite uma avaliação quantitativa da função biológica do vetor de terapia gênica do AAV8. A referência é a norma da OMS ou uma preparação padrão calibrada contra a norma WHO para FIX humano.
[00156] Biopotência in vivo: As partículas do AAV8 codificante do FIX humano foram infundidas via intravenosa em oito camundongos deficientes de FIX humano (Charles River Germany (CR0 em Sulzfeld, Alemanha)). A preparação do AAV8 foi avaliada mediante ELISA do antígeno para determinar as partículas do capsídeo por ml – cp/ml. As amostras foram enviadas à instalação de teste (congeladas, ≤-60°C), descongeladas e diluídas com o tampão de formulação a 4,95E+l0 cp/ml. Os animais receberam uma injeção em bolus intravenosa única de 2,47E+11cp/kg das amostras de teste ou controle, logo depois de que as amostras foram descongeladas. A atividade de FIX em plasma foi monitorada regularmente através da atividade de coagulação de FIX medida por um ensaio de coagulação de APTT de uma fase contra um padrão de plasma humano calibrado contra um padrão internacional. Uma amostra que contém FIX foi diluída a um intervalo dentro de uma curva de calibração em tampão de imidazol +albumina a 1%. Adicionaram-se 50 l da amostra diluída a 50 l de plasma deficiente de FIX e colocado em contato com uma suspensão de fosfolipídio de 50 l (Pathromtin SL, Siemens) após 240 segundos de incubação a coagulação é iniciada adicionando 50 l de 25 mM de solução de CaCl2, o tempo para gerar uma formação de coagulação é medido sobre um patim BCS XP(Siemens) ou ACL 500 (Werfen).
[00157] qPCR: Um ensaio quantitativo de PCR baseado na química Taqman® foi desenvolvido para medir as concentrações da cópia do genoma do vetor do DNA transgênico. Para o DNA do vetor de FIX foram usados dos métodos de qPCR de FIX específico: um para o vetor de AAV do DNA bicatenário e outro para o vetor de AAV do DNA monocatenário.
[00158] O título do genoma do vetor (vg) por mililitro (ml) foi determinado usando um qPCR baseado em TaqMan com iniciadores e uma sonda marcada de maneira fluorescente que detecta uma sequência dentro das sequências de FIX e o sinal de poliadenilação. Para a detecção da sequência de FIX específico foram tratados com DNAse I e depois uma posterior etapa de proteinase K a genoma de scAAV foi liberado do capsídeo. Finalmente, uma digestão com enzima de restrição é realizada para resolver estruturas em forma de T de ITR do AAV.
[00159] O plasmídeo usado como material de referência foi linearizado com uma enzima de restrição de cortador único e purificado adicionalmente a partir de um gel de agarose. A absorvância UV A260 de DNA extraído do gel foi medida três vezes em um espectrofotômetro UV e o valor médio da concentração de DNA foi calculado em g por ml.
[00160] Para determinar os números de cópia por ml para o plasmídeo padrão linearizado o peso molecular de dsDNA foi calculado em gramas por mol considerando a massa exata para cada nucleotídeo individual da sequência subjacente.
[00161] O título do genoma do vetor no artigo de teste (em genomas do vetor por mL) foi calculado através de ajuste de curva padrão de plasmídeo com regressão linear.
[00162] Resultados
[00163] A figura 6 demonstra que CryoTEM pode ser usada para obter imagens de capsídeos cheios e vazios. A figura 7 é um exemplo da análise da amostra. As imagens de CryoTEM adquiridas a uma ampliação de 38k foram submetidas a análise de densidade interna. A análise do componente principal de cada perfil de densidade radial de partículas do AAV revelou aglomerados de níveis de empacotamento: cheio (vermelho; esquerda), azul (vazio; direita), indeterminado (verde; meio); Anéis tracejados: intervalos de confiança a 99%. Veja-se a tabela 8 para um resumo das descobertas.
[00164] Tabela 8: Dados obtidos a partir de 5 imagens que analisam um total de 1568 partículas.
