CN117660534B - 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞DNA残留的辅助质粒及应用。本发明降低rAAV中宿主细胞DNA残留的辅助质粒包括骨架质粒和重组序列；所述重组序列包括：Rep、Cap蛋白编码序列，E2A、E4、VA RNA序列和至少一个启动子序列。本发明降低rAAV中宿主细胞DNA残留的辅助质粒，可用于降低宿主细胞DNA残留的AAV生产系统，能够显著降低AAV生产中宿主细胞DNA残留，一方面可以提高AAV产品的纯度，降低产品接受者的治疗风险，另一方面也有利于简化AAV下游纯化过程，降低AAV生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞DNA残留的辅助质粒及应用。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)因其具有长期表达基因，广谱的趋向性，低免疫原性，无病原性，不整合基因组等优势使其成为备受青睐的基因治疗递送载体。rAAV包含一个单链基因组，包裹在由三种不同蛋白VP1、VP2和VP3组成的二十面体衣壳中。基于不同的宿主细胞系，如人HeLa、HEK293或昆虫Sf9细胞，已经建立了多个rAAV生产平台。在宿主细胞内，衣壳蛋白被表达，病毒基因组被复制并包装到新组装的衣壳中，从而产生rAAV颗粒。
然而，病毒DNA的包装并不是一个防错的过程，已有研究表明，一些非目的基因DNA，包括来自包装质粒的含有抗生素基因的DNA片段，来自包装质粒的野生型AAV含有的DNA片段和宿主细胞基因组DNA等，可能会被包裹进AAV。将额外的DNA序列传递给患者是AAV临床应用面临的一个主要的安全问题。AAV宿主细胞DNA残留是指AAV包装过程中AAV衣壳颗粒随机包裹了宿主细胞的DNA片段。由于复杂的开发过程，细胞和基因疗法有许多潜在的污染源，必须在这些产品进入市场的过程中仔细监测。特别是，宿主细胞DNA污染没有被正确检测和过滤，可能会给接受治疗的患者带来可怕的后果。宿主细胞DNA进入病人体内，就有可能引发不良反应，比如免疫反应或炎症反应。如果使用Hela细胞系生产rAAV，潜在的致癌DNA序列进入病人体内，存在致癌DNA转移的风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞DNA残留的辅助质粒及应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种降低rAAV中宿主细胞DNA残留的辅助质粒，包括骨架质粒和重组序列；所述重组序列包括：
Rep、Cap蛋白编码序列，E2A、E4、VA RNA序列和至少一个启动子序列。
本发明降低rAAV中宿主细胞DNA残留的辅助质粒，可用于降低宿主细胞DNA残留的AAV生产系统，能够显著降低AAV生产中宿主细胞DNA残留，一方面可以提高AAV产品的纯度，降低产品接受者的治疗风险，另一方面也有利于简化AAV下游纯化过程，降低AAV生产成本。
作为本发明所述的辅助质粒的优选实施方式，所述重组序列还包括至少一个DA’序列。
进一步的，所述DA’序列位于所述Rep、Cap蛋白编码序列的下游。
作为本发明所述的辅助质粒的优选实施方式，所述启动子序列位于所述Rep、Cap蛋白编码序列的下游。
进一步的，所述E2A、E4、VA RNA序列位于所述启动子序列的下游。
作为本发明所述的辅助质粒的优选实施方式，所述E2A、E4、VA RNA序列位于所述Rep、Cap蛋白编码序列的下游。
作为本发明所述的辅助质粒的优选实施方式，所述重组序列从5’至3’方向依次包括以下任意一种：
i、所述Rep、Cap蛋白编码序列，所述E2A、E4、VA RNA序列，所述启动子序列；
ii、所述Rep、Cap蛋白编码序列，所述E2A、E4、VA RNA序列，所述DA’序列，所述启动子序列；
iii、所述Rep、Cap蛋白编码序列，所述DA’序列，所述E2A、E4、VA RNA序列，所述启动子序列；
iv、所述Rep、Cap蛋白编码序列，所述启动子序列，所述E2A、E4、VA RNA序列；
v、所述Rep、Cap蛋白编码序列，所述DA’序列，所述启动子序列，所述E2A、E4、VARNA序列；
vi、所述Rep、Cap蛋白编码序列，所述启动子序列，所述E2A、E4、VA RNA序列，所述DA’序列。
作为本发明所述的辅助质粒的优选实施方式，所述启动子为P5启动子。
作为本发明所述的辅助质粒的优选实施方式，所述Rep来自2型腺相关病毒，所述Cap来自9型腺相关病毒。
第二方面，本发明提供了一种低宿主细胞DNA残留的AAV生产系统，由上述的辅助质粒转化宿主细胞而得。
优选的，所述宿主细胞为HeLa、HEK293或昆虫Sf9细胞。
第三方面，本发明将所述的辅助质粒、所述的AAV生产系统在AAV生产中应用。能够显著降低降低宿主细胞DNA残留。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明降低rAAV中宿主细胞DNA残留的辅助质粒，可用于降低宿主细胞DNA残留的AAV生产系统，能够显著降低AAV生产中宿主细胞DNA残留。一方面可以提高AAV产品的纯度，降低产品接受者的治疗风险，另一方面也有利于简化AAV下游纯化过程，降低AAV生产成本。
附图说明
图1为实施例中研究P5、DA’功能的实验设计示意图；
图2为实施例中质粒骨架的结构元件示意图；
图3为实施例中检测的各组质粒包装的纯化后的AAV中宿主细胞DNA残留量。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：辅助质粒的构建
通过设计含有多种DA’、P5启动子、Rep、Cap、E2A、E4、VA RNA的放置位置的组合，通过常规分子克隆方法基于骨架载体构建出不同的候选辅助质粒(图1)，再平行比较各辅助载体生产的AAV中宿主细胞DNA的残留情况。
