CN117285608A

CN117285608A - 腺相关病毒突变体及其应用

Info

Publication number: CN117285608A
Application number: CN202311217358.5A
Authority: CN
Inventors: 李华鹏; 樊颖; 钟育健; 卜晔; 檀克勤; 张有为; 代志勇
Original assignee: Guangzhou Packgene Biotech Co ltd
Current assignee: Guangzhou Packgene Biotech Co ltd
Priority date: 2023-09-20
Filing date: 2023-09-20
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2043-09-20

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种腺相关病毒突变体及其应用。本发明的AAV6衣壳蛋白突变体包括异源肽；所述异源肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.11任一序列所示。本发明的AAV6衣壳蛋白突变体无需整合基因组，所构建得到的重组腺相关病毒特异性地感染激活的T细胞，可实现快速感染和回输，减少不必要的质检和体外停留时间。本发明高产AAV6衣壳蛋白突变体病毒库的制备方法，使用基于AAV2的Rep‑Cap失活突变载体，而非基于AAV6的Rep‑Cap失活突变载体进行病毒包装，产量达到超10倍提升，并且具有各突变体丰度高、均一度好的优点。

Description

腺相关病毒突变体及其应用

技术领域

本发明涉生物医药技术领域，具体涉及一种腺相关病毒突变体及其应用。

背景技术

腺相关病毒(AAV)是长约4.7kb单链DNA片段组成的非致病缺陷病毒。AAV基因组包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框和末端反向重复序列。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，作为一种重要的基因载体，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，被广泛应用于基因功能研究和基因治疗领域。不同的血清型对组织和细胞有着不同的特异亲嗜性，转染效率有所差别。

肿瘤免疫疗法通过激活自身免疫系统或增强机体抗肿瘤免疫应答的方式，特异性识别并清除肿瘤细胞。因其副作用小、起效快，成为当前肿瘤治疗领域发展方向。随着近几年对肿瘤免疫疗法的深入研究，多种类型的疗法在难治复发肿瘤中出现很好的疗效，如抗体偶联药物、双靶向抗体、CAR-T疗法和TCR-T疗法等。在抑制肿瘤生长、清除肿瘤病灶方面，T细胞具有重要作用。免疫检查点抑制剂和肿瘤浸润淋巴细胞的相关研究表明了T细胞治疗癌症的潜力。但T细胞于治疗方面所发挥的效果受肿瘤特异性、效应细胞数量所限制，并需克服任何局部免疫抑制因素。因此，研发一种对T细胞具有高效靶向性，且不会影响T细胞活性的病毒载体具有巨大的临床价值和商业意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种腺相关病毒突变体及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种AAV6衣壳蛋白突变体，包括异源肽；所述异源肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.11任一序列所示；所述异源肽的插入位点位于AAV衣壳蛋白氨基酸588和589之间。

本发明的AAV6衣壳蛋白突变体无需整合基因组，所构建得到的重组腺相关病毒特异性地感染激活的T细胞，可实现快速感染和回输，减少不必要的质检和体外停留时间。

作为本发明所述的AAV6衣壳蛋白突变体的优选实施方式，其氨基酸序列如SEQ IDNo.23～SEQ ID No.33任一序列所示。

第二方面，本发明提供一种编码AAV6衣壳蛋白突变体的核酸，包括异源肽；所述异源肽的核苷酸序列如SEQ ID No.12～SEQ ID No.22任一序列所示。

作为本发明所述的核酸的优选实施方式，其核苷酸序列如SEQ ID No.34～SEQ IDNo.44任一序列所示。

第三方面，本发明提供一种重组腺相关病毒，包括所述的AAV6衣壳蛋白突变体。该腺相关病毒突变体对静息T细胞特异性的感染能力，具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。未激活的T细胞感染可以实现当天收集细胞当天感染，当天回输的优点，极大降低了制备成本，可减少对T细胞活性的影响。

作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式，还包括异源目的基因；所述异源目的基因编码干扰RNA、适配体、内切核酸酶、指导RNA中任一种基因产物。

第四方面，本发明将所述的AAV6衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞的药物或制备肿瘤免疫治疗药物中应用。

