CN115947796A - 一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体包含腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸且第456位苏氨酸突变为了丝氨酸，或者，第459位精氨酸发生了缺失且第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸；腺相关病毒衣壳蛋白VP1的突变显著增加了所述重组腺相关病毒载体在中枢神经系统的转导效率(增加了10～20倍)，在建立中枢神经系统相关疾病模型或制备中枢神经系统相关的基因治疗药物中极具应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组腺相关病毒载体及其在基因递送中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
中枢神经系统疾病包括中枢神经系统退行性疾病和脑肿瘤。其中，中枢神经系统退行性疾病是指一组由慢性进行性的中枢神经组织退行性变性而产生的疾病的总称，病理上可见脑和/或脊髓发生神经元退行变性、丢失，主要包括帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、亨廷顿病(Huntington disease，HD)和肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等。脑肿瘤是指原发于颅内组织的肿瘤及脑转移瘤，临床表现为颅内压增高及各种神经系统症状，主要包括胶质母细胞瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤等。中枢神经系统疾病通常是由遗传性基因突变引起的，这些突变导致神经系统发育异常、神经变性或神经元功能受损等。基因治疗能够通过使用基因递送载体将治疗基因递送至特定组织或细胞，纠正缺陷基因造成的异常。目前，基因治疗已被用于包括神经系统疾病在内的多种疾病的治疗。
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一种单链DNA复制缺陷型细小病毒。腺相关病毒的基因组大小为4.7kb，由末端反向重复序列ITR和中间的Rep、Cap基因组成。其中，ITRs对于腺相关病毒的复制和包装具有重要作用；Rep基因编码参与腺相关病毒复制、包装和基因组整合的非结构蛋白，Cap基因编码结构蛋白VP1、VP2和VP3，3种蛋白分别按1:1:10的比例组装形成病毒衣壳，充当病毒基因传递载体。此外，Cap基因内嵌套的另一个开放阅读框编码装配激活蛋白AAP，参与衣壳蛋白的靶向和装配。腺相关病毒转导细胞主要经历了细胞表面受体介导的内吞、逃离内体、入核、脱衣壳和双链转化几个过程。进入细胞后，可以在辅助病毒的存在下进入其复制周期。
重组腺相关病毒载体(recombination adeno-associated virus,rAAV)是在非致病的野生型腺相关病毒基础上改造而成的基因载体。与慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等其他基因治疗载体相比，腺相关病毒载体具有基因递送效率高、安全稳定和细胞毒性低等优势。迄今为止，腺相关病毒载体已被应用于许多基因治疗药物中，例如，Glybera、Luxturna、Zolgensma、Upstaza和Roctavian等。腺相关病毒血清型众多，其中，2型腺相关病毒(AAV2)是研究最为广泛的一种腺相关病毒，Luxturna和Upstaza就是使用了2型重组腺相关病毒载体。但是，在中枢神经系统的转导中，2型腺相关病毒的感染范围较为局限(参见文献：Tordo et.al.,2018；Han et.al.,2022)，因此，为使2型重组腺相关病毒载体能够更好地应用于中枢神经系统的基因递送，有必要开发在中枢神经系统转导效率更高的2型腺相关病毒。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失、第447位精氨酸发生了突变和/或第456位苏氨酸发生了突变。
在本发明的一种实施方式中，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸；或者，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种腺相关病毒衣壳突变体，所述腺相关病毒衣壳突变体包含上述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体。
本发明还提供了一种腺相关病毒突变体，所述腺相关病毒突变体包含上述腺相关病毒衣壳突变体和基因组。
在本发明的一种实施方式中，所述基因组中，Cap基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包含上述腺相关病毒突变体，并且，所述腺相关病毒突变体的基因组上整合有编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA。
在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括标记蛋白或活性蛋白中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述标记蛋白包括荧光蛋白或酶反应显色蛋白中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述标记蛋白包括BFP、CFP、GFP、YFP、RFP、iRFP、Cerulean、Venus、eGFP、eCFP、eYFP、eBFP、DsRed、dTomato、tdTomato、mCherry、mKate、mApple、mBanana、mCitrine、mOrange、mPlum、tagRFP、tagBFP、HRP、Firefly luciferase或Renilla luciferase中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述活性蛋白包括激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、钙离子信号探针蛋白、小分子信号探针蛋白、介导凋亡蛋白、疾病相关突变蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子、病毒感染辅助受体、重组酶或基因编辑工具蛋白中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述功能性RNA包括小RNA、小干扰RNA、小发卡RNA、小向导RNA、细胞器定位RNA、用于RNA测序的Barcode RNA或用于原位杂交分析的BarcodeRNA中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述腺相关病毒突变体的基因组上还整合有启动子。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子包括CAG、CMV、hUbC、Ef1α、nEF、hSyn、CaMKIIα、Vgat、Thy1、TRE、UAS、GFAP、gfaABC1D、TH、RPE65、TRE、CBA、PGK、E-SARE、C-fos、RAM、SST、PV、mDlX、NPY、CR、TCAP、SFRP2、ChAT、TPH2、mTH、GAD67、GFAP104、CD68、Nestin、MBP、TRPV1、L7/Pcp2、mOXT、RK、hGRK1、CAR、Grm6、ROH、Nrl、MCK、dMCK或tMCK中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述整合为插入或取代。
本发明还提供了一种基因递送方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法使用上述重组腺相关病毒载体将编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA递送至目标位置。
在本发明的一种实施方式中，所述目标位置包括中枢神经系统。
本发明还提供了上述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体或上述腺相关病毒衣壳突变体或上述腺相关病毒突变体或上述重组腺相关病毒载体在基因递送、制备基因递送试剂、建立疾病模型或制备基因治疗药物中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
