CN116396983A - 一种检测aav抗体滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测AAV抗体滴度的方法,属于生物医学技术领域,包括:S1制备不同MOI值的无血清孵育的AAV载体;制备含不同体积的待测血清样本与已知MOI值AAV载体共孵育的混合液;S2:将含有CRISPR‑Cas9基因编辑系统的质粒加入电转液中,进行已知数量细胞的电转过程,分别加入步骤S1中的无血清孵育的AAV载体和混合液至电转后的细胞中,分别检测电转后报告基因的表达效率;S3:根据检测结果计算待测血清样本中AAV抗体滴度。本发明主要优势是可以将AAV抗体滴度以数字化、定量的方式展示,便于理解与交流,并且使用不同细胞系、不同AAV转导剂量都得到稳定可靠的结果。这种方法易于标准化和验证,比传统的方法省时、省力、节约检测费用,且直接反应抗体中和活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,尤其涉及一种检测AAV抗体滴度的方法。
背景技术
AAV是广泛应用的基因治疗载体,目前未发现AAV病毒引起的相关疾病,因此具有安全性、同时具有不同组织靶向性和高效转导效率,成为目前应用最广泛的基因治疗载体。在很大程度上由于病毒载体技术的发展,对基因治疗领域的兴趣和投资重新兴起,最终在2017年美国食品和药物管理局批准了第一个针对单一突变疾病的基因治疗产品。在2000年代,源自非病原性和非包膜复制缺陷型细小病毒的腺相关病毒(AAV)载体已成为一种安全有效的基因递送工具,引发了第二波临床浪潮。在多种疾病的基因疗法中,如眼、神经、心脏、肝、肺、肌肉、血液等,AAV载体是最优选的基因治疗载体。
AAV载体基因治疗临床应用面临的困境之一:体内预先存在的AAV抗体会降低甚至抵消AAV载体的治疗效果,大大限制了AAV基因治疗的应用。研究显示,在出生后2年,部分人就产生了针对AAV病毒衣壳的抗体;在健康人群中,有60%的受试者出现了针对AAV2病毒的抗体。50%~90%的人群暴露于AAV感染,其中约50%的病例导致针对AAV衣壳的中和抗体(NAbs)的发生。
AAV载体基因治疗临床应用面临的困境之二:AAV血清型中存在高度的衣壳氨基酸序列同源性。NAbs对各种AAV血清型的交叉反应性是AAV载体应用的另一局限。据报道,血液中低至1:5的NAb滴度可以完全阻止体内AAV转导。因此,针对特定AAV血清型的NAbs存在进行预筛选是动物实验和临床试验中的关键程序。
目前AAV抗体筛查的主要方法如下:
1:ELISA为基础的总抗体检测法(total anti-capsid antibody,TAb):方法简单易行,可以相对灵敏的检测与AAV结合的抗体含量,但是不能反应抗体的中和活性,而且检测方法本身耗时且成本高,检测结果也是半定量的方式。
2:细胞介导的体外转导抑制实验(transduction inhibition,TI assay):用于筛查和检测中和性AAV抗体含量。这种方法最常用的报告系统是荧光素酶系统:待测样本进行梯度稀释,与AAV病毒孵育,孵育完成后,感染不同的细胞系,检测荧光素酶发光值RUL,推算AAV抗体滴度。这种方法的主要局限是:虽然相对容易设置,但大多数AAV血清型在体外转导细胞方面效率非常低下,因此在测定中使用高多重感染(MOIs),导致抗体检测的灵敏度较低。此外,与细胞培养条件相关的几个参数可能有助于测定的可变性,例如使用的细胞系,细胞密度和报告载体制备;荧光酶发光信号的检测是一种半定量的方式,无法精确检测AAV抗体量。抗体滴度展示方式缺乏可解释性,难以交流,不容易理解,无法确定抗体究竟能中和多少AAV载体。另外,荧光酶系统需要加入反应底物,产生荧光进行监测,最佳监测窗口只有几分钟,因此在实际操作过程中,难以把握,导致误差很大。荧光酶系统需要荧光检测仪进行监测,仪器检测费用高且普通实验室不具备,实施性差。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种检测AAV抗体滴度的方法,该方法能够精确检测AAV抗体滴度。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种检测AAV抗体滴度的方法,包括如下步骤:
