JP7232766B2 - アデノ随伴ウイルス調製物の効力を決定する方法 - Google Patents
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Description
本開示の方法は、例えば、投与用の調製物を作成するための最終ステップを含めて精製プロセスの1又は2以上のステップの後(例えば、各ステップの後)に得られるAAV画分又は調製物の濃度、用量及び/又は効力を測定するステップなど、1又は2以上の品質管理ステップを含む。
本開示の方法により生成されるAAV調製物を本明細書にさらに提供する。ある実施形態では、AAV調製物を生成する方法は、(i)目的遺伝子を含む少なくとも1つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトするステップ;(ii)AAVカプシドを含む細胞培養物の上清又は細胞懸濁液を収集してAAV画分又は調製物を作成するステップ;(iii)AAV特異的ELISAアッセイを用いてAAV画分又は調製物中のAAVカプシドの総数を定量化するステップ;及び(iv)ステップ(iii)において決定したAAVカプシドの総数に基づき所望の濃度を有するAAV調製物を調製するステップを含む。ある実施形態では、その方法は、AAV画分を濃縮することを含む。ある実施形態では、その方法は、AAV画分から空カプシドの少なくとも一部を除去することを含む。ある実施形態では、特定濃度の完全カプシド及び/又は特定の完全カプシド:空カプシド比を有するAAV画分又は調製物をもたらすためにその量の空カプシドが除去される。ある実施形態では、AAV画分又は調製物を適切なバッファーで所望の用量に希釈する。
本開示の方法に関して、AAVはあらゆるAAV血清型であってよい。ある実施形態では、本明細書に記載のAAVは、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、AAV10血清型のもの、又はキメラAAVベクターであってよい。ある実施形態では、AAVは野生型である。ある実施形態では、AAVは組換えAAV(rAAV)である。ある実施形態では、AAVは、遺伝子操作により改変されている及び/又は化学修飾されている。ある実施形態では、AAVは、改変されたカプシド、例えば、遺伝子操作された又は化学修飾されたAAVカプシドである。ある実施形態では、AAVは、AAV8血清型のものである。ある実施形態では、AAVはAAV9血清型のものである。
本開示の方法は、本明細書に開示されるステップのあらゆる組合せを含み、任意選択で、1つ又は複数の追加ステップと組み合わせてもよい。
この実施例は、AAV特異的ELISAを実証する。ELISAは、試験画分又は調製物中に存在するAAV8粒子の量を決定する。
この実施例は、低温透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)を実証する。
この実施例は、AAV特異的ELISAを使用することにより、qPCR手法を使用するよりも少ない変動をもたらすことを実証する。
この実施例は、AAV調製物中の完全及び空カプシドの量を測定するツールとしてのCryoTEMのバリデーション(妥当性確認)を行う。
CryoTEM:ベクター試料を、極低温条件下で瞬間凍結することにより不活性支持体上において非結晶性の非晶質氷中に包埋することによって、その本来の状態に近い状態で保存した。実施例2に記載するように、Vironova解析ソフト(VAS)を利用する自動客観解析法を用いて画像解析を行った。
図6は、CryoTEMを用いて完全カプシド及び空カプシドを画像化できることを実証する。図7は、試料分析の例である。38kの倍率で取得したCryoTEM画像を、内部密度分析にかけた。各AAV粒子の半径方向密度プロファイルの主成分分析は、パッケージングレベルのクラスターを表した:完全(赤;左)、青(空;右)、不確定(緑;中央);破線の輪:99%信頼区間。得られた結果の概要に関して表8を参照。
CryoTEMはAAV調製物の効力を定量化する有用なツールであり、治療用途用の遺伝子治療ベクター調製物のリリースを可能にする。ベクターの定量化のために完全及び空カプシド粒子の量、或いはベクターゲノムのタイターを測定することは、オルトゴナル法としての機能を果たすことができる。CryoTEMは、遺伝子治療ベクターの質及び効力を監視することを可能にするという利点を有する。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
[実施態様1]
AAV調製物の用量を定量化する方法であって、AAV特異的ELISAアッセイにより、AAV調製物中のAAVカプシドの総数を定量化するステップを含む、方法。
[実施態様2]
AAV調製物の用量を定量化する方法であって、AAV特異的ELISAアッセイにより、AAV調製物中のAAVカプシドの総数を定量化するステップ、及び低温透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)により、AAV調製物中の完全対空(完全:空)AAVカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップを含む、方法。
[実施態様3]
AAV調製物中の完全AAVカプシドの濃度を測定する方法であって、AAV特異的ELISAアッセイにより、AAV調製物中のAAVカプシドの総数を定量化するステップ、及び低温透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)により、AAV調製物中の完全対空AAVカプシドのパーセンテージを評価するステップを含む、方法。
[実施態様4]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原特異的な、サンドイッチELISA、直接ELISA、間接ELISA、又は競合ELISAアッセイである、実施態様1~3のいずれかに記載の方法。
[実施態様5]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原に特異的なサンドイッチELISAアッセイである、実施態様1~4のいずれかに記載の方法。
[実施態様6]
