CN117801076B - 腺相关病毒突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,公开了一种腺相关病毒突变体及其应用。本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体插入有异源肽;异源肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。本发明的重组腺相关病毒包括所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体。本发明将所述腺相关病毒衣壳蛋白突变体、所述重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织中的药物或制剂、在制备用于预防和/或治疗肝脏类疾病的药物递送工具中应用。本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体具有特异性的肝脏靶向性,为临床治疗提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。
Description
本发明专利申请是基于2023年06月09日提交的发明名称为“一种腺相关病毒突变体及其应用”的中国专利申请号202310681981.X的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种具有肝脏靶向性的腺相关病毒突变体及其应用。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一类包裹着线性单链DNA基因组的无包膜小病毒,属于微小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependovirus),需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV基因组为单链DNA片段,包含于非包膜病毒衣壳中,可分成三个功能区域:两个开放阅读框(Rep基因、Cap基因)和末端反向重复序列(ITR)。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点,作为基因转移载体在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中,rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验),如基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
遗传疾病血友病是由于缺乏关键的凝血因子导致的疾病,患者出血后需要极长的时间来凝血,一些轻微的受伤,就可能带来足以威胁生命的影响。病情严重的患者的关节和肌肉还会经常自发出血。由于血友病是十分典型的单基因突变引起的罕见病,所以基因疗法对其治疗效果较为明显。已批准的B型血友病一次性基因疗法Hemgenix为一种基于腺相关病毒5(AAV5)的基因疗法,用于治疗目前正在使用凝血因子IX预防性治疗、目前或先前有发生危及生命的出血、或反复出现严重自发性出血发作的B型血友病(先天性因子IX缺乏症)成人患者。Hemgenix由携带凝血因子IX基因的AAV5病毒载体组成。该载体将因子IX的Padua基因变体(FIX Padua)携带到肝脏的靶细胞中,Hemgenix在提高B型血友病患者的平均因子IX活性和止血保护方面是独特的:一次性输注后数年,通过使机体持续产生因子IX,提高和维持血液中因子IX水平,减少每年出血发生率,减少或消除预防性治疗的需求。然而,Hemgenix仍存在一定的问题,例如其需要较高的剂量,其推荐剂量为每千克(kg)体重2×1013个基因组拷贝(gc),治疗价格高昂;Hemgenix常见的副作用较大,例如肝酶升高等肝毒性的风险;预存抗体与AAV相互作用影响治疗效果。此外,AAV的免疫原性是限制治疗效果并引起副作用的重要原因之一,较高的剂量需求又进一步加剧免疫原性等问题,除了影响疗效,还会导致载体诱导的肝细胞损伤等问题。
虽然AAV是目前应用广泛且最安全的基因治疗载体之一,但在肝脏内的长期表达、更低剂量、更低免疫原性等方面仍需进一步改进。因此,开发出具有更好治疗效果、降低治疗剂量、减少副作用和使用成本的血清型类型的AAV载体,以筛选新的肝脏靶向AAV血清型成为了一个必要的且具有重要临床价值的研究方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种腺相关病毒突变体及其应用。该腺相关病毒突变体具有特异的肝脏靶向性,具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白突变体,所述腺相关病毒衣壳蛋白突变体插入有异源肽;所述异源肽的氨基酸序列为如SEQ ID No.1~4中任一所示的序列。