S1:制备不同MOI值的无血清孵育的AAV载体;制备含不同体积的待测血清样本与已知MOI值AAV载体共孵育的混合液;
S2:将含有CRISPR-Cas9基因编辑系统的质粒加入电转液中,进行已知数量细胞的电转过程,分别加入步骤S1中的无血清孵育的AAV载体和混合液至电转后的细胞中,所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包括Sp/SaCas9-sgRNA,所述AAV载体包括报告基因;
S3:根据检测结果计算待测血清样本中AAV抗体滴度。
优选的,所述不同MOI值包括0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105和8×105;所述已知MOI值为0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105、8×105中的任意一种。
优选的,所述不同体积包括0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8μL中的多种。
优选的,所述AAV载体的切割位点包括EEF1A1位点、EEF2位点、CD326a或AAVS1。
优选的,所述AAV载体包含切割位点两侧同源臂序列。
优选的,所述报告基因包括绿色荧光表达蛋白GFP、mNenoGreen、Crimson、tdTomato或Luciferase。
优选的,所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
优选的,所述细胞包括K562、Hela、293T、HT1080或iPSC。
优选的,所述两侧同源臂序列的长度包括50、100、150、300、600、1000、1500或2000bp。
所述计算待测血清样本中AAV抗体滴度步骤如下:
S3-1、根据无血清孵育的AAV载体不同MOI值和已知数量细胞计算AAV病毒粒子数,AAV病毒粒子数=MOI×细胞数;
S3-2、根据无血清孵育的AAV载体检测到的报告基因的表达效率,制作多项式曲线,其中以AAV病毒粒子数为横坐标,报告基因的表达效率为纵坐标,得到曲线公式;
S3-3、根据混合液检测报告基因的表达效率,利用S3-2得到的曲线公式,计算所需AAV病毒粒子数;
S3-4、被抗体中和的AAV粒子数=孵育前所加AAV病毒粒子数-S3-3得出的所需AAV病毒粒子数;
S3-5、以被抗体中和的AAV粒子数为纵坐标,以加入待测血清样本的体积为横坐标,制作多项式曲线公式;
S3-6、根据中和50%AAV载体所需样本体积数作为AAV抗体滴度,AAV抗体滴度vg/mL=中和50%AAV载体数vg/样本体积数mL。
相对于现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种检测AAV抗体滴度的方法,利用CRISPR-Cas9-AAV基因编辑体系为体外AAV抗体筛查提供了一种颠覆性的技术革新,其基于未被AAV抗体抑制的AAV载体作为供体插入到电转后细胞的敲入(KI)效率,并且AAV抗体滴度与靶细胞中插入的AAV基因组效率呈负相关。本发明颠覆传统的基于细胞的体外转导抑制测定法,其主要优势是可以将AAV抗体滴度以数字化、定量的方式展示,便于理解与交流,并且使用不同细胞系、不同AAV转导剂量都得到稳定可靠的结果。这种方法易于标准化和验证,比传统的方法省时、省力、节约检测费用,且直接反应抗体中和活性。
附图说明
图1:EEF1A1位点基因编辑示意图和流式细胞检测结果,A.AAV8-Donor在EEF1A1位点通过同源重组整合外源性E2A-mNeonGreen序列;B.在基因编辑后1、2、3天,流式检测不同MOI值阳性细胞比例,横坐标是FITC通道检测绿色荧光蛋白信号比例,纵坐标是无关信号通道APC;
图2:EEF2位点基因编辑示意图和结果,A.AAV8-Donor在EEF2位点通过同源重组整合外源性E2A-mNeonGreen序列;B.在基因编辑后1、2、3天,流式检测不同MOI值阳性细胞比例,横坐标是FITC通道,纵坐标是无关信号通道APC;C.2天和3天收取的流式检测数据,建立AAV8-Donor量和荧光信号的模拟曲线;
