JP2018523992A - パルボウイルスを大規模生産および精製するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
堅固な標準化されたH−1PV産生方法は、以下に例示され、図9に要約したように、五つの個別ウイルスバッチについて確立された。
未処理ウイルス採取物は、完全粒子、中空粒子および中間密度粒子を含有しており、ウイルスおよび宿主細胞のDNAおよびタンパク質の両方によってコンタミネーションされた。これらを最初にDNAse処理し、次にフィルター(例えば、0.2μmフィルター)に通して清澄化した。これは宿主細胞DNAおよび非パッケージウイルスDNAの37%および全タンパク質の24%の排除を生じさせた。宿主細胞DNAの残留断片は、62bpより小さいことが証明された。
ハーモナイゼーション国際会議は、“”Specifications:Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products”(Q6B,1999)において、このタイプの産物のためのガイドラインを発行した。これらのガイドラインは、それらの物理化学的特性、生物学的活性、免疫化学的特性、量、純度、不純物およびコンタミネーション物質を含む、製剤が特性解析されなければならないレベルを規定している。原則として、前記原料物質、精製工程および処方が、製剤の一貫性の品質を保証する。H−1PVバッチは、ICHガイドラインにしたがって定量および特定される。本発明において取り扱った特定の課題は、中空粒子による完全粒子ウイルスストックのコンタミネーションであった。これは、中空粒子が非毒性ではあるが、細胞生理学に影響を及ぼして、抗ウイルス免疫応答を誘導する可能性があるために、重要である(Gao他,2014)。したがって、ゲノム含有ビリオンおよび全物理的ウイルス粒子の両方を定量するための方法が必要とされる。定量的PCRは完全ビリオンを定量するための良好な方法であると思われるが、物理的粒子定量のより便宜的方法が必要とされる。本発明においては、集合H−1PVカプシドを特異的に認識する、前記mAb BL−H1を使用する「カプシド−ELISA」が開発された。このELISAは、パルボウイルス粒子を検出するために伝統的に使用されてきた前記赤血球凝集反応検定ほど煩雑ではなく、信頼性がより高く、更に感受性がより高いことが証明された。完全ビリオンバッチから中空粒子を清澄化することは、依然として精製手法を更に改善するための目標である。これとは逆に、感染性ビリオンを全く含まない、および、ウイルス感染性の非存在下でそれらのインビトロおよびインビボ作用について試験できる中空粒子ストックを得ることもまた重要である。これは、感染性ビリオンを不活化するために中空粒子バッチをUV光で照射することにより達成された。前記手法は、含有する感染性ビリオンが10−10%未満である中空粒子バッチを生じさせる。
ウイルスストックの定性的および定量的制御における使用に加えて、mAb BL−H1は、前臨床試験および臨床試験両方に付随する研究にとって価値が高いことが判明した。それは、処置動物由来の血清中のH−1PV特異的抗体を定量するための標準物質として使用されており(Grekova他,2011)、将来は患者における血清変換を監視するために使用することができよう。BL−H1は、ELISAにおいて感染被験者におけるウイルス血症を検出する捕捉抗体としても、そして、PV感染についての動物施設由来のラットをスクリーニングするためにも使用することができる(欧州特許第2332986(A1)号明細書)。
(a)プロデューサー細胞系NB−324Kを提供する工程、
(b)好適な条件下で前記細胞系を増殖させる工程、および、0.5〜2×10−2PFU/細胞のMOIを備えるパルボウイルスを用いて2.0〜5.0×104細胞/cm2の細胞密度で前記細胞を感染させる工程、
(c)前記細胞を感染2〜6日後に採取して遠心分離によって細胞ペレットを得る工程、
(d)細胞溶解物を含有するパルボウイルスを得るために、再懸濁した前記細胞ペレットを機械的、物理的、または、化学的な細胞溶解に供する工程、
(e)前記細胞溶解物を超音波処理して前記細胞溶解物をDNAse処理に供する工程、
(f)濾過によって前記DNAse処理したパルボウイルス採取物を清澄化する工程、および、
(g1)2回の連続密度勾配超遠心分離によって前記パルボウイルスを精製する工程であって、第1勾配はイオジキサノール/PBSステップ勾配であり、第2勾配はイオジキサノール/リンゲルステップ勾配またはイオジキサノール/リンゲル連続勾配であり、一つの分画内で全活性パルボウイルス粒子およびまた別の分画内で中空パルボウイルス粒子を得るためものである、工程、または
(g2)中空パルボウイルス粒子を得るために前記パルボウイルスを連続CsCl勾配超遠心分離によって精製する工程、を含む方法に関する。
