JP2023512014A - ウイルスベクターに対する中和抗体力価を決定するための改善されたアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、改善されたアッセイ、特に、従来の公知のアッセイよりも低い閾値で、及び／又はより速い速度で、抗体力価、特に中和抗体（ＮＡｂ）力価を一貫して測定することができる改善されたアッセイに関する。本発明は更に、遺伝子治療の提供と組み合わせて、及び／又は患者からの中和抗体の除去／枯渇を目的とする方法の提供と組み合わせた、かかるアッセイの使用に関する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、改善されたアッセイ、特に、従来の公知のアッセイよりも低い閾値で、及び／又は速い速度で、抗体力価、特に中和抗体（ＮＡｂ）力価を着実に測定することができる改善されたアッセイに関する。本発明は更に、遺伝子治療の提供と組み合わせる、及び／又は患者からの中和抗体の除去／枯渇を目的とする方法の提供と組み合わせる、かかるアッセイの使用に関する。

発明の背景
ウイルス（アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレンチウイルス等）を用いる遺伝子治療は、ますます、血友病Ａ及びＢ、並びにさまざまなリソソーム障害を含む多くのまれな疾患の治療のための治療プラットフォームとしての可能性を有すると認められている。現在、ＡＡＶ遺伝子治療を用いてこれらの障害を治療しようとする複数の試験がある（Ｄｏｓｈｉ ａｎｄ Ａｒｒｕｄａ ２０１８，Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．２０１３）。この有望なアプローチにもかかわらず、ベクターが目的の導入遺伝子の形質導入を促進する機会を得る前に、液性免疫が、ウイルスベクターに対する体患者のシステムからのベクターの除去をもたらすため、遺伝子治療の障害である。特に、ＡＡＶキャプシドに対して特異性を有する抗体はヒトにおいて非常に一般的であり、広範囲のＡＡＶ血清型と交差反応することが知られている（異なる血清型間でキャプシドタンパク質配列の高度な相同性がある）。ＡＡＶに対する既存の中和抗体（ＮＡｂ）は、ベクターの形質導入を阻止することか、ＡＡＶベクターの分布を標的器官以外の組織に指向し直すことにより、ＡＡＶベクターを介する遺伝子治療の有効性を調節することが示されている（Ｃａｌｃｅｄｏ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＡＡＶ．２０１３）。更に、ＮＡｂは、ある特定の血清型についての一般集団の３０～７０％に存在し得る（Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｍｏｒｉｚｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．２０１２）。比較的低い力価の中和抗体でさえ、ＡＡＶ形質導入を阻止できると考えられている（Ｋｒｕｚｉｋ，ｅｔ ａｌ．２０１９）。まとめると、ＡＡＶに対するＮＡｂの保有率及び低力価の生物学的関係性により、新しい治療に適格な患者の数が減少する。これは特に、患者が、例えばヒトの間で流行している野生型ＡＡＶに既に曝露されている場合に当てはまる。従って、患者又は対象がウイルスベースの遺伝子治療で治療される場合、それらは、抗ＡＡＶ抗体等の抗ウイルス中和抗体（ＮＡｂ）を産生する可能性がある。かかるＮＡｂはウイルスベクターを中和し、それによって治療効果の大幅な低下を引き起こすリスクがある。

ＡＡＶに対する宿主の免疫応答を克服し、より多くの患者に治療を拡大するために、いくつかの戦略が開発されている。１の研究領域は、キャプシド修飾である。これには、現在の血清型（例、ＡＡＶ２）の効率的な形質導入を保持しながら、同時に低い血清保有率（例、ＡＡＶ５）を示す新規キャプシドの検索が含まれる。他の取り組みにより、脂質ベースのナノ粒子（Ｐ． Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．２０１９）又はエクソソーム等の細胞外小胞（Ｇｙｏｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｇｕｉｒｅ ２０１８）へのパッケージング等のＡＡＶ粒子の産生後修飾に焦点が当てられている。より最近では、前臨床データにより、ラパマイシンを封入する合成ワクチン粒子（ＳＶＰ［Ｒａｐａ］、現在はＩｍｍＴＯＲ）とのＡＡＶ同時投与後の、患者の再投与が候補に挙がっている（Ｍｅｌｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．２０１８）。これらの技術が成熟するにつれて、ＡＡＶ遺伝子治療により患者が効果的に治療され得るように、ＮＡｂの状態を決定する新しい方法を開発することが重要になる。まとめると、既存のＮＡｂを回避する戦略及び投与後のそれらの出現の予防により、ＡＡＶ遺伝子治療の利用可能性をこれまで以上に多くの患者に拡大することが約束される。

別の研究手段は、アフェレーシス／血漿交換による患者の血漿からのＮＡｂの枯渇等の、抗体枯渇技術によるＮＡｂの除去／枯渇である。血漿交換では、患者から取り出された血液が血球及び血漿に分離され、後者は廃棄されてアルブミン溶液に置き換えられる。このアプローチは、医療機関において、病原性免疫グロブリンを除去／枯渇させるために用いられ得る。

アフェレーシス／血漿交換の潜在的な代替法として、患者の血漿からの免疫グロブリン物質の標的化除去／枯渇も知られている。例えば国際公開第２０２０／０１８４３９号から知られているように、基板に接着又は固定化された、ＡＡＶ結合抗体親和性マトリックスが用いられ得る。例えば米国特許第１０，２８６，０８７号から知られているように、ヒトＩｇＧに特異的な結合部分を含む、免疫吸着のための体外デバイスが用いられ得る。他の従来手段も用いられ得る。外部デバイスの代替としては、ヒトＩｇＧを消化する酵素（ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ等）の投与が挙げられる。対象における血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる薬剤を対象に投与する方法は、とりわけ、国際公開第２０１６／０１２２８５号、国際公開第２０２０／０１６３１８号、及び国際公開第２０２０／１５９９７０号に開示されている。

ＮＡｂ減少の一過性の特徴により、アフェレーシス／血漿交換によるか否かにかかわらず、ほぼリアルタイムで患者のＮＡｂ力価の（ＡＡＶ－）中和能のモニタリングを可能にする、迅速でロバストなアッセイの使用が必要になる。

現在、中和抗体をスクリーニングするためのアッセイは存在する。患者の血漿中のＮＡｂをモニタリングする１の方法は、インビトロ形質導入阻害アッセイ（ＴＩＡ）である。患者試料中の中和抗体の存在を評価するためのＴＩＡ法はＭｅｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６：４５－５３（２０１５））から公知である。国際公開第２０１５／００６７４３号は、ＡＡＶに対するＮＡｂ力価を検出するための、かかる形質導入阻害アッセイを記載している。レポーター分子をコードする導入遺伝子を有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が患者からの試料と共にインキュベーションされ、続いて、ウイルス及び試料の混合物が、ｒＡＡＶに感染し得る標的細胞とインキュベーションされる。ＡＡＶがレポーター遺伝子を標的細胞に形質導入するための２４時間の期間の後、レポーター導入遺伝子の発現が測定され、対照試料と比較される。中和力価又はＮＡｂ力価は、対照試料との比較によりレポーター遺伝子の５０％以上の阻害をもたらす試料の希釈度として定義される。ＮＡｂ力価値は、希釈範囲、例、１：１０～１：３１として記録され得；又は、「離散力価（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｔｉｔｒｅ）」として記録され得る。例えば、１：１００の離散力価は、単純に、ＮＡｂ含有量が、例えば１：２００又は１：５０よりも１：１００に近いことを意味する。

国際公開第２０１７／０９６１６２号は、ＡＡＶに対するＮＡｂ力価を検出するための同様のＴＩＡ法を記載し、任意のシグナルが測定される前にＡＡＶがレポーター遺伝子を標的細胞に形質導入するのに７２時間の期間を必要とする方法を例示している。一般に、（例、Ｍｅｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１５／００６７４３号又は国際公開第２０１７／０９６１６２号において教示されている通りの）公知の方法は、形質導入が、固定化／接着された細胞に対して実施されるように前もって（通常、アッセイの２４時間前又はオーバーナイトで）標的細胞をプレーティングするアッセイ前工程を含む。

抗体レベルの定量化のためのＥＬＩＳＡの使用は公知であり、現在用いられている。上記の形質導入阻害アッセイよりもはるかに迅速に完了するが、それは（ＮＡｂレベル特異的ではなく）全体的な抗体レベルのみを測定するため、形質導入阻害の機能的な情報を提供しない。そして―ＴＩＡ法とは対照的に―ＮＡｂ力価を決定する方法を提供しない。細胞結合及び標識ウイルス粒子のＦＡＣＳベースの検出及び内在化ベクターゲノムのｑＰＣＲ検出（Ｐ．Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．２０１９）等の他の方法は、ＥＬＩＳＡよりも潜在ＮＡｂのより正確な結果を提供することが期待されるが、細胞核における機能的ベクターゲノムの送達の成功について情報を提供しない。

ＴＩＡ法にかかる時間を短縮しようとすると、深刻な障害に遭遇する傾向がある。第一に、アッセイ感度の問題がある。ｒＡＡＶレポーターが標的細胞を形質導入するためのインキュベーション時間を短縮することにより、不十分なシグナルが生じるリスクがある。従って、ＮＡｂ力価が低いと記録される患者は、実際には、血液循環中に、ウイルスベクターの形質導入を阻止するのに十分なＮＡｂを有している場合がある。用いるｒＡＡＶ－レポーターの量を増やすことによってこの問題を解決しようとすると、結果生じるシグナルをバックグラウンドから区別するという点で、十分にロバストなアッセイシグナル（Ｚ’ファクター）を生じさせることに問題がもたらされる。Ｚ’ファクター（Ｔｈｅ Ｚ－ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ Ｚ’－ｆａｃｔｏｒ）は、シグナルがバックグラウンドからどれだけよく区別されるかを決定する際に広く用いられているアッセイの質のパラメータであり、とりわけＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２，１９９９）に論じられている。

従って、ｒＡＡＶレポーターの、標的細胞との２４時間（又はそれ以上）のインキュベーションを必要とせずに、ＮＡｂ力価を確実に測定することができるアッセイ法についてのニーズがある。１日以内又は代替的にオーバーナイトで結果を迅速にターンオーバーできる、ＮＡｂ力価レベルを検出するためのロバストなアッセイを開発することが望ましい。低濃度の抗体でも、ロバスト性をなお維持しつつ（例、０．５超のＺ’を有する）、ＮＡｂ力価を確実に測定できるアッセイ法についてのニーズがある。

発明の要旨
本発明は、試料の阻害力価（ＮＡｂ力価）の当日の決定又は翌日／オーバーナイトの決定のいずれかを可能にするプロトコルを用いるルシフェラーゼベースの形質導入阻害アッセイ（ＴＩＡ）に関する。この方法の重要な構成要素は、非常に低いレベルの発現で強力な発光シグナルを生じさせ得る、合成高輝度ルシフェラーゼ（「ＢｒｉｇｈｔＬｕｃ」）である。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書で提供されるＴＩＡが、わずか３時間の形質導入後に首尾よく形質導入を検出することができることを見出した。特に、本発明者らは、種々のパラメータ（例、用いるベクターの量、細胞数、又はＭＯＩ）の最適化が、わずか３時間の形質導入後でもロバストなアッセイシグナル（Ｚ’＞０．５）を確保できることを見出した。

従って、一態様においては、本発明は、対象からの試料中の着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を決定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）着目したキャプシドを含むウイルスベクターの粒子を、（１）種々の希釈の試料を含む１以上の参照溶液中、及び（２）少なくとも１の対照溶液中でインキュベーションし、パート（ａ）のウイルスベクターがルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含む工程；
（ｂ）工程（ａ）からの各溶液を、着目したウイルスベクターによる感染に感受性である標的細胞の集団に曝露する工程；
（ｃ）設定された時間間隔の間待機し、形質導入が起こるのを可能にする工程；
（ｄ）ルシフェラーゼのための基質を参照溶液及び対照溶液に添加し、ルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）を測定する工程；
（ｅ）少なくとも１の対照溶液中のルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）を参照溶液中のルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）と比較する工程；並びに
（ｆ）ＮＡｂ力価を算出する工程；
を含むルシフェラーゼを用いる形質導入阻害アッセイ（ＴＩＡ）を含み：
（ｉ）工程（ｃ）における設定された時間間隔が２４時間未満、場合により１９時間以下、場合により１２時間以下、場合により８時間以下、場合により６時間以下、及び場合により３時間であり；並びに
（ｉｉ）ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を提供する合成ルシフェラーゼである
方法を提供する。

「着目したウイルスベクターに対するＮＡｂ力価」は、ウイルスキャプシドに対するＮＡｂ力価を指すと理解されるべきである。「着目したウイルスベクター」は、着目したキャプシドを含むウイルスベクターを指すと理解されるべきである。

この方法の重要な構成要素が、合成高輝度ルシフェラーゼ（「ＢｒｉｇｈｔＬｕｃ」）である。これは、非常に低いレベルの発現でロバストな発光シグナル（０．５超のＺ’）を生じさせ得る。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書中に提供される本発明の方法が、形質導入のわずか３時間以内に、効果的な形質導入、即ち遺伝子発現をもたらす形質導入を検出できることを見出した。

従って、本発明の更なる態様は、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含むか又はキャプシドで包むＡＡＶウイルスベクターであって、ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を提供する合成ルシフェラーゼである、ＡＡＶウイルスベクターを提供する。

組換えベクターゲノムは自己相補的であり得る。組換えベクターゲノムは、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された非天然プロモーターを含み得る。プロモーターはＣＭＶプロモーターであり得る。ＡＡＶウイルスベクター及び／又はコードされたルシフェラーゼは、本明細書で更に定義される通りであり得る。

ＡＡＶウイルスベクターは、ルシフェラーゼのための基質を含む試薬と共に提供され得る。

従って、本発明は、ルシフェラーゼのための基質を含む試薬と共に、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含むか又はキャプシドで包む本発明のＡＡＶウイルスベクターを含むキットを更に提供する。キットは、本発明の方法を実施するための指示書を更に含み得る。

以下により詳細に記載されるように、本発明の方法の更なる利点は、それが標的細胞の懸濁液に対して実施され得ること、そして標的細胞が事前にプレーティングされる必要がないことである。これにより、懸濁液中の標的細胞（例、解凍された標的細胞の懸濁液を含む）を、該方法に先立つプレーティング工程を必要とせずに、該方法において直接用いることが可能になる。

従って、本発明のキットは、標的細胞を含む容器を更に含み得る。標的細胞は懸濁液状であり得る。キット又は容器は、分離手段又は冷却手段を含み得る。

本明細書中に開示の方法において用いるための標的細胞の継代数は、２５を超えないことが好ましい。

ホタルルシフェラーゼは当該分野で周知である。参照ホタルルシフェラーゼは、ここで配列番号１として提供される。従って、合成ルシフェラーゼは、配列番号１による配列を有するホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を有し得る。

合成ルシフェラーゼは公知である。かかる「合成」ルシフェラーゼは、一般に天然に生じるルシフェラーゼに由来するが、その１以上の特性を最適化して、例えば、増強された発光、より高い安定性、より小さなサイズ等を提供するよう―多くの場合相当程度―改変される。かかる改変には、一般に、１以上のタンパク質サブユニットを取り除く；及び／又はルシフェラーゼのアミノ酸配列を改変することによる、サイズの縮小が含まれる。かかる改変には、保存的又は非保存的な置換、付加又は欠失が含まれ得る。

合成ルシフェラーゼの増強された発光は、合成ルシフェラーゼ及びその基質の発光シグナル（ＲＬＵ）並びにホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質の発光シグナル（ＲＬＵ）を同一条件下で測定すること（それにより比較の実施が可能になる）によって決定され得る。合成ルシフェラーゼ及びその基質のシグナル（ＲＬＵ）は、ホタル及びそのルシフェリン基質のシグナル（ＲＬＵ）よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、又はそれ以上強くてもよい。本発明の方法と共に用いるための合成高輝度ルシフェラーゼは、上記で定義されたホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質よりも少なくとも８０～１００倍又はそれ以上のシグナルを有することが好ましい。

特に好ましい合成高輝度ルシフェラーゼは、５０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、又は２０ｋＤａ未満であり得る。合成高輝度ルシフェラーゼはＡＴＰ非依存性であり得る。

合成高輝度ルシフェラーゼは、基質としてフリマジン又はセレンテラジンを用い得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、フリマジン又はセレンテラジンの任意の公知の好適な誘導体又は変異体、又は任意の他の好適な公知の基質を用い得る。基質の選択は、該方法のために選択された合成高輝度ルシフェラーゼに応じて異なり、関連分野の当業者に困難をもたらさない。

合成高輝度ルシフェラーゼは、商品名「ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）」（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国特許第８，５５７，９７０号）を有する配列番号２による配列を含み得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、配列番号２と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列を含み得る。

代替的に、合成高輝度ルシフェラーゼは、商品名「ＴｕｒｂｏＬｕｃ（登録商標）」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有する配列番号３による配列を含み得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、配列番号３と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、配列番号３と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列を含み得る。