优选的，所述细胞为免疫细胞。

优选的，所述免疫治疗包括CAR-T疗法或TCR-T疗法。

第五方面，本发明将所述的AAV6衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在感染静息T细胞中应用。

第六方面，本发明提供一种高产AAV6衣壳蛋白突变体病毒库的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建AAV6骨架载体；所述AAV6骨架载体包含CAG启动子、Intron、突变的AAV6CAP序列和polyA；所述突变的AAV6 CAP序列包括去除AAV6CAP序列的T589后序列和N583的T与polyA前段的序列构成后续用于酶切骨架的位点；

(2)构建AAV2突变Rep-CAP载体；所述AAV2突变Rep-CAP载体中CAP序列的VP1、VP2、VP3起始密码的前20bp内引入终止密码子；

(3)以包含AAV6 CAP的载体为模板，利用引物PCR扩增获得包含随机序列的核酸片段；将所述核酸片段通过Gibson同源重组连接的方式连接入所述AAV6库骨架载体；得AAV6随机肽载体库；

(4)将所述AAV2突变Rep-Cap质粒、所述AAV6随机肽载体库、pHelper质粒共转于细胞中，纯化腺相关病毒，即得高产AAV6衣壳蛋白突变体病毒库。

本发明在制备AAV6突变体病毒库时，使用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体，而非基于AAV6的Rep-Cap失活突变载体进行病毒包装。定量结果显示，使用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体包装AAV6病毒库时，产量达到超10倍提升，并且具有各突变体丰度高、均一度好的优点。测序结果未发现采用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体制备的AAV6病毒库中存在AAV6和AAV2的Cap重组序列。

作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，所述引物为：

GGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKACAGACCCTGCGACCGGAGAT和/或

CGGTTTATTGATTAACAATCGATTACAGGGGACGGGTGAGGTAAC。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明筛选所得的AAV衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体靶向T细胞的效率高，具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。本发明筛选所得的AAV衣壳蛋白突变体无需整合基因组，所构建得到的重组腺相关病毒感染静息的T细胞可实现快速感染和回输，减少不必要的质检和体外停留时间，使用本发明筛选所得的AAV衣壳蛋白突变体感染静息T细胞具有巨大的临床价值和商业应用场景。

附图说明

图1为荧光显微镜检测不同rAAV病毒体感染静息T细胞的eGFP荧光强度(72h)；A为空白，B为rAAV6病毒于MOI 10⁴条件下感染静息T细胞，C为rAAV6病毒于MOI 10⁵条件下感染静息T细胞，D～N为AAV6衣壳蛋白突变体病毒a～k于MOI 10⁴条件下感染静息T细胞。

图2为流式细胞仪检测不同rAAV病毒体感染静息T细胞72h后eGFP荧光表达情况直方图；A为空白，B为rAAV6病毒于MOI 10⁴条件下感染静息T细胞，C为rAAV6病毒于MOI 10⁵条件下感染静息T细胞，D～N为AAV6衣壳蛋白突变体病毒a～k于MOI 10⁴条件下感染静息T细胞。

图3为流式细胞仪检测不同rAAV病毒体感染静息T细胞72h后eGFP荧光表达情况统计结果；A为表达eGFP蛋白细胞占总细胞比例柱状图，B为各感染条件下eGFP平均荧光强度统计柱状图。

图4为RT-qPCR检测不同rAAV6衣壳蛋白突变体病毒感染静息T细胞72h后eGFPmRNA的相对强度。

图5为通过荧光素酶活性测定检测不同rAAV病毒体在感染后96h对静息T细胞的感染能力。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。AAV6 VP1的GenBank登录号为AF028704.1。

实施例1：筛选有效感染未激活T细胞的AAV6突变体

(1)AAV6库骨架载体的构建

AAV6库骨架载体包含CAG启动子、Intron、突变的AAV6 CAP序列[AAV6CAP序列的T589后序列被去除，N583的T与polyA前段的序列构成后续用于酶切骨架的位点BsrG I(TGTACA)]和polyA。将上述序列通过基因合成的方式合成，并插入到rAAV载体的ITR之间，形成AAV6库骨架载体。