したがって、タンパク質を除去するために、Zolotukhinによって記載された(Zolotukhin他,1999)ステップ密度勾配遠心分離を実施した。好ましい実施形態では、Quicksealチューブ(Beckman、独国、例えば25×89mm)に10〜50mL、好ましくは20mLのウイルス懸濁液を充填した。この懸濁液の下に、緩衝剤、例えば、PBS中の、2〜5層、例えば、4層のイオジキサノール(Alexis Shield、ノルウェー)を置いた。好ましいイオジキサノール濃度、15、25、40および60%。超遠心分離は、超遠心分離機において好適な時間および速度で、好ましくは、227,220の相対遠心分離力(RCF)に相当する50,000rpmの50.2 Tiローター(Beckman、L870M、独国)で4℃、2時間で実施した。通常、40%のイオジキサノール層から3.5mLのウイルス懸濁液が収集された。この後、更にタンパク質を除去して中空粒子から完全粒子を分離するために、緩衝剤、好ましくは、リンゲル液(B.Braun、独国)中に希釈したVisipaque(GE Healthcare、ノルウェー)を使用して第2密度勾配遠心分離を実施した。好ましい実施形態では、Quicksealチューブ(例えば、25×89mm)に緩衝剤、例えば、リンゲル液中に、少なくとも1:2.5で希釈したIOD−PBS密度勾配からのウイルス懸濁液を充填した。この後、1〜10mL(例えば、5mL)の25%、1〜10mL(例えば、4mL)の40%、および、1〜10mL(例えば、4mL)の55%のリンゲル液中のVisipaqueを下に置いた。40%の層を検出するために、25%および55%のVisipaque/リンゲル相がフェノールレッドで着色された参照勾配を作成した。更に、前記40%相を前記サンプルチューブ上の外側に表示した。超遠心分離は、好適な条件下で、例えば、50,000rpmに設定した50.2 Tiローター内において4℃で2時間実施した。次に、前記40%相の2つの分画、好ましくは、1〜5mL、例えば2.5mLの完全粒子分画(40%層の下方のバンド)および、好ましくは0.1〜1.5mLの、例えば、800μLの中空粒子分画(40%層の上方のバンド)をシリンジおよび中空針を用いて収集した。屈折計(AR200、Reichert Analytical Instruments、独国)を使用して5μLサンプルの屈折率を測定し、分画を取り出した領域の密度は、イオジキサノールについての参照表(AXIS-SHIELD、ノルウェー)を用いて計算した。
連続Vis−リンゲル勾配のために、Quicksealチューブに、約1.3〜1.4、例えば、1.3815(30%のVisipaqueに相当する)の屈折指数までリンゲル液に希釈したウイルス懸濁液を充填した。前記ウイルス懸濁液の下に、0.1〜1mL、好ましくは0.5mLの60〜70%、好ましくは、65.2%のVisipaqueクッションを置き、前記チューブに、好ましくは、30%のVisipaque/リンゲル液を完全に充填した。超遠心分離は、好適な条件下で、例えば、63,000rpmでの70.1 Tiローター内において4℃で10時間実施した。約500μLの分画を制御滴下法(controlled dripping)の下で底部から収集した。
材料および方法
(A)プロデューサー細胞系、H−1PVウイルスストック
シミアン・ウイルス40(SV40)を用いて形質転換させたNB−324Kヒト新生児腎細胞(TattersallおよびBratton,1983)を5%のCO2雰囲気下で5%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS、Biowest、仏国)を含む最小必須培地(MEM、Sigma、独国)中で37℃にて培養した。前記培地には、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンおよび2mMのL−グルタミン(Life Technologies、独国)を補充した。産生するために、6,360cm2の増殖面積を備える10層式CellSTACK(登録商標)培養チャンバー(Corning、独国)内に175cm2のY型フラスコ(Nunc、デンマーク国)で増殖させたNB−324K細胞を播種した。0.4%のトリパンブルー(Invitrogen(商標)、独国)を用いて生細胞を染色することによって、細胞密度および生存率を測定した。細胞数は、Countess(登録商標)セルカウンター(Life Technologies、独国)を用いて計数した。社内精製H−1PVウイルスストックを使用して、前記細胞を感染させた。