在本发明的一种实施方式中，所述基因递送包括将编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA递送至目标位置。
在本发明的一种实施方式中，所述目标位置包括中枢神经系统。
在本发明的一种实施方式中，所述疾病模型包括中枢神经系统相关疾病模型。
在本发明的一种实施方式中，所述基因治疗药物包括中枢神经系统相关疾病的基因治疗药物。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸，或者，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸；所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体显著增加了重组腺相关病毒载体在中枢神经系统的转导效率(增加了10～20倍)，因此，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体在建立中枢神经系统相关疾病模型或制备中枢神经系统相关的基因治疗药物中极具应用前景。
2、本发明提供了一种重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体包含腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸，或者，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸；腺相关病毒衣壳蛋白VP1的突变显著增加了所述重组腺相关病毒载体在中枢神经系统的转导效率(增加了10～20倍)，因此，所述重组腺相关病毒载体在建立中枢神经系统相关疾病模型或制备中枢神经系统相关的基因治疗药物中极具应用前景。
附图说明
图1：质粒pAAV2/2.A2的图谱。
图2：质粒pAAV2/2.A1的图谱。
图3：C57BL/6小鼠脑区定位注射rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA与rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒载体后的脑组织切片成像结果。
图4：C57BL/6小鼠脑区定位注射rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA与rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒载体后的脑组织切片成像结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：重组腺相关病毒载体及其制备方法
本实施例提供了重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA，所述重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA包含腺相关病毒突变体AAV2.A2，所述腺相关病毒突变体AAV2.A2包含腺相关病毒衣壳突变体，所述腺相关病毒衣壳突变体包含腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述重组腺相关病毒载体AAV2.A2的制备过程如下：
1、质粒pAAV2/2.A2的构建
以质粒pAAV2/2(Addgene plasmid#104963)为模板，以Mu-A2-F(SEQ IDNO.6)和Mu-A2-R(SEQ ID NO.7)作为引物，使用Fast Mutagenesis System试剂盒(TransGenBiotech)进行PCR，得到PCR产物；将PCR产物用1μL模板消化酶DMT(北京全式金生物技术有限公司)于37℃消化模板1h，得到消化产物；取5μL消化产物转化至Stbl3感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(深圳康体生命科技有限公司)上，于37℃培养16h后挑取单菌落；取单菌落接种于15mL LB液体培养基基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L、)上，于37℃培养16h，得到菌液；取菌液抽提质粒后进行测序，测序正确后得到质粒pAAV2/2.A2(图谱见图1)。
其中，所述PCR反应体系为：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix，25μL；10μM正向引物，1μL；10M反向引物，1μL；模板pAAV2/2，2μL；ddH2O，31μL。所述PCR反应程序为：98℃，5min；{98℃，30s；60℃，30s；72℃，5min；72℃，10min}36个循环；16℃，30min。
2、重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的构建
参考文献“AAV11 permits efficient retrograde targetingofprojectionneurons，Han et.al.；bioRxiv 2022.01.13.476170；doi:https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476170”，采用三质粒包装系统包装腺相关病毒的方法，将核心元件装载质粒pAAV-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA、腺病毒元件辅助质粒pAd-Helper与质粒pAAV2/2.A2按质粒分子数1：1：1共转染HEK-293T细胞(American Type Culture Collection)，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀，用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，得到重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA(重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的基因组中，Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。使用SYBR Green qPCR法检测所得重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的腺相关病毒滴度，检测结果为：6.0×1012VG/mL。
实施例2：重组腺相关病毒载体及其制备方法
本实施例提供了重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA，所述重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA包含腺相关病毒突变体AAV2.A1，所述腺相关病毒突变体AAV2.A1包含腺相关病毒衣壳突变体，所述腺相关病毒衣壳突变体包含腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述重组腺相关病毒载体AAV2.A1的制备过程如下：
1、质粒pAAV2/2.A1的构建
以质粒pAAV2/2(Addgene plasmid#104963)为模板，以Mu-A1-F(SEQ IDNO.8)和Mu-A1-R(SEQ ID NO.9)作为引物，使用Fast Mutagenesis System试剂盒(TransGenBiotech)进行PCR，得到PCR产物；将PCR产物用1μL模板消化酶DMT(北京全式金生物技术有限公司)于37℃消化模板1h，得到消化产物；取5μL消化产物转化至Stbl3感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(深圳康体生命科技有限公司)上，于37℃培养16h后挑取单菌落；取单菌落接种于15mL LB液体培养基基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L、)上，于37℃培养16h，得到菌液；取菌液抽提质粒后进行测序，测序正确后得到质粒pAAV2/2.A1(图谱见图2)。