AAV調製物中の完全対空(完全:空)AAVカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様7]
前記評価するステップが、ELISAアッセイの前又は後に行われる、実施態様1~6のいずれかに記載の方法。
[実施態様8]
前記評価するステップが、低温透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)、ネガティブ染色TEM、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、UV分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全:空AAVカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、実施態様6又は7に記載の方法。
[実施態様9]
前記評価するステップが、CryoTEMを使用することを含む、実施態様6~8のいずれかに記載の方法。
[実施態様10]
CryoTEMステップが:
(i)不活性支持体中の基材にAAV調製物を包埋する;
(ii)包埋AAV調製物を瞬間凍結する;
(iii)低温透過型電子顕微鏡法を用いて包埋AAV調製物を画像化する;及び
(iv)AAV調製物中の完全AAVカプシド対空AAVカプシドのパーセンテージを定量化することを含む、実施態様8又は9に記載の方法。
[実施態様11]
前記基材が非結晶性の非晶質氷である、実施態様10に記載の方法。
[実施態様12]
AAV調製物が細胞破片を含まない、実施態様10に記載の方法。
[実施態様13]
定量PCRを含まない、実施態様1~12のいずれかに記載の方法。
[実施態様14]
AAV調製物をそれを必要とする対象に投与する方法であって、
(i)精製AAV調製物を得るステップ;
(ii)AAV特異的ELISAアッセイを用いて、精製AAV調製物中のAAVカプシドの濃度を測定するステップ;及び
(iii)治療有効量の精製AAV調製物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
[実施態様15]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原特異的な、サンドイッチELISA、直接ELISA、間接ELISA、又は競合ELISAアッセイである、実施態様14に記載の方法。
[実施態様16]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原に特異的なサンドイッチELISAアッセイである、実施態様14又は15に記載の方法。
[実施態様17]
AAV調製物中の完全対空(完全:空)AAVカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、実施態様14~16のいずれかに記載の方法。
[実施態様18]
前記評価するステップが、ELISAアッセイの前又は後に行われる、実施態様17に記載の方法。
[実施態様19]
前記評価するステップが、CryoTEM、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、UV分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全:空AAVカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、実施態様17又は18に記載の方法。
[実施態様20]
前記評価するステップが、CryoTEMを使用することを含む、実施態様17~19のいずれかに記載の方法。
[実施態様21]
精製AAV調製物の濃度が、約1x10 10 cp/ml~約1x10 20 cp/mlである、実施態様14~20のいずれかに記載の方法。
[実施態様22]
AAV調製物の治療有効量が、約1x10 10 cp/kg~約1x10 16 cp/kgの間の用量である、実施態様14~21のいずれかに記載の方法。
[実施態様23]
定量PCRを含まない、実施態様14~22のいずれかに記載の方法。
[実施態様24]
前記対象がヒトである、実施態様14~23のいずれかに記載の方法。
[実施態様25]
AAV調製物をそれを必要とする対象に特定用量で投与する方法であって、
(i)精製AAV調製物を得るステップ;
(ii)AAV特異的ELISAアッセイを用いて、精製AAV調製物中のAAVカプシドの濃度を測定するステップ;及び
(iii)特定用量の精製AAV調製物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
[実施態様26]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原特異的な、サンドイッチELISA、直接ELISA、間接ELISA、又は競合ELISAアッセイである、実施態様25に記載の方法。
[実施態様27]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原に特異的なサンドイッチELISAアッセイである、実施態様25又は26に記載の方法。
[実施態様28]
AAV調製物中の完全対空(完全:空)AAVカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、実施態様25又は27に記載の方法。
[実施態様29]
前記評価するステップが、ELISAアッセイの前又は後に行われる、実施態様28に記載の方法。
[実施態様30]
前記評価するステップが、CryoTEM、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、UV分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全:空AAVカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、実施態様28又は29に記載の方法。
[実施態様31]
前記評価するステップが、CryoTEMを使用することを含む、実施態様28~30のいずれかに記載の方法。
[実施態様32]
定量PCRを含まない、実施態様25~31のいずれかに記載の方法。
[実施態様33]