便宜的な単回使用産生システムとして、10層式CellSTACK(登録商標)(CS)を選択した。細胞播種および感染を同時に実施するために、NB−324K細胞を10層式CS内に3.6×104細胞/cm2で播種し、直ちにH−1PVを用いて細胞当たり0.01プラーク形成単位(PFU)の感染多重度(MOI)で感染させた。感染中のpHは、7.0±0.1であった。前記感染細胞を5%のCO2雰囲気下の37℃で4日間にわたり、顕微鏡下で観察される死細胞および脱離細胞のパーセンテージとして測定される前記細胞変性作用(CPE)が少なくとも30%に達するまでインキュベートした。同時ではない播種および感染のためには、NB−324K細胞を10層式CS内に7.9×103細胞/cm2で播種し、それまでにコントロールフラスコ培養で測定されたおよそ3.6×104細胞/cm2の密度に達する時間により、3日間にわたり増殖させた。次に、これらのアンカー細胞を上記したように0.01PFU/細胞のMOIで感染させ、4日間インキュベートした。採取するために、前記培地を吸引し、感染細胞をPBS/1mMのEDTAを用いて処理した。前記培地上清および脱離細胞を5分間にわたり5,000×gで遠心した。前記ペレットをPBSで洗浄し、0.05MのTris HC1、30.5mMのEDTAを含有するウイルスTris/EDTA緩衝剤(pH8.7)(VTE)中に再懸濁させ、回の凍結/融解サイクルに供した。5,000×gでの5分間の遠心分離後、細胞断片を廃棄した。次に前記細胞溶解液をSonorex Super 10P超音波ホモジナイザー(Bandelin、独国)内で48Wにて1分間超音波処理し、DNAse(50U/mL、Sigma、独国)を用いて37℃で30分間処理した。
前記DNase処理ウイルス採取物は、0.2μmのSartolab(登録商標)P20 Plusフィルター(Sartorius、独国)に通す濾過によって清澄化した。ウイルスを精製するためには、一つはイオジキサノール−PBS(IOD−PBS)を用いて、および、一つはVisipaque−リンゲル(VIS−リンゲル)を用いて−または、塩化セシウム密度勾配の後にVTE緩衝剤に対する透析を行ういずれか二つの連続ステップ勾配を用いる二種の異なる方法を使用した。
タンパク質を除去するために、Zolotukhin(Zolotukhin他,1999)によって記載されたステップ密度勾配遠心分離を実施した。このために、25×89mmのQuicksealチューブ(Beckmann、独国)に20mLのウイルス懸濁液を充填した。この懸濁液の下に、PBS中の4層のイオジキサノール(Alexis Shield、ノルウェー)(イオジキサノール濃度;15、25、40および60%)を置いた。超遠心分離は、227,220の相対遠心分離力(RCF)に相当する50,000rpmに設定した50.2 Tiローター(Beckmann、L870M、独国)内で4℃にて2時間実施した。通常、前記40%のイオジキサノール層から3.5mLのウイルス懸濁液が収集された。この後、更にタンパク質を除去して中空粒子から完全粒子を分離するために、リンゲル液(B.Braun、独国)中に希釈したVisipaque(GE Healthcare、ノルウェー)を使用して第2密度勾配遠心分離を実施した。このためには、リンゲル液中に少なくとも1:2.5で希釈したIOD−PBS密度勾配からのウイルス懸濁液を25×89mmのQuicksealチューブに充填した。この後、リンゲル液中の5mLの25%、4mLの40%および4mLの55%のVisipaqueを下に置いた。40%の層を検出するために、25%および55%のVisipaque/リンゲル相がフェノールレッドで着色された参照勾配を作成した。更に、前記40%相を前記サンプルチューブ上の外側に表示した。超遠心分離は、50,000rpmに設定した50.2 Tiローター内において4℃で2時間実施した。この後に、シリンジおよび中空針を用いて、前記40%相の二つの分画を収集した。2.5mLの前記完全粒子分画(40%層の下方のバンド)、および、800μLの前記中空粒子分画(40%層の上方のバンド)。屈折計(AR200、Reichert Analytical Instruments、独国)を使用して5μLサンプルの屈折率を測定し、イオジキサノールについての参照表(AXIS-SHIELD、ノルウェー)を用いて分画を取り出した領域の密度を計算した。
連続Vis−リンゲル勾配のために、Quicksealチューブに1.3815の屈折指数までリンゲル液に希釈した(30%のVisipaqueに相当する)ウイルス懸濁液を充填した。前記ウイルス懸濁液の下に、0.5mLの65.2%のVisipaqueクッションを置き、前記チューブに30%のVisipaque/リンゲル液を完全に充填した。超遠心分離は、63,000rpmに設定した70.1 Tiローター内において4℃で10時間実施した。約500μLの分画を制御滴下法の下で底部から収集した。
CsCl密度勾配は、以前に記載されたように確立された(Paradiso,1981)。このために、14×95mmのポリアロマー製遠心チューブ(Beckmann、独国)に5mLのCsClを1.4g/cm3の密度で充填し、この上に1mLの1Mサッカロース、次に5mLのウイルス懸濁液を充填した。超遠心分離は、39,000rpmに設定したSW41ローター内で15℃にて少なくとも20時間実施した。底部から様々な分画(例えば、分画#1:500μL、分画#2:300μL、分画#3〜20:200μL)を収集し、カプシド(物理的粒子、PP)含量を本明細書に記載した新規なELISA(カプシド−ELISA)、または、赤血球凝集アッセイによって測定した。