代替的に、合成高輝度ルシフェラーゼは、商品名「Ｌｕｃｉａ」（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を有する配列番号４による配列を含み得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、配列番号４と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得る。合成高輝度ルシフェラーゼは、配列番号４と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列を含み得る。

上記の合成高輝度ルシフェラーゼの均等物もまた、本発明の方法の範囲内に含まれる。合成高輝度ルシフェラーゼは、それが上記定義の通りのホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を有することの試験を満たすという条件で、本発明の方法において用いられ得る。

少なくとも１の対照溶液は、着目したウイルスベクターに対する抗体を欠く陰性対照溶液を含み得る。少なくとも１の対照溶液は、着目したウイルスベクターに対する抗体を欠く第１の陰性対照溶液、及び着目したウイルスベクターの形質導入を最大限に阻害するのに十分な濃度の中和抗体を含む第２の陽性対照溶液を含み得る（以下の実施例４においては、完全な１００％阻害を達成することは、必ずしも実用的又は必要であるとは限らない）。陽性対照溶液は、ＩＶＩＧ（インビトロ免疫グロブリン）の溶液であり得る。ＩＶＩＧ溶液は一般に、着目したウイルスベクターのあり得る最大限の阻害を確実にするのに十分な高濃度であり得る。ＩＶＩＧは、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度であり得る。少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度が好ましい。

少なくとも１の対照溶液が陽性対照溶液を含む場合、該方法は、陽性対照溶液の５０％阻害レベル（ＥＣ５０）を確立するために、陽性対照溶液を段階希釈し、段階希釈について上記の工程（ａ）～（ｄ）を実施する工程を含み得る。

患者からの試料は、一般的に血漿試料である。

標的細胞の集団は、少なくとも２０，０００又は２５，０００の標的細胞を含み得る。標的細胞の集団は、少なくとも５０，０００の標的細胞を含み得る。標的細胞の集団は、少なくとも１００，０００の標的細胞、１５０，０００の標的細胞又はそれ以上を含み得る。

標的細胞は、試験されるウイルスベクターによって効率的に形質導入され得る任意の哺乳動物細胞であり得る。特に、標的細胞は、ＨＥＫ－２９３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、２９３、Ｂ－５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、Ｈｕｈ７、ＨＥＲ、ＨＥＫ、ＨＥＬ、又はＨｅＬａ細胞であり得る。標的細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であり得、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり得る。当業者は、試験される特定の着目したウイルスベクターに基づいて、本発明の方法で用いるための細胞種を容易に選択することができる。

本明細書で言及されるウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス粒子であり得る。ＡＡＶ粒子は、天然に生じるＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はそれらの混合物のキャプシド又はそれらに由来するキャプシドを有し得る。ＡＡＶ５は、ＴＩＡにおいて従来用いられている細胞を効果的に形質導入しないので興味を引き、従って、本発明の方法は、依然としてロバストなシグナルを得ながら、ＡＡＶ５と共にＴＩＡを用いる方法を提供する。従って、一態様においては、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５のキャプシド又はそれに由来するキャプシドを有する。代替的に、ＡＡＶ粒子は、天然に生じない／合成の／改変されているキャプシドを有し得る。かかるキャプシドは、ＡＡＶ３Ｂ由来であり得、そして特に、国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号３１、４６、４７、５４又は５６（これらはそれぞれ、本願の配列番号６、７、８、９又は１０に対応する）のいずれか１を含むキャプシド、特にキャプシドＬＫ０３（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号３１（本願の配列番号６））を有し得る。ウイルス粒子は、配列番号５によって定義されるキャプシドを有し得る。キャプシドは、上記のキャプシドに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し得る。

ウイルス粒子はレンチウイルス粒子であり得る。

該方法の工程（ａ）は、着目したウイルスベクターの粒子を１．７×１０^７～１．７×１０^５ｖｇ／ｍｌの濃度でインキュベーションすることを含み得る。例示的な濃度は８．３ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌである。

ウイルス粒子及び標的細胞は、２５０：１以下、２００：１以下、１００：１以下、５０：１以下、２５：１以下、１０：１以下、又は１：１以下であり得るｖｇ：細胞比（感染多重度（ＭＯＩ））で存在し得る。

特に、本発明者らは、種々のパラメータ（例、用いられるベクター量、細胞数又はＭＯＩ）の最適化が、本発明の方法が、形質導入のわずか３時間後でもロバストなアッセイシグナル（Ｚ’＞０．５）を生じさせることを確実にし得ることを見出した。

従って、本発明の方法は、０．５超、０．６以上、０．７以上、又は０．７５以上の算出されたＺ’値を有し得る。

インキュベーション工程（ａ）は、試料中に存在する中和抗体がウイルス粒子に結合して中和することを可能にする任意の長さの時間であり得る。これは、１時間、２時間、３時間、又はそれ以上の場合がある。

試料希釈剤は、健常なヒト血漿を含み得るか、又はそれであり得る。代替的には、それは、ＩｇＧが枯渇したＦＢＳであり得るウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み得る。試料希釈剤は、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭであり得るＤＭＥＭを更に含み得る。

試料及び／又は陽性対照の希釈は、段階希釈を含み得る。段階希釈は、２倍の希釈倍率を含み得る。段階希釈は、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：１０２４、１：２０４８、１：４０９６等の１以上を含み得；及び／又は１：１０、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００等の１以上を含み得る。段階希釈は、５～１５の希釈物を含み得る。段階希釈は、８～１１の希釈物を含み得る。用いられる希釈物の数は当業者にとって明らかである。

公知の方法とは対照的に、本発明の方法は、事前にプレーティングされている標的細胞の使用を必要としない。本発明の方法は、標的細胞が固定化されることも、アッセイプレートに接着されることも必要としない。本発明者らは、驚くべきことに、懸濁液中の標的細胞に対して形質導入を実施するＴＩＡ法が非常に効果的であることを見出した。いかなる理論にも拘束されることないが、本発明者らは、懸濁液中の標的細胞に対して形質導入工程を実施することが、アッセイの感度に肯定的な影響を有し得ると推測している。

従って、本発明の方法の工程（ｂ）及び工程（ｃ）は、懸濁液中の標的細胞の集団に対して実施され得る。従って、工程（ｂ）は、工程（ａ）からの各溶液を、着目したウイルスベクターによる感染に感受性である懸濁液中の標的細胞の集団に曝露する工程として定義され得る。

工程（ｂ）は、アッセイプレート上に標的細胞の集団を提供し、それに溶液を加える工程を含み得る。アッセイプレートは、マルチウェルアッセイプレートであり得る。標的細胞が懸濁液中にあるか否かに関わらず、アッセイプレートが用いられ得る。

アッセイの前に細胞をプレーティングする必要がないことの利点は、複雑さが軽減されること、及びアッセイ全体にかかる時間が短縮されることである。従って、本発明は、全体の所要時間及び形質導入時間が大幅に短縮されるアッセイを提供する。

従って、本発明の方法は、最初から最後まで２４時間以下の期間内に実施され得る。

工程（ｄ）は、基質を添加する前に、細胞を溶解して合成ルシフェラーゼを溶液中に放出する工程を含み得る。代替的に、事前に細胞を溶解する必要なしに細胞に浸透できる基質が用いられ得る。別の代替として、合成ルシフェラーゼは、標的細胞から溶液に分泌され得る場合がある。

ＮＡｂ力価は、様々な方法で決定又は定量化され得る。

ＮＡｂ力価は、得られたシグナル（ＲＬＵ）が対照溶液で得られたシグナル（ＲＬＵ）の５０％である参照溶液の希釈度として、上記の工程（ｆ）において算出され得る。これは、参照溶液（複数可）の希釈物と対照溶液（複数可）の希釈物との間の単純な視覚的比較として算出され得る。

５０％の阻害は、陰性対照に対して比較され得る。

本発明の方法の工程（ｆ）において、ＮＡｂ力価は、参照溶液データ（即ち、参照溶液から得られたＲＬＵ値）を曲線に近似し、５０％の中和が生じる正確な半最大値を得るために非線形回帰モデルを用いることにより算出され得る。非線形回帰モデルは、各試料希釈物からの発光シグナル（ＲＬＵ）に適用され得る。非線形回帰モデルは、陽性（最大阻害）及び／又は陰性（０％阻害）対照による正規化後、各試料希釈物からの発光シグナル（ＲＬＵ）に適用され得る。ＮＡｂ力価は、陽性（最大阻害）及び陰性（０％阻害）対照の両方による正規化後、各試料希釈物からの発光シグナルに４パラメータ可変勾配モデル（ｆｏｕｒ－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ－ｓｌｏｐｅ ｍｏｄｅｌ）にフィッティングすることにより算出され得る。

ＮＡｂ力価は、５０％の形質導入阻害（ＴＩ５０）での補間力価として算出され得る。

本発明の方法は、ＥＬＩＳＡよりも高い精度で陰性ＮＡｂ試料と陽性ＮＡｂ試料とを区別するのに十分な感度がある。特に、本発明の方法により、患者の集団が、治療において投与されるウイルスベクターに対するそれらのＮＡｂ力価に基づいて、遺伝子治療に対するそれらの適格性又は適合性を決定するために、短期間で迅速かつ確実に階層化されることが可能になる。

従って、本発明の別の態様は、患者が、着目したキャプシドを含むウイルスベクターを用いる遺伝子治療に適格であるか否かを決定する方法であって、上記で定義された方法を用いて前記ウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価（即ち、遺伝子治療ウイルスベクターにおける着目したキャプシドに特異的なＮＡｂ力価）を決定すること、及びそれを確定又は所定の閾値と比較することを含み、ＮＡｂ力価が閾値以下である場合、患者が該ウイルスベクターを用いる遺伝子治療に適格である、方法を提供する。

ＮＡｂ力価が許容可能である（従って患者が遺伝子治療に適格である）とみなされる閾値は、当業者が、例えば、同一又は類似の粒子を有するベクター粒子による臨床経験に基づいて、過度の負担なしに決定することができるものである。

患者が現在遺伝子治療に適格ではないことを示すＮＡｂ力価を有すると定義される場合、当該技術分野で公知の１以上の従来法が、患者の血漿からＮＡｂを除去／枯渇させるか、又は少なくともＮＡｂ力価を閾値レベル以下に減少させるために用いられ得、それにより患者は遺伝子治療に適格となる。アフェレーシス／血漿交換等の技術は、病原性免疫グロブリンを除去／枯渇させるために医療機関で用いられ得る臨床技術である。これらの技術は、各投与後にＡＡＶに対するＮＡｂ力価を２～３倍減少させ得る。しかし、一部の免疫グロブリンは他の免疫グロブリンよりもはるかに長い半減期を有するため、数ラウンドの血漿交換が必要になり得る。特に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルは「リバウンド」現象を特徴とし、免疫抑制療法を併用しなくても４８時間以内にアフェレーシス前のレベルの４０％に戻り得る。

本明細書で言及される血漿交換の方法は、二重濾過血漿交換（ＤＦＰＰ）であり得る。

従って、本発明の別の態様は、血漿交換又は免疫グロブリンの標的枯渇等の、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに特異的な免疫グロブリンの枯渇の進行を患者においてモニタリングする方法であって：
（ａ）患者からの試料に対して本発明の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇のラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定する工程；
（ｂ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価が遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定する工程；
及び場合により
（ｃ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価に基づいて、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが適切であるか否かを決定する工程
を含む、方法を提供する。

関連する態様において、本発明は、遺伝性障害を治療する方法において用いるためのＡＡＶウイルスベクターであって、前記方法が：
（ａ）患者に対して免疫グロブリン枯渇の方法を実施すること；
（ｂ）本発明の方法を用いて、免疫グロブリンの枯渇の進行をモニタリングすること；及び
（ｃ）免疫グロブリンが十分に枯渇す時点で、ＡＡＶウイルスベクターを投与すること
を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターが、遺伝性疾患に関与するポリペプチドをコードする導入遺伝子を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターがキャプシドを含み、前記患者がキャプシドに対する抗体を有する、ＡＡＶウイルスベクター
を提供する。

設定された時間間隔は、とりわけ、本発明の方法において成功した形質導入に必要な時間の長さに影響される。設定された時間間隔は、２４時間以下、１９時間以下、１２時間以下、９時間以下、又は６時間以下であり得る。

免疫グロブリン枯渇の方法は、アフェレーシス／血漿交換又は免疫グロブリンの標的枯渇等、当該技術分野で公知の任意のかかる方法であり得る。免疫グロブリンの標的枯渇は、免疫グロブリンに特異的であるか、又は着目したウイルスベクターに対して特異性を有するＩｇＧ若しくは抗体に特異的である親和性マトリックス又は結合部分に依存する方法を含み得る。

免疫枯渇の方法は、免疫グロブリンを特異的に標的とし得る。免疫枯渇の方法は、ＩｇＧに結合する体外デバイスを用いてもよい。代替的に、免疫枯渇の方法は、ヒトＩｇＧを消化する酵素（ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ等）の投与を含み得る。免疫枯渇の方法は、血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を減少させる薬剤を対象に投与する方法を含み得る。

薬剤又は酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス等のストレプトコッカス菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼ、或いはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）若しくはストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）等のストレプトコッカス菌由来、又はコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）又はエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼである。薬剤又は酵素は、配列番号１１若しくは配列番号１２による配列、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片又は変異体を含み得る。

このモニタリングする方法は、任意の免疫グロブリン枯渇の前に得られる初期ＮＡｂ力価を参照して実施され得る（例えば、患者が遺伝子治療に適格であるか否かを決定するために、本発明の方法を最初に用いる場合、それらの初期ＮＡｂ力価がわかる）。従って、「初期ＮＡｂ力価」は、患者の枯渇前のＮＡｂ力価を意味すると理解されるべきであり、従って、患者におけるＮＡｂの枯渇前レベルを指す。従って、モニタリングする方法の工程（ｃ）は、免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価を初期ＮＡｂ力価と比較して、免疫グロブリン枯渇が何らかの効果を有したか否かを決定する工程を含み得る。

モニタリングする方法は、患者に対する免疫グロブリン枯渇１以上の更なるラウンドの後に実施され得る。免疫グロブリン枯渇の更なる各ラウンドは、同一日又は連続する日に実施され得る。

従って、モニタリングする方法は、以下の工程：
（ｄ）患者からの試料に対して本発明の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること；
（ｅ）免疫グロブリン枯渇の前記更なるラウンド後のＮＡｂ力価が、遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定すること；
及び場合により
（ｆ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価に基づいて、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが適切であるか否かを決定すること
を更に含み得る。

免疫グロブリン枯渇のなお更なるラウンドが適切であるか否かを決定する工程は、免疫グロブリンの枯渇が意図した効果を有しているか否かを決定するために、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンド後のＮＡｂ力価を互いに比較する、及び場合により、初期ＮＡｂ力価と比較する、工程を含み得る。

免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが適切であるか否かを決定するには、当業者の能力の範囲内で十分である。例えば、初期ＮＡｂ力価と、１ラウンド超の免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価との間に殆ど差がない場合、患者をなお更なるラウンドの免疫グロブリン枯渇に供することは不適切であると見なされ得る。代替的に、１超のラウンドの免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価が、患者を遺伝子治療に適格にする、確定又は所定の閾値に非常に近い場合、患者をなお更なるラウンドの免疫グロブリン枯渇に供することが適切であると見なされ得る。一般に、ＮＡｂレベルがまだ閾値を上回っている場合は、以前のラウンドで有意な効果がない場合を除き、いま一度のラウンドの免疫グロブリンの枯渇は適切である。

従って、モニタリングする方法は、以下の工程：
（ｇ）患者からの試料に対して本発明の方法を実施することにより、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンド後に、設定された時間間隔内に、患者におけるＮＡｂレベルを決定すること；
（ｈ）前記以前の免疫グロブリン枯渇のラウンド後のＮＡｂ力価が、遺伝子治療の適格性について確定又は所定の閾値を下回っているか否かを決定すること；
及び場合により
（ｉ）免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが適切であるか否かを決定すること
を更に含み得る。

免疫グロブリンレベルは枯渇後にリバウンドするので、一般に、モニタリングする方法、及び免疫グロブリン枯渇のすべての必要なラウンドを、４日以内、好ましくは３日以内、及び最も好ましくは４８時間以内の期間で実施することが望ましいと理解される。従って、工程（ａ）～（ｃ）、（ａ）～（ｆ）、又は（ａ）～（ｉ）のすべては、４日の期間以内、７２時間以内、４８時間以内、又は２４時間以内に実施され得る。

工程（ｃ）、工程（ｆ）及び工程（ｉ）の免疫グロブリン枯渇の更なるラウンド（複数可）は、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの４８時間以内、好ましくは以前の免疫グロブリン枯渇の翌日のうちに実施されることが好ましい。

免疫グロブリン枯渇の更なる各ラウンドは、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの２４時間以内に実施され得る。