Classe % (contagens) CI a 95%
Vazio 20% (315) 18-22% Cheio 80% (1249) 78-82% Indeterminado 0% (4) 0-1%
[00165] A figura 8 é uma validação de CryoTEM de acordo com ICH Q2(R1) (ou seja, Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano) incluído especificidade, repetibilidade, precisão intermediária, linearidade, precisão de diluição, e robustez. Sã apresentados os resultados para linearidade de um conjunto de seis experiências independentes. A figura 8 demonstra a diferença entre o conteúdo teórico e o medido de partículas do AAV8 cheias. As preparações do rAAV8 que contêm quase 80% de capsídeo cheio, e outra com a maioria dos capsídeos vazios, foram misturadas para obter 4 amostras com porcentagens de 40 a 80% de capsídeos cheios. Estas preparações foram medidas em duas redes cada, em que o eixo x representa a porcentagem teórica de capsídeos “cheios”, e o eixo y representa os valores medidos mediante CryoTEM. Um ponto de informação reflete uma média de duas repetições. Todos demonstraram uma boa correlação de valores teóricos e experimentais com coeficientes de correlação acima de 0,996.
[00166] A figura 9 examina preparações com graus crescentes de capsídeos cheios que foram purificados a partir de frações de ultracentrifugação (veja-se a publicação de pedido internacional PCT/US2017/059967). Em particular, a figura 9 descreve o aumento do título de qPCR dependendo da porcentagem de capsídeos “completos”. O eixo x é a porcentagem de capsídeos “completos” medida mediante CryoTEM, e o eixo y é o valor de qPCR medido. Quanto maior a porcentagem de capsídeos “cheios” maior é o título de qPCR. A proporção de qPCR por antígeno do AAV8 na figura 9 demonstra como esta proporção aumenta com a quantidade de partículas “cheias”, quanto maior a porcentagem de capsídeos cheios maior é a proporção de qPCR versus o antígeno do AAV8 [ Y:Proporção vg/cp POR X:porcentagem de capsídeos cheios (CryoTEM)]. Em porcentagens maiores de capsídeos cheios, a variabilidade de qPCR é maior, portanto, fazendo-o menos preciso. Isto é especialmente importante dado que o produto proporcionado ao sujeito estaria dentro o intervalo maior de capsídeos cheios. Genomas do vetor por títulos de partícula de capsídeo foram calculados a partir de resultados de ELISA de partícula de capsídeo do AAVB e qPCR, e correlacionados com os dados de CryoTEM.
[00167] As figuras 10 e 11 demonstram a influência da % de partículas do capsídeo do AAV8 de FIX completas na biopotência in vivo e a biopotência in vitro. Na Figura 10, a mesma preparação do vetor do AAV tal como é usado na figura 8 foi administrada por via intravenosa a camundongos deficientes de fator IX (n=8). As amostras de plasma foram tomadas após 14 dias e a atividade de coagulação de huFIX foi medida. Para a figura 11, as preparações com graus variados de capsídeos cheios (as mesmas que na figura 9) foram preparadas mediante isolamento de frações de ultracentrifugação e posterior purificação. A biopotência foi medida em um ensaio baseado em células, relacionado com cp, e traçado contra a % de partículas cheias. A biopotência in vitro aumenta com graus maiores de capsídeos cheios.
[00168] Tabela 9: Dosagem para a figura 10 como determinado por ELISA.
Grupo Itens de teste Camundongo Doses Análises in vivo Dia 7, 14, 28 A S1= G9_VV_1602_BULK 7 78% de capsídeo cheio punção retro-orbital B S2= G9_VV_1602_meC_37_A 7 Atividade de FIX [ensaio de
2.47E+11 cp/kg 70% cheio/vazio coagulação] [título de ELISA] Antígeno de FIX C S3= G9_VV_1602_meC_37_B 7 [ELISA] 60% cheio/vazio D S4= G9_VV_1602_meC_37_C 7 40 % cheio/vazio E S5= G9_VV_meC_37_BULK 7 0% capsídeo vazio
[00169] A % de capsídeos cheios foi medida usando CryoTEM. Neste caso foi usado AAV8 que contém DNA bicatenário que codifica FIX Padua. Para os resultados in vivo desta amostra de experiência com diferente conteúdo de partículas cheias e vazias foram preparados misturando um capsídeo cheio que contém produto BDS com um produto BDS de capsídeo vazio tal como é mostrado na figura 10. Os animais receberam uma injeção em bolus intravenosa única no dia 0, e foi extraído sangue nos dias 7, 14, e 28. A atividade de FIX foi analisada em um ensaio de coagulação da fase FIX (o ensaio do fator baseado em APTT é amplamente usado para a medição dos fatores VIII, IX, XI e XI). A amostra foi colocada em contato com fosfolípidos e plasma deficiente do fator IX, incubada, e a coagulação foi iniciada com uma solução de cloreto de cálcio e o tempo de coagulação é medido. O tempo de coagulação tem uma clara relação matemática com a concentração de fatores de coagulação.