赤血球凝集単位を検出するために(KongsvikおよびToolan,1972)、分画をPBS中に1:1.25で希釈し、更に丸底96ウエルプレート(Greiner Bio-One、独国)内で連続的に1:2に希釈した。次に、PBS中の、25μLの2%のモルモット赤血球懸濁液(Charles River Laboratories、独国)を加えた。前記プレートを4℃で1時間インキュベートし、赤血球凝集反応が完了した時点の力価を最高希釈率として読み取った。屈折指数を測定し、CsClについての参照表にしたがって密度を計算した(Griffith,2006)。完全または中空カプシドを含有する分画をプールし、室温でおよそ30分間にわたり1,000体積のVTE緩衝剤に対して直接的に透析した。この後に、前記毒性CsClを除去するために4℃で3回の透析サイクルを実施した。
前記中空粒子プール内の残留感染性粒子を不活化するために、500μLの中空粒子分画を無菌層流フード下の6cm培養皿(Greiner Bio-One、独国)の中心に置いた。254nmで発光するUVランプ(NU−4型、Herolab、独国)を使用して、放射計(VLX−3W、Benda、独国)を用いて測定した0.5mW/cm2でサンプルを照射した。前記サンプルは、UVを使用しない5分間の間隔をあけて、4回、2分間ずつ照射した。
(i)プラーク形成アッセイ
プラークアッセイは、本質的にTattersallおよびBratton,1983に記載されたように実施した。NB−324K細胞は、5%のFBS、100μg/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンおよび2mMのL−グルタミンを含有するMEM培地中で単層培養により増殖させた。NB−324K細胞は、H−1PVの連続希釈液を用いて60%のコンフルエンスで感染させ、37℃で1時間インキュベートした。次に接種原(inoculum)をバクトアガーオーバーレイ(5%のFBSを含有するMEM中で1.7%)と置換した。感染4日後、バクトアガー(Becton Dickinson、独国)を含有する0.02%のトルイレンレッド染色液(Sigma、独国)の添加により生細胞を18〜24時間にわたり染色した。前記培養皿を37℃の5%のCO2雰囲気下でインキュベートした。感染5日後にライトボックス上でプラーク形成単位を計数し、プラーク形成単位の濃度をPFU/mLで表示した。
NB−324K細胞(7.6×103細胞/ウエル)は、H−1PVによって感染させる24時間前に、96ウエルプレート内に播種した。前記NB−324K細胞をH−lPVの10倍連続希釈液で感染させ、5%のCO2雰囲気下において37℃で72時間インキュベートした。−80°Cでの凍結およびアルカリ性融解(1.5MのNaOH)後、それらのDNAをCL−1000紫外線架橋剤(UVP、米国)で架橋させたナイロン膜に移し、NSl特異的32P放射標識プローブとハイブリダイズさせた後にオートラジオグラフィーにかけた。ウイルス滴定を二回実施し、力価はmL当たりの感染単位(IU)で表示した(Lacroix他,2010)。
ゲノム含有ウイルス粒子(GP)の数は、本質的には以前に記載されたように(Lacroix他,2010)、Q−PCRによって決定した。各ウエルには、1×のPremix Ex Taq(商標)(TaKaRa、仏国)、0.3μΜの標識NSl−TaqMan(商標)プローブ、0.3μΜの各プライマーおよび3μLの鋳型を含有する20μLの反応ミックスを充填した。Q−PCRは、Abi Prism 7900 HT配列検出システムで実施し、結果は前記SDS 2.1ソフトウエア(Applied Biosystems、独国)を用いて処理した。
ELISAは、カプシド(完全または中空、以下では「物理的粒子」またはPPと呼ぶ)検出のために開発された。柔軟性の96ウエルのU底プレート(BD Falcon、ニュージーランド)を4℃で一晩、PBS中の2ng/μLの100μLのモノクローナル抗体BL−H1でコーティングした。この抗体の前記開発(Leuchs他,2010)については下記に記載する。前記コーティング液を除去し、200μLのブロッキング緩衝剤(PBS中の2mg/mLのカゼイン(Sigma、独国)および0.05%のTween 20(Sigma、独国))を各ウエルに加え、前記混合液を37℃で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝剤を吸引し、前記ウエルをPBS、0.05%のTween 20により洗浄し、この後に前記陽性コントロール、前記陰性コントロール、前記サンプルおよびH−1PV標準物質の連続希釈液(それらの全部がPBS緩衝剤中に含まれる)を100μL/ウエルで二回ずつプレーティングした。前記プレートを37℃で1時間インキュベートした。前記反応混合物を吸引し、前記ウエルを洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(0.1μg/mL)で標識した100μLのmAb BL−H1を各ウエルに加え、37℃で1時間インキュベートした。サンプルを吸引し、前記ウエルをPBS、0.05%のTween 20で洗浄した。100μLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Sigma、独国)を各ウエルに加え、前記プレートを室温の暗所で15分間インキュベートした。前記反応は、1ウエル当たり100μLの1MのH2SO4を加えることにより停止させた。サンプル吸光度は、450nmでAscent Multiscanプレートリーダー(Thermov Fisher Scientific、独国)を使用して測定した。