(2)突变Rep-CAP载体的构建

通过在AAV2中CAP序列(NCBI Reference Sequence:NC_001401.2)的VP1、VP2、VP3起始密码的前20bp内引入终止密码子的方式，使基于AAV2的Rep-CAP失活突变载体表达Rep蛋白，而不能表达AAV2的CAP的VP1、VP2、VP3蛋白，从而避免亲本AAV2中CAP序列的污染(质粒编号：D#YJ119)。通过在AAV6中CAP序列(GenBank:AF028704.1)的VP1、VP2、VP3起始密码的前20bp内引入终止密码子的方式，使基于AAV6的Rep-CAP失活突变载体表达Rep蛋白，而不能表达AAV6的CAP的VP1、VP2、VP3蛋白(质粒编号：D#YJ077)。将上述序列通过基因合成的方式合成，并插入替换Rep-CAP载体的CAP序列。

(3)随机7肽载体库的构建

设计2条引物(插入位点位于AAV6的S588与T589之间，上游引物靶向模板T589后核酸序列，下游引物靶向CAP末端序列)，上下游引物5’端均具有与骨架一致的15bp以上同源臂序列。此外上游引物在同源臂序列和靶向序列间引入21bp核酸序列(7*NNK)以将随机7肽引入CAP序列中。

2条引物(5’->3’)的碱基序列如下：

V6-7P-F：

GGGACTGTGGCAGTCAATCTCCAGAGCAGCAGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKACAGACCCTGCGACCGGAGAT；

V6-Stop-R：

CGGTTTATTGATTAACAATCGATTACAGGGGACGGGTGAGGTAAC。

以包含AAV6 CAP的载体为模板，利用上述引物PCR扩增获得包含随机序列的片段。将片段进行凝胶电泳和胶回收，得到纯化的随机7肽库的核酸片段；将核酸片段通过Gibson同源重组连接的方式连接入AAV6库骨架载体(经过BsrG I酶切和胶回收纯化)；连接后的载体通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，用Plasmid-Safe DNase酶消化，以去除没有连接上的片段；最后再通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，即得构建好的AAV6载体库。

(4)AAV6突变体病毒库的构建

将突变的Rep-Cap质粒、AAV6载体库、pHelper质粒共转于HEK-293T细胞中，采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化腺相关病毒，测量病毒滴度在1×10¹²GC/mL～1×10¹³GC/mL为合适滴度，得AAV6突变体病毒库，放置-80℃备用。

使用传统方法制备AAV病毒库时，相较于多种其他AAV血清型，AAV6突变体库产能非常低，单皿产量介于2E7至4E8之间，难以满足正常筛选需求。存在制备成本高，均一度及覆盖度较其他血清型差的劣势。为降低新型血清型筛选时，由于病毒库制备误差造成的偏差，本发明首先着力对AAV6突变体病毒库制备进行了优化。

使用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体，与基于AAV6的Rep-Cap失活突变载体对比，进行病毒包装测试。

按照AAV突变体库生产所需3质粒转染比例进行配比，相同的生产规模进行病毒包装，对比结果见表1：

表1对比结果

生产编号	生产系统使用RC质粒	裂解液滴度(GC/mL)
			RM392	基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体(质粒编号：D#YJ119)	1.44E+10
RM394	基于AAV6的Rep-Cap失活突变载体(质粒编号：D#YJ077)	4.24E+08

本发明在制备AAV6突变体病毒库时，使用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体，而非基于AAV6的Rep-Cap失活突变载体进行病毒包装。定量结果显示，使用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体平行进行AAV6病毒库包装时，产量较使用基于AAV6的Rep-Cap失活突变载体的组别达到近百倍提升。测序结果未发现采用基于AAV2的Rep-Cap失活突变载体制备的AAV6病毒库中存在AAV6和AAV2的Cap重组序列。

(5)T细胞筛选AAV6突变体

1)T细胞的复苏和AAV感染

RPMI 1640培养基于37℃预热；取冻存CD3⁺T细胞，快速化冻；将复苏的细胞吸入50mL离心管，加入15mL含1％ P/S及10％ FBS的RPMI 1640培养基，300g离心10min～15min；用1mL含1％ P/S及10％ FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数(台盼蓝染色，计数细胞总数和死细胞数)；在细胞培养板中每孔加入5×10⁵细胞悬液；按每孔5×10⁹GC的剂量加入AAV6突变体病毒库，感染未激活T细胞。感染2小时后，每孔加入50U/mL终浓度的rhIL-2，用移液枪轻轻吹打混匀。2小时后，以25μL/mL的终浓度每孔加入CD3/CD28 T cellactivator，用移液枪轻轻吹打混匀，细胞培养箱中培养48h(37℃，5％ CO₂)。