精製AAV調製物の濃度が、約1x10 10 cp/ml~約1x10 20 cp/mlである、実施態様25~32のいずれかに記載の方法。
[実施態様34]
AAV調製物の治療有効量が、約1x10 10 cp/kg~約1x10 16 cp/kgの間の用量である、実施態様25~33のいずれかに記載の方法。
[実施態様35]
前記対象がヒトである、実施態様25~34のいずれかに記載の方法。
[実施態様36]
AAV調製物を生成する方法であって、
(i)目的遺伝子を含む少なくとも1つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトするステップ;
(ii)AAVカプシドを含む細胞培養物の上清又は細胞懸濁液を収集してAAV画分を作成するステップ;
(iii)AAV特異的ELISAアッセイを用いて、AAV画分中のAAVカプシドの総数を定量化するステップ;及び
(iv)前記AAVカプシドの総数に基づき、所望の濃度を有するAAV調製物を調製するステップ
を含む、方法。
[実施態様37]
AAV画分を濃縮するステップをさらに含む、実施態様36に記載の方法。
[実施態様38]
AAV画分から空カプシドの少なくとも一部を除去するステップをさらに含む、実施態様36又は37に記載の方法。
[実施態様39]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原特異的な、サンドイッチELISA、直接ELISA、間接ELISA、又は競合ELISAアッセイである、実施態様36~38のいずれかに記載の方法。
[実施態様40]
前記ELISAアッセイが、AAV抗原に特異的なサンドイッチELISAアッセイである、実施態様36~39のいずれかに記載の方法。
[実施態様41]
AAV調製物中の完全対空(完全:空)AAVカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、実施態様36~40のいずれかに記載の方法。
[実施態様42]
前記評価するステップが、ELISAアッセイの前又は後に行われる、実施態様41に記載の方法。
[実施態様43]
前記評価するステップが、CryoTEM、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、UV分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全:空AAVカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、実施態様41又は42に記載の方法。
[実施態様44]
前記評価するステップが、CryoTEMを使用することを含む、実施態様41~43のいずれかに記載の方法。
[実施態様45]
定量PCRを含まない、実施態様36~44のいずれかに記載の方法。
[実施態様46]
完全AAVカプシドのパーセンテージは約40%~約100%である、実施態様36~45のいずれかに記載の方法。
[実施態様47]
少なくとも60%のAAVカプシドが完全AAVカプシドである、実施態様36~46のいずれかに記載の方法。
[実施態様48]
前記濃度は約1x10 10 cp/ml~約1x10 20 cp/mlの間である、実施態様36~47のいずれかに記載の方法。
[実施態様49]
AAV調製物を凍結乾燥するステップをさらに含む。実施態様36~48のいずれかに記載の方法。
[実施態様50]
AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、又はキメラAAVベクターである、実施態様1~49のいずれかに記載の方法。
[実施態様51]
AAVはAAV8である、実施態様50に記載の方法。
[実施態様52]
AAVはAAV9である、実施態様50に記載の方法。
[実施態様53]
AAVは、遺伝子操作AAV、化学修飾AAV、又はその両方である、実施態様1~52のいずれかに記載の方法。
[実施態様54]
AAV抗原は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、キメラAAV、遺伝子操作AAV、又は化学修飾AAVに由来する、実施態様4~13、15~24、26~35、及び39~53のいずれかに記載の方法。
[実施態様55]
実施態様36~54のいずれかに記載の方法により生成されたAAV調製物。
[実施態様56]
特定の効力を有し、該効力が、in vitroシステム、in vivoシステム、又はその両方の組合せを用いて確認される、実施態様55に記載のAAV調製物。
Claims (24)
- 目的遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)の調製物を定量化する方法であって、
AAV特異的ELISAアッセイにより、前記AAV調製物中のAAVカプシドの総数を定量すること、及び
クライオ透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)により、前記AAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価すること
を含む、方法。 - 目的遺伝子を含むAAVの調製物中の完全AAVカプシドの濃度を測定する方法であって、
AAV特異的ELISAアッセイにより、前記AAV調製物中のAAVカプシドの総数を定量すること、及び
クライオ透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)により、前記AAV調製物中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージを評価すること
を含む、方法。 - 特定用量の、目的遺伝子を含むAAVの調製物を調製する方法であって、
(i)精製AAV画分を得ること、
(ii)AAV特異的ELISAアッセイを用いて、前記精製AAV画分中のAAVカプシドの濃度を測定すること、
(iii)AAVカプシドの総数に基づき、所望の濃度を有するAAV調製物を調製すること、及び
(iv)クライオ透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)により、前記AAV調製物又は前記AAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価すること