タンパク質濃度は、5〜250μg/mLの動作範囲でPierce(登録商標)BCAタンパク質アッセイキット23227(Pierce、米国)を使用して決定した。前記タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用いて決定し、Nanodrop 2000を用いて測定した。前記ブラッドフォードアッセイは、標準物質としてのBSA(Sigma、独国)を用いて、96ウエルプレート内で50〜2,000μg/mLの動作範囲で実施した。
ウイルス調製物の前記純度を評価するために、10%のSDS−PAGEを実施し(SERVA Electrophoresis、独国)、次に銀染色(Invitrogen、独国)およびウェスタンブロッティングを実施した。ウイルスカプシドタンパク質(VP)の検出のためには、ウサギポリクローナル抗VP(αVP)(C.Dinsart、DKFZ、ハイデルベルクによって提供された)およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG(Amersham(商標)ECLウェスタンブロッティング分析)を使用した。
DNAは、Nanodrop分光光度計を用いて260nmで前記吸光度を測定することにより定量した。前記ウイルス調製物中のヒトゲノムDNAは、前記製造業者の指示にしたがって、h−TERT(ヒトテロメラーゼ逆転写酵素)を検出するために前記Quantifiler(登録商標)ヒトDNA定量キット(Applied Biosystems、独国)を用いるQ−PCRによって定量した。前記検出限界は、26ng/mLであり、前記アンプリコンのサイズは62bpであった。陽性コントロールとして、NB−324K細胞ゲノムDNAを使用した。
エンドトキシンによるコンタミネーションは、Endosafe(登録商標)Gel−Clotカブトガニアメーバ様細胞(Limulus Amebocyte)溶解物アッセイ(Charles River Laboratories、独国)を用いて試験した。前記アッセイの前記感受性は、1mL当たり0.25エンドトキシン単位(EU)であった。各H−1PV調製物は、37℃で5日間にわたり2.5μLの大豆/ペプトン寒天上の前記調製物をインキュベートすることによって細菌性もしくは真菌性コンタミネーションの非存在についてチェックした。
ウイルス調製物の定性的分析のために、電子顕微鏡画像を撮影した。このために、5μLのウイルス懸濁液を使用準備の整ったカーボンコーティングを施した銅グリッドに加え、2分間インキュベートした。次に前記グリッドを5μLの二回蒸留水で洗浄し、2%の酢酸ウラニル液で30秒間コーティングした。前記液滴は、Whatman 50濾紙を使用して前記グリッドから吸着させ、前記グリッドをおよそ1分間乾燥させた。顕微鏡写真は、Zeiss透過型電子顕微鏡を20,100倍の倍率で使用して撮影した。
H−1PVカプシド(PP)に対するモノクローナル抗体を産生するために、Balb/cマウス(Charles River、独国)を三カ月間にわたり三回、各時点に1.2×108PFUを用いる腹腔内注射で免疫した。H−1PVの最終注射の一週間後、マウスの脾臓を切除し、脾臓細胞をX63/Ag8リンパ腫細胞(Kuck他,2007、Wobus他,2000)と融合させた。前記ハイブリドーマ細胞を増殖させ、単一クローン由来の前記上清をH−1PVに対してウェスタンドットブロッティングによってスクリーニングした。単一コロニー分析により陽性ウエルを選択し、三ラウンドの選択後、前記選択したハイブリドーマ細胞を使用してCELLine 1000バイオリアクター(Integra Biosciences AG、スイス国)内でBL−H1抗体を産生した。10%のFBS、100μg/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、20mMのHepes(pH7.2)を補給したRPMI 1640培地を使用して、前記ハイブリドーマ細胞を培養した。前記BL−H1抗体のサブクラスは、前記Amershamマウスモノクローナル抗体イソタイプ分類キット(Braunschweig、独国)を用いて決定した。精製は、前記HiTrap(商標)プロテインA HP親和性カラムキット(GE Healthcare、スウェーデン国)およびAektaプライムシステム(GE Healthcare、独国)を使用して実施した。前記IgG2a濃度は、前記マウスIgG2a ELISAセット(BD Biosciences、独国)を使用して決定した。