图3:含有AAV8抗体的血清用量与中和AAV8模板载体曲线关系的建立,A.电转后2天,两组不同AAV8 MOI值,流式检测结果;B.根据加入含有AAV8抗体的血清量和中和AAV8模板载体量之间的关系曲线,图中显示中和一半AAV8模板载体所需要的血清量;
图4:含有AAV8抗体的血清用量与中和AAV8模板载体量曲线关系,A.电转后3天,两组不同AAV8 MOI值,流式检测结果;B.根据加入含有AAV8抗体的血清量和中和AAV8模板载体量之间的关系曲线,图中显示中和一半AAV8模板载体所需要的血清量;
图5为不同AAV8模板MOI值的检测结果对比图;
图6为本发明检测AAV抗体滴度方法的流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测AAV抗体滴度的方法,包括如下步骤:
S1:制备不同MOI值的无血清孵育的AAV载体;制备含不同体积的待测血清样本与已知MOI值AAV载体共孵育的混合液;
S2:将含有CRISPR-Cas9基因编辑系统的质粒加入电转液中,进行已知数量细胞的电转过程,分别加入步骤S1中的无血清孵育的AAV载体和混合液至电转后的细胞中,分别检测电转后报告基因的表达效率;所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包括Sp/SaCas9-sgRNA,所述AAV载体包括报告基因;
S3:根据检测结果计算待测血清样本中AAV抗体滴度。
在本发明中,制备不同MOI值的无血清孵育的AAV载体;制备含不同体积的待测血清样本与已知MOI值AAV载体共孵育的混合液。所述不同MOI值优选的包括0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105和8×105;所述已知MOI值优选为0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105、8×105中的任意一种。所述不同体积优选的包括0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8μL中的多种。所述待测血清样本的预处理方式为在置于56℃下30min~1h。所述共孵育的条件为35~40℃共孵育1~2h,进一步优选为37℃共孵育1.5h。本发明中的样本还可以是哺乳动物、人血浆、滑液或脑脊液。
本发明的AAV载体可以为各种血清型,比如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12等。本发明所述的AAV载体包括单链、双链等多种形式。所述AAV载体包括切割位点序列、切割位点两侧同源臂序列以及报告基因序列,所述切割位点为易编辑基因位点,优选的包括EEF1A1位点、EEF2位点、CD326a或AAVS1。所述两侧同源臂序列的长度优选包括50、100、150、300、600、1000、1500或2000bp,进一步优选为600bp。所述报告基因优选的包括绿色荧光表达蛋白GFP、mNenoGreen、Crimson、tdTomato或荧光素酶(Luciferase),进一步优选为mNenoGreen。
本发明所述方法检测其他血清型的抗体滴度时,比如AAV6,计算方法和上述相同,但MOI可能需要调整,是AAV-HDR模板的加量和编辑效率之间存在近似线性相关的范围。建议的编辑效率为最高HDR效率的10~80%,如果太高,可能偏离拟合曲线的范围;如果太低,会使检测精度降低。
在本发明中,将含有CRISPR-Cas9基因编辑系统的质粒加入电转液中,进行已知数量细胞的电转过程,分别加入步骤S1中的无血清孵育的AAV载体和混合液至电转后的细胞中,分别检测电转后报告基因的表达效率;所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包括Sp/SaCas9-sgRNA,所述AAV载体包括报告基因。所述细胞优选的包括K562、Hela、293T、HT1080或iPSC,进一步优选为稳定表达spCas9的细胞,如K562-spCas9或HeLa-spCas9稳定表达细胞系。所述已知浓度细胞优选为0.04、0.05或0.06M,进一步优选为0.05M。本发明的CRISPR-Cas9基因编辑系统可以是表达sgRNA、Cas9质粒提供基因编辑元件,还可以是稳定表达Cas9的细胞系,电转时只提供表达sgRNA质粒。所述CRISPR-Cas9基因编辑系统中的Cas9可以为SpCas9,也可以为SaCas9。所述sgRNA的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