2)总RNA提取和RT-PCR

将细胞吸入1.5mL离心管中，300g离心10分钟收集细胞，吸去上清。RNA提取方法按照TransZol Up Plus RNA Kit(全式金，ER501)说明书。提取RNA样品使用PrimeScript^TM IV1st strand cDNA Synthesis Mix(Takara，6215A)进行第一链cDNA的合成。随后使用NEBQ5进行2轮PCR扩增，第一轮使用外侧引物扩增，第二轮使用胶回收的第一轮产物作为模板，或使用NGS引物进行扩增，胶回收对应条带大小的PCR产物送公司进行NGS测序；或使用建库引物进行扩增、胶回收，并按前述的过程进行子载体库的构建、包毒、筛选等过程。筛选出AAV衣壳蛋白突变体a～k，其VP1的氨基酸序列分别如SEQ ID No.23～SEQ ID No.33所示、核苷酸序列分别如SEQ ID No.34～SEQ ID No.44所示；VP1中靶向肽的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.11所示、核苷酸序列分别如SEQ ID No.12～SEQ ID No.22所示。

实施例2：构建AAV衣壳蛋白突变体并生产病毒

以r AAV6为对照，构建AAV衣壳蛋白突变体a～k，具体如下：

(1)突变型血清型载体的构建和质粒提取

将Rep-CAP质粒用Smi I和BshT I双酶切，凝胶电泳并切下5000bp左右的片段条带进行凝胶回收，得到酶切的骨架片段。分别根据筛选获得的目的突变体a～k的Cap序列设计引物构建目的突变体AAV的质粒。以AAV6的Rep-CAP质粒为模板使用F1+R1引物进行PCR扩增得到目的产物1，同样以AAV6的Rep-CAP质粒为模板用F2+R2引物进行PCR扩增得到目的产物2。骨架与片段，片段与片段间具有同源臂序列，可通过Gibson进行多片段组装成完整载体。

AAV衣壳蛋白突变体a载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFa-R，PCR产物2的引物为FFa-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为：

FFa-F：

TTGAGTGGGAGTGATACGAAGACAGACCCTGCGACCGGAGA；

FFa-R：

CTTCGTATCACTCCCACTCAAGCTGCTGCTCTGGAGATTGA。

AAV衣壳蛋白突变体b载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFb-R，PCR产物2的引物为FFb-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为：

FFb-F：

GTGCCGGGTTTTCCTGCTTTGACAGACCCTGCGACCGGAGA；

FFb-R：

CAAAGCAGGAAAACCCGGCACGCTGCTGCTCTGGAGATTGA。

AAV衣壳蛋白突变体c载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFc-R，PCR产物2的引物为FFc-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFc-F：

GATACGCAGACTCAGAAGCATACAGACCCTGCGACCGGAGA；

FFc-R：

ATGCTTCTGAGTCTGCGTATCGCTGCTGCTCTGGAGATTGA。

AAV衣壳蛋白突变体d载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFd-R，PCR产物2的引物为FFd-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFd-F：

GATACGCAGAATCAGAAGCATACAGACCCTGCGACCGGAGA；

FFd-R：

ATGCTTCTGATTCTGCGTATCGCTGCTGCTCTGGAGATTGA。

AAV衣壳蛋白突变体e载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFe-R，PCR产物2的引物为FFe-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFe-F：

CATGATTCTTCTCCTAAGGCTACAGACCCTGCGACCGGAGA；

FFe-R：

AGCCTTAGGAGAAGAATCATGGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

AAV衣壳蛋白突变体f载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFf-R，PCR产物2的引物为FFf-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFf-F：

GAGGGGCCTCGGTCTCTGGAGACAGACCCTGCGACCGGAG；

FFf-R：

CTCCAGAGACCGAGGCCCCTCGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

AAV衣壳蛋白突变体g载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFg-R，PCR产物2的引物为FFg-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFg-F：