精製H−1PV(1×108PFU/ドット)またはスクロース密度勾配分画(100μLのPBS中に1:10で希釈)は、真空ブロッターを用いてニトロセルロース膜(AppliChem、独国)に移した。洗浄工程は、PBS、0.05%のTween 20を用いて実施した。前記膜は、5%の脱脂粉乳を含有するPBSを用いて1時間ブロッキングした。ハイブリドーマスクリーニングのために、40μLの未希釈ハイブリドーマ上清を少なくとも3時間インキュベートした。スクロース勾配分析のために、精製mAb BL−H1(1:1,000)またはαVP抗体(1:500に希釈した)のいずれかを使用した。次に前記膜を室温で30分間洗浄し、PBS中の二次ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体(GE Healthcare、独国)またはヤギ抗ウサギ抗体(GE Healthcare、独国)と一緒にインキュベートした。検出は、ECL PlusおよびHyperfilm ECL(Amersham Biosciences GmbH、独国)を用いて実施した。
抽出物は、感染性H−1PV分子クローン(Kestler他,1999)を用いてトランスフェクトした293T細胞(CRL−11268、American Tissue Culture Collection)から調製し、トランスフェクション72時間後に採取した。1mLの抽出物を10〜50%の線形スクロース勾配に移した。遠心分離は、28,000rpmに設定したTST 41.14(Kontron)ローター内で4℃にて3.3時間実施した。分画(400μL)を収集し、ウェスタンブロッティングおよび赤血球凝集アッセイによって分析した。前記分画を更に感染性およびゲノム含有粒子についてもアッセイした。
H−1PVの特性解析
本発明の目的の一つは、前記H−1PVの製造手法を標準化することであった。これは、標準操作手順を確立するために、上流、および、下流プロセス工程を特徴付けること、再現性を保証すること、並びに、前記最終産物の前記同一性、純度、および、安全性を完全に特徴付けることを包含していた。
H−1PVカプシドを定量するためのELISA
H−1PV産生を通して物理的粒子を定量するために、本発明者らは、mAb BL−H1を使用する「カプシド−ELISA」を開発した。前記ELISAを標準化するために、H−1PVを公知の力価を備えるアデノウイルス5型(Ad5、American Type Culture Collection)のストックの適切な希釈液と混合し、前記混合物を電子顕微鏡法によって可視化した。無作為に選択した8枚の画像上で、H−1PV粒子およびAd5粒子を計数し、公知のAd5力価と関連付けてH−1PV粒子の数を決定した。ELISAは、PPの数(2.5×109〜3.9×107PPの範囲内)と450nmでの吸光度との再現性のある線形関係を示した(図2)。試験した希釈液中の二つであるQC−L(低ビリオンロード)およびQC−M(中ビリオンロード)をこの後のアッセイにおける品質コントロールとして使用した。完全H−1PVカプシドから中空粒子を分離するためにCsCl密度勾配遠心分離を使用した場合、このELISAは、両方の定量を許容した。これは、(本発明者らのカプシド−ELISAおよび赤血球凝集アッセイによって決定した)カプシドの分布、および、遠心分離後のゲノム含有粒子の分布を示している図3に例示されている。物理的粒子を検出するための前記二種の方法は、スーパーインポーズ可能なプロファイルを生じさせ、中空カプシドについての一つの主要ピーク、および、完全カプシドについての二つの小さなピークを生じさせた。DNA含有カプシドのPCR検出も同様に二つの密度群(4〜6分画および7〜10分画)を明らかにした。中間密度粒子は干渉性欠陥粒子からなる可能性があるが(FaustおよびWard,1979)、中間密度粒子の性質はこれ以上分析されなかった。それでも、本発明者らの結果は、前記開発したELISAが物理的粒子の日常的検出のために好適であることを明白に示している。
H−1PVの大規模生産
(A)細胞の播種および感染の最適化
本発明者らは、最初に感染時の細胞密度、MOI、および、採取時を最適化した。前記ウイルス最高収率は、およそ30%のCPEとともに、3.6×104細胞/cm2の細胞密度、1×10−2PFU/細胞のMOIおよび感染4日後の採取で得られた(データは示していない)。これらの条件は、引き続いて全産生実験において使用したが、唯一の相違は、一部の細胞を175cm2のY型フラスコ内で増殖させ、採取し、CSに移して直ちに感染させたが、他の細胞は感染前3日間にわたり前記CS内で増殖するに任せたことであった。
図4に示したように、前記H−1PVビリオンの収率は、5回の独立産生にわたり高度に再現性であった。粒子対感染性比(PP/PFU)およびゲノム含有粒子の比率(PP/GP)もまたこれらの産生間で類似であった。PFU対GP対PPの比率は、1:7×102:5×103であった。したがって、平均して、指標細胞は、産生性感染を受けるためには7×102ゲノム含有ビリオンで感染させなければならないと思われた。全ビリオンの約14%は、カプシド封入ゲノムを含有していた。