其中，所述PCR反应体系为：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix，25μL；10μM正向引物，1μL；10M反向引物，1μL；模板pAAV2/2，2μL；ddH2O，31μL。所述PCR反应程序为：98℃，5min；{98℃，30s；60℃，30s；72℃，5min；72℃，10min}36个循环；16℃，30min。
2、重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的构建
参考文献“AAV11 permits efficient retrograde targetingofprojectionneurons，Han et.al.；bioRxiv 2022.01.13.476170；doi:https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476170”，采用三质粒包装系统包装腺相关病毒的方法，将核心元件装载质粒pAAV-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA、腺病毒元件辅助质粒pAd-Helper与质粒pAAV2/2.A1按质粒分子数1：1：1共转染HEK-293T细胞(American Type Culture Collection)，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀，用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，得到重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA(重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的基因组中，Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。使用SYBR Green qPCR法检测所得重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的腺相关病毒滴度，检测结果为：8.0×1012VG/mL。
对比例1：重组腺相关病毒载体及其制备方法
本对比例提供了重组腺相关病毒载体rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA，所述重组腺相关病毒载体rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA及其制备方法为在实施例1的基础上，将质粒pAAV2/2.A2替换为质粒pAAV2/2。使用SYBR Green qPCR法检测所得重组腺相关病毒载体rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA的腺相关病毒滴度，检测结果为：6.0×1012VG/mL。
实验例1：重组腺相关病毒载体在中枢神经系统的转导效率
本实验例提供了实施例1～2和对比例1的重组腺相关病毒载体在中枢神经系统的转导效率实验，实验过程如下：
将实施例1的重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA、实施例2的重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA和对比例1的重组腺相关病毒载体rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA分别立体定位注射注射至C57BL/6小鼠(8～10周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)在尾壳核(CPu)与腹侧海马(vHPC)的两个脑区，注射剂量为300nL，注射3周后对小鼠灌流取脑组织。将小鼠脑组织先用经DEPC处理的浓度为4％(m/v，g/100mL)的PFA(多聚甲醛)溶液固定4小时后再用经DEPC处理的含30％(m/v，g/100mL)蔗糖的PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4，pH＝7.4)脱水48小时。将脱水后的小鼠脑组织用包埋剂(SAKURA)充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的切片。将小鼠脑组织切片进行贴片并使用玻片扫描仪显微成像，扫描结果见图3～4。
由图3可以看出，无论在CPu脑区还是vHPC脑区，实施例1的重组腺相关病毒载体rAAV2.A2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA均比对比例1的重组腺相关病毒载体rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA表现出更大的转导范围(转导范围扩大了约10倍)。
由图4可以看出，在CPu脑区，实施例2的重组腺相关病毒载体rAAV2.A1-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA比对比例1的重组腺相关病毒载体rAAV2-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA表现出更大的转导范围(转导范围扩大了约20倍)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失、第447位精氨酸发生了突变和/或第456位苏氨酸发生了突变。
2.如权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第447位精氨酸突变为了蛋氨酸，并且，第456位苏氨酸突变为了丝氨酸；或者，所述腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺相关病毒衣壳蛋白VP1相比，第459位精氨酸发生了缺失，并且，第456位苏氨酸突变为了异亮氨酸。
3.一种腺相关病毒衣壳突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳突变体包含权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体。
4.一种腺相关病毒突变体，其特征在于，所述腺相关病毒突变体包含权利要求3所述的腺相关病毒衣壳突变体和基因组。
5.如权利要求4所述的腺相关病毒突变体，其特征在于，所述基因组中，Cap基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包含权利要求4或5所述的腺相关病毒突变体，并且，所述腺相关病毒突变体的基因组上整合有编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA。
7.如权利要求6所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒突变体的基因组上还整合有启动子。
8.一种基因递送方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法使用权利要求6或7所述的重组腺相关病毒载体将编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA递送至目标位置。
9.权利要求1或2所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1突变体或权利要求3所述的腺相关病毒衣壳突变体或权利要求4或5所述的腺相关病毒突变体或权利要求6或7所述的重组腺相关病毒载体在基因递送、制备基因递送试剂、建立疾病模型或制备基因治疗药物中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基因递送包括将编码目的蛋白的目的基因和/或功能性RNA递送至目标位置；所述疾病模型包括中枢神经系统相关疾病模型；所述基因治疗药物包括中枢神经系统相关疾病的基因治疗药物。
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2022
- 2022-12-30 CN CN202211741124.6A patent/CN115947796A/zh active Pending
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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