CN117660533A - 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒及应用。本发明降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒包括骨架质粒和重组序列；所述重组序列包括：Rep蛋白编码序列、Cap蛋白编码序列和至少一个启动子序列。本发明的包装质粒可显著降低rcAAV的残留，可以提高AAV产品的纯度，降低产品接受者的治疗风险。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒及应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)具有许多优点，使其成为备受青睐的基因治疗递送载体。首先，AAV的复制需要辅助病毒的参与，因此被认为是无病原性的。其次，AAV进入细胞后，其由ITR结构包裹的基因组能够环化形成游离体的结构，降低其与基因组重组的概率进而降低基因组毒性。此外，AAV有12种不同的血清型及上百种由此衍生的变体，大大扩大了它的应用范围。
辅助病毒依赖性复制型腺相关病毒(rcAAV)，也称为“野生型”或“伪野生型”AAV，它是由AAV衣壳颗粒包裹两侧含有ITR的rep和cap基因组，它能够在辅助病毒的存在下进行复制。重组腺相关病毒(rAAV)生产过程中rcAAV的产生被认为是由于目的基因载体表达盒里的ITR序列与包装辅助质粒上的rep和cap基因序列发生同源或非同源重组事件产生的。尽管野生型AAV无法自主复制，需要与辅助病毒(如腺病毒)共同感染，但rcAAV中Rep或Cap蛋白的表达增加了rAAV载体转导组织中免疫毒性的风险。
复制型腺相关病毒(rcAAV)与重组腺相关病毒(rAAV)载体非常相似，不能通过纯化工艺步骤来分离。因此，需要尽可能降低rAAV生产过程中rcAAV的形成。已有研究表明，通过删除AAV包装载体上的同源序列或者替换与重组事件有关的p5启动子区域可以降低rcAAV的产生，然而在大规模质粒转染生产rAAV中仍能明显检测到rcAAV的存在。此外，通过将辅助质粒上的Rep和Cap拆分成两个方向相反的表达盒，在辅助质粒Cap末端加上microRNA结合盒以及将辅助基因Rep和Cap限制在细胞质中的方法也被提出用于降低rcAAV的产生。rcAAV可能通过尚未完全了解的机制促进免疫毒性，在为临床试验性产品开发准备的rAAV载体中，将rcAAV降低到可达到的最低水平显得尤其重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种降低重组腺相关病毒(rAAV)中复制型腺相关病毒(rcAAV)残留的包装质粒及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种降低重组腺相关病毒中复制型腺相关病毒残留的包装质粒，包括骨架质粒和重组序列；所述重组序列包括：
Rep蛋白编码序列、Cap蛋白编码序列和至少一个启动子序列。
本发明的包装质粒可显著降低rcAAV的残留。可用于降低rcAAV残留的AAV生产系统，可以提高AAV产品的纯度，降低产品接受者的治疗风险。
作为本发明所述的包装质粒的优选实施方式，所述重组序列还包括至少一个DA’序列。
作为本发明所述的包装质粒的优选实施方式，所述Rep蛋白编码序列位于Cap蛋白编码序列的下游。
作为本发明所述的包装质粒的优选实施方式，所述重组序列从5’至3’方向依次包括以下任意一种：
i、所述DA’序列、所述启动子序列、所述Rep蛋白编码序列、所述Cap蛋白编码序列；
ii、所述Rep蛋白编码序列、所述Cap蛋白编码序列、所述启动子序列；
iii、所述Rep蛋白编码序列、所述Cap蛋白编码序列、所述DA’序列、所述启动子序列。
作为本发明所述的包装质粒的优选实施方式，所述启动子为P5启动子。
作为本发明所述的包装质粒的优选实施方式，所述Rep蛋白编码序列和所述Cap蛋白编码序列来自2型腺相关病毒。
第二方面，本发明提供了一种降低rAAV中rcAAV残留的质粒组，包括上述包装质粒、辅助质粒和AAV质粒。
优选的，所述辅助质粒为pAdHelper。
优选的，所述AAV质粒为CAG启动子驱动的荧光蛋白的AAV质粒pAAV.CAG.EGFP载体。
第三方面，本发明提供了一种低复制型腺相关病毒残留的重组腺相关病毒生产系统，由上述质粒组转化宿主细胞而得。
优选的，所述宿主细胞为HeLa、HEK293或昆虫Sf9细胞。
第四方面，本发明提供了一种降低复制型腺相关病毒残留的重组腺相关病毒生产方法，采用上述AAV生产系统生产。
第五方面，本发明将所述包装质粒、所述的质粒组、所述AAV生产系统在AAV生产中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的包装质粒可显著降低rcAAV的残留。可用于降低rcAAV残留的AAV生产系统，可以提高AAV产品的纯度，降低产品接受者的治疗风险。
附图说明
图1为实施例中研究P5、DA’功能的实验设计示意图。
图2为实施例中质粒骨架的结构元件示意图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：包装质粒pRC的构建
通过设计含有多种DA’序列、P5启动子序列的放置位置的组合，通过常规分子克隆方法基于骨架载体序列构建出不同的候选包装质粒(见图1)，再平行比较各包装载体在通用的三质粒转染体系中rcAAV的残留情况。
其中，质粒骨架(如图2所示)序列如SEQ ID NO：1所示；P5启动子序列如SEQ IDNO：2所示；DA’序列如SEQ ID NO：3所示；Rep来自2型腺相关病毒，其序列如SEQ ID NO:4所示；Cap来自2型腺相关病毒，其序列如SEQ ID NO:5所示。