[00170] Conclusões
[00171] CryoTEM é uma ferramenta valiosa para quantificar a potência de uma preparação do AAV, que permitirá a liberação de uma preparação de vetor de terapia gênica para uso terapêutico. Pode servir como um método ortogonal para medir quantidades de partículas de capsídeo cheios e vazios ou título do genoma do vetor para quantificação do vetor. A CryoTEM tem a vantagem de permitir a monitoração da qualidade e potência do vetor de terapia gênica.
[00172] CryoTEM é superior a outros métodos baseados em microscópio eletrônico, já que seus princípios para preparação da amostra preservam em grande parte o estado nativo da amostra. Além disso, não há necessidade de depender de colorações.
[00173] Diversas modificações da invenção, além das descritas no presente documento, resultarão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição anterior. Tais modificações também pretendem estar dentro do escopo das reivindicações adjuntas. Cada referência citada no presente pedido, incluindo todas as patentes, pedidos de patente, e bibliografia de não patente, é incorporada no presente documento como referência em sua totalidade.

Claims (56)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de quantificação da dose de uma preparação do AAV, caracterizado pelo fato de que compreende quantificar um número total de capsídeos do AAV na preparação do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico.
2. Método de quantificação da dose de uma preparação do AAV, caracterizado pelo fato de que compreende quantificar um número total de capsídeos do AAV na preparação do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico e avaliar uma porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV através de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM).
3. Método de medição da concentração de capsídeos do AAV cheios em uma preparação do AAV, caracterizado pelo fato de que compreende quantificar um número total de capsídeos do AAV na preparação do AAV através de um ensaio de ELISA do AAV específico e avaliar uma porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus vazios na preparação do AAV através de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche, ELISA direto, ELISA indireto, ou de ELISA competitivo específico para um antígeno do AAV.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche específico para um antígeno do AAV.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda avaliar uma porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação é realizada antes ou depois do ensaio de ELISA.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende determinar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios mediante microscopia eletrônica de transmissão criogênica (CryoTEM), TEM de coloração negativa, eletroforese capilar, ultracentrifugação analítica, gel de agarose negativo, gel de agarose alcalino, transferência de Southern, hibridização dot-blot, espectrofotometria UV, cromatografia de troca aniônica fraca ou espectrometria de massas.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende o uso de CryoTEM.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de CryoTEM compreende: (i) embutir a preparação do AAV em um substrato em um suporte inerte; (ii) congelar de maneira instantânea a preparação do AAV embutida; (iii) obter imagens da preparação do AAV embutida usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica; e (iv) quantificar a porcentagem de capsídeos do AAV cheios versus capsídeos do AAV vazios na preparação do AAV.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o substrato é gelo não cristalino, amorfo.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a preparação do AAV é livre de detritos celulares.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método não inclui PCR quantitativo.