以下の実施例において実証されるように、血漿交換の「連続」サイクル（各サイクルは以前のサイクルの翌日に行われることを意味する）は、患者の初期ＮＡｂ力価を臨床試験適格性及び／又は遺伝子治療に適切なレベルにまで減少させることができる。特に、連続５日にわたる５サイクルの血漿交換は、患者の初期ＮＡｂ力価を最大９４％減少させると予測される。

従って、該方法は：
（ａ）２日間にわたる２ラウンドの免疫グロブリン枯渇；
（ｂ）３日間にわたる３ラウンドの免疫グロブリン枯渇；
（ｃ）４日間にわたる４ラウンドの免疫グロブリン枯渇；又は
（ｄ）５日間にわたる５ラウンドの免疫グロブリン枯渇
を含み得る。

従って、２４時間未満で得られるＮＡｂ力価の正確な測定を可能にする本発明の方法は、結果を得ることができる前に２４時間以上のインキュベーション／形質導入期間を必要とする現在公知の方法に対して明らかな利点を提供することが十分に理解される。

詳細な説明
一般的な定義
別段に定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

一般に、用語「含む」は、含むが、限定されないことを意味することが意図される。

本発明のいくつかの実施形態においては、単語「含む」は、語句「からなる」又は語句「から本質的になる」と置換される。用語「からなる」は、限定することが意図される。

本明細書において用いられる場合、「遺伝子治療」は、欠損変異対立遺伝子が機能的な対立遺伝子で置換されるか又は補充される、遺伝性疾患等の疾患を治療するための、個体の細胞及び／又は組織への核酸配列（例、遺伝子）の挿入である。血液凝固障害等の後天性疾患は、遺伝子治療によって治療され得る。

パルボウイルスファミリーの「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡのゲノムを有する小ウイルスである。これらのウイルスは遺伝子治療ベクターとして有用である。ＡＡＶはヒトにおける病原性疾患に関連していないため、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶ病因をもたらすことなく、治療用タンパク質及び薬剤をヒト患者に送達することができる。

「レンチウイルス」は、相当量のウイルスｃＤＮＡを宿主細胞のＤＮＡに組み込むことができ、非分裂細胞に効率的に感染することができるレトロウイルスの１の属であり、そのことにより、それらが遺伝子送達の効率的な手段になる。レンチウイルスは、特定の遺伝子を安定的に過剰発現させるためにも用いられ得、従って研究者はモデル系で遺伝子発現の増加の影響を検証することが可能になる。レンチウイルスベクターについての別の一般的な用途は、ヒト又は動物の細胞に新しい遺伝子を導入することである。例えば、血友病等の遺伝性疾患は、この方法で治療され得る。

「ＡＡＶベクター」又は単なる「ベクター」は、分子的方法を用いることによって野生型ＡＡＶゲノムを除去し、それを治療用遺伝子発現カセット等の非天然核酸で置換することにより、野生型ＡＡＶから誘導される。典型的には、野生型ＡＡＶゲノムの逆位末端反復配列はＡＡＶベクター中に保持される。ウイルスゲノムの全部又は一部が、ＡＡＶ核酸配列に関して非天然の核酸である導入遺伝子カセットで置き換えられているため、ＡＡＶベクターはＡＡＶとは区別される。

「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、又は「と反応する」という用語は、抗体、ウイルスキャプシド又はキャプシドタンパク質が分子レベルで相互作用することを意味する。従って、抗体に結合又は反応するキャプシドタンパク質は、分子レベルで抗体と相互作用する。

「中和抗体」又は「ＮＡｂ」は、ウイルスベクターが標的細胞に形質導入するのを防ぐような方法でウイルスベクターに結合する抗体である。

異なる血清型のキャプシドタンパク質は、特定の血清型に対する抗体と交差反応性であり得ることが知られている。従って、例えば、ある特定のＡＡＶ血清型、例、ＡＡＶ２に対するＮＡｂ等の抗体等の抗体は、１以上の他のＡＡＶ血清型にも結合し得る。「血清型」は、伝統的に、抗体間で、あるウイルスに対して、別のウイルスと比較して交差反応性がないことに基づいて定義される。かかる交差反応性の違いは、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基における違いによる（例、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の違いによる）。

ＡＡＶとしては、種々の天然に生じる及び天然に生じない血清型が挙げられる。かかる非限定的な血清型としては、ＡＡＶ－１、－２、－３、－３Ｂ、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－ｒｈ７４、－ｒｈｌＯ及びＡＡＶ－２ｉ８が挙げられる。

ウイルス（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルス）ベクターは、ポリヌクレオチドを安定的又は一過的に細胞に導入／送達するために用いられ得る。用語「導入遺伝子」は、ウイルスベクターを介して細胞又は生物に導入され得る、かかる異種ポリヌクレオチドを簡便に指すために用いられる。導入遺伝子としては、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、抑制性ポリヌクレオチド（例、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）に転写されるポリヌクレオチド、又は転写されない（例、転写をドライブするプロモーター等の発現制御エレメントを欠く）ポリヌクレオチド等の任意のポリヌクレオチドが広く挙げられる。

本明細書で用いられる場合、組換えＡＡＶベクター又は組換えレンチウイルスベクター等のウイルスベクターの修飾語、及び組換えポリヌクレオチド及びポリペプチド等の配列の修飾語としての用語「組換え」は、組成物が、一般的に自然界では発生しない方法で操作（即ち、改変）されていることを意味する。組換えＡＡＶの特定の例は、野生型ＡＡＶに通常は存在しないポリヌクレオチドが、ＡＡＶ粒子及び／又はゲノム内にある場合である。組換えポリヌクレオチドの特定の例は、タンパク質をコードする導入遺伝子がベクターにクローン化される場合である。用語「組換え」は、本明細書では、ＡＡＶベクター並びにポリヌクレオチド及びポリペプチド等の配列に関して常に用いられるわけではないが、ＡＡＶ及びＡＡＶベクター、並びにポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む配列の組換え形態は、いずれのかかる省略にもかかわらず、明示的に含められる。

本明細書で用いられる「核酸」又は「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、及び一本鎖の場合、線状又は環状のいずれかの形態のその相補配列の分子を指す。核酸分子を検討する際には、特定の核酸分子の配列又は構造は、配列を５’から３’方向に示すという通常の慣習に従って本明細書に記載され得る。本発明の核酸に関して、用語「単離された核酸」が用いられることがある。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、その起源である生物の天然に生じるゲノムにおいて直接隣接する配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド又はウイルスベクター等のベクターに挿入された、又は原核生物若しくは真核生物の細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。

本発明の目的のために、２の配列（２のポリペプチド配列等）のパーセント同一性を決定するためには、配列は、最適な比較目的のためにアラインメントされる（例、第２の配列との最適なアラインメントのために、第１の配列中にギャップが導入され得る）。次いで、各位置のアミノ酸が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸で占められる場合、配列はその位置で同一である。２の配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一の位置の数／参照配列中の位置の総数×１００）。

典型的には、配列比較は、参照配列の長さにわたって実施される。例えば、ユーザが、ある特定の（「試験」）配列が配列番号１と９５％同一であるか否かを決定したいのであれば、その場合は配列番号１が参照配列である。ヌクレオチド配列が配列番号１（参照配列の例）と少なくとも８０％同一であるか否かを評価するために、当業者は、配列番号１の長さにわたってアラインメントを実施し、試験配列中において、いくつの位置が配列番号１のものと同一であったかを特定する。少なくとも８０％の位置が同一である場合、試験配列は、配列番号１と少なくとも８０％同一である。配列が配列番号１より短い場合、ギャップ又は欠落している位置は、同一ではない位置と見なさなくてはならない。

誤解を避けるために、「少なくとも８０％の同一性」、「少なくとも９０％の同一性」、「少なくとも９５％の同一性」及び／又は「少なくとも９８％の同一性」への言及はすべて１００％の同一性を暗黙的に含むこととして解釈するべきであると理解される。

当業者は、２の配列間の相同性又は同一性を決定するために利用可能な異なるコンピュータプログラムを認識している。例えば、２の配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。一実施形態においては、２のアミノ酸又は核酸配列間の同一性パーセントは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／）で入手可能）中のＧＡＰプログラムに組込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）を用いて決定される。

用語「免疫応答」は、脊椎動物対象の免疫系による抗原又は抗原決定基に対する任意の応答を指すことを意味する。例示的な免疫応答としては、体液性免疫応答（例、抗原特異的抗体の産生）及び細胞性免疫応答（例、リンパ球の活性化又は増殖）が挙げられる。

本明細書で用いられる場合、用語「中和抗体力価」又は「ＮＡｂ力価」は、患者又は対象からの試料等の試料中に存在する中和抗体（ＮＡｂ）の量を指す。本願の目的のために、抗体力価は、形質導入の５０％阻害が観察される試料の希釈度として表される。例えば、抗ＡＡＶ ＮＡｂについての試験で、１：１０の希釈度でＡＡＶベクターの形質導入が５０％阻害されることが示される場合、抗ＡＡＶ ＮＡｂの量（力価）は１：１０である。

「Ｚファクター」は、アッセイのロバスト性に対する基準であり、スクリーニングウィンドウ係数（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）についての基準である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）。それは、アッセイの質を比較及び評価するための有用なツールとして広く採用されている。特に、Ｚファクターの算出は、以前の、シグナル対ノイズ比（平均シグナル値と平均バックグラウンド値との間の差をバックグラウンドの標準偏差で除したものとして定義）及びシグナル対バックグラウンド比（平均バックグラウンド値に対する平均シグナル値として算出される）の比較に置き換わるものである。Ｚファクターは：

の通りに算出され得る。
代替的に、それは、

（式中、μ_ｓは試料の平均であり、μ_ｃは対照の平均であり、σ_ｓは試料の標準偏差であり、及びσ_ｃは対照の標準偏差である）と定義され得る。

「Ｚ’－ファクター」は、対照データのみを参照することによるアッセイの質についての特徴的なパラメータである。負又はゼロに近いＺ値は、アッセイが有用なデータを生じさせるのに好適でないことを示す。０．５超のＺ値は、アッセイが好適にロバストであることを示す指標である。従って、Ｚ’ファクターは、全体的なアッセイの質の算出に適している。これは：

（式中、μ_ｃ＋は陽性対照の平均であり、μ_ｃ－は陰性対照の平均であり；σ_ｃ＋は陽性対照についての標準偏差であり；σ_ｃ－は陰性対照についての標準偏差である）と定義される。

以下の実施例中に提供されるデータ並びに上記の発明の陳述を考慮すると、本発明の方法は、偽陽性及び偽陰性を最小限に抑えるという点で、対応するＥＬＩＳＡ方法よりも正確であることが容易に理解される（図１３）。本発明の別の利点は、免疫グロブリンの「リバウンド」が起こり得る前に、（例、血漿交換を介する）免疫グロブリン枯渇の各ラウンド後の、ＮＡｂ力価の決定を可能にする迅速なＴＩＡの提供にある。これにより、今度は、免疫グロブリンの枯渇が（即ち、遺伝子治療において用いられるウイルスベクターに対する患者のＮＡｂを枯渇させることによって）患者を遺伝子治療に好適とするのに十分成功しているか否かの決定がなされること及び／又は免疫グロブリン枯渇の更なる１以上のラウンドが適切か否かを決定することが可能になる。

本発明の方法は、陰性ＮＡｂ試料と陽性ＮＡｂ試料とを、ＥＬＩＳＡよりも高い正確度で区別するのに十分な感度がある。特に、本発明の方法により、患者の集団が、治療において投与されるウイルスベクターに対するそのＮＡｂ力価に基づいて、遺伝子治療に対するそれらの適格性又は適合性を決定するために、短期間で迅速かつ確実に階層化されることが可能になる。

従って、ＮＡｂ力価の正確な測定が６時間以内に得られることを可能にする本発明の方法は、結果が得られ得る前の２４時間以上のインキュベーション／形質導入期間を必要とする現在公知の方法に対して明らかな利点を提供することが十分に理解される。