在本发明中,根据检测结果计算待测血清样本中AAV抗体滴度。
所述计算待测血清样本中AAV抗体滴度步骤如下:
S3-1、根据无血清孵育的AAV载体不同MOI值和已知数量细胞计算AAV病毒粒子数,AAV病毒粒子数=MOI×细胞数;
S3-2、根据无血清孵育的AAV载体检测到的报告基因的表达效率,制作多项式曲线,其中以AAV病毒粒子数为横坐标,报告基因的表达效率为纵坐标,得到曲线公式;
S3-3、根据混合液检测报告基因的表达效率,利用S3-2得到的曲线公式,计算所需AAV病毒粒子数;
S3-4、被抗体中和的AAV粒子数=孵育前所加AAV病毒粒子数-S3-3得出的所需AAV病毒粒子数;
S3-5、以被抗体中和的AAV粒子数为纵坐标,以加入待测血清样本的体积为横坐标,制作多项式曲线公式;
S3-6、根据中和50%AAV载体所需样本体积数作为AAV抗体滴度,AAV抗体滴度vg/mL=中和50%AAV载体数vg/样本体积数mL。
在本发明中,本发明通过上述方法中,S3-2得到的曲线公式例如y=-0.0221x2+1.7889x+1.2105,R2=0.9936。S3-5得到的多项式曲线公式例如y=-2.361x2+15.822x-16.755,R2=0.9925。
本发明致力于AAV抗体量检测方法的不断探索和优化,以数字化方式精确定量AAV抗体滴度。本发明所述方法的检测原理是(1):通过基因编辑技术,在K652-SpCas9细胞系的EEF1A1、EEF2定点整合绿色荧光蛋白mNeonGreen序列,利用流式细胞仪器定量检测荧光蛋白信号的比例,选择高效编辑位点EEF2进行后续实验。Cas9-sgRNA切割基因组EEF1A1或EEF2位点后,同源介导修复(HDR)的编辑比例与进入细胞核的AAV拷贝数呈正相关。HDR的效率可以在加入AAV后1~4天用流式细胞仪(FACS)进行精确检测,准确率达到99%以上。编辑2~3天后,编辑效率趋于稳定,因此检测窗口很大。(2)标准曲线的制作方法:AAV8-Donor病毒粒子数和表达荧光蛋白的细胞的百分比(FACS分析)之间的多项式关系曲线。一般使用二项式进行关联,R2>0.99。(3)在检测血清样本中的AAV抗体滴度时,把待测血清进行2~100×稀释,根据标准曲线推算中和后的AAV8模板载体量,从而计算出血清中能够中和掉AAV的抗体滴度。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测AAV抗体滴度的方法,包括如下步骤:
1.1构建CRISPR-cas9基因编辑质粒和AAV报告基因表达质粒载体
首先利用KAPA HiFi PCR扩增试剂盒,以实验室现有相应质粒为模板,PCR获得相关DNA片段,或者直接在IDT公司合成gBlocks;质粒骨架通过酶切和PCR获得。然后使用NEBuilder HiFi DNA Assembly kit试剂盒将各个片段进行组装。所有载体序列都利用核酸内切酶和桑格测序进行验证。
其中,CRISPR-Cas9基因编辑质粒中以EEF2位点设计Sg序列为GTTCCTGGACAAATTGTAGG(SEQ ID NO.1)。
1.2AAV8模板载体包装
利用AAV三质粒包装系统包括:1)目的质粒载体;2)反式质粒pAAV2/8,包含rep和cap基因;3)腺病毒辅助质粒pHelper(Cell Biolabs)。转染时各质粒之间用量的比例为1:1:2。使用PEI“Max”转染293T细胞生产AAV,293T细胞汇合度约为80~90%时进行病毒包装。切向流过滤系统(Tangential flow filtration,TFF)浓缩病毒,碘克沙醇密度梯度离心,进行AAV载体的纯化。最后利用qPCR或ddPCR测定AAV滴度。
1.3血清样本收集
血友病A小鼠,尾静脉注射AAV8载体,注射剂量2E+12vg/kg。注射后2~3月,通过眼球取血,室温放置半小时,2500rpm,离心20min。将上清吸至无菌EP管,分装冻存-80℃。在使用前取出,冰盒融化后,56℃加热30min~1h。