H−1PVの精製
(A)H−1PV採取物のDNase消化および清澄化
未処理ウイルス採取物は、非カプシド封入ウイルスおよび宿主細胞DNAを消化するためにDNaseを用いて処理し、次にSartolab(登録商標)P20 Plusフィルターに通す濾過によって清澄化した。個々の5バッチについて得られた結果は、これらの工程の有意性を証明した。前記ヒトDNA定量キットを用いて測定したように、前記宿主細胞DNAの99.8%は、DNase処理によって除去した。それでもA260nm測定によって決定されたように、前記全DNAの37%しか除去されなかった。前記残留DNAは、DNA検出のために使用されるh−TERTアンプリコン(62bp)より小さい保護されたウイルスゲノムおよび/または細胞DNA断片であろう。図8aに例示したように、濾過工程は、宿主細胞およびFBS由来タンパク質の24%を排除した。清澄化後には前記感染性ビリオンの80%超および物理的粒子の100%が回収された(表2b)。結論として、この第1精製工程は高速で、有意な量の外来DNAおよびタンパク質を排除する。
中空H−1PV粒子から完全H−1PV粒子を分離するために、二種の勾配遠心分離手法を比較した。二つの10層式CS培養からの五つの個別H−1PV採取物を用いて類似の結果が得られた。清澄化後、各採取物を二つの同等部分に分割し、一方は、二つの連続ステップ勾配、IOD−PBSおよびVIS−リンゲルによって精製したが、ヒトへ注射するためには後者のリンゲルおよびVisipaque調製物の方が良好に適していた。材料および方法の項で記載したように、二つの分画を収集したが、完全粒子分画(前記40%相の下方バンド)は1.25/mLの近似密度を備え、中空粒子分画(前記40%相の上方バンド)は1.23g/mLの近似密度を備えていた。図5aに示したように、完全粒子分画内の感染性粒子の平均力価は1.3×1010PFU/mLであったが、他方、GPおよびPP濃度は、それぞれ9.2×1012GP/mLおよび1.7×1013PP/mLであった。中空粒子分画における力価は、6.3×109PFU/mL、4.6×1012GP/mLおよび3.9×1013PP/mLであった。
図6aに示したように、IOD−PBS密度勾配遠心分離は、感染性粒子の有意な消失(46%)をもたらした。続くVIS−リンゲル勾配工程での消失は、極めてわずかであった。結合イオジキサノール勾配遠心分離が感染性ウイルス分画から全タンパク質の90%超の排除をもたらしたことは注目に値する。IOD−PBS工程は、比活性における15.4倍の増加をもたらし、VIS−リンゲル工程は、更に5.9倍の増加をもたらした。したがって、この精製プロセスを通して、3×1011PFU/mg(タンパク質)への比活性における全体で91倍の増加が達成された。他方、CsCl密度勾配精製は感染性粒子の消失はわずかに高いだけであったが(57%)、より効率的なタンパク質排除をもたらし、比活性の227倍の増加を生じさせた。結果として生じた粒子対感染性比(PP/PFU)は、両方の精製後に103:1に近かった。
図6bに示したように、中空粒子分画内の物理的粒子の回収率は、IOD−PBSおよびVIS−リンゲル密度勾配遠心分離後(7%)よりもCsCl密度勾配精製後の方が高かった(清澄化ウイルス採取物からの全PPの78%)。更に、VIS−リンゲル中空粒子分画は、CsCl中空粒子分画(GP対PP比:1:102;PFU対PP比:1:105)に比較して相当に高い比率のGP(GP対PP比:1:10)およびPFU(PFU対PP比:1:104)を含有していた。これにより、本発明者らは、中空カプシドを精製するためにはCsCl密度勾配遠心分離を推奨する。CsCl中空粒子分画のカプシド濃度は、約1.4×1014PP/mg(タンパク質)であった。
上記のIOD−PBS/VIS−リンゲルおよびCsCl精製法によって得たウイルスバッチ内の感染性粒子の力価は、約1×1010PFU/mLであった。一部の用途についてはより高い力価が必要とされるので、本発明者らは、前記VIS−リンゲル工程勾配を連続勾配と置換することを試みた。これにより本発明者らは、3×1011PFU/mLの力価を達成することができた(図7)。
不活化中空粒子
CsCl分画化後に得られた中空粒子分画内では、依然として感染性ウイルスを検出することができた(PFU対PP比:1:105)。非感染性コントロールとして中空粒子の使用を許容するためには、カプシド構造を変化させることなくウイルス感染性を排除する不活化法を開発することが不可欠であった。これは、UV照射によって達成された(表3)。UV照射はPP力価を変化させなかったが、測定したGP力価を90%減少させた。これはおそらく、Q−PCRによるそれらの滴定を用いてウイルスゲノム内で誘導されたDNA損傷の干渉に起因すると思われる。重要なことに、UV照射はウイルス感染性を7対数超減少させ、残留感染性は7×1011PP当たり1PFUと低かった。これは、H−1PVの腫瘍崩壊作用の前臨床試験における非感染性コントロールとしてUV照射した中空粒子の精製調製物を使用することを可能にした(Kiprianova他,2011)。