図の説明
これより、本発明を、以下の図を参照して、非限定的な例として説明する。
図１は、特に好ましい、着目したＢｒｉｇｈｔＬｕｃ（商品名ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））についての反応図を示し、その基質の変換及び光の放出がＡＴＰ非依存性であることを示している。 図２（２Ａ）ＦＬＧ０９７プラスミドを用いて、ＲＣ－０１－３１と命名したＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃ（ＡＡＶ－ＢＬ）レポーター（本明細書ではｓｃＡＡＶ－ＮＬｕｃとも称する）を生成した。（２Ｂ）実施例で用いたＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターの力価及び比較基準として用いたＡＡＶ－ｅＧＦＰベクターの力価。力価は、ｑＰＣＲ及びキャプシドＥＬＩＳＡによって決定した。 図３は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターによって生じさせた発光シグナルの測定の結果を示す。パネルＡ～Ｄは、表示した希釈度で、６時間にわたってＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターとインキュベーションした１ｘ１０^５ＨＥＫ２９３Ｔ細胞／ウェルからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ試薬の適用後１時間にわたる発光アッセイシグナルの成績を示す。パネルＥ～Ｈは、２４時間のインキュベーション後の結果を示す。（３Ａ）６時間の形質導入後の原発光シグナル。（３Ｂ）６時間で非形質導入（ＮＴ）細胞に対して算出したＳ：Ｂ（シグナルバックグラウンド比）。（３Ｃ）６時間のインキュベーション後の変動係数（「ＣＶ」）値（全体を通して（標準偏差／平均）^＊１００と定義）。（３Ｄ）６時間のインキュベーション後のＺ値。 図３は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターによって生じさせた発光シグナルの測定の結果を示す。パネルＡ～Ｄは、表示した希釈度で、６時間にわたってＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターとインキュベーションした１ｘ１０^５ＨＥＫ２９３Ｔ細胞／ウェルからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ試薬の適用後１時間にわたる発光アッセイシグナルの成績を示す。パネルＥ～Ｈは、２４時間のインキュベーション後の結果を示す。（３Ｅ）２４時間の形質導入後の原発光シグナル。（３Ｆ）２４時間で非形質導入（ＮＴ）細胞に対して算出されたＳ：Ｂ（シグナルバックグラウンド比）。（３Ｇ）２４時間のインキュベーション後のＣＶ値。（３Ｈ）２４時間のインキュベーション後のＺ値。 図３は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターによって生じさせた発光シグナルの測定の結果を示す。（３Ｉ）試験したアッセイ条件のまとめ。 図４は、２．５ｘ１０^４、５ｘ１０^４、又は１０ｘ１０^４細胞／ウェルの形質導入の３、６、又は２４時間において、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの１／３００，０００、１／３０，０００、及び１／３，０００希釈物からの発光シグナルの測定結果を示す。試験した時点は、３時間（４Ａ～４Ｄ）、６時間（４Ｅ～４Ｈ）、及び２４時間（４Ｉ～４Ｌ）であった。非形質導入細胞からのシグナルを、（４Ａ）、（４Ｅ）及び（４Ｉ）に示す。１／３００，０００のベクター希釈物からのシグナルを（４Ｂ）、（４Ｆ）及び（４Ｊ）に示す。１／３０，０００のベクター希釈物からのシグナルを（４Ｃ）、（４Ｇ）及び（４Ｋ）に示し、ベクターの１／３，０００希釈物からのシグナルを（４Ｄ）、（４Ｈ）及び（４Ｌ）に示す。 図４は、２．５ｘ１０^４、５ｘ１０^４、又は１０ｘ１０^４細胞／ウェルの形質導入の３、６、又は２４時間において、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの１／３００，０００、１／３０，０００、及び１／３，０００希釈物からの発光シグナルの測定結果を示す。試験した時点は、３時間（４Ａ～４Ｄ）、６時間（４Ｅ～４Ｈ）、及び２４時間（４Ｉ～４Ｌ）であった。非形質導入細胞からのシグナルを、（４Ａ）、（４Ｅ）及び（４Ｉ）に示す。１／３００，０００のベクター希釈物からのシグナルを（４Ｂ）、（４Ｆ）及び（４Ｊ）に示す。１／３０，０００のベクター希釈物からのシグナルを（４Ｃ）、（４Ｇ）及び（４Ｋ）に示し、ベクターの１／３，０００希釈物からのシグナルを（４Ｄ）、（４Ｈ）及び（４Ｌ）に示す。 図４は、２．５ｘ１０^４、５ｘ１０^４、又は１０ｘ１０^４細胞／ウェルの形質導入の３、６、又は２４時間において、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの１／３００，０００、１／３０，０００、及び１／３，０００希釈物からの発光シグナルの測定結果を示す。（４Ｍ）：表示したＭＯＩでのＡＡＶ－ＢＬによる３時間、６時間、又はオーバーナイトの形質導入後の発光シグナル成績。パネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、それぞれ２５，０００細胞及び５０，０００細胞についてのすべての試験ＭＯＩ並びに試験時点において得られたシグナルを表す。 図５は、ＩＶＩＧを用いるアッセイ感度を示す。（５Ａ）表示したＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの希釈物を６時間にわたる形質導入に用いる、１：２０００ＩＶＩＧによる、１％陰性血漿（即ち、希釈剤として通常の増殖培地（ＤＭＥＭ）を含む１％陰性血漿）の存在下での１時間のインキュベーション後の阻害試験。（５Ｂ）６時間の形質導入後の、表示したｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃの希釈物の、阻害後に残存する発光シグナルのパーセンテージ。 図６は、ＩＶＩＧの中和力価の測定結果を示す。ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの１／１，５００（６Ａ）及び１／１５，０００（６Ｂ）希釈物を、２％陰性血漿の存在下で一連のＩＶＩＧ希釈物により１時間かけて中和した。次に、１ｘ１０^５細胞／ウェルを中和した材料とともに６時間インキュベーションした。非形質導入（ＮＴ）及び２％陰性血漿の存在下で形質導入した細胞を、それぞれ陽性及び陰性対照として用いた。ＥＣ５０値を列記する。 図７は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いる本発明の６時間ＴＩＡプロトコル（「ｒＴＩＡ」）と、ＡＡＶ－ｅＧＦＰレポーターベクター（「ｃＴＩＡ」）又はＡＡＶ－ホタルルシフェラーゼレポーターベクターを用いるより従来的なＴＩＡ間の比較を示す。（７Ａ）２６試料を用い、「ｒＴＩＡ」プロトコル及び「ｃＴＩＡ」プロトコルを用いて生じさせたＴＩ５０値間の相関。（７Ｂ）３６試料を用い、「ｃＴＩＡ」プロトコル及び「ｒＴＩＡ」プロトコルを用いて生じさせた離散力価値間の相関。 図７は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いる本発明の６時間ＴＩＡプロトコル（「ｒＴＩＡ」）と、ＡＡＶ－ｅＧＦＰレポーターベクター（「ｃＴＩＡ」）又はＡＡＶ－ホタルルシフェラーゼレポーターベクターを用いるより従来的なＴＩＡ間の比較を示す。（７Ｃ）６時間の形質導入後にＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃ及びＡＡＶ－Ｆｉｒｅｆｌｙベクターから得られた発光シグナルの比較。 図８は、６時間後及び１６時間後のＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いる本発明のＴＩＡプロトコルの結果間の比較を示している。 図９は、１６時間後のＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いる本発明のＴＩＡプロトコル（「ｒＴＩＡ」）と、ＡＡＶ－ｅＧＦＰレポーターベクターを用いるより従来型のＴＩＡ（「ｃＴＩＡ」）との比較を示す。（９Ａ）２５試料を用い、「ｒＴＩＡ」プロトコル及び「ｃＴＩＡ」プロトコルを用いて生じさせたＴＩ５０値間の相関。（９Ｂ）３３試料を用い、「ｃＴＩＡ」プロトコル及び「ｒＴＩＡ」プロトコルを用いて生じさせた離散力価値間の相関。試料希釈剤は、ヒト血漿試料「ＴＣＳ１３７」であった。 図１０は、種々の試料希釈剤及び濃度において、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いて、本発明のＴＩＡプロトコルによって１６時間後に得られたＴＩ５０値を示す。「ＴＣＳ１３７」＝陰性患者血漿。「ＩｇＧＤ」＝ＩｇＧが枯渇したＦＢＳ。 図１１は、１６時間後の、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いる本発明のＴＩＡプロトコル（「ｒＴＩＡ」）と、ＡＡＶ－ｅＧＦＰレポーターベクターを用いるより従来型のＴＩＡ（「ｃＴＩＡ」）との比較を示す。（１１Ａ）２４試料を用い、「ｒＴＩＡ」プロトコル及び「ｃＴＩＡ」プロトコルを用いて生じさせたＴＩ５０値間の相関。（１１Ｂ）３２試料を用い、「ｃＴＩＡ」プロトコル及び「ｒＴＩＡ」プロトコルを用いて生じさせた離散力価値間の相関。試料希釈剤は、５０％ＩｇＧ枯渇ＦＢＳを添加した、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭであった。 図１２は、６時間後及び１６時間後に、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いて得られたＴＩ５０値の比較を示す。（１２Ａ）３２試料を用い、試料希釈剤として陰性患者血漿（ＴＣＳ１３７、ｘ軸）又はＩｇＧ枯渇ＦＢＳ（ｙ軸）のいずれかを用いてＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターにより１６時間で得られたＴＩ５０値間の相関。（１２Ｂ）試料希釈剤として陰性患者血漿（「ＴＣＳ１３７」）を用いて、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクター（ｘ軸）６時間又はＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクター（ｙ軸）１６時間のいずれかにより得られたＴＩ５０値間の相関。 図１２は、６時間後及び１６時間後に、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターを用いて得られたＴＩ５０値の比較を示す。（１２Ｃ）２８試料を用い、試料希釈剤としてＩｇＧ枯渇ＦＢＳを用いて、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクター（ｘ軸）６時間又はＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクター（ｙ軸）１６時間のいずれかにより得られたＴＩ５０値間の相関。（１２Ｄ）（１２Ａ）、（１２Ｂ）、及び（１２Ｃ）からの結果のまとめ。 図１３は、血友病Ｂ患者におけるＴＩＡ及びＥＬＩＳＡトリアージの比較を示す。６２患者試料について、オーバーナイトのＴＩＡプロトコルを用いてＴＩ５０を決定し、ＡＡＶ ＥＬＩＳＡを用いて抗ＡＡＶ抗体価を決定した。１：８のＴＩ５０及び１０μｇ／ｍＬの抗ＡＡＶ抗体価をカットオフとして用いて、遺伝子治療に対する患者の適格性を決定した。白丸（左下）は、ＥＬＩＳＡ法及びＴＩＡ法によって陰性（即ち、ＡＡＶ遺伝子治療を可能にするのに、受け入れ可能に十分低い中和力価を有する）と判明した試料を示す。白四角（右下）は、ＴＩＡ法では陰性であるが、ＥＬＩＳＡ法では陰性でない、即ち偽陽性であることが判明した試料を示す。十字白丸（左上）は、ＥＬＩＳＡ法では陰性であるが、ＴＩＡ法では陰性でない、即ち偽陰性であることが判明した試料を示す。黒丸（右上）は、陽性である（即ち、指定されたカットオフポイントよりも高い中和力価を有する）ことが判明した試料を示す。破線の円は、本発明の方法を用いて正しい値が確認された後、ＥＬＩＳＡを介して得られた値が偽陽性／偽陰性を表す場所を示す。 図１４は、二重濾過血漿交換（ＤＦＰＰ）を受けている３６患者からの試料の解析を示し、抗ＡＡＶ ＥＬＩＳＡとＧＦＰベースのＴＩＡを比較している。（１４Ａ）ＩＶＩＧ標準曲線（平均＋ＳＥＭ）による抗ＡＡＶ ＥＬＩＳＡアッセイを用いる、各ＤＦＰＰラウンドの前（「前」）及び後（「後」）の試料の解析。（１４Ｂ）ＧＦＰベースのＴＩＡを用いる、ＤＦＰＰ前後の試料のＡＡＶ中和力価解析。横線は群平均を示す。（Ｃ）それぞれ１０μｇ／ｍＬ及び１：１００のカットオフを用いる、ＥＬＩＳＡ及びＧＦＰベースのＴＩＡトリアージの比較。白丸（左下）は、ＥＬＩＳＡ法及びＴＩＡ法によって陰性（即ち、ＡＡＶ遺伝子治療を可能にするのに、受け入れ可能に十分低い中和力価を有する）と判明した試料を示す。白四角（右下）は、ＴＩＡ法では陰性であるが、ＥＬＩＳＡ法では陰性でない、即ち偽陽性であることが判明した試料を示す。線入り白丸（左上）は、ＥＬＩＳＡ法では陰性であるが、ＴＩＡ法では陰性でない、即ち偽陰性であることが判明した試料を示す。黒丸（右上）は、陽性である（即ち、指定されたカットオフポイントよりも高い中和力価を有する）ことが判明した試料を示す。 図１５は、本発明のＴＩＡ（ＢＬ－ＴＩＡ）を用いる、ＤＦＰＰの「連続」サイクルあり又は無しでの、試料の解析を示す。（１５Ａ）ＢＬ－ＴＩＡを用いる各ＤＦＰＰラウンドの前（「前」）及び後（「後」）の試料の解析。黒丸は「連続」サイクルを示し、白丸は「不連続」を示す。（１５Ｂ）３回の「連続」ＤＦＰＰサイクル後のＴＩ５０減少及び回帰分析（ｎ＝４）。（Ｃ）５の「不連続」ＤＦＰＰサイクルと３、４、若しくは５の「連続」ＤＦＰＰサイクルとのＴＩ５０減少の比較。サイクル５「前」の場合、最上部の黒丸（実線）が白丸（破線）と重なるため、黒丸のみが見えることに注意。

実施例
それぞれ６時間プロトコル及び１６時間プロトコルと呼ばれる、９時間未満又はオーバーナイトで完了され得る２のプロトコルが開発された。両プロトコルは同量のｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃレポーターベクター（即ち、１／６，０００、８．３ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌに相当）を用い、試験した３０試料に対して同等のＴＩ５０値をもたらす。

アッセイの感度及びロバスト性を、開発中に並行して検討した。一方では、試料の中和活性に対するこれらの方法の感度は、用いられるベクターの量に反比例する。これは、阻害中に用いられるベクターの量が多いほど、アッセイシグナルがベクターの中和を介して有意に阻害される可能性が低くなるためである。他方、形質導入及び導入遺伝子の発現の成功はＭＯＩに依存するため、アッセイシグナルのロバスト性は用いるベクターの量に正比例する。従って、アッセイの感度及びロバスト性のバランスをとるために、短い時間枠内でロバストなアッセイシグナル（Ｚ’＞０．５）をなおもたらす最小のベクター量を求めた。レポーターｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃベクターの任意の新しいバッチは、推定のｖｇ／ｍｌ又はｖｐ／ｍｌ力価に関係なく、ロバストなアッセイシグナルをなおもたらす最薄希釈度を経験的に決定するために段階希釈することが推奨される。

細胞／ウェルの数、用いたベクターの量、及びインキュベーション時間はすべて最適化した。３時間以内に、ＡＡＶ－Ｎｌｕｃベクターの１／３０００希釈物（ｖｇ：細胞 ＭＯＩ８．３３：１）により、わずかなアッセイシグナル（Ｚ’値が０～０．５）になる。６時間以内に、ＭＯＩ０．８３：１でロバストなシグナルが取得され、同時に感度、ロバスト性、及び結果の迅速なターンオーバーについての要件が満たされる。これらの条件により、３７℃で１時間のベクター中和中に８．３ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌの濃度に変換され、１６時間の形質導入工程で日中プロトコルを延長する場合、変わることはなかった。

材料及び方法
試料
日中プロトコル及びオーバーナイトプロトコルの開発及び試験中に、いくつかの血漿試料を用いた。表示される場合、試験試料は、抗ＡＡＶ中和活性が低い健常なヒト血漿試料（「ＴＣＳ１３７」）を用いて希釈した。ＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＬＧＣから提供された、他のすべての試験試料のリストについては、以下を参照。

アッセイプロトコル
６時間又は１６時間（即ちオーバーナイト）で結果をもたらすことができるインビトロ形質導入阻害アッセイを開発し、試験した。形質導入時に、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクター（「ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃ」と命名、配列番号５によるキャプシドを使用）は、上流のＣＭＶプロモーターから商業的にＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）として知られているルシフェラーゼを発現する自己相補的ＡＡＶゲノムを送達する。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼは、小さな（１９．１ｋＤａ）ＡＴＰ非依存性のルシフェラーゼで、フリマジンをフリムアミドに効率的に変換し（図１）、明るくて長く持続する（グロータイプ）発光を生じさせる。本実施例は、本明細書で用いられるＡＡＶ－キャプシドに対するＮＡｂを検出するように設定されるが、アッセイ設計の原理が一般的に適用可能であることが理解される。

本アッセイにおいては、陽性対照は１：１０００希釈物（５０マイクログラム／ミリリットルに相当）の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）をスパイクした試料希釈剤から成り、一方陰性対照は試料希釈剤のみである。両方の対照にｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃベクターを添加し、シグナルの倍数差（陰性／陽性対照）は１００倍を超えると予想される。試料希釈剤は、有意なＡＡＶ中和活性を欠く、ヒト血漿（上記のように供給）又は、市販のＩｇＧ枯渇ＦＢＳの希釈剤（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．ｎｏ．３１０５３－０２８）中）（実施例９を参照）のいずれかであり得る。

アッセイは、２の９６ウェルプレートを用いることにより実施する。試験試料を段階的に希釈してｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃと１時間かけて混合するｖ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｅｌｌｓｔａｒ ｐｒｏｄｕｃｔ ｎｏ．６５１１８０）を「中和プレート」と命名する。中和された試料及びレポーターベクターの混合物を１ｘ１０^５又は１．５ｘ１０^５のＨＥＫ２３９Ｔ細胞／ウェルとそれぞれ１６時間又は６時間インキュベーションする白色、滅菌のＴＣ（組織培養）処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９１７）を、「アッセイプレート」と命名する。

典型的には、６６μｌの試料を用いて、３３μｌのこの試料を３３μｌの事前に分注された試料希釈剤に移して混合することにより、段階希釈を生成する。次いで、得られた各試料希釈剤に、最終レポーター濃度が８．３ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌであるように、６６μｌの希釈ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃベクターを添加する。３７℃で１時間インキュベーション後、試料及びベクターの混合物を、１５μｌの試料及びベクターの混合物を１５０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を懸濁液状態で含有する６０μｌの体積（６時間プロトコル）（４連）に混合すること、又は２５μｌの試料及びベクターの混合物を１００，０００細胞を懸濁液状態で含有する５０μｌの体積（１６時間プロトコル）（３連）に混合することによりアッセイプレートに移す。本発明の方法は、細胞を十分に前もってプレーティングすることを必要とする従来のレポーターベースのＴＩＡ法とは対照的に、懸濁状態の細胞に形質導入を実施することにより、プレート上に細胞を前もって準備する必要性を回避する。タイミングは、用いる正確なプロトコルによって異なり得るが、従来のレポーターベースのＴＩＡ法においては、細胞は通常、オーバーナイトで、又はアッセイの少なくとも２４時間前にプレーティングする。

通常の増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２）下でのインキュベーション（６時間又は１６時間）後、アッセイプレートの各ウェルに、製造業者の指示に従って調製した、ルシフェラーゼのための基質を含有する７５μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ１１１０）を添加する。発光は、プレート上から５ｍｍの読み取り高さ、及び０．５ｍｓのインテグレーションタイムを用いてプレートリーダーで読み取る。

解析
本アッセイにおいては、血漿又は血清試料の中和力価は、陽性（１００％阻害）と陰性（０％阻害）対照の両方で正規化した後、各試料希釈物からの発光シグナルに４パラメータ可変勾配モデルをフィッティングすることによって算出される。主要な数値アウトプットは、５０％の形質導入阻害での補間された力価であり、本発明者らはこれを「ＴＩ５０」と命名している。ＴＩ５０は、ＮＡｂ含有量に比例して試料をランク付けする。従来のＦＡＣＳベースの形質導入阻害アッセイにおいて用いられている任意的な情報は、離散中和力価である。離散中和力価は、発光レベルがアッセイ陽性対照のレベルの５０％以上である最大の試料希釈度として定義する。

２の方法間で結果を比較（例、ｃＴＩＡと６時間ｒＴＩＡとの比較）するために、結果得られたＴＩ５０又は離散中和力価に対してスピアマンの順位相関値（ｒ）を計算する。

実施例１―ｓｃＡＡＶレポーターカセット：ＣＭＶ－ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）－ＳＶ４０ｐＡの設計
ルシフェラーゼＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．２０１２）を、ＡＡＶレポーターベクター中に含めるために選択した（複数の細胞株中でロバストな遺伝子発現をドライブできるＣＭＶプロモーターを用いる）。発現率を高めるために、第２鎖合成の必要性を回避する自己相補的ベクターゲノムを用いた。まとめると、これらの特徴は、ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃ（本明細書においては「ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃ」及び「ＲＣ－０１－３１」とも呼ばれる）レポーターベクターの基礎を形成する。

ＲＣ－０１－３１ベクターのｖｇ／ｍｌ力価の最も正確な測定値を提供するために、ｑＰＣＲ及びキャプシドＥＬＩＳＡを、ルシフェラーゼの代わりにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をコードする導入遺伝子を含むこと以外はｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃと同一の別のレポーターベクターと並行して実施した。このｓｃＡＡＶ－ｅＧＦＰ（本明細書においては（「ＡＡＶ－ｅＧＦＰ」とも呼ばれる）レポーターベクターは、現在、現在のＦＡＣＳベースの形質導入阻害アッセイにおいて用いられている（本明細書においては、本発明の迅速ＴＩＡ（「ｒＴＩＡ」）と区別するために「ｃＴＩＡ」とも呼ばれる）。ｑＰＣＲはこれらのベクター間の約１０倍の違いを明らかにし、これはキャプシドＥＬＩＳＡを用いて得られた結果と整合した（図２Ｂ）。