GCGGGTGGTAGTTCTGCGGAGACAGACCCTGCGACCGGAG；

FFg-R：

CTCCGCAGAACTACCACCCGCGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

AAV衣壳蛋白突变体h载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFh-R，PCR产物2的引物为FFh-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFh-F：

GATACGCAGAATAAGAAGCATACAGACCCTGCGACCGGAG；

FFh-R：

ATGCTTCTTATTCTGCGTATCGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

AAV衣壳蛋白突变体i载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFi-R，PCR产物2的引物为FFi-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFi-F：

GATAGTCCTAATAAGAAGAATACAGACCCTGCGACCGGAG；

FFi-R：

ATTCTTCTTATTAGGACTATCGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

AAV衣壳蛋白突变体j载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFj-R，PCR产物2的引物为FFj-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFj-F：

GAGGTTGGGGTGCAGCCTTATACAGACCCTGCGACCGGAG；

FFj-R：

ATAAGGCTGCACCCCAACCTCGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

AAV衣壳蛋白突变体k载体构建中PCR产物1的引物为Cap-F+FFk-R，PCR产物2的引物为FFk-F+Cap-R。所涉及的引物序列(5’至3’)为

FFk-F：

GGTAATTCTGCTTCTAAGGATACAGACCCTGCGACCGGAG；

FFk-R：

ATCCTTAGAAGCAGAATTACCGCTGCTGCTCTGGAGATTG。

上述AAV衣壳蛋白突变体a-k载体构建中涉及的引物Cap-F和Cap-R的序列为：

Cap-F：

GCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGG；

Cap-R:

GTTCAACTGAAACGAATCAATTTATTGATTAACAGGCAATTACAGG。

取1个干净的200μL PCR管做好标记并放在冰盒上，将上述酶切骨架、目的片段1和目的片段2，按骨架：片段摩尔比为1:3配制反应液，PCR仪中50℃反应30min进行重组连接。取50μL感受态细胞在冰上解冻，10μL的连接产物与DH5α感受态细胞混合，冰上放置20min-30min；42℃热激45秒；快速置于冰上冰浴2min，加入400μL复苏SOC培养基(不含抗生素)，37℃、200rpm培养1h；均匀涂于Amp抗性平板(50μg/ml)，32℃培养18个小时。挑选单克隆菌，在4ml液体LB培养基(Amp+抗性)中扩大培养，32℃培养18小时。

菌液经过12000rpm离心1分钟，倒掉上清培养基；加入250μL的buffer P1/RNaseA混合液，高速涡旋重悬细菌；加入250μL的buffer P2，上下颠倒8～10次；加入350μL的buffer P3，立即颠倒混匀8～10次让溶液彻底中和；13000rpm离心10分钟，取上清过柱；12000rpm离心1分钟，倒掉废液，加入500μL的PW1，12000rpm离心1分钟，倒掉废液；加入600μL的PW2，12000rpm离心1分钟，倒掉上清；加入600μL的PW2，12000rpm离心1分钟，倒掉上清；12000rpm空转2分钟；加入55℃预热洗脱液30μL～50μL，静置2分钟，12000rpm离心1分钟。使用微量核酸定量仪进行浓度检测。

获得质粒经过浓度检测，经过酶切鉴定的阳性质粒取10μL送测序，阳性质粒保存在-20℃。测序结果表明，获得质粒能够编码变异型衣壳蛋白VP1。最后根据后期测试需要的病毒量提取相关的Helper质粒，各组Rep-Cap质粒(AAV6,AAV6突变体a～k)质粒以及GOI质粒(包含scAAV、CAG、eGFP、WPREs、SV40pA)。

(2)突变型血清型病毒的包装和纯化

将得到的各组(AAV6野生型和AAV6衣壳蛋白突变体)的Rep-Cap质粒、表达绿色荧光蛋白(eGFP)的质粒或表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的质粒、pHelper质粒以合适的量共转于HEK-293T细胞中，采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1×10¹²GC/mL～1×10¹³GC/mL为合适滴度，得对照AAV6野生型病毒,AAV6衣壳蛋白突变体1(专利申请公布号CN115838399A所述)和AAV6衣壳蛋白突变体病毒a～k，放置-80℃备用。