1.4利用不含血清FBS的相应细胞培养基制备不同MOI值(0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105和8×105)AAV载体,即为无血清孵育的AAV载体;
制备含不同体积(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μL)的待测血清样本与MOI值为2.0×105的AAV载体37℃共孵育2h的混合液;
1.5准备K562-SpCas9细胞电转:使用Lonza NucleofectorTM Kit V电转液,1M细胞/70μL电转液,0.5μg S897 pU6-sgEEF2-Stop13(v2)gTTCCTGGACAAATTGTAGG。处于对数期的细胞,计数,取1M,400g 5min离心,洗涤一次。进行电转,取混合好的电转液重悬细胞(注意操作轻柔),转移至电转杯中。将电转杯放置到Lonza 2b电转仪正确位置,选择T-016程序,电转;电转后,将电转杯放置在37℃培养箱中5min,取出电转杯,加入培养基(K562-SpCas9细胞培养基:RPMI 1640+10%FBS,4℃冷藏,有效期一个月),将电转后的0.05M细胞对应预先加入相应上述无血清孵育的AAV载体或AAV与待测血清样本孵育混合悬液的48孔板中,放入培养箱,37℃,CO25%培养过夜,第二天更换新鲜培养基。电转后1~3天,流式检测mNeonGreen%。
1.6流式检测
电转后1天、2天、3天,收集细胞,进行流式检测mNeonGreen阳性细胞的比例,检测HDR插入效率。取至少1×105个细胞,使用BD FACSAria III流式细胞仪通过FITC通道检测阳性细胞比例,选择APC通道作为无关通道。
1.7根据检测结果计算待测血清样本中AAV抗体滴度
1)根据无血清孵育的AAV载体不同MOI值和0.05M细胞计算AAV病毒粒子数,AAV病毒粒子数=MOI×细胞数;
2)根据无血清孵育的AAV载体检测到的报告基因的表达效率,制作多项式曲线,其中以AAV病毒粒子数为横坐标,报告基因的表达效率为纵坐标,得到曲线公式;
3)根据混合液检测报告基因的表达效率,利用2)得到的曲线公式,计算所需AAV病毒粒子数;
4)被抗体中和的AAV粒子数=孵育前所加AAV病毒粒子数-3)得出的所需AAV病毒粒子数;
5)以被抗体中和的AAV粒子数为纵坐标,以加入待测血清样本的体积为横坐标,制作多项式曲线公式;
6)根据中和50%AAV载体所需样本体积数作为AAV抗体滴度,AAV抗体滴度vg/mL=中和50%AAV载体数vg/样本体积数mL。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于,实施例2的1.4步骤中是制备含不同体积(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μL)的待测血清样本与MOI值为4.0×105的AAV载体37℃共孵育2h的混合液,其余步骤与实施例1相同。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于,实施例3的CRISPR-Cas9基因编辑质粒中以EEF1A1位点设计Sg序列为GTAGTCATCCTTACCCAA(SEQ ID NO.2),靶向7号外显子,其余步骤与实施例1相同。
图1为EEF1A1位点基因编辑示意图和流式细胞检测结果,图2为EEF2位点基因编辑示意图和流式细胞检测结果。
由图1和图2可知,在EEF1A1位点,荧光信号的比例结果:总体比例较低,在电转后3天,最高剂量组AAV8-Donor MOI=8×105,绿色荧光信号的百分比例只达到18%。在EEF2位点,编辑效率比较高,在电转后1天,AAV8-Donor MOI=8×105,绿色荧光信号的百分高达22%;电转后2天、3天,GFP信号比较稳定,AAV8-Donor MOI=8×105,绿色荧光信号的百分高达45%,因此选择高效编辑位点EEF2进行后续研究,提高实验方法的可靠性。