実施例２―６時間及び２４時間にわたるＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃによる形質導入後のルシフェラーゼシグナルの評価
従来のＦＡＣＳベースの形質導入阻害アッセイ（ｃＴＩＡ）を、本方法の開発における出発点として用いた。ｃＴＩＡプロトコルにおけるｓｃＡＡＶ－ｅＧＦＰベクターストックの使用には、５０μｌ体積中で２５０（ｖｇ：細胞）の感染多重度（ＭＯＩ、ベクターゲノムの数と宿主細胞の数との比として定義される）をもたらす、２．９ｘ１０^６ｖｇを約１．２ｘ１０^４のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ウェルあたり）に適用することが含まれた（図３Ｉ）。

ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターが感染の６時間以内に発光シグナルを提供できるか否かを決定するために、このベクターのいくつかの希釈物を体積５０μｌのＨＥＫ２３９Ｔ細胞の懸濁液に適用した。ＡＡＶのために可能な限り多くの利用可能な細胞結合部位を提供するために、インキュベーション中に１ｘ１０^５ＨＥＫ２３９Ｔ細胞（ｃＴＩＡの約８倍）を用いた。形質導入率の改善に加えて、この数の細胞により、ＭＯＩの範囲（８３３３：１～０．８３：１、図３Ｉ）の探索が可能になった。

フェノールレッドは弱い発光シグナルの検出を妨げ得るため、効率的な検出を確実にするためにフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（カタログ番号２１０６３－０２９）を用いた。インキュベーションの間に、ＤＭＥＭに希釈した１０％陰性（「１０％－ｖｅ」）血漿も含めた。これが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を日常的に維持するために用いられるＦＢＳ（ウシ胎児血清）サプリメントの最大量に相当するからである。６時間又は２４時間の形質導入後、５０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに加え、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｉ３ｘ分光光度計を用いて１時間にわたって３分ごとにアッセイプレートを読み取った。結果の生の値を、６時間及び２４時間の両方の時点についての時間に対してプロットした。シグナル対バックグラウンド比及びＺ’値を、ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃ形質導入の非存在下で増殖した細胞に対して算出した。４のテクニカルレプリケートについてのＣＶ値（本明細書中においては（標準偏差／平均）^＊１００として定義）を、各条件について算出した。

６時間及び２４時間の両方の時点で試験されたすべての希釈物について、ロバスト且つ安定したシグナル（ここでは５，０００超のＲＬＵ、即ち相対光単位として定義）が得られた（図３Ａ及びＥ）。

形質導入の６時間後、試験したＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの最初の４の希釈物についてのＣＶ値は、試験した最後の希釈物（１／３０，０００）に対して殆どが１０％未満、又は殆どが２０％未満であり、非形質導入細胞対照でについては殆どが８０％未満であった（図３Ｃ）。シグナル対バックグラウンド比（Ｓ：Ｂ、レポーターベクター（ＡＡＶ－ｅＧＦＰ又はＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃ）で形質導入された細胞とレポーターベクターで形質導入されていない細胞との間の倍数差として定義）は、典型的には、試験したすべての条件について１００倍超であり（図３Ｂ）、そして非形質導入細胞のより高いＣＶ及び１／３０，０００希釈にもかかわらず、Ｚ’値は対照以外の殆どすべての希釈物について０．５を超えたままであった（図３Ｄ）。２４時間で、得られたＳ：Ｂ比も、試験したすべての条件において１００倍超であったが（図３Ｆ）、ＣＶは１０％未満であり、対照以外の殆どすべての希釈物について０．８超の優れたＺ’値をもたらした（図３Ｈ）。まとめると、これらの結果により、ＭＯＩ（ｖｇ：細胞）８３３３：１～０．８３：１で形質導入後６時間又は２４時間でロバストなアッセイシグナルを得られ得ることが示された。

実施例３―ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃの更なる希釈物の、ウェルあたりの種々の細胞数による３、６及び２４時間における試験
ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃのいくつかの希釈物は、形質導入の６時間後にロバストなシグナルを示した。このアッセイシグナルの限界を探索するために、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃの１／３，０００及び１／３０，０００希釈物の両方により実験を繰り返し、更に１／３００，０００希釈物を含めた。更に、アッセイシグナルに対する細胞数（従って利用可能なＡＡＶ関連部位）の影響を特性解析するために、２．５ｘ１０^４、５ｘ１０^４、及び１０ｘ１０^４細胞／ウェルを試験した。最後に、発光シグナルを３時間、６時間及び２４時間において測定した。試験した結果のアッセイ条件のまとめを以下の表１に示す。

形質導入の２４時間後に試験したすべての条件について、ロバストなアッセイシグナル（５，０００ＲＬＵ超）が得られた（図４Ｊ～Ｌ）。形質導入の６時間後、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの１／３，０００及び１／３０，０００希釈物のみが、５，０００超のＲＬＵをもたらし（図４Ｆ～Ｈ）、３時間においては、どのアッセイ条件もこの基準を満たさなかった（図４Ｂ～Ｄ）。ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃをＭＯＩ８で３時間形質導入したウェルあたり１００，０００の細胞を用いた別の実験では、０．５超のＺ値で５，０００超のＲＬＵがもたらされた（図４Ｍ）。一貫して、１００，０００細胞／ウェルを用いると、ＭＯＩが低いにもかかわらず、５０，０００細胞と２５，０００細胞の両方に対して発光シグナルがほぼ２倍に増加した（表１）。いずれの理論にも拘束されることはないが、本発明者らは、これについて考えられる理由の１つは、各細胞が、それらに適用されるすべてのベクター粒子に対して結合／進入部位をいくつか提供するので、細胞の数が多いほど、（すべてではないにしても）より多くの適用されたベクター粒子が、細胞に進入する機会を有することを意味し得ることだと考察する。従って、低ＭＯＩにおいては、これは、細胞に適用されたすべてのＡＡＶベクターが形質導入する可能性が高いシナリオがあり得ることを示している。これは、何らかの中和イベント（細胞とのＡＡＶ結合の防止）が検出される可能性がより高いことを意味する。

まとめると、これらの結果は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの最低１／３０，０００希釈で１００，０００細胞／ウェルを用いると、形質導入の６時間以内にロバストなアッセイシグナルが得られることを示す。

実施例４―ＩＶＩＧを用いるｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃ中和の試験
ｃＴＩＡにおいては、１の陽性対照は、１％陰性（「１％－ｖｅ」）血漿（本明細書では、希釈剤としての、通常の増殖培地（ＤＭＥＭ）を含む１％陰性血漿として定義される）の存在下におけるＩＶＩＧの１：２０００希釈物で構成される。この混合物を、中和時に５．８ｘ１０^７ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ－ｅＧＦＰとともに１時間超インキュベーションする。続いて、５０μｌ（２．９ｘ１０^６ｖｇ）のこの混合物を９６ウェルディッシュで増殖する１．２ｘ１０^４ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に移し、このことによりＭＯＩ（ｖｇ：細胞）２５０：１となる。成功のランにおいては、この陽性対照は、中和されていない陰性対照（最大シグナル）の１％未満に相当するｅＧＦＰシグナルをもたらす。これは、同じ条件で構成されるが、ＩＶＩＧは省略される。

上記の材料及び方法の節において確立された条件がｃＴＩＡと同等の結果をもたらすか否かを決定するために、ＩＶＩＧの１：２０００希釈物による阻害レベルを試験した。この実験においては、中和を、ＩＶＩＧの１：２０００希釈物及び１％－ｖｅ血漿の存在下で、５０μｌの体積で１時間にわたって実施した。非形質導入対照に加えて、この工程におけるＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの量は１／１，５００、１／１５，０００、又は１／１５０，０００のいずれか（それぞれ１．７ｘ１０^７、１．７ｘ１０^６、又は１．７ｘ１０^５ｖｇ／ｍｌに相当）であった。２５μｌのこの材料を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ及び１％－ｖｅ血漿中に１ｘ１０^５細胞を含有する２５μｌの細胞懸濁液と混合し、用いたＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの各量に対してそれぞれＭＯＩ８．３対１、０．８３対１及び０．０８３対１をもたらした。アッセイを、５０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加し、２０分間の発光シグナルの発生後にプレートを読み取ることにより完了した。

１ｘ１０^４ＲＬＵ超のロバストなシグナルが、（細胞に対する）ベクターの１／３，０００及び１／３０，０００希釈物の両方により得られた。ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃレポーターベクターの１／３００，０００希釈物については、より弱い（１ｘ１０^３ＲＬＵ程度）シグナルが得られた（図５Ａ、「ｓｃＮＬｕｃ」と命名）。非形質導入対照は、５０ＲＬＵ／ウェルの平均バックグラウンドをもたらした。ＩＶＩＧの１：２０００希釈物は、試験した条件のいずれにおいても完全な阻害をもたらさず、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃの１／１５０，０００希釈物は、なお約１００ＲＬＵ又は非形質導入バックグラウンドの約２倍をもたらした。

試験した各条件について、最大値のパーセンテージを、阻害されていない形質導入シグナルを、マッチするＩＶＩＧ中和値で除することによって算出した。ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの１／３，０００、１／３０，０００、及び１／３００，０００希釈物についての残存発光シグナルは、それぞれ最大の１２．５％、８％、及び７％であった（図５Ｂ）。

驚くべきことに、ｅＧＦＰを用いるｃＴＩＡによって示したように、中和時に用いるＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクター量を３ログ超減少させても、シグナルが最大値の１％未満に減少しないことが判明した。中和において用いるベクターの量及びその後のＭＯＩ（ｖｇ：細胞）がｃＴＩＡのそれと類似しているか、はるかに低いのにである。興味深いことに、示された阻害の量は、用いるベクターの量が減少するにつれて１００％に進行するのではなく、約９３％（最大の７％での発光シグナル）まで横ばいになっているようである。これは、一定量のＩＶＩＧ（即ち、１：２０００希釈）の場合、中和工程で用いられるベクターの量を更にいくら減らしても、１００％阻害に繋がる可能性が低いことを示している。重要なことに、観察された阻害プラトーは、非形質導入対照の阻害シグナルに等しい阻害シグナルによる（即ち、アッセイが最低値）ものではない。ＩＶＩＧで阻害されたＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃの１／３００，０００希釈物によってもたらされるシグナルが、非質導入対照よりも約１５倍程度高いからである（図５Ａ）。

まとめると、これらの結果により、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの量における、ロバストなアッセイシグナルをなおもたらす最少ベクター量である１／１５，０００希釈（中和時に１．７ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌ、ＭＯＩ０．８３：１）を超える更なる減少には利点がないことが示される。

実施例５―ｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃを用いてＩＶＩＧの中和力価を決定する
ＩＶＩＧの１：２０００希釈物は、ＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃの非常に薄い希釈物（中和時：１／１５０，０００又は１．７ｘ１０^５ｖｇ／ｍｌ）とインキュベーションした場合、９９％超の阻害を引き起こさなかった。もたらされるルシフェラーゼシグナルは１ｘ１０^４ＲＬＵ未満であるため、更なる希釈は最適ではない。ＩＶＩＧの見かけの中和力価に対するこれらの条件の影響を決定するために、１００，０００細胞／ウェル（実施例３に記載の通り）をＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃの１／３０，０００（ＭＯＩ０．８３：１）又は１／３，０００（ＭＯＩ８．３：１）のいずれかと、２％陰性血漿中のＩＶＩＧ希釈物による１時間の中和後６時間にわたってインキュベーションした。この間、ベクター濃度はそれぞれ１．７ｘ１０^６及び１．７ｘ１０^７ｖｇ／ｍｌであった。感染時に細胞に適用される陰性血漿の量は、試験される試料の開始時希釈によって決定される。例えば、ｃＴＩＡにおける１：１００の開始時希釈により、２日間の形質導入工程中に細胞に適用される１％の陰性血漿がもたらされる。最終的な試料試験で、１：５０の希釈から開始することで試料の階層化の増強がもたらされ得るように、アッセイ開発のこの段階においては、２％の陰性血漿バックグラウンドが選択された。１：５００から開始して、１．４１の希釈倍率を用いて更に２１のＩＶＩＧ希釈物を生成した。陽性対照は非形質導入細胞（ＮＴ）で構成し、陰性対照は２％陰性血漿の存在下で１時間インキュベーションし６時間形質導入したＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターで構成した。結果として得られた発光値は、４パラメータ可変勾配モデルを用いて結果として得られたＥＣ５０を推定する前に、陰性（０％阻害）及び陽性（１００％阻害）対照のシグナルに対して正規化した。ｃＴＩＡで証明されたＩＶＩＧの中和力価は１：１０，０００である。この実験においては、両方のベクター希釈物によって得られたＥＣ５０力価はそれぞれ、１：１０，１２４及び１：９，４６１であり、中和時のベクター希釈は１／１５，０００（図６Ｂ）及び１／１，５００（図６Ａ）であった。１：２０００ＩＶＩＧ希釈物においては、中和時の１／１５，０００及び１／１，５００のＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクター希釈物について阻害はそれぞれ９６及び９３％であった。９９％超の阻害は、用いたＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターの両方の量を含む１：１０００ＩＶＩＧ希釈物でのみ得られた。

これらの結果により、形質導入阻害アッセイ中に用いるレポーターベクターの量における対数差が、中和力価の全体的な測定に対して有する影響はごく僅かであることが示される。更に、発光シグナルの９９％超の阻害が得られる前に、１：１０００ＩＶＩＧ希釈が必要である。実施例４からの結果とともに、これらの結果により、これらのアッセイ条件によって、得られた血漿試料の中和力価が、ｃＴＩＡにより得られた中和力価より２倍少ない可能性があることが示される。

実施例６―６時間のｒＴＩＡ（迅速なＴＩＡ）とｃＴＩＡとの中和力価比較
試料試験に最適なアッセイ条件を決定し、１ｘ１０^５細胞／ウェル（実施例３）及び、１／１，５００（１．７ｘ１０^７ｖｇ／ｍｌ）～１／１５，０００（１．７ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌ）での中和におけるベクター希釈物（実施例５）の使用を含めた。これら両方の量のＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターにおいて、１：１０００ＩＶＩＧにより発光シグナルの９９％阻害がもたらされ、このことにより、将来のすべての実験における陽性対照としてのその使用が正当化された（実施例５）。

該２の方法を更に比較するために、ｃＴＩＡにより試験した試料の離散中和力価と算出されたＥＣ５０を、上記の実施例で確立した条件を用いることにより決定したが、次の変更を含んだ。
１．５０％陰性血漿又は試料の存在下でのｓｃＡＡＶ－Ｎｌｕｃベクターの１／６，０００希釈物（８．３ｘ１０^６ｖｇ／ｍｌ）の１時間の中和（試料の１：２開始時希釈）
２．力価測定を試験試料の１：２希釈で開始できるようにするために、最後の１０％陰性血漿を細胞に適用する（上記の方法論を使用）。
３．１．５ｘ１０^５細胞／ウェルでの６時間の形質導入―ロバストな発光シグナル（１ｘ１０^４ ＲＬＵ超）を確保するための細胞／ウェルの５０％の増加。

陰性血漿中の試験試料の１：２希釈から始めて、２倍希釈倍率を用いて更に１１希釈物を生成した。中和時のＩＶＩＧの１：１０００希釈物を陽性対照として用い、陰性対照は１時間インキュベーションしたＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターで構成し、１０％陰性血漿の存在下で６時間細胞に適用（形質導入）した。得られた発光値を、４パラメータ可変勾配モデルを用いて中和力価を推定する前に、陰性（０％阻害）及び陽性（１００％阻害）対照のシグナルに対して正規化した。用語「ＥＣ５０」は、この方法を用いる試料の阻害力価の推定を反映するために、ここでは用語「ＴＩ５０」（形質導入阻害５０％を意味する）と交換可能に用いられる。

ＬＧＣ及びＴＣＳ（商業供給者）から得られた３６の健常人血漿試料を、本節に記載したプロトコル条件によりアッセイした。比較を可能にするために、これらの試料に関する既存のｃＴＩＡ力価を再解析して、それらのＴＩ５０／ＥＣ５０値を推定した。一部のｃＴＩＡアッセイは、４希釈物（１／１００、１／２００、１／３００、及び１／４００）のみで実施されたため、ＴＩ５０は利用可能なすべての試料から生じさせたわけではなかった。従って、ＴＩ５０（図７Ａ）及び力価（図７Ｂ）の比較については、それぞれ２６と３６の比較ポイントを生じさせ得た。

ｒＴＩＡ及びｃＴＩＡの結果の比較を、ＴＩ５０及び離散力価の両方についてのスピアマンの順位相関検定を計算することによって実施した。各相関プロットについて、各データポイントの形状は、ｃＴＩＡにおいて得られた離散力価を示す。ＴＩ５０及び離散力価の比較に関して、０．８５（図７Ａ）及び０．９１（図７Ｂ）の相関係数がそれぞれ得られた。このことにより、試料のランク付けがｒＴＩＡとｃＴＩＡの間で類似していることが示された。

ｃＴＩＡと比較して、１／４００を超えるすべての試料についてｒＴＩＡ ＴＩ５０において３倍の低下が得られた。驚くべきことに、見かけの中和力価におけるこの減少は、１／４００以下の試料（最大１０倍）について激化したことが判明した。離散力価を比較した場合にも、同様の結果が観察された。