实施例3：突变血清型感染静息T细胞各指标的对比检测

(1)AAV感染T细胞和细胞培养

设置分组：对照AAV6病毒，参照AAV6衣壳蛋白突变体1(专利申请公布号CN115838399A所述)，AAV6衣壳蛋白突变体病毒a～k。

RPMI 1640培养基于37℃预热；取冻存CD3⁺T细胞，快速化冻；将复苏的细胞吸入50mL离心管，加入15mL含1％ P/S及10％ FBS的RPMI 1640培养基，300g离心10min～15min；用1mL含1％ P/S及10％ FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，细胞计数(台盼蓝染色，计数细胞总数和死细胞数)；根据细胞计数结果，调整细胞密度为1×10⁶cells/mL；按实验分组，在24孔细胞培养板中加入500μL细胞悬液(细胞数为5×10⁵细胞/孔)，或在96孔细胞培养板中加入100μL细胞悬液(细胞数为1×10⁵细胞/孔)；每组按MOI：1E4(对照AAV6高剂量组MOI为1E5)，分组感染T细胞。感染4小时后，每孔加入50U/mL终浓度的rhIL-2，用移液枪轻轻吹打混匀。2小时后，以25μL/mL的终浓度每孔加入CD3/CD28 T cell activator，用移液枪轻轻吹打混匀，置于细胞培养箱中培养(37℃，5％ CO₂)。

(2)荧光观察

在72h使用荧光显微镜分别对每组T细胞进行荧光拍照(拍照参数和曝光时间保持一致)。

(3)目的mRNA表达水平检测

1)总RNA提取：

将每组细胞分别吸入1.5mL离心管中，300g，离心15min收集细胞，后吸去液体。RNA提取方法按照TransZol Up Plus RNA Kit(全式金，ER501)说明书。每管细胞中加入300μlTranZol up，加60μL氯仿，剧烈震荡30s，室温敷育3min；12,000g，4℃离心10min。转移无色的水相于新的1.5ml RNase-free EP管中，加入等体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀；将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12,000g室温离心30s，弃滤液；加500μL CB9，12,000g室温离心30s，弃滤液；重复一次；加入500μL WB9，12,000g室温离心30s，弃滤液；重复一次；12,000g室温离心2min，彻底去除残留的乙醇；将离心柱放入1.5ml RNase-free EP管中，加入50μL RNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1min；12,000g室温离心1min，洗脱RNA；使用微量核酸定量仪检测器进行样品RNA浓度检测，测定RNA浓度、OD260/280、OD260/230，把提取好的RNA保存于-80℃。每组RNA样品使用III RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)(诺唯赞，R323)进行第一链cDNA的合成。

2)定量PCR(qPCR)实验

取每组cDNA作为模板，按照2×SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake，B212203)说明书进行qPCR体系配置，如表2所示：

表2qPCR体系

试剂	使用量
		2×SYBR Green qPCR Master Mix	10μL
模板	1μL
		上游引物	0.5μL
下游引物	0.5μL
		ROX Reference Dye	0.4μL
去离子水	Up to 20μL

引物序列(5’->3’)如下：

EGFP-Tf：GCTGGAGTACAACTACAAC；

EGFP-Tr：TGGCGGATCTTGAAGTTC；

GAPDH101-F：CTGGGCTACACTGAGCACC；

GAPDH101-R：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG。

qPCR程序设置如表3所示：

表3qPCR程序

根据每组的Ct值，按公式2^-ΔΔct计算相对表达量。

(4)流式细胞仪检测

将上述培养72h的各组T细胞收集：每孔细胞和上清收集于1.5mL EP管中，于300g离心12min后去上清。重复洗涤一次，去上清后加入500μL PBS重悬，并用枪头吹散成单细胞悬液，置于冰上待上流式检测。

(5)萤火虫荧光素酶活性检测

将上述培养96h的各组T细胞转移至荧光素酶检测用96孔板，等体积加入室温的Bright-Lumi^TMII萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂(碧云天RG052)，室温孵育5分钟。使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。