质粒构建步骤具体如下：
(1)以含有RepCap基因质粒为模板，分别扩增RepCap基因序列、DA’序列以及P5启动子序列。
PCR反应体系如表1所示：
表1PCR反应体系
质粒A使用的引物如下所示：
正向引物1：ccccctcgatcgaggtcgacggtatcgggggagctaggtcctgtattagaggtcacgtg；反向引物1：caatctcgtaaaaccccggcatggcggctgcgcgttcaaacc；
正向引物2：cggggttttacgagattgtga；
反向引物2：accatcggcagccatacctgatttaaatcatttattgttcaaagatg；
正向引物3：atggctgccgatggttatc；
反向引物3：gaaacgaatcaaccggtttattgattaacaggcaa；
正向引物4：accggttgattcgtttcagt；
反向引物4：agctcccccgataccgtc。
质粒B使用的引物如下所示：
正向引物1：ccggtaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgc；
反向引物1：aaacggactagtccgctctagagcctcagtgagcg；
正向引物2：ccccccctcgatcgaggtcgacggtatcgggggagctaggaacccctagtgatggagtt；反向引物2：caatctcgtaaaaccccggcatggcggctgcgcgttcaaacc；
正向引物3：tgccggggttttacgagatt；
反向引物3：gttcaactgaaacgaatcaaccg；
正向引物4：accggttgattcgtttcagt；
反向引物4：agctcccccgataccgtc。
质粒C使用的引物如下所示：
正向引物1：ccccctcgatcgaggtcgacggtatcgggggagctatgccggggttttacgagattg；
反向引物1：aaacgaattcgcccttcgca；
正向引物2：Tgcgaagggcgaattcgtttaaacaggtcctgtattagaggtcacgtgag；
反向引物2：cggccgccagtgtgatggatatcggcggctgcgcgttcaaacc；
正向引物3：atccatcacactggcggccg；
反向引物3：agctcccccgataccgtc。
质粒D使用的引物如下所示：
正向引物1：cgatcgaggtcgacggtatc；
反向引物1：aaacgaattcgcccttcgca；
正向引物2：tgcgaagggcgaattcgtttaaacctgcaaggaacccctagtgatggagtt；
反向引物2：cggccgccagtgtgatggatatctgcagaattcggcttggcggctgcgcgttcaaacc；
正向引物3：atccatcacactggcggccg；
反向引物3：agctcccccgataccgtc。
PCR反应条件如表2所示：
表2PCR反应条件
(2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的条带，使用胶回收试剂盒回收目的片段。
(3)使用无缝克隆试剂盒进行多片段连接。
无缝克隆反应体系如表3所示：
表3反应体系
| 反应成分 | 体积(μL) |
| 2×Assembly Mix | 5 |
| Linearized vector | 1 |
| Inserts | n |
| Nuclease-free Water | to 10 |
反应条件为50℃1h。
将反应后的产物转化大肠杆菌，涂于卡那抗性的平板上，隔天挑克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送至广州金唯智公司进行测序，挑选出所需的正确的质粒。
实施例2：三质粒转染生产AAV
(1)铺293T细胞约5E+06至15cm细胞培养皿中，使用高糖DMEM培养基，含10％新生牛血清、1％ Penicillin/Streptomycin，在37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养约48h，转染时细胞密度约为60～70％；
(2)把实施例1构建的包装质粒A-D(pRC)、辅助质粒(pAdHelper)及CAG启动子驱动的荧光蛋白的AAV质粒pAAV.CAG.EGFP载体分别按0.5μg:0.5μg:0.5μg加入0.5mL DMEM培养基中，再加入PEI 3μL(1μg/μL)，涡旋混匀，室温放置10分钟后加到25ml转染培养基中，涡旋混匀。吸去培养基皿中培养基，加入转染混合培养基，再放回37℃细胞培养箱(5％ CO2浓度)培养。
(3)培养72小时后加入25μL细胞裂解液，将细胞和上清收集到离心瓶中。采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1E+12GC/mL～1E+13GC/mL为合适滴度，放置-80℃备用。
实施例3：复制完整型AAV(rcAAV)检测
(1)铺293T细胞约1E+07于T75细胞培养瓶中，使用高糖DMEM培养基，含10％新生牛血清、1％ Penicillin/Streptomycin，在37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养过夜。