利用可能な比較ポイントの数が増えたため（ＴＩ５０については２６、離散力価については３６）、離散力価を用いた場合、ｒＴＩＡとｃＴＩＡの間のより良い相関が得られた（ＴＩ５０については０．９１と０．８５との比較）。まとめると、ｃＴＩＡとｒＴＩＡとの間の良好な相関関係により、両方のアッセイが、同様に、患者を同じようにランク付けすることが示される。ｒＴＩＡとｃＴＩＡとの間のこの良好な相関関係及び後者に基づいて既にスクリーニング及び投与されている患者からの試料の入手可能性を考えると、本発明の方法がより短い時間枠で従来の方法に匹敵する正確な結果を提供することは明らかである。

実施例７―１６時間（オーバーナイト）の形質導入阻害アッセイプロトコルの開発及び試験
６時間のｒＴＩＡプロトコルに加えて、同じＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃベクターを用いるオーバーナイト（１６時間）のプロトコルを、臨床現場における試料試験で最大限の柔軟性を確保するように設計した。実施例６の結果により、中和力価における最大の不一致が、１：４００以下のｃＴＩＡ力価で得られたことが明らかとなった。従って、ｃＴＩＡ及びｒＴＩＡの両方で見かけの力価が１／１０，０００であるＩＶＩＧの代わりに、血漿試料ＴＣＳ９３を試験用に選択した。実施例６において用いた６時間のプロトコル（材料及び方法の節で説明されている）を、形質導入時間の構成要素を超えて更に変更することなく用いた。形質導入の６時間後及び１６時間後に完了するように、２のアッセイプレートを構成した。ＴＩ５０は、前述の通り算出した（実施例６を参照）。

この試料については、６時間及び１６時間においてそれぞれ１：１３９及び１：２２５のＴＩ５０が得られ、見かけの中和力価における４０％程度の増加がもたらされた（図８）。実施例６においては、同じ試料が６時間プロトコルで１：１２８のＴＩ５０を示しており、このことにより、６時間プロトコル及び１６時間プロトコルで異なるＴＩ５０がもたらされ得ることが示された。この結果は、形質導入の延長の結果であり得るが、別の考えられる説明は、単純なアッセイのばらつきである。

実施例８―オーバーナイト（１６時間）プロトコルの拡張試験
実施例７に記載の予備試験によって、蒸発により、おそらく細胞増殖条件がオーバーナイトで変化することにより、９６ウェルアッセイプレートの外縁において得られる発光シグナルが減少することが立証された。この問題を回避するために、プレートの外縁をアッセイプレートのレイアウトに含めなかった。最後の６時間のｒＴＩＡには、６時間の形質導入に亘って培養した１．５ｘ１０^５の細胞／ウェルが含まれる。同数の細胞がオーバーナイトで接触阻害するまで増殖する可能性があり、その結果、最適な細胞増殖、ひいては遺伝子発現に依存するアッセイシグナルの歪みが生じる。細胞増殖に関連する問題を防ぐために、細胞／ウェルの数を１ｘ１０^５に減らした。他のすべてのアッセイ条件は、上記の実施例に記載された６時間のプロトコルと同一に保った。利用可能な試料の試験では、ＴＩ５０及び離散力価についてそれぞれ２５及び３３の比較ポイント（ｃＴＩＡとｒＴＩＡとの比較）がもたらされた。１６時間プロトコルを用いる試料のランク付けは、ｃＴＩＡと同様であった（ＴＩ５０及び離散力価についてのスピアマンの順位係数はそれぞれ０．９０及び０．９３であった、図９Ａ及び９Ｂ）。６時間プロトコルと１６時間プロトコルとの間の試料のランク付けはほぼ同一であった（図１２Ｂ、及び実施例１０において更に詳しく説明する）。１６時間のｒＴＩＡプロトコルとＧＦＰベースのｃＴＩＡとの間の倍数変化も、１／４００超の力価の試料（ｃＴＩＡによる）については約３倍であり、残りの１：４００以下の試料については最大１０倍に増加した。しかし、６時間プロトコルと１６時間プロトコルとのＴＩ５０を比較した場合、力価においては平均して差が見られなかった（２９試料に対してＳＤが０．４の平均倍数差１．０、図１２Ｄ）。まとめると、これらの結果により、１６時間プロトコルの成績が上記の実施例に記載の６時間と非常によく似ていることが示される。

実施例９―試料希釈剤の標準化：ＩｇＧ枯渇ＦＢＳ及びＡＡＶ－ＮＡＦ陰性の健常なヒトの血漿の比較
市販のコンパニオン診断アッセイでは、用いるすべての試薬を標準化する必要がある。上記の実施例２～８で用いた試料希釈剤は、健康なヒトドナーからの血漿であった。ヒト血漿試料の入手可能性及び生成追跡可能性が限られているため、別のより一般的に入手可能なアッセイ希釈剤を探し求めた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭで日常的に維持している。増殖培地のこの成分は、広告されているＩｇＧ濃度が５ｕｇ／ｍＬ未満のプロテインＧＩｇＧ枯渇形態で入手できる（Ｇｉｂｃｏカタログ１６２５００８６）。本実験においては、試料希釈剤としてのＩｇＧ枯渇ＦＢＳの使用を研究した。

豊富な試験血漿試料である試料ＴＣＳ８５を、前述の通り（上記の材料及び方法）、陰性血漿を用いて希釈し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中に、その５０％又は１０％のいずれかに希釈した。並行して、同一の試料をＩｇＧ枯渇ＦＢＳ中に希釈し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中に同様に５０％又は１０％希釈した。試料処理のため、アッセイプレート中で得られる希釈剤（陰性血漿又はＩｇＧ枯渇ＦＢＳ）の濃度は、試料希釈剤の原液、５０％、及び１０％組成物について１０％、５％、又は１％である。次いで、上記の実施例８に記載の１６時間プロトコルを用いてアッセイを実施した。

ＩｇＧ枯渇ＦＢＳで得られたＴＩ５０は、陰性血漿で得られたものと非常に似ている（「ＴＣＳ１３７」、図１０）。原液陰性血漿又はＩｇＧ枯渇ＦＢＳを用いると、５０％及び１０％希釈物と比較して力価が低くなった。アッセイ希釈剤の５０％及び１０％希釈物は、ＴＩ５０値において何らかの更なるシフト（２０％超）をもたらす。まとめると、この結果により、陰性血漿及びＩｇＧ枯渇ＦＢＳとの間の同等性が証明され、ＦＢＳの５０％希釈物が最高のアッセイ感度をもたらす可能性が高いことが示される。

実施例１０―試料希釈剤として５０％ＩｇＧ枯渇ＦＢＳを用いる健常血漿試料の再試験
上記の１６時間プロトコルを用いて、健常血漿試料を再試験した。利用可能な試料の試験では、ＴＩ５０及び離散力価についてそれぞれ２４及び３２の比較ポイント（ＡＡＶ－ｅＧＦＰとＡＡＶ－ＢｒｉｇｈｔＬｕｃとの比較）がもたらされた。試料希釈剤としてＩｇＧ枯渇ＦＢＳを用いる試料のランク付けは、ｃＴＩＡと同様であった（ＴＩ５０及び離散力価の両方についてスピアマンの順位係数０．９４、図１１Ａ及び１１Ｂ）。試料のランク付けは、６時間プロトコルと１６時間プロトコルの間でほぼ同じであった（図１２Ｃ）。倍数変化は、１６時間のｒＴＩＡプロトコルとｃＴＩＡの間で１／４００超の力価の試料（ｃＴＩＡによる）については約３倍のままであり、残りの１：４００以下の試料については最大１０倍に増加した。しかし、６時間プロトコルと１６時間プロトコルのＴＩ５０を比較した場合、力価においては平均して差が見られなかった（２９試料に対してＳＤ０．５５で平均倍数差１．０、図１２Ｄ）。

最後に、陰性血漿及びＩｇＧ枯渇ＦＢＳ試料の両方からの１６時間プロトコルの結果を比較した。０．９９のスピアマンの順位相関が得られた。このことにより、これらのプロトコルによってもたらされたＴＩ５０値の間の強い一致があることが示された（図１２Ａ）。更に、３３の比較ポイントに対してＴＩ５０の平均値（ＳＤ ０．３９で平均倍数変化１．０）に差はなかった（図１２Ｄ）。

まとめると、これらの結果により、試料希釈剤として５０％ＩｇＧ枯渇ＦＢＳを用いる１６時間プロトコルの成績が、実施例２～実施例６に記載の６時間プロトコル、及び例８に記載の１６時間プロトコルと非常によく似ていることが示される。

実施例１１―抗体及びＮＡｂ力価に対する血漿交換の効果の検証
二重濾過血漿交換（ＤＦＰＰ）は、血流から抗体を除去するための日常的な方法であり、移植手術を受ける前の患者において従来用いられている。腎臓移植の前に最大５ラウンドのＤＦＰＰを受けた３６人の患者からのバイオバンク血漿試料を後ろ向き解析した。サイクル前及びサイクル後の血漿試料を、ＥＬＩＳＡ及び、上記の方法論を用いるＧＦＰベースの従来型ＴＩＡ（ｃＴＩＡ）の両方を用いて、抗ＡＡＶ抗体について試験した。

移植患者におけるＤＦＰＰの各連続ラウンドの後、ＡＡＶ Ａｂの総力価及び中和力価は減少した。抗体の再合成及び／又は組織からの再分布のパターンがサイクル間で観察されたが、その後のラウンドでは常にベースラインと比較して抗体価を更に低下させることができた。ＥＬＩＳＡ解析（図１４Ａ）により、開始力価に関係なく、各ＤＦＰＰサイクル後に抗体レベルの減少とその後の上昇があったことが確認される。すべてのデータの平均傾向は、最初のサイクル後の抗ＡＡＶ抗体における最大の減少を示しており、これは連続する各サイクルで継続し、すべての患者で全体的な減少を示している。

ＧＦＰベースのＴＩＡ（ｃＴＩＡ）により、ＤＦＰＰ前の力価と比較して、ＤＦＰＰの５サイクル後のすべての患者について、ＡＡＶ ＮＡｂにおける減少が見出された（図１４Ｂ）。このアッセイにおいては、１：１００以下のすべての力価は、ＡＡＶ ＮＡｂについて陰性であると定義されている。このことは、かかる結果により、患者が遺伝子治療に適格であると見なされるようになることを意味する。ＤＦＰＰの５サイクル後（「後」）に１：１００に到達するための最高の開始（「前」）力価は１：１６００であることがわかった。開始力価が１：１６００以下の血清陽性患者を検討すると、ＤＦＰＰを受けたかかる患者の６２％が適格性に必要な力価を達成した。

実施例１２―ＴＩＡ結果のＥＬＩＳＡとの比較
疾患関連集団におけるＡＡＶ－ＮＬｕｃベースのＴＩＡアッセイの有用性を実証するために、６２の血友病Ｂ患者試料において中和力価を測定した。ＮａｎｏｌｕｃベースのＴＩＡを、上記の通り、１６時間（オーバーナイト）の免疫複合体形成工程と、７５μＬの形質導入反応液中で１００，０００のＨＥＫ２３９Ｔ細胞を用いて実施した。抗ＡＡＶＩｇＧを測定するための間接ＥＬＩＳＡを以下の通り実施した。捕捉基質であるＡＡＶウイルスベクター粒子を、ＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルプレートの表面に＋２～＋８℃でオーバーナイトでコーティングした。結合していないＡＡＶ抗原をすべて除去するための洗浄工程に続いて、プレートをブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去するための更なる洗浄工程の後に、対照及び試験試料を加えた。

インキュベーション後、結合していない物質をすべて洗い流し、ＨＲＰに結合したポリクローナル抗ヒト抗体を加えた。検出抗体とのインキュベーション及び更なる洗浄工程の後、基質発色原ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ^ＴＭ、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩）、ペルオキシダーゼをウェルに添加した。３Ｍ ＨＣｌを加えることにより反応を停止し、６３０ｎｍの参照波長で４９２ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーを用いて光学密度を決定した。ＴＩＡ及びＥＬＩＳＡの結果を比較すると、１０μｇ／ｍＬのＥＬＩＳＡカットオフにより、それぞれ１６％及び２７％の偽陰性率及び偽陽性率がもたらされることがわかった（図１３）。

最後に、ＥＬＩＳＡの結果とｃＴＩＡの結果とを比較すると（図１４Ｃ）、ＡＡＶ遺伝子治療の適格性を決定する際にＴＩＡと比較してＥＬＩＳＡの精度が低下することが示された。より詳細には、ＥＬＩＳＡ方法論は偽陰性及び偽陽性の両方をもたらす。いずれの理論にも拘束されないが、本発明者らは、中和抗体（ＮＡｂ）力価の正確な決定を可能にする本発明のＴＩＡとは対照的に、ＥＬＩＳＡの方法論は、抗体全体の含有量は測定するが、ＮＡｂはしないと推測する。

実施例１３―連続ＤＦＰＰ及び不連続ＤＦＰＰの効果の比較
上記の実施例１１において試験した血漿試料は、腎臓移植の前にＤＦＰＰを受けていた患者から得た。その場合、ＤＦＰＰの５サイクルは、殆どの場合、（「連続」と見なされる）連続する日ではなく、（「不連続」と見なされる）より長い間隔、通常、サイクル間で４８時間又は７２時間、ときに更に長時間で実施した。

上記の実施例１１と図１３に示す通り、ＥＬＩＳＡ法は遺伝子治療に対する適格性を決定するのに十分正確ではないため、医療機関においてＮＡｂ力価を正確に測定するにはＴＩＡが必要である。毎日のアフェレーシスサイクル（「連続」とみなされる）に必要なＮＡｂ解析の迅速なターンアラウンドを容易にするために、本発明の迅速なＴＩＡ（ｒＴＩＡ／ＢＬ－ＴＩＡ）が開発された。これは合成高輝度ルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））を用い、（上記実施例に示す通り）２４時間以内に正確な結果をもたらし得る。

本発明のＢＬ－ＴＩＡアッセイを用いて、上記の実施例１１からの６人の患者由来の試料を再試験した。そのうち４人は連続する日に３ラウンドのＤＦＰＰを受けた（「連続」）。図１５Ａに示す通り、ＤＦＰＰサイクル２、３、及び４又はサイクル３、４、及び５は「連続」であり、このことにより、それらが連続する日に提供されたことが意味される。従って、サイクル３はサイクル２の翌日に提供された。及び／又はサイクル４はサイクル３の翌日に提供された。

このＤＦＰＰの「連続」実施からの試料の解析により、第１、第２、及び第３サイクルについてそれぞれ６６％、６０％、及び５８％のＮＡｂ力価（ＴＩ５０を用いて測定）の減少がもたらされた（図１５Ｂ）。

これら６人の患者からの初期試料と最終試料の解析では、ＡＡＶ ＮＡｂ力価における平均８５％の低下がみられ（図１５Ｃ）、ＧＦＰベースのＴＩＡを用いる上記の実施例１１からの知見とよく一致していた（図１４Ｂ）。

ＤＦＰＰの連続ラウンドを解析すると、最初のラウンドが最も効率的であることが確認される。ＡＡＶ ＮＡｂの６６％が最初の連続日に除去され、同様の、しかしより低いパーセンテージが次の日に除去された。全体として、ＤＦＰＰの３「連続」ラウンドにより、ＡＡＶ ＮＡｂ力価が７９±９％減少した。

ＡＡＶ ＮＡｂを減少させるために必要な最小サイクル数を更に理解するために、３の「連続した」ＤＦＰＰサイクル（即ち、各サイクルは前のサイクルの翌日に実施される）を用いて得られた平均の減少を用いて回帰分析を実施した。この分析により、ＤＦＰＰの４の「連続した」サイクルが、５の「不連続的な」サイクルと同様のＮＡｂの減少をもたらすことが示された。重要なことに、５の「連続」サイクルにより、開始ＡＡＶ ＮＡｂ力価が９４％減少し（図１５Ｃ）、それによってＡＡＶ ＮＡｂ力価の減少可能性が改善されると予測される。

従って、重要なことに、実質的に２４時間未満で正確なＮＡｂ力価の結果を提供し、（上記に実証される通り）形質導入のわずか１６時間後に、又は６時間後であっても、確実にそうできる本発明のＴＩＡを用いると、連続するラウンドのアフェレーシスにより、抗ＡＡＶ ＮＡｂを臨床試験に含まれるのと一致するレベルまで減らせることが理解できる。

実施例１４―ＡＡＶ血清型全体でＴＩＡの有効性を比較する
上記実施例に記載のＴＩＡの手順を用いて、ＣＭＶプロモーターからのＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼをコードするベクターゲノムを含有する任意のＡＡＶ血清型とのインキュベーション後に、複数（例、９６以上）の個々のヒト血漿試料の中和抗体（ＮＡｂ）状態を比較できる。