AAV衣壳蛋白突变体病毒a～k对静息T细胞感染的结果发现，各衣壳蛋白突变体病毒在感染后72h较rAAV6对照病毒具有更高的eGFP荧光表达强度。其中，以衣壳蛋白突变体病毒j较rAAV6对照病毒差异最为明显(图1至图5)。流式细胞仪分析显示，与rAAV6对照病毒相比，衣壳蛋白突变体病毒a～k均具有更强的静息T细胞感染能力。AAV衣壳蛋白突变体a-k感染T细胞后，表达eGFP荧光的细胞占总细胞百分比较对照rAAV6病毒有2.65至11.8倍的提升(图2和图3)。较rAAV6对照病毒而言，感染AAV衣壳蛋白突变体a～k的T细胞内eGFP平均荧光强度有1.4至12.1倍的提升(图3)。RT-qPCR研究显示，在相同MOI下，衣壳蛋白突变体病毒a～k较rAAV6对照病毒有5.4至19倍目标基因mRNA表达量的提升(图4)。值得一提的是，衣壳蛋白突变体病毒j和k在MOI：1E4条件下实现接近或超越对照病毒rAAV6在MOI：1E5条件下对静息T细胞的感染。衣壳蛋白突变体j的表现尤为优异，在MOI：1E4条件下感染静息T细胞时，表达eGFP绿色荧光细胞比例及eGFP平均荧光强度达到对照rAAV6病毒在MOI：1E5条件下感染静息T细胞的约两倍。实现在降低10倍感染低度条件下，依然有更强的目标基因表达强度。

其次，采用对感染后T细胞裂解液荧光素酶活性检测发现，衣壳蛋白突变体病毒a～k在感染后96h，与rAAV6对照病毒相比，均在T细胞中具有更高的荧光素酶活性(图5)。说明本发明的AAV衣壳蛋白突变体对静息T细胞具有更好的感染效果。

本发明筛选所得的AAV衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体靶向静息T细胞的效率高，具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。比起现有技术中使用刺激因子激活后(48h)感染，感染静息T细胞可以实现当天收集细胞当天感染，当天回输的优点，极大降低了制备成本。且感染未经激活的T细胞减少了体外培养的繁琐操作和处理时间，可极大减少对T细胞活性的影响。相较于慢病毒载体具有基因组整合致癌风险、且感染未激活T细胞的效率相较低的缺点，本发明筛选所得的AAV衣壳蛋白突变体无需整合基因组、大幅提升对静息T细胞的感染力，可实现快速感染和回输，减少不必要的质检和体外停留时间。总之，使用本发明筛选所得的AAV衣壳蛋白突变体感染静息T细胞具有巨大的临床价值和商业应用场景。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种AAV6衣壳蛋白突变体，其特征在于，包括异源肽；所述异源肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.11任一序列所示；所述异源肽的插入位点位于AAV衣壳蛋白氨基酸588和589之间。

2.根据权利要求1所述的AAV6衣壳蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.23～SEQ ID No.33任一序列所示。

3.一种编码AAV6衣壳蛋白突变体的核酸，其特征在于，包括异源肽；所述异源肽的核苷酸序列如SEQ ID No.12～SEQ ID No.22任一序列所示。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.34～SEQ IDNo.44任一序列所示。

5.一种重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的AAV6衣壳蛋白突变体。

6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒，其特征在于，还包括异源目的基因；所述异源目的基因编码干扰RNA、适配体、内切核酸酶、指导RNA中任一种基因产物。

7.权利要求1或2所述的AAV6衣壳蛋白突变体、权利要求5或6所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞的药物或制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。优选的，所述细胞为免疫细胞。所述免疫治疗包括CAR-T。

8.权利要求1或2所述的AAV6衣壳蛋白突变体、权利要求5或6所述的重组腺相关病毒在感染静息T细胞中的应用。

9.一种高产AAV6衣壳蛋白突变体病毒库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建AAV6骨架载体；所述AAV6骨架载体包含CAG启动子、Intron、突变的AAV6 CAP序列和polyA；所述突变的AAV6 CAP序列包括去除AAV6CAP序列的T589后序列和N583的T与polyA前段的序列构成后续用于酶切骨架的位点；

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述引物为：

CGGTTTATTGATTAACAATCGATTACAGGGGACGGGTGAGGTAAC。