本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体对肝脏的靶向能力有大幅提升,达到了野生型腺相关病毒的16倍以上;且缺乏对大脑的嗜性,具有相对的特异性,可避免感染脑部引起不必要副作用。
作为本发明所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体的优选实施方式,所述异源肽的插入位点位于腺相关病毒衣壳蛋白氨基酸588和589之间。
作为本发明所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体的优选实施方式,其氨基酸序列为如SEQ ID No.9~12中任一所示的序列。
第二方面,本发明提供了一种编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸,其核苷酸序列包含如SEQ ID No.5~8所示的异源肽核苷酸序列。
作为本发明所述的编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸的优选实施方式,其核苷酸序列为如SEQ ID No.13~SEQ ID No.16中任一所示的序列。
第三方面,本发明提供了一种重组腺相关病毒,包括所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体。
本发明的重组腺相关病毒载体对肝脏具有特异的靶向性,对大脑的靶向性明显降低,是特异性良好的血清型突变体,将为临床使用,为广大疾病患者提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。而且还具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。
作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式,还包括异源目的基因。
作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式,所述异源目的基因编码干扰RNA、适配体、内切核酸酶、指导RNA中任一种基因产物。
第四方面,本发明将所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织中的药物或制剂中应用。
第五方面,本发明将所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于预防和/或治疗肝脏类疾病的药物递送工具中应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明基于临床应用广泛的AAV9的基础上进行血清型筛选进化,开发一种剂量需求和费用更低的新型AAV基因治疗产品,本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体对肝脏的靶向能力有大幅提升,达到了野生型腺相关病毒的16倍以上;且缺乏对大脑的嗜性,具有相对的特异性,可避免感染脑部引起不必要副作用。本发明的重组腺相关病毒载体是特异性良好的血清型突变体,将为临床使用,为广大疾病患者提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。而且还具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。本发明可满足更多不同患者的需求,推动基于AAV的基因治疗方法朝向规模化、社会化应用,对于提升基因治疗的效益,服务于广大患者具有重要意义。
附图说明
图1为不同血清型对C57小鼠肝脏靶向性分析(3周);图中,A为肝脏的mRNA相对表达水平,B为肝脏的蛋白相对表达水平分析;
图2为不同血清型对C57小鼠大脑靶向性分析(3周);图中,A为大脑的mRNA相对表达水平,B为大脑的蛋白相对表达水平分析;
图3为不同血清型对C57小鼠肌肉(肱四头肌)靶向性分析(3周);图中,A为肌肉的mRNA相对表达水平,B为肌肉的蛋白相对表达水平分析。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:新型突变体的筛选
(1)AAV9衣壳蛋白突变体库骨架质粒的构建
骨架载体包含AAV5 p41启动子片段,AAV2 rep剪接信号序列,以及突变移码的AAV9的CAP序列(其中AAV9的CAP序列将原氨基酸位点449的K突变为R,核酸序列由tcaaag突变为tctaga,引入Xba I酶切位点;将原氨基酸位点594的氨基酸G的核酸序列由ggc突变为ggt,引入BshT I酶切位点;同时在原氨基酸位点588与位点589位之间插入一段包含终止密码的34bp序列,以造成序列的移码,避免骨架载体酶切不干净造成的污染),并在CAP序列之后加入SV40 polyA序列。将上述序列通过基因合成法合成,并插入到rAAV载体的ITR序列之间,形成AAV9衣壳蛋白突变体库骨架质粒。
(2)突变Rep-CAP载体的构建