14. Método para administrar uma preparação do AAV a um sujeito em necessidade da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) obter uma preparação do AAV purificada;
(ii) medir a concentração de capsídeos do AAV na preparação do AAV purificada usando um ensaio de ELISA do AAV específico; e (iii) administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva da preparação do AAV purificada ao sujeito.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche, ELISA direto, ELISA indireto, ou de ELISA competitivo específico para um antígeno do AAV.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche específico para um antígeno do AAV.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda avaliar uma porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação é realizada antes ou depois do ensaio de ELISA.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende determinar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios mediante CryoTEM, ultracentrifugação analítica, gel de agarose negativo, gel de agarose alcalino, transferência de Southern, hibridização dot-blot, espectrofotometria UV, cromatografia de troca aniônica fraca, ou espectrometria de massas.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende o uso de CryoTEM.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado pelo fato de que a concentração da preparação do AAV purificada é de aproximadamente 1x1010 cp/ml a aproximadamente 1x1020 cp/ml.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente efetiva da preparação do AAV é uma dose entre aproximadamente 1 x 1010 cp/kg e aproximadamente 1 x 1016 cp/kg.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo fato de que o método não inclui PCR quantitativo.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 23, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
25. Método para administrar uma preparação do AAV a uma dose específica a um sujeito em necessidade da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende (i) obter uma preparação do AAV purificada; (ii) medir a concentração de capsídeos do AAV na preparação do AAV purificada usando um ensaio de ELISA do AAV específico; e (iii) administrar uma dose específica da preparação do AAV purificada ao sujeito.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche, ELISA direto, ELISA indireto, ou de ELISA competitivo específico para um antígeno do AAV.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche específico para um antígeno do AAV.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda avaliar uma porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação é realizada antes ou depois do ensaio de ELISA.
30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende determinar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios mediante CryoTEM, ultracentrifugação analítica, gel de agarose negativo, gel de agarose alcalino, transferência de Southern, hibridização dot-blot, espectrofotometria UV, cromatografia de troca aniônica fraca, ou espectrometria de massas.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende o uso de CryoTEM.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pelo fato de que o método não inclui PCR quantitativo.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo fato de que a concentração da preparação do AAV purificada é de aproximadamente 1x1010 cp/ml a aproximadamente 1x1020 cp/ml.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 33, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente efetiva da preparação do AAV é uma dose entre aproximadamente 1 x 1010 cp/kg e aproximadamente 1 x 1016 cp/kg.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
36. Método para produzir uma preparação do AAV, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) transfectar células hospedeiras com pelo menos um plasmídeo que compreende o gene de interesse; (ii) coletar o sobrenadante ou suspensão celular da cultura celular que compreende capsídeos do AAV para criar uma fração do AAV; (iii) quantificar um número total de capsídeos do AAV na fração do AAV usando um ensaio de ELISA do AAV específico; e (iv) preparar uma preparação do AAV com uma concentração desejada baseada no número total de capsídeos do AAV.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que compreende ainda concentrar a fração do AAV.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que compreende ainda remover pelo menos uma porção de capsídeos vazios da fração do AAV.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche, ELISA direto, ELISA indireto, ou de ELISA competitivo específico para um antígeno do AAV.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, caracterizado pelo fato de que o ensaio de ELISA é um ensaio de ELISA sanduíche específico para um antígeno do AAV.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de que compreende ainda avaliar uma porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios versus vazios (cheio:vazio) na preparação do AAV.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação é realizada antes ou depois do ensaio de ELISA.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41 ou reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende determinar a porcentagem ou proporção de capsídeos do AAV cheios:vazios mediante CryoTEM, ultracentrifugação analítica, gel de agarose negativo, gel de agarose alcalino, transferência de Southern, hibridização dot-blot, espectrofotometria UV, cromatografia de troca aniônica fraca, ou espectrometria de massas.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação compreende o uso de CryoTEM.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 44, caracterizado pelo fato de que o método não inclui PCR quantitativo.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 45, caracterizado pelo fato de que a porcentagem de capsídeos do AAV cheios é desde aproximadamente 40% até aproximadamente 100%.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 46, caracterizado pelo fato de que pelo menos 60% dos capsídeos do AAV são capsídeos do AAV cheios.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 47, caracterizado pelo fato de que a concentração é entre aproximadamente 1x1010 cp/ml e aproximadamente 1x1020 cp/ml.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 48, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda liofilizar a preparação do AAV.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, ou um vetor de AAV quimérico.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV8.
52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV9.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o AAV é um AAV geneticamente modificado por engenharia, um AAV quimicamente modificado, ou ambos.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, 15 a 24, 26 a 35 e 39 a 53, caracterizado pelo fato de que o antígeno do AAV é de um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV quimérico, AAV geneticamente modificado por engenharia, ou AAV quimicamente modificado.
55. Preparação de AAV, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 54.
56. Preparação de AAV, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que a preparação do AAV tem uma potência específica e pelo fato de que se verifica a potência usando um sistema in vitro, um sistema in vivo, ou uma combinação de ambos.
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