其中，质粒骨架(如图2所示)序列如SEQ ID NO：1所示；P5启动子序列如SEQ IDNO：2所示；DA’序列如SEQ ID NO：3所示；Rep来自2型腺相关病毒，其序列如SEQ ID NO：4所示；Cap来自9型腺相关病毒，其序列为如SEQ ID NO：5所示；E2A、E4、VA RNA来自腺病毒，E2A序列如SEQ ID NO：6所示，E4序列如SEQ ID NO：7所示，VA RNA序列如SEQ ID NO：8所示。
图1中辅助质粒A至G的构建过程为：
1)以含有RepCap基因质粒为模板，分别扩增RepCap基因序列、DA’序列、P5序列以及含E2A/E4/VA RNA基因序列。
PCR反应体系如表1所示：
表1PCR反应体系
质粒A使用的引物序列如下所示：
正向引物1：ATGGCTGCCGATGGTTATC；
反向引物1：acgtaatccgtagatgtacctgg；
正向引物2：aggtacatctacggattacgtAAGCCGAATTCTGCAGATATCC；
反向引物2：gtgacctctaatacaggacctAGCTCCCCCGATACCGTC；
正向引物3：aggtcctgtattagaggtcacg；
反向引物3：ACCATCGGCAGCCATacctgatttaaatcatttattgttcaaagatg。
质粒B使用的引物序列如下所示：
正向引物1：aggtacatctacggattacgtTGCAGGACTAGAGGTCCTG；
反向引物1：AGCTCCCCCGATACCGTC；
正向引物2：CGATCGAGGTCGACGGTATC；
反向引物2：acgtaatccgtagatgtacctgg。
质粒C使用的引物序列如下所示：
正向引物1：CCCCCTCGATCGAGGATGCCGGGGTTTTACGAGAT；
反向引物1：CCTCCCACCAGATCACCATC；
正向引物2：aggtacatctacggattacgtACCTGCAAGGAACCCCTAGT；
反向引物2：gagttgggtaccggatccGTTCAACTGAAACGAATCAACCG；
正向引物3：ggatccggtacccaactcca；
反向引物3：acgtaatccgtagatgtacctgg。
质粒D使用的引物序列如下所示：
正向引物1：aggtacatctacggattacgtGCAGGACTAGAGGTCCTGTATTAG；反向引物1：gagttgggtaccggatccGCCTCAGTGAGCGAGC；
正向引物2：ggatccggtacccaactcca；
反向引物2：acgtaatccgtagatgtacctgg。
质粒E使用的引物序列如下所示：
正向引物1：
CGAAGGGCGAATTCGTTTGCAGGACTAGAGGTCCTGTATTAG；
反向引物1：gggtaaataatcacccgagagt；
正向引物2：aggtacatctacggattacgtTTCCAGTCGGGAAACCTGTC；
反向引物2：gagttgggtaccggatccACTTTATGCTTCCGGCTCGT；
正向引物3：ggatccggtacccaactcca；
反向引物3：acgtaatccgtagatgtacctgg。
质粒F使用的引物序列如下所示：
正向引物1：aggtacatctacggattacgtTTCCAGTCGGGAAACCTGTC；
反向引物1：gagttgggtaccggatccACTTTATGCTTCCGGCTCGT；
正向引物2：ggatccggtacccaactcca；
反向引物2：acgtaatccgtagatgtacctgg。
质粒G使用的引物序列如下所示：
正向引物1：ggatccggtacccaactcca；
反向引物1：GTCCTGCAGCCTCAGTGA；
正向引物2：ACTGAGGCTGCAGGACGTGGAGCTCCAGCTTTTGTT；反向引物2：GTTCAACTGAAACGAATCAACCG；
正向引物3：
CGGTTGATTCGTTTCAGTTGAACTGCAGGACTAGAGGTCCTG；
反向引物3：gagttgggtaccggatccGGATATCTGCAGAATTCGGCTT。
PCR反应条件如表2所示：
表2PCR反应条件
(2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的条带，使用胶回收试剂盒回收目的片段。
(3)使用无缝克隆试剂盒进行多片段连接。
无缝克隆反应体系如表3所示：
表3反应体系
| 反应成分 | 体积(μL) |
| 2×Assembly Mix | 5 |
| Linearized vector | 1 |
| Inserts | n |
| Nuclease-free Water | to 10 |
反应条件为50℃1h。
将反应后的产物转化大肠杆菌，涂于卡那抗性的平板上，隔天挑克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送至广州金唯智公司进行测序，挑选出所需的正确的质粒。实施例2：病毒的包装和纯化
(1)铺293T细胞约5E+06至15cm皿中，使用高糖DMEM培养基，含10％新生牛血清、1％ Penicillin/Streptomycin，在37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养约48h，转染时细胞密度约为60～70％；
(2)把实施例1构建好的辅助质粒A至G及CAG启动子驱动的荧光蛋白基因的AAV质粒pAAV.CAG.EGFP载体1μg:0.5μg加入0.75mL DMEM中，再加入PEI(1μg/μL)，涡旋混匀，室温放置10分钟后加到25mL转染培养基中，涡旋混匀。吸去15cm皿中培养基，加入转染混合培养基，再放回37℃细胞培养箱(5％ CO2浓度)培养。
(3)培养72小时后加入25μL细胞裂解液，将细胞和上清收集到离心瓶中。采用碘克沙醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1E+12GC/mL-1E+13