通过在AAV9中CAP序列的VP1、VP2、VP3蛋白的N端引入终止密码子的方式,使Rep-CAP载体正常表达Rep蛋白、AAP蛋白,而不能表达CAP的VP1、VP2、VP3蛋白,从而避免亲本AAV9中CAP序列的污染。将上述序列通过基因合成的方式合成,并插入替换AAV9 Rep-CAP载体的CAP序列。
(3)随机7肽载体库的构建
采用oligo6设计2条引物(5’→3’),如下:
引物1:ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC;
引物2:
GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNN MNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG。
其中一条所设计的引物含有随机7肽的21bp核酸序列,并以AAV9衣壳蛋白突变体库骨架载体为模板,进行PCR扩增获得包含随机序列的片段。将片段进行凝胶电泳和胶回收目的大小片段,得到纯化的随机7肽库的核酸片段。将该片段通过Gibson同源重组连接的方式连接入AAV9衣壳蛋白突变体库骨架载体(经过XbaI与BshT I双酶切和胶回收纯化)。连接后的载体通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化后,用Plasmid-Safe DNase酶消化,以去除没有连接上的片段。最后再通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化后,即为构建好的AAV9随机7肽载体库,即AAV9突变体质粒库。
(4)AAV9病毒突变体库的构建
将突变的Rep-Cap质粒、AAV9突变体质粒库、pHelper质粒共转于HEK-293T细胞中,采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化腺相关病毒,测量病毒滴度在1×1012GC/mL~1×1013GC/mL为合适滴度,得AAV9病毒突变体库,放置-80℃备用。
(5)筛选AAV9突变体
将上述构建的随机7肽病毒突变体库按1×1011GC的剂量,通过尾静脉注射的方式注入C57小鼠体内,在SPF级环境中饲养1周后,解剖小鼠进行肝脏取材,取材后的组织置于-80℃中保存。
通过组织DNA提取试剂盒提取随机7肽病毒突变体库中的AAV基因组,并设计相应引物(F(5’→3’):ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC;R(5’→3’):GGAAGTATTCCTTGGTTTTGAACCCA)进行PCR扩增,扩增后的PCR产物进行凝胶电泳确认条带大小,并将目的条带片段切下来,使用胶回收试剂盒进行产物的回收。将回收后的PCR产物片段与酶切骨架(Xba I与BshT I双酶切并胶回收骨架片段)进行重组连接,连接后的产物转化Stbl3感受态细胞,并涂Amp抗性平板,培养过夜,次日挑单克隆菌落进行测序。同时将扩增后的PCR片段产物用于下一轮随机库的构建,并重复动物体内筛选的过程。经过2~3轮筛选过程,并通过比对测序结果,直至发现高度重复的富集序列。将高度重复的序列作为候选AAV衣壳蛋白突变体,然后进行进一步的动物实验验证。
筛选出AAV衣壳蛋白突变体1~4,其VP1的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.9~SEQ IDNo.12所示、核苷酸序列分别如SEQ ID No.13~SEQ ID No.16所示;VP1中靶向肽的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示、核苷酸序列分别如SEQ ID No.5~SEQ IDNo.8所示。
实施例2:构建AAV衣壳蛋白突变体并生产病毒
(1)突变体血清型载体的构建和质粒提取
将AAV9 Rep-CAP质粒用Smi I和BshTI双酶切,凝胶电泳并切下5000bp左右的片段条带进行凝胶回收,得到酶切的骨架片段。
根据突变体1的Cap序列,设计以下引物,具体步骤为:以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ141-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ141-1,以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用YJ141-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ141-2,通过以下步骤和比例混合骨架片段、YJ141-1、YJ141-2,即可重组构建突变体1的Rep-CAP质粒;
根据突变体2的Cap序列,设计以下引物,具体步骤为:以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ142-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ142-1,以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用YJ142-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ142-2,通过以下步骤和比例混合骨架片段、YJ142-1、YJ142-2,即可重组构建突变体2的Rep-CAP质粒;