を含む、方法。 - 目的遺伝子を含むAAVの調製物を作製する方法であって、
(i)目的遺伝子を含む少なくとも1つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトすること、
(ii)AAVカプシドを含む細胞培養物の上清又は細胞懸濁液を収集してAAV画分を作製すること、
(iii)AAV特異的ELISAアッセイを用いて、前記AAV画分中のAAVカプシドの総数を定量すること、
(iv)AAVカプシドの総数に基づき、所望の濃度を有するAAV調製物を調製すること、及び
(v)クライオ透過型電子顕微鏡法(CryoTEM)により、前記AAV調製物又は前記AAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価すること、
を含む、方法。 - AAV画分を濃縮する及び/又はAAV画分から空カプシドの少なくとも一部を除去することをさらに含む、請求項3又は4に記載の方法。
- AAV調製物を凍結乾燥することをさらに含む、請求項3~5のいずれか一項に記載の方法。
- CryoTEMによりAAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価することが、前記ELISAアッセイの前に行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- CryoTEMによりAAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価することが、前記ELISAアッセイの後に行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- CryoTEMによりAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価することが、前記ELISAアッセイの前に行われる、請求項3~6のいずれか一項に記載の方法。
- CryoTEMによりAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価することが、前記ELISAアッセイの後に行われる、請求項3~6のいずれか一項に記載の方法。
- CryoTEMによりAAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価することが、そのAAV調製物又はAAV画分が以前のAAV調製物又はAAV画分と一貫した完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を有することを試験するために1回行われる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- ネガティブ染色TEM、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、UV分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、AAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を決定することをさらに含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- CryoTEMによりAAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージ又は比を評価することが、
(i)不活性支持体上において基材にAAV調製物又はAAV画分を包埋すること、
(ii)包埋AAV調製物又はAAV画分を瞬間凍結すること、
(iii)クライオ透過型電子顕微鏡法を用いて包埋AAV調製物又はAAV画分を画像化すること、及び
(iv)AAV調製物又はAAV画分中の完全AAVカプシドの空AAVカプシドと対比したパーセンテージを定量すること
を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記基材が非結晶性の非晶質氷である、請求項13に記載の方法。
- AAV調製物又はAAV画分が細胞破片を含まない、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記ELISAアッセイが、AAV抗原特異的な、サンドイッチELISA、直接ELISA、間接ELISA、又は競合ELISAアッセイである、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- AAV抗原が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、キメラAAV、遺伝子操作されたAAV、又は化学修飾されたAAVに由来する、請求項16に記載の方法。
- 定量PCRを含まない、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 完全AAVカプシドのパーセンテージが40%~100%である、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも60%のAAVカプシドが完全AAVカプシドである、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃度が1x1010cp/ml~1x1020cp/mlの間である、請求項2~20のいずれか一項に記載の方法。
- AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、又はキメラAAVベクターである、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- AAVが、AAV6、AAV8、又はAAV9である、請求項22に記載の方法。
- AAVが、遺伝子操作されたAAV、化学修飾されたAAV、又はその両方である、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
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