由图3和图4的结果表明,使用低AAV8-Donor MOI值为2×105时,电转后2天检测到4.2×1012vg/mL,电转后3天检测到4.5×1012vg/mL;使用高AAV8-Donor MOI值为4×105时,电转后2天检测到5.6×1012vg/mL,电转后3天检测到5.8×1012vg/mL。根据实施例1或2电转后2天和3天的数据,计算得到的AAV8抗体量非常接近分别为4.2×1012vg/mL vs 4.5×1012vg/mL、5.6×1012vg/mL vs 5.8×1012vg/mL;使用不同MOI值,低剂量和高剂量直接比较,统计分析,计算结果只有1.4倍的差异,因此,本发明所述的方法检测AAV抗体滴度更加精确、稳定可靠。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测AAV抗体滴度的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:制备不同MOI值的无血清孵育的AAV载体;制备含不同体积的待测血清样本与已知MOI值AAV载体共孵育的混合液;
S2:将含有CRISPR-Cas9基因编辑系统的质粒加入电转液中,进行已知数量细胞的电转过程,分别加入步骤S1中的无血清孵育的AAV载体和混合液至电转后的细胞中,分别检测电转后报告基因的表达效率;所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包括Sp/SaCas9-sgRNA,所述AAV载体包括报告基因;
S3:根据检测结果计算待测血清样本中AAV抗体滴度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述不同MOI值包括0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105和8×105;所述已知MOI值为0.25×105、0.5×105、1.0×105、2.0×105、4.0×105、8×105中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述不同体积包括0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8μL中的多种。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述AAV载体的切割位点包括EEF1A1位点、EEF2位点、CD326a或AAVS1。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述AAV载体包含切割位点两侧同源臂序列。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述报告基因包括绿色荧光表达蛋白GFP、mNenoGreen、Crimson、tdTomato或Luciferase。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞包括K562、Hela、293T、HT1080或iPSC。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述两侧同源臂序列的长度包括50、100、150、300、600、1000、1500或2000bp。
10.根据权利要求1~9任意一项所述的方法,其特征在于,所述计算待测血清样本中AAV抗体滴度步骤如下:
S3-1、根据无血清孵育的AAV载体不同MOI值和已知数量细胞计算AAV病毒粒子数,AAV病毒粒子数=MOI×细胞数;
S3-2、根据无血清孵育的AAV载体检测到的报告基因的表达效率,制作多项式曲线,其中以AAV病毒粒子数为横坐标,报告基因的表达效率为纵坐标,得到曲线公式;
S3-3、根据混合液检测报告基因的表达效率,利用S3-2得到的曲线公式,计算所需AAV病毒粒子数;
S3-4、被抗体中和的AAV粒子数=孵育前所加AAV病毒粒子数-S3-3得出的所需AAV病毒粒子数;
S3-5、以被抗体中和的AAV粒子数为纵坐标,以加入待测血清样本的体积为横坐标,制作多项式曲线公式;
S3-6、根据中和50%AAV载体所需样本体积数作为AAV抗体滴度,AAV抗体滴度vg/mL=中和50%AAV载体数vg/样本体积数mL。
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