根据突变体3的Cap序列,设计以下引物,具体步骤为:以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ146-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ146-1,以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用YJ146-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ146-2,通过以下步骤和比例混合骨架片段、YJ146-1、YJ146-2,即可重组构建突变体3的Rep-CAP质粒;
根据突变体4的Cap序列,设计以下引物,具体步骤为:以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用Cap-f+YJ147-R引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ147-1,以AAV9的Rep-CAP质粒为模板使用YJ147-F+cap-r引物进行扩增并胶回收得到目的产物YJ147-2,通过以下步骤和比例混合骨架片段、YJ147-1、YJ147-2,即可重组构建突变体4的Rep-CAP质粒;
上述AAV衣壳蛋白突变体1~4的Rep-CAP载体构建中涉及的引物如表1所示:
表1引物序列
取1个干净的200μL PCR管做好标记并放在冰盒上,将上述酶切骨架、各个目的片段,按骨架:片段摩尔比为1:3配制反应液,PCR仪中50℃反应30min进行重组连接。取50μL感受态细胞在冰上解冻,10μL的连接产物与DH5α感受态细胞混合,冰上放置20~30分钟;42℃热激45秒;快速置于冰上冰浴2分钟,加入400μL复苏SOC培养基(不含抗生素),37℃、200rpm培养1h;均匀涂于Amp抗性平板(50μg/mL),37℃培养14个小时。挑选单克隆菌,在4mL液体LB培养基(Amp+抗性)中扩大培养,37℃培养14小时。
菌液经过12000rpm离心1分钟,倒掉上清培养基;加入250μL的buffer P1/RNaseA混合液,高速涡旋重悬细菌;加入250μL的buffer P2,上下颠倒8~10次;加入350μL的buffer P3,立即颠倒混匀8~10次让溶液彻底中和;13000rpm离心10分钟,取上清过柱;12000离心1分钟,倒掉废液,加入500μL的PW1,12000离心1分钟,倒掉废液;加入600μL的PW2,12000离心1分钟,倒掉上清;加入600μL的PW2,12000离心1分钟,倒掉上清;12000rpm空转2分钟;加入55℃预热洗脱液30~50μL,静置2分钟,12000rpm离心1分钟。使用微量核酸定量仪进行浓度检测。
获得质粒经过浓度检测,酶切鉴定的阳性质粒取10μL送测序,阳性质粒保存在-20℃。测序结果表明,获得质粒能够编码变异型衣壳蛋白VP1。最后根据后期测试需要的病毒量提取相关的Helper质粒,各组Rep-Cap质粒(AAV9野生型及AAV9突变体1~4)质粒以及GOI质粒(ssAAV.CAG.Fluc-2a-eGFP.WPRE.SV40pA)。
(2)突变体血清型病毒的包装和纯化
将得到各组(AAV9野生型和AAV9突变体1~4)的Rep-Cap质粒,表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(EGFP)的GOI质粒,pHelper质粒以合适的量共转于HEK-293T细胞中,采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化AAV病毒,测量病毒滴度在1E+12GC/mL~1E+13GC/mL为合适滴度,放置-80℃备用。
实施例3:突变体血清型各指标的对比测试
(1)动物注射及解剖
动物实验使用6~8周龄的C57雄性小鼠,按照设计好的实验组和对照组配制相关病毒,每组按每只小鼠注射1012GC病毒,在注射3周后进行动物解剖及各器官取材,样本取材后立即进行液氮速冻,并分别用于后续RNA提取和WB检测等实验。
(2)目的基因mRNA表达水平检测
(2.1)总RNA提取及反转录:
样品的研磨:提前10min预冷研磨仪并设置好研磨参数。将保存于-80℃冰箱动物组织样品取出,取约50~100mg组织,于无菌培养皿内剪成黄豆粒大小后,转移至1.5mLRNase-free EP管内。按照每50~100mg组织:1mL TransZol Up的比例加入适量的TransZolUp,然后加入干净无菌的3mm研磨钢珠两颗,缠上封口膜。将样品置于24孔研磨适配器内并配平,拧紧螺旋,按下关盖按钮。启动研磨程序,待仪器运行结束后取出样品,观察样品研磨粒度,如无大块组织残留,即可进行后续提取操作。研磨后的样品在4℃,12,000×g转速离心2min,吸取上清转移至新的做好相应标记的1.5mL RNase-free EP管内。