すべての血漿試料を、ＡＡＶベクターの希釈物（例、１ｘ１０^４、１ｘ１０^５、１ｘ１０^６又はそれ以上のｖｇ／ｍＬのＡＡＶ－Ｎｌｕｃ若しくはＡＡＶ５－Ｎｌｕｃベクター、又は天然に生じるか又は合成／改変かを問わず任意の他の血清型のＡＡＶ）と１：１で混合し、５０％の血漿－ベクター混合物を得、３７℃である特定の時間（例、１、２又は３時間）にわたってインキュベーションして血漿中の中和因子（例、抗体）とＡＡＶ粒子との間の複合体形成を可能にする。

続いて、この材料を細胞懸濁液中に１：５に希釈して、関連する細胞株又は初代細胞（例、ＨＥＫ２３９Ｔ、ＨＵＨ７、肝臓初代細胞等）の適切な数の細胞（例：２５，０００、５０，０００、又は１００，０００細胞）を含有する混合物を得る。

３７℃、５％ＣＯ_２でオーバーナイトでインキュベーション後、細胞を溶解し、試薬に付属の説明書に従ってＮａｎｏＧｌｏ試薬と１：１で混合することにより、ＮａｎｏＬｕｃの発現を定量化する。上記の方法は、ＡＡＶ中和の存在について試料を陽性又は陰性のいずれかとして分類するために用いる。

本発明のＴＩＡは、ある特定の、着目した細胞株（例、ＨＥＫ２９３Ｔ）を効率的に形質導入しないＡＡＶ５を含む多くの血清型について、時間枠内で十分な発光シグナルを提供する。従って、本発明のＴＩＡは、それらの血清型に対してさえ、許容可能なアッセイ品質及びロバスト性パラメータ（例、０．５超のＺ’及び２５％未満のＣＶ）を提供する。

この方法の鍵となる利点は、効率的に形質導入する血清型によって用いられるベクター等の、典型的に少量のベクターを用いて、形質導入効率における大きなばらつきを伴う血清型の形質導入を、同一細胞株に対して短期間で（より高いスループットを裏付けるために）比較できることである。少量のレポーターベクター（即ち、ｓｃＡＡＶ－ＮＬｕｃ）は、より感度の高いＴＩＡを可能にし、血清保有率のより完全な全体像を提供する。まとめると、この方法は、同一（ベクターの量、インキュベーション時間、細胞型）、高スループット、及び高感度の条件下で実験を実施することにより、血清保有率の比較を可能にする。

配列表

配列番号１

配列番号２

配列番号３

配列番号４

配列番号５

配列番号６（＝国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号３１）

配列番号７（＝国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号４６）

配列番号８（＝国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号４７）

配列番号９（＝国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号５４）

配列番号１０（＝国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号５６）

配列番号１１（＝国際公開第２０１６／０１２２８５号の配列番号１）

配列番号１２（＝国際公開第２０１６／０１２２８５号の配列番号２）

番号を付した本発明の態様
１．対象からの試料中の着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を決定するための方法であって、以下の：
（ａ）着目したキャプシドを含むウイルスベクターの粒子を、（１）種々の希釈の試料を含む１以上の参照溶液中、及び（２）少なくとも１の対照溶液中でインキュベーションし、パート（ａ）のウイルスベクターがルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含む工程；
（ｂ）工程（ａ）からの各溶液を、着目したウイルスベクターによる感染に感受性である標的細胞の集団に曝露する工程；
（ｃ）設定された時間間隔の間待機し、形質導入が起こるのを可能にする工程；
（ｄ）ルシフェラーゼのための基質を参照溶液及び対照溶液に加え、ルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）を測定する工程；
（ｅ）少なくとも１の対照溶液中のルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）を参照溶液中のルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）と比較する工程；並びに
（ｆ）ＮＡｂ力価を算出する工程；
を含む、ルシフェラーゼを用いる形質導入阻害アッセイ（ＴＩＡ）を含み：
（ｉ）工程（ｃ）における設定された時間間隔が２４時間未満であり、場合により１９時間以下であり、場合により１２時間以下であり、場合により８時間以下であり、場合により６時間以下であり、及び場合により３時間であり；並びに
（ｉｉ）ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を提供する合成ルシフェラーゼである
方法。

２．工程（ｃ）における設定された間隔が６時間以下である、態様１に記載の方法。

３．工程（ｃ）における設定された間隔が３時間である、態様１に記載の方法。

４．合成ルシフェラーゼが、配列番号１による配列を有するホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、上記態様のいずれか１に記載の方法。

５．合成ルシフェラーゼが、以下の修飾：
（ａ）野生型ルシフェラーゼと比較してより高い安定性；
（ｂ）野生型ルシフェラーゼと比較して小さなサイズ（ｋＤａ）；
（ｃ）野生型ルシフェラーゼの１以上のサブユニットの欠失又は除去；
（ｄ）野生型アミノ酸配列と比較した１以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換、付加及び／又は欠失
の１以上を有する天然に生じる野生型ルシフェラーゼに由来する、上記態様のいずれか１に記載の方法。

６．合成ルシフェラーゼが５０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、又は２０ｋＤａ未満である上記態様のいずれか１に記載の方法。

７．合成ルシフェラーゼがＡＴＰ非依存性である上記態様のいずれか１に記載の方法。

８．合成ルシフェラーゼが、基質としてフリマジン又はその誘導体若しくは変異体を用いる、上記態様のいずれか１に記載の方法。

９．合成ルシフェラーゼが、基質としてセレンテラジン又はその誘導体又は変異体を用いる、上記態様のいずれか１に記載の方法。

１０．合成ルシフェラーゼ及びその基質の発光シグナル（ＲＬＵ）並びにホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質の発光シグナル（ＲＬＵ）を同一条件下で測定することにより、合成ルシフェラーゼの増強された発光が決定される、上記態様のいずれか１に記載の方法。

１１．合成ルシフェラーゼ及びその基質のシグナル（ＲＬＵ）が、ホタル及びそのルシフェリン基質のシグナル（ＲＬＵ）よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍又はそれ以上強い、態様１０に記載の方法。

１２．合成ルシフェラーゼ及びその基質のシグナル（ＲＬＵ）が、ホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質のシグナル（ＲＬＵ）よりも少なくとも８０～１００倍又はそれ以上強い、態様１０に記載の方法。

１３．合成高輝度ルシフェラーゼが：
（ａ）配列番号２による配列；
（ｂ）配列番号２と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
（ｃ）配列番号２と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列；
を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

１４．合成高輝度ルシフェラーゼが：
（ａ）配列番号３による配列；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
（ｃ）配列番号３と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列；
を含む、態様１～１２のいずれか１に記載の方法。

１５．合成高輝度ルシフェラーゼが：
（ａ）配列番号４による配列；
（ｂ）配列番号４と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
（ｃ）配列番号４と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列
を含む、態様１～１２のいずれか１に記載の方法。

１６．少なくとも１の対照溶液が陰性対照溶液を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

１７．対照溶液が、着目したウイルスベクターに対する抗体を欠く、態様１６に記載の方法。

１８．少なくとも１の対照溶液が、第１の陰性対照溶液及び第２の陽性対照溶液を含む、態様１～１５のいずれか１に記載の方法。

１９．第１の陰性対照溶液が、着目したウイルスベクターに対する抗体を欠く、態様１８に記載の方法。

２０．第２の陽性対照溶液が、着目したウイルスベクターの形質導入を最大限に阻害するのに十分な濃度の中和抗体を含む、態様１８又は態様１９に記載の方法。

２１．陽性対照溶液がＩＶＩＧ（インビトロ免疫グロブリン）を含む、態様１８～２０のいずれか１に記載の方法。

２２．ＩＶＩＧ溶液が、着目したウイルスベクターの起こり得る最大限の阻害を確実にするのに十分に高い濃度を有する、態様２１に記載の方法。

２３．ＩＶＩＧが少なくとも２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度を有する、態様２１又は態様２２に記載の方法。

２４．ＩＶＩＧが少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度を有する、態様２３に記載の方法。

２５．方法が、陽性対照溶液の％阻害レベル（ＥＣ５０）を確立するために、陽性対照溶液を段階希釈し、段階希釈物に対して態様１の工程（ａ）～（ｄ）を実施する工程を含む、態様１８～２４のいずれか１に記載の方法。

２６．患者からの試料が血漿試料を含むか、又は血漿試料である、上記態様のいずれか１に記載の方法。

２７．標的細胞の集団が
（ａ）少なくとも２０，０００の標的細胞；
（ｂ）少なくとも２５，０００の標的細胞；
（ｃ）少なくとも５０，０００の標的細胞；
（ｄ）少なくとも１００，０００の標的細胞。
（ｅ）少なくとも１５０，０００の標的細胞；又は
（ｆ）１５０，０００超の標的細胞
を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

２８．標的細胞の集団が哺乳動物細胞を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

２９．標的細胞が、ＨＥＫ－２９３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、２９３、Ｂ－５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、Ｈｕｈ７、ＨＥＲ、ＨＥＫ、ＨＥＬ、又はＨｅＬａ細胞を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

３０．標的細胞がＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

３１．ウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス粒子を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

３２．ＡＡＶ粒子が、天然に生じるＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はそれらの混合物のキャプシド又はそれらに由来するキャプシドを含み；場合により、ＡＡＶ粒子がＡＡＶ５のキャプシド又はそれに由来するキャプシドを含む、態様３１に記載の方法。

３３．ＡＡＶ粒子が、天然に生じないか、又は合成若しくは改変されているキャプシドを含む、態様３１に記載の方法。

３４．天然に生じないキャプシドがＡＡＶ３又はＡＡＶ３Ｂに由来する、態様３３に記載の方法。

３５．ＡＡＶ粒子が：
（ａ）配列番号５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｂ）配列番号６（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号３１）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｃ）配列番号７（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号４６）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｄ）配列番号８（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号４７）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｅ）配列番号９（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号５４）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；又は
（ｆ）配列番号１０（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号５６）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド
を含む、態様３３又は態様３４に記載の方法。

３６．ウイルス粒子がレンチウイルス粒子を含む、態様１～３０のいずれか１に記載の方法。

３７．態様１の工程（ａ）が、１．７ｘ１０^７～１．７ｘ１０^５ｖｇ／ｍｌの濃度で着目したウイルスベクターの粒子をインキュベーションすることを含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

３８．態様１の工程（ａ）が、８．３×１０^６ｖｇ／ｍｌの濃度で着目したウイルスベクターの粒子をインキュベーションすることを含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

３９．態様１の工程（ｂ）が、ｖｇ：細胞比（感染多重度（ＭＯＩ））２５０：１以下、２００：１以下、１００：１以下、５０：１以下、２５：１以下、１０：１以下、又は１：１以下でウイルス粒子及び標的細胞を曝露することを含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

４０．試料希釈剤が健常なヒト血漿を含むか、又はそれである、上記態様のいずれか１に記載の方法。

４１．試料希釈剤がウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、態様１～３９のいずれか１に記載の方法。

４２．試料希釈剤がＩｇＧ枯渇ＦＢＳを含む、態様４１に記載の方法。

４３．試料希釈剤がＤＭＥＭを更に含む、態様４０～４２のいずれか１に記載の方法。

４４．ＤＭＥＭがフェノールレッドを含まないＤＭＥＭである、態様４３に記載の方法。

４５．試料希釈及び／又は陽性対照希釈が段階希釈を含む、前記態様のいずれか１に記載の方法。

４６．段階希釈が２倍の希釈倍率を含む、態様４５に記載の方法。

４７．段階希釈が１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：１０２４、１：２０４８、又は１：４０９６の１以上を含む、態様４５又は態様４６に記載の方法。

４８．段階希釈が１：１０、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、又は１：３２００の１以上を含む、態様４５～４７の何れか１に記載の方法。

４９．段階希釈が５～１５の希釈物を含む、態様４５～４８のいずれか１に記載の方法。

５０．段階希釈が８～１１の希釈物を含む、態様４５～４９のいずれか１に記載の方法。

５１．態様１の工程（ｂ）が、アッセイプレート上に細胞の集団を提供し、それに溶液を加えることを含む、前記態様のいずれか１に記載の方法。

５２．アッセイプレートがマルチウェルアッセイプレートである、態様５１に記載の方法。

５３．態様１の工程（ｄ）が、基質を加える前に、細胞を溶解して合成ルシフェラーゼを溶液中に放出する工程を含む、上記態様のいずれか１に記載の方法。

５４．態様１の工程（ｄ）が、標的細胞に浸透できる基質を加えることを含む、態様１～５２のいずれか１に記載の方法。

５５．合成ルシフェラーゼが標的細胞から溶液に分泌されることが可能である、態様１～５２のいずれか１に記載の方法。

５６．態様１の工程（ｆ）が、得られたシグナル（ＲＬＵ）が対照溶液において得られたシグナル（ＲＬＵ）の５０％である参照溶液の希釈度としてＮＡｂ力価を算出又は定量化する工程を含む。前記態様のいずれか１の方法。

５７．ＮＡｂ力価が単一の値（離散力価）として算出又は定量化される、態様５６に記載の方法。

５８．ＮＡｂ力価が値の範囲として算出又は定量化される、態様５６に記載の方法。

５９．ＮＡｂ力価が、参照溶液の希釈物と対照溶液（複数可）との間の視覚的比較を通じて算出又は定量化される、態様５６～５８のいずれか１に記載の方法。

６０．前記ＮＡｂ力価が、非線形回帰モデルを用いて算出又は定量化されて、参照溶液データを曲線に近似し、５０％中和が生じる正確な半最大値を取得する、態様５６～５８のいずれか１に記載の方法。

６１．非線形回帰モデルが各試料希釈物からの発光シグナル（ＲＬＵ）に適用される、態様６０の方法。

６２．非線形回帰モデルが、陽性（最大阻害）及び／又は陰性（０％阻害）対照により正規化した後、各試料希釈物からの発光シグナル（ＲＬＵ）に適用される、態様６１に記載の方法。

６３．陽性（最大阻害）及び陰性（０％阻害）対照の両方により正規化フィッティングすることによってＮＡｂ力価を算出又は定量化する、態様６１又は態様６２の方法。

６４．ＮＡｂ力価が、５０％の形質導入阻害（ＴＩ５０）において補間された力価として算出又は定量化される、態様６０～６３のいずれか１に記載の方法。

６５．ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含むか又はキャプシドで包むＡＡＶウイルスベクターであって、ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を提供する合成ルシフェラーゼである、ＡＡＶウイルスベクター。

６６．組換えベクターゲノムが自己相補的である、態様６５に記載のＡＡＶウイルスベクター、又は態様１～６３のいずれか１に記載の方法。

６７．合成ルシフェラーゼが、配列番号１による配列を有するホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、態様６５又は態様６６のＡＡＶウイルスベクター。

６８．合成ルシフェラーゼ及びその基質の発光シグナル（ＲＬＵ）並びにホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質の発光シグナル（ＲＬＵ）を同一条件下で測定することにより、合成ルシフェラーゼの増強された発光が決定される、態様６５～６７のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

６９．合成ルシフェラーゼ及びその基質のシグナル（ＲＬＵ）が、ホタル及びそのルシフェリン基質のシグナル（ＲＬＵ）よりも少なくとも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍又はそれ以上強い、態様６５～６８のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７０．合成ルシフェラーゼ及びその基質のシグナル（ＲＬＵ）がホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質のシグナル（ＲＬＵ）よりも少なくとも８０～１００倍又はそれ以上強い、態様６９のＡＡＶウイルスベクター。

７１．合成高輝度ルシフェラーゼが５０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満又は２０ｋＤａ未満である、態様６５～７０のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７２．合成高輝度ルシフェラーゼがＡＴＰ非依存性である、態様６５～７１のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７３．前記合成高輝度ルシフェラーゼが：
（ａ）配列番号２による配列；
（ｂ）配列番号２と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
（ｃ）配列番号２と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列
を含む、態様６５～７２のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７４．前記合成高輝度ルシフェラーゼが：
（ａ）配列番号３による配列；
（ｂ）配列番号３と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
（ｃ）配列番号３と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列
を含む、態様６５～７２のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７５．前記合成高輝度ルシフェラーゼが：
（ａ）配列番号４による配列；
（ｂ）配列番号４と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
（ｃ）配列番号４と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列
を含む、態様６５～７２のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７６．ウイルスベクターが：
（ａ）天然に生じるＡＡＶ血清型ＡＡＶ３及び／若しくはＡＡＶ３Ｂのキャプシド若しくはそれらに由来するキャプシド；
（ｂ）配列番号５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｃ）配列番号６（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号３１）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｄ）配列番号７（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号４６）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｅ）配列番号８（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号４７）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
（ｆ）配列番号９（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号５４）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；又は
（ｇ）配列番号１０（国際公開第２０１３／０２９０３０号の配列番号５６）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド
を含む、態様６５～７５のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクター。

７７．患者が、着目したキャプシドを含むウイルスベクターを用いる遺伝子治療に適格であるか否かを決定する方法であって、上記態様１～６４のいずれか１に記載の方法を用いて、前記ウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること、及びそれを所定の閾値と比較することを含み、Ｎａｂ力価が閾値以下である場合、患者はウイルスベクターを用いる遺伝子治療に適格である。方法。