(2)用DMEM将供试品(实施例2中包装质粒A-D转染生产的AAV)稀释成1E+11vg/mL，将wtAAV2工作品(ATCC来源的AAV2标准品：ATCC VR-680)稀释成1E+13IU/mL，将Ad5工作品(TCC来源的Ad5标准品：ATCC VR-1516)稀释4倍。
(3)从培养箱中取出细胞，吸去培养基，用PBS润洗一遍，然后加入配制好的工作液，37℃孵育4h。加样体系如表4所示：
表4加样体系
(4)4h后，每瓶加入7mL 2×完全培养基，放入37℃，5％ CO2细胞培养箱中继续培养过夜。然后用完全培养基进行换液，每瓶14mL，继续放入37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养过夜。培养结束后收集细胞到15mL离心管中，3000g离心3min，吸去上清，各加入1mL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，-80℃冻存2h，37℃融解10min。重复冻融一次后于56℃水浴60min灭活病毒。10000g离心5min收集全部灭活上清液于1.5mL离心管中，作为第二轮感染样品。
(5)铺293T细胞约1E+07于T75细胞培养瓶中，使用高糖DMEM培养基，含10％新生牛血清、1％ Penicillin/Streptomycin，在37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养过夜。
(6)从培养箱中取出细胞，吸去培养基，用PBS润洗一遍，然后加入配制好的工作液，37℃孵育4h。加样体系如表5所示：
表5加样体系
| 组别 | DMEM(mL) | Ad5工作品(μL) | 灭活上清液 |
| 空白对照 | 6 | 4 | 全部灭活上清 |
| 供试品 | 6 | 4 | 全部灭活上清 |
| 参比对照 | 6 | 4 | 全部灭活上清 |
| 阳性对照 | 6 | 4 | 全部灭活上清 |
(7)4h后，每瓶加入7mL 2×完全培养基，放入37℃，5％ CO2细胞培养箱中继续培养44h。
培养结束后收集细胞到15mL离心管中，3000g离心3min，吸去上清，各加入2mL PBS重悬细胞，均分至2管1.5mL离心管中，3000g离心3min，吸去上清，收获细胞沉淀。
(8)抽提细胞DNA，用Nanodrop测定DNA浓度。
(9)荧光定量PCR检测各组样品，配制11+6n个反应体系，n为待检样品数量，分装15μl反应液于PCR管中，每管加入5μL反应模板，分别为空白对照DNA、供试品DNA、参比对照DNA、阳性对照DNA和H2O(NTC)，各3个孔，反应液体系如下表6所示：
表6反应液体系
10)加样完毕，盖上配对的盖子，轻微震荡混匀，快速离心10s后放入荧光定量PCR仪中。报告荧光基团为FAM，探针为REP。设置反应的程序如下表7所示：
表7反应液体系
rcAAV检测结果如表8所示：
表8检测结果
以上检测的各种质粒包装纯化后的病毒中rcAAV残留情况比较结果表明，与P5启动子在Rep2之前相比，在P5启动子前面增加DA’序列可以降低rcAAV的残留。与P5启动子在Rep2之前相比，将P5启动子序列放置在Rep2Cap2后面可以降低rcAAV的残留。
实施例中采用了具体血清型(Rep2Cap2)的包装质粒，本领域技术人员应理解的是，本发明并不限于该具体血清型，而是可利用目前已知和未来可能继续发现的其他血清型包装质粒来实施本发明。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种降低重组腺相关病毒中复制型腺相关病毒残留的包装质粒，其特征在于，包括骨架质粒和重组序列；所述重组序列包括：
Rep蛋白编码序列、Cap蛋白编码序列和至少一个启动子序列。
2.根据权利要求1所述的包装质粒，其特征在于，所述重组序列还包括至少一个DA’序列。
3.根据权利要求1所述的包装质粒，其特征在于，所述Rep蛋白编码序列位于Cap蛋白编码序列的下游。
4.根据权利要求1所述的包装质粒，其特征在于，所述重组序列从5’至3’方向依次包括以下任意一种：
i、所述DA’序列、所述启动子序列、所述Rep蛋白编码序列、所述Cap蛋白编码序列；
ii、所述Rep蛋白编码序列、所述Cap蛋白编码序列、所述启动子序列；
iii、所述Rep蛋白编码序列、所述Cap蛋白编码序列、所述DA’序列、所述启动子序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的包装质粒，其特征在于，所述启动子为P5启动子。
6.根据权利要求1-4任一项所述的包装质粒，其特征在于，所述Rep蛋白编码序列和所述Cap蛋白编码序列来自2型腺相关病毒。
7.一种降低重组腺相关病毒中复制型腺相关病毒残留的质粒组，其特征在于，包括辅助质粒、权利要求1-6任一项所述的包装质粒和AAV质粒。
8.一种低复制型腺相关病毒残留的重组腺相关病毒生产系统，其特征在于，由权利要求7所述质粒组转化宿主细胞而得。
9.一种降低复制型腺相关病毒残留的重组腺相关病毒生产方法，其特征在于，采用权利要求8所述AAV生产系统生产。
10.权利要求1-6任一项所述包装质粒、权利要求7所述的质粒组、权利要求8所述的生产系统在重组腺相关病毒生产中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202311709067.8A CN117660533A (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒及应用 |
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