样品总RNA的提取:具体参照TransZol Up Plus RNA Kit(北京全式金,货号:ER501)说明书。每使用1mL TransZol up,加0.2mL RNA Extraction Agent,剧烈震荡5min;12,000×g,4℃离心10min。此时样品分为三层,转移无色的水相于新的1.5mL RNase-freeEP管中,加入等体积的无水乙醇(此时可能会出现沉淀),轻轻颠倒混匀;将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中,12,000×g室温离心30s,弃滤液;加500μL CB9,12,000×g室温离心30s,弃滤液;重复上步骤一次;加入500μLWB9,12,000×g室温离心30s,弃滤液;重复上步骤一次;12,000×g室温离心2min,彻底去除残留的乙醇;将离心柱放入1.5mL RNase-free EP管中,加入30~50μL(视组织大小而定)RNase-free Water在离心柱的中央,室温静置1min;12,000×g室温离心1min,洗脱RNA;
样品核酸浓度测定:使用微量核酸定量仪检测器检测RNA浓度,记录浓度、OD260/280、OD260/230,把RNA保存于-80℃。
反转录:每组RNA样品使用All-in-One First-StrandcDNASynthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(北京全式金,货号:AE341-03),具体步骤参考说明书。
(2.2)定量PCR(qPCR)实验:
取每组cDNA作为模板,按照2×SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake,货号:B21203)说明书进行qPCR体系配置,见表2~4:
表2 qPCR体系
试剂 | 使用量 |
2×SYBR Green qPCR Master Mix | 10μL |
cDNA模板 | 1.5μL |
上游引物(10μM) | 1μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
ROX Reference Dye | 0.4μL |
去离子水 | Up to 20μL |
表3引物序列
引物名称 | 引物序列(5’->3’) |
Fluc2-qPCR-F1 | AACCAGCGCCATTCTGATCA |
Fluc2-qPCR-R1 | TCGGGGTTGTTAACGTAGCC |
GAPDH-F2 | CAGGAGAGTGTTTCCTCGTCC |
GAPDH-R2 | TTCCCATTCTCGGCCTTGAC |
表4 qPCR程序设置
(2.3)数据分析
根据每组的Ct值,按公式2-ΔΔct计算相对表达量。
(3)WB检测目的蛋白的表达水平
样品预处理:
把组织剪切成细小的碎片,称量并且记录重量后,放置1.5mL或者2mL离心管中,标记管子,在-80℃中冷冻待用,预冷冷冻研磨仪;溶解RIPA(碧云天,P0013B)裂解液(在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF终浓度为1mM);
按照每20mg组织加入150~250μL裂解液的比例加入上述完全裂解液,然后加入两颗已灭菌的氧化锆研磨珠,直接在裂解液中研磨样品(脑、脊髓等组织样品:温度-20℃,频率70Hz,时间每震荡50s停顿10s,循环3~4次;肌肉、肝脏等样品:温度-20℃,频率70Hz,时间每震荡50s停顿10s,5~7次)。样品研磨完后,将样品在冷冻离心机中,4℃,12,000×g离心5~10min,后取上清转移至新的灭菌EP管中,-20℃或-80℃保存;
蛋白浓度测定:
按照改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(生工,货号C503051)中的方法测定蛋白浓度后,根据所需用量取适量的蛋白匀浆样品,与相应量的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合,沸水浴10min,冷却后低速离心片刻,等待上样。
WB(Western Blot)检测:
a.SDS-PAGE电泳:根据蛋白浓度及表达水平确定适当的上样量,小于20μL/孔,组织匀浆蛋白上样量约为20~50μg,电泳具体操作流程如下:将预制胶上的梳子拔出,将凝胶安装到电泳槽,内、外槽均加入电泳缓冲液,其中内槽加入新配制的缓冲液,并检漏,若无漏则可在外槽加入电泳缓冲液;取适量处理好的蛋白样品上样,用预染的标准蛋白作为参照,在天能电泳装置上进行100V恒压电泳,电泳时间为100min,直到溴酚蓝到达胶底部。关闭电源,小心卸下预制胶板,取下凝胶,置于转膜缓冲液中等待后续操作;