７８．血漿交換又は免疫グロブリンの標的（例、親和性ベースの）枯渇等の、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに特異的な免疫グロブリンの枯渇の進行を患者においてモニタリングする方法であって：
（ａ）患者からの試料に対して態様１～６４のいずれか１に記載の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇のラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定する工程；
（ｂ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価が遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定する工程；
及び場合により
（ｃ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価に基づいて、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが適切であるか否かを決定する工程
を含む、方法。

７９．設定された時間間隔が、２４時間以下、１９時間以下、１２時間以下、９時間以下、又は６時間以下である、態様７８に記載の方法。

８０．工程（ｃ）が、免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価を初期ＮＡｂ力価と比較して、免疫グロブリン枯渇が任意の有意な効果を有したか否かを決定する工程を含む、態様７８又は態様７９の方法。

８１．前記方法が：
（ｄ）患者からの試料に対して態様１～６４のいずれか１に記載の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること；
（ｅ）免疫グロブリン枯渇の前記更なるラウンド後のＮＡｂ力価が、遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定すること；
及び場合により
（ｆ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価に基づいて、免疫グロブリン枯渇のなお更なるラウンドが適切であるか否かを決定すること
を更に含む、態様７８～８２のいずれか１に記載の方法。

８２．工程（ｆ）が、免疫グロブリン枯渇が何らかの有意な効果を有していたか否かを決定するために、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンド後のＮＡｂ力価を互いに比較し、及び場合により初期ＮＡｂ力価と比較する工程を更に含む、態様８１の方法、

８３．前記方法が：
（ｇ）患者からの試料に対して本発明の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること；
（ｈ）免疫グロブリン枯渇の前記更なるラウンド後のＮＡｂ力価が、遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定すること；
及び場合により
（ｉ）免疫グロブリン枯渇のなお更なるラウンドが適切であるか否かを決定すること
を更に含む、態様７８～８２のいずれか１に記載の方法。

８４．工程（ｃ）、工程（ｆ）及び工程（ｉ）の免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの４８時間以内に実施され；場合により、工程（ｃ）、工程（ｆ）及び工程（ｉ）の免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの翌日に実施され；及び場合により、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの２４時間以内に実施される、態様７８～８３のいずれか１に記載の方法。

８５．前記方法が：
（ａ）２日間にわたる２ラウンドの免疫グロブリン枯渇；
（ｂ）３日間にわたる３ラウンドの免疫グロブリン枯渇；
（ｃ）４日間にわたる４ラウンドの免疫グロブリン枯渇；又は
（ｄ）５日間にわたる５ラウンドの免疫グロブリン枯渇
を含む、態様７８～８４のいずれか１に記載の方法。

８６．免疫グロブリン枯渇法が血漿交換であり；及び場合により、免疫グロブリン枯渇法が二重濾過血漿交換（ＤＦＰＰ）である、態様７８～８５のいずれか１項に記載の方法。

８７．標的細胞の集団が懸濁状態にあることを特徴とする、態様１～６４のいずれか１に記載の方法。

８８．態様１の工程（ｂ）が、態様１の工程（ａ）からの溶液のそれぞれを、着目したウイルスベクターによる感染に感受性である懸濁液中の標的細胞の集団に曝露することを含む、態様１～６４又は態様８７のいずれか１に記載の方法。

８９．標的細胞の集団が該方法に先立ってプレーティングされない、態様１～６４、８７又は８８のいずれか１に記載の方法。

９０．標的細胞が、アッセイプレートに固定化も接着もされていない、態様１～６４又は８７～８９のいずれか１に記載の方法。

９１．任意の準備工程を含む、前記方法のすべての工程が２４時間以内、場合により１８時間以内；場合により１２時間以内；場合により８時間以内；及び場合により８時間未満で完了する、態様１～６４のいずれか１に記載の方法。

９２．ＡＡＶウイルスベクターによってコードされるルシフェラーゼのための基質を含む試薬とともに、態様６５～７６のいずれか１に記載のＡＡＶウイルスベクターを含むキット。

９３．態様１～６４のいずれか１に記載のアッセイ法を実施するための指示書を更に含む、態様９２に記載のキット。

９４．標的細胞を含む容器を更に含み；場合により、標的細胞が哺乳動物細胞を含む。態様９２又は態様９３に記載のキット。

９５．標的細胞がＨＥＫ－２９３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、２９３、Ｂ－５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、Ｈｕｈ７、ＨＥＲ、ＨＥＫ、ＨＥＬ、又はＨｅＬａ細胞を含む、態様９４に記載のキット。

９６．標的細胞がＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む、態様９４のキット。

９７．キットが分離手段を更に含む、態様９２～９６のいずれか１に記載のキット。

９８．キットが冷却手段を更に含む、態様９２～９７のいずれか１に記載のキット。

９９．容器が分離手段を含む、態様９４～９６のいずれか１に記載のキット。

１００．容器が冷却手段を含む、態様９４～９６又は態様９９のいずれか１に記載のキット。

１０１．遺伝性障害を治療する方法において用いるためのＡＡＶウイルスベクターであって、前記方法が：
（ａ）患者に対して免疫グロブリン枯渇の方法を実施すること；
（ｂ）態様７８～８６のいずれか１に記載の方法を用いて、免疫グロブリンの枯渇の進行をモニタリングすること；及び
（ｃ）免疫グロブリンが十分に枯渇する時点で、ＡＡＶウイルスベクターを投与すること
を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターが、遺伝性疾患に関与するポリペプチドをコードする導入遺伝子を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターがキャプシドを含み、前記患者がキャプシドに対する抗体を有する方法である、ＡＡＶウイルスベクター。

１０２．免疫グロブリン枯渇法が：
（ａ）免疫グロブリンを特異的に標的とする免疫枯渇の方法；
（ｂ）ＩｇＧに結合する体外デバイスを用いる免疫枯渇の方法；又は
（ｃ）ヒトＩｇＧを消化する薬剤又は酵素（ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ等）の投与を含む免疫枯渇の方法であり、場合により、前記方法が、血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を減少させる薬剤又は酵素を対象に投与することを含み；場合により、薬剤又は酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス等のストレプトコッカス菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼ、或いはストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・エクイ若しくはストレプトコッカス・ズーエピデミクス等のストレプトコッカス菌由来、又はコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス、エンテロコッカス・フェカリス又はエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼであり；及び場合により、薬剤又は酵素は、配列番号１１若しくは配列番号１２による配列、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片又は変異体を含む
態様７８～８５のいずれか１に記載の方法。

Claims (29)

1. 対象からの試料中の着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を決定するための方法であって、以下の：
   （ａ）着目したキャプシドを含むウイルスベクターの粒子を、（１）種々の希釈の試料を含む１以上の参照溶液中、及び（２）少なくとも１の対照溶液中でインキュベーションし、パート（ａ）のウイルスベクターがルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含む工程；
   （ｂ）工程（ａ）からの各溶液を、着目したウイルスベクターによる感染に感受性である標的細胞の集団に曝露する工程；
   （ｃ）設定された時間間隔の間待機し、形質導入が起こるのを可能にする工程；
   （ｄ）ルシフェラーゼのための基質を参照溶液及び対照溶液に加え、ルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）を測定する工程；
   （ｅ）少なくとも１の対照溶液中のルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）を参照溶液中のルシフェラーゼから得られたシグナル（ＲＬＵ）と比較する工程；並びに
   （ｆ）ＮＡｂ力価を算出する工程；
   を含む、ルシフェラーゼを用いる形質導入阻害アッセイ（ＴＩＡ）を含み：
   （ｉ）工程（ｃ）における設定された時間間隔が２４時間未満であり、場合により１９時間以下であり、場合により１２時間以下であり、場合により８時間以下であり、場合により６時間以下であり、及び場合により３時間であり；並びに
   （ｉｉ）ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を提供する合成ルシフェラーゼである
   方法。
2. 工程（ｃ）において設定された間隔が６時間以下であり；及び場合により、工程（ｃ）において設定された間隔が３時間である、請求項１に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
3. 合成ルシフェラーゼが、配列番号１による配列を有するホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を有する、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
4. 合成ルシフェラーゼ及びその基質の発光シグナル（ＲＬＵ）並びにホタルルシフェラーゼ及びそのルシフェリン基質の発光シグナル（ＲＬＵ）を同一条件下で測定することにより、合成ルシフェラーゼの増強された発光が決定される、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
5. 合成ルシフェラーゼ及びその基質のシグナル（ＲＬＵ）が、ホタル及びそのルシフェリン基質のシグナル（ＲＬＵ）よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍又はそれ以上強い、請求項４に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
6. 合成高輝度ルシフェラーゼが：
   （ａ）配列番号２による配列；
   （ｂ）配列番号２と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；
   （ｃ）配列番号２と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列；
   （ｄ）配列番号３による配列；
   （ｅ）配列番号３と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
   （ｆ）配列番号３と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列；
   （ｇ）配列番号４による配列；
   （ｈ）配列番号４と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
   （ｉ）配列番号４と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列
   を含む、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
7. （ａ）少なくとも１の対照溶液が、着目したウイルスベクターに対する抗体を欠く陰性対照溶液を含む；又は
   （ｂ）少なくとも１の対照溶液が、着目したウイルスベクターに対する抗体を欠く第１の陰性対照溶液、及びウイルスベクターの形質導入を最大限に阻害するのに十分な濃度の中和抗体を含む第２の陽性対照溶液を含む、
   前記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
8. 陽性対照溶液がＩＶＩＧ（インビトロ免疫グロブリン）を含み；場合により、ＩＶＩＧが少なくとも２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度を有する、請求項７（ｂ）に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
9. 患者からの試料が血漿試料である、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
10. 試料希釈剤が、ＩｇＧが枯渇したウシ胎児血清を含み；場合により、試料希釈剤がＤＭＥＭを更に含む、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
11. 標的細胞の集団が、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１５０，０００、又は１５０，０００超の標的細胞を含む、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定する方法。
12. 標的細胞がＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
13. ウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス粒子である、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
14. ウイルスベクターが：
    （ａ）天然に生じるＡＡＶ血清型ＡＡＶ３及び／又はＡＡＶ３Ｂのキャプシド又はそれら由来のキャプシド；
    （ｂ）配列番号５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｃ）配列番号６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｄ）配列番号７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｅ）配列番号８に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｆ）配列番号９に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｇ）配列番号１０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；又は
    （ｈ）天然に生じる血清型ＡＡＶ５のキャプシド又はそれに由来するキャプシド
    を含む、請求項１３に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
15. 前記ＮＡｂ力価が、非線形回帰モデルを用いて算出又は定量化されて、参照溶液データを曲線に近似し、５０％中和が生じる正確な半最大値を取得する、上記請求項のいずれか１項に記載のＮＡｂ力価を決定するための方法。
16. ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えベクターゲノムを含むか又はキャプシドで包むＡＡＶベクターであって、ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼと比較して増強された発光を提供する合成ルシフェラーゼである、ＡＡＶベクター。
17. 組換えベクターゲノムが自己相補的である、請求項１６に記載のＡＡＶベクター、又は請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記組換えベクターゲノムが：
    （ａ）配列番号２による配列；
    （ｂ）配列番号２と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；
    （ｃ）配列番号２と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列；
    （ｄ）配列番号３による配列；
    （ｅ）配列番号３と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；
    （ｆ）配列番号３と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列；
    （ｇ）配列番号４による配列；
    （ｈ）配列番号４と少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列；又は
    （ｉ）配列番号４と１以下、２以下、３以下、４以下、又は５以下のアミノ酸が異なる配列
    を含むか又はからなる合成高輝度ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子を含む、請求項１６又は請求項１７に記載のＡＡＶベクター。
19. 前記ウイルス粒子が：
    （ａ）天然に生じるＡＡＶ血清型ＡＡＶ３及び／又はＡＡＶ３Ｂのキャプシド又はそれら由来のキャプシド；
    （ｂ）配列番号５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｃ）配列番号６に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｄ）配列番号７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｅ）配列番号８に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；
    （ｆ）配列番号９に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド；又は
    （ｇ）配列番号１０に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するキャプシド。
    を含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
20. 患者が、着目したキャプシドを含むウイルスベクターを用いる遺伝子治療に適格であるか否かを決定する方法であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記ウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること、及びそれを所定の閾値と比較することを含み、Ｎａｂ力価が閾値以下である場合、患者はウイルスベクターを用いる遺伝子治療に適格である。方法。
21. 血漿交換又は免疫グロブリンの標的枯渇等の、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに特異的な免疫グロブリンの枯渇の進行を患者においてモニタリングする方法であって：
    （ａ）患者からの試料に対して請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇のラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定する工程；
    （ｂ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価が遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定する工程；
    及び場合により
    （ｃ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価に基づいて、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが適切であるか否かを決定し；及び場合により、免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価を初期ＮＡｂ力価と比較して、免疫グロブリン枯渇が何らかの有意な結果を有していたか否かを決定する工程
    を含む、方法。
22. 前記方法が：
    （ｄ）患者からの試料に対して請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること；
    （ｅ）免疫グロブリン枯渇の前記更なるラウンド後のＮＡｂ力価が、遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定すること；
    及び場合により
    （ｆ）免疫グロブリン枯渇後のＮＡｂ力価に基づいて、免疫グロブリン枯渇のなお更なるラウンドが適切であるか否かを決定し、及び場合により、免疫グロブリン枯渇が何らかの有意な効果を有していたか否かを決定するために、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンド後のＮＡｂ力価を互いに比較し、及び場合により初期ＮＡｂ力価と比較すること
    を更に含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記方法が：
    （ｇ）患者からの試料に対して本発明の方法を実施することにより、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンド後に、設定された時間間隔内に、着目したキャプシドを含むウイルスベクターに対する患者のＮＡｂ力価を決定すること；
    （ｈ）免疫グロブリン枯渇の前記更なるラウンド後のＮＡｂ力価が、遺伝子治療の適格性について所定の閾値を下回っているか否かを決定すること；
    及び場合により
    （ｉ）免疫グロブリン枯渇のなお更なるラウンドが適切であるか否かを決定すること
    を更に含む、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
24. 設定された時間間隔が、２４時間以下、１９時間以下、１２時間以下、９時間以下、又は６時間以下である、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 工程（ｃ）、工程（ｆ）及び工程（ｉ）の免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドから４８時間以内に実施され；場合により、工程（ｃ）、工程（ｆ）及び工程（ｉ）の免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの翌日に実施され；及び場合により、免疫グロブリン枯渇の更なるラウンドが、以前の免疫グロブリン枯渇のラウンドの２４時間以内に実施される、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記方法が：
    （ａ）２日間にわたる２ラウンドの免疫グロブリン枯渇；
    （ｂ）３日間にわたる３ラウンドの免疫グロブリン枯渇；
    （ｃ）４日間にわたる４ラウンドの免疫グロブリン枯渇；又は
    （ｄ）５日間にわたる５ラウンドの免疫グロブリン枯渇。
    を含む、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 免疫グロブリン枯渇法が血漿交換であり；及び場合により、免疫グロブリン枯渇法が二重濾過血漿交換（ＤＦＰＰ）である。請求項２１～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 免疫グロブリン枯渇法が：
    （ａ）免疫グロブリンを特異的に標的とする免疫枯渇の方法；
    （ｂ）ＩｇＧに結合する体外デバイスを用いる免疫枯渇の方法；又は
    （ｃ）ヒトＩｇＧを消化する薬剤又は酵素（ＩｇＧシステインプロテアーゼ又はＩｇＧエンドグリコシダーゼ等）の投与を含む免疫枯渇の方法であり、場合により、前記方法が、血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる薬剤又は酵素を対象に投与することを含み；場合により、薬剤又は酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス等のストレプトコッカス菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼ、或いはストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・エクイ若しくはストレプトコッカス・ズーエピデミクス等のストレプトコッカス菌由来、又はコリネバクテリウム・シュードツベルクローシス、エンテロコッカス・フェカリス又はエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼであり；及び場合により、薬剤又は酵素は、配列番号１１若しくは配列番号１２による配列、又はＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片又は変異体を含む
    請求項２１～２６のいずれか１項に記載の方法。
29. 遺伝性障害を治療する方法において用いるためのＡＡＶウイルスベクターであって、前記方法が：
    （ａ）患者に対して免疫グロブリン枯渇の方法を実施すること；
    （ｂ）請求項２１～２７のいずれか１項に記載の方法を用いて、免疫グロブリンの枯渇の進行をモニタリングすること；及び
    （ｃ）免疫グロブリンが十分に枯渇する時点で、ＡＡＶウイルスベクターを投与すること
    を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターが、遺伝性疾患に関与するポリペプチドをコードする導入遺伝子を含み、前記ＡＡＶウイルスベクターがキャプシドを含み、前記患者がキャプシドに対する抗体を有する方法である、ＡＡＶウイルスベクター。

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