前記H−1PV調製物の純度
前記H−1PV調製物をタンパク質およびDNAコンタミネーション、エンドトキシンの存在、並びに、無菌性について分析した。精製プロセスにおける様々な工程および勾配分画からのタンパク質をSDS−PAGEによって分析し、銀染色により明らかにした。図8aに例示したように、予想ウイルスポリペプチドであるVP1、VP2およびVP3が検出された。密度勾配分画化後に残留している不純物の量は、低値から検出不能までであった。二種の精製法は同様に効果的であった。CsCl精製中空粒子には、中空カプシドがVP2からVP3切断を受けることができない(Paradiso他,1984、Tattersall他,1976)という事実に一致して、VP3が欠如したことは注目に値する。UV照射後には、有意なカプシドタンパク質分解は観察されなかった。ウェスタンブロット分析は、VPポリペプチドバンドの同一性を確証した(図8b)。電子顕微鏡法によって、非UV照射カプシドとUV照射カプシドとの超微細構造的差は全く観察されなかった(図8c、d)。どの前記精製法を使用しても全カプシドの精製バッチは2.5EU/mL未満しか含有していなかったが、他方、中空不活化粒子バッチは、5EU/kg(体重)の米国食品医薬品局の制限下での動物モデルにおけるH−1PV調製物の使用と適合して、25EU/mL未満を含有していた(MalyalaおよびSingh,2008)。全調製物は無菌であることが実証された。
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Claims (12)
- 中空不活性または完全活性パルボウイルス粒子を産生するための方法であって、
(a)プロデューサー細胞系NB−324Kを提供する工程、
(b)好適な条件下で前記細胞系を増殖させる工程、および、0.5〜2×10−2PFU/細胞のMOIでパルボウイルスを用いて2.0〜5.0×104細胞/cm2の細胞密度で前記細胞を感染させる工程、
(c)前記細胞を感染2〜6日後に採取して遠心分離によって細胞ペレットを得る工程、
(d)細胞溶解物を含有するパルボウイルスを得るために、再懸濁した前記細胞ペレットを機械的、物理的、または、化学的細胞溶解方法に供する工程、
(e)前記細胞溶解物を超音波処理し、それをDNAse処理に供する工程、
(f)濾過によって前記DNAse処理したパルボウイルス採取物を清澄化する工程、および、
(g1)2回の連続密度勾配超遠心分離によって前記パルボウイルスを精製する工程であって、第1勾配はイオジキサノール/PBSステップ勾配であり、第2勾配はイオジキサノール/リンゲルステップ勾配またはイオジキサノール/リンゲル連続勾配であり、一つの分画内で全活性パルボウイルス粒子および別の分画内で中空パルボウイルス粒子を得るための工程、または、
(g2)中空パルボウイルス粒子を得るために連続CsCl勾配超遠心分離によって前記パルボウイルスを精製する工程、を含む方法。 - 前記工程(b)の前記細胞密度は、3.0〜4.0×104細胞/cm2である請求項1に記載の方法。
- 前記工程(f)のためにプレフィルターを備える0.2μmフィルターが使用される請求項1または2に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞系NB−324Kは、
(a)少なくとも95%の生存率、
(b)20未満の継代数、および/または、
(c)マイコプラズマコンタミネーションの欠如、によって特徴付けされる請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - ウイルス産生は、収集システム内で実施される請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記収集システムは、10層式細胞培養チャンバーである請求項5に記載の方法。
- 前記パルボウイルスは、H−1PVである請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 天然パルボウイルスカプシド対非集合カプシドタンパク質または変性カプシドの比率を決定する工程を更に含む請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記比率は、モノクローナル抗体を使用して決定される請求項8に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体は、抗体BL−H1(DSM ACC 3030)である請求項9に記載の方法。
- 中空非活性化粒子を提供するために、工程(g2)で得られた中空粒子が、残留するまだ活性の粒子を非活性化するための非活性化工程に供せられる請求項1に記載の方法。
- 前記非活性化工程は、UV不活化である請求項11に記載の方法。
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