b.转膜:据胶面积剪取6张滤纸和1张PVDF膜。PVDF膜在甲醇中浸泡5-10sec,然后转移至转膜缓冲液浸泡5min,滤纸也在转膜缓冲液中预湿润;安装转移装置:负极(黑板)-海绵-3层润湿的滤纸-凝胶-PVDF膜-3层润湿的滤纸-海绵-正极(透明板)。赶走每层气泡以避免影响转移效果,夹紧支架,放入电转槽内;使用100V恒压冰浴转膜100min;根据预染蛋白质分子量标准条带是否完全转至PVDF膜来判断转膜成功与否;将转好的PVDF膜浸泡在PBST溶液中室温洗涤5min,按照需求裁剪PVDF膜,裁膜过程中注意勿让PVDF膜变干;
c.封闭及抗体孵育:用封闭液(5%脱脂奶粉)孵育PVDF膜,室温2h或4℃过夜;将封闭好的PVDF膜转入一抗杂交液(Luciferase Rabbit Polyclonal antibody(Proteintech,27986-1-AP)按1:2000;GADPH Rabbit Polyclonal antibody(Proteintech,10494-1-AP)按1:2000;Rabbit GFP tag Polyclonal antibody(Proteintech,50430-2-AP)按1:2000,分别加入至4ml QuickBlockTMWestern一抗稀释液(碧云天,P0256)中,即配为一抗杂交液),室温孵育1h或4℃孵育过夜,然后用PBST洗膜,3×5min;将洗涤后的PVDF膜转入二抗杂交液(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech,SA00001-2)按1:5000加入至4mL QuickBlockTMWestern二抗稀释液(碧云天,P0258)中,即配为二抗杂交液),室温孵育1h,PBST洗膜,3×5min;
d.显色:将ECL化学发光试剂盒的A液与B液等体积混合,震荡混匀后,将发光液滴在PVDF膜上以使PVDF膜上全都覆盖有发光液,调整不同的曝光时间使蛋白条带清晰,仪器拍照。
经上述对不同的筛选突变体与亲本AAV9对照相比,突变体1~4对肝脏的靶向能力均有不同程度的提升。其中突变体1和突变体4达到AAV9的16倍以上(mRNA相对表达量分别为AAV9的16.93和24.53倍),突变体2达到AAV9的12.21倍,突变体3达到AAV9的3.00倍。为了进一步验证蛋白水平的表达差异,通过Western Blot检测突变体1~4靶向肝脏的蛋白表达情况,结果表明,蛋白水平的表达结果与mRNA水平趋势基本一致,其中突变体1和突变体4增幅效果明显,突变体3由于差异倍数较低,蛋白水平的差异并不显著。
由于AAV9是具有穿透血脑屏障(BBB)能力的血清型,同时也观察了突变体对大脑的嗜性。从结果中看出突变体1~4的大脑靶向性显著性降低(mRNA相对表达量分别为AAV9的0.18、0.12、0.22和0.09倍),蛋白水平也显著低于AAV9。说明突变体缺乏对大脑的嗜性,具有相对的特异性,可避免感染脑部引起不必要副作用。对于肌肉系统,突变体反而出现一定程度的提高。
综合以上结果,本发明通过定向筛选的方法,筛选获得了4个靶向肝脏的血清型突变体,分别从mRNA和蛋白表达水平验证了其靶向小鼠肝脏的能力。总之,本发明的4个突变体具有远超亲本AAV9的肝脏靶向性,同时对大脑的靶向性明显降低,是特异性良好的血清型突变体,将为下一步应用于非人灵长类,走向临床使用,为广大疾病患者提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种腺相关病毒衣壳蛋白突变体,其特征在于,所述腺相关病毒衣壳蛋白突变体插入有异源肽;所述异源肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示;所述异源肽的插入位点位于腺相关病毒衣壳蛋白氨基酸588和589之间。
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
3.一种编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示。
4.一种重组腺相关病毒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒,其特征在于,还包括异源目的基因。
6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒,其特征在于,所述异源目的基因编码干扰RNA、适配体、内切核酸酶、指导RNA中任一种基因产物。
7.权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、权利要求4~6任一项所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织中的药物或制剂中的应用。
8.权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、权利要求4~6任一项所述的重组腺相关病毒在制备用于预防和/或治疗肝脏类疾病的药物递送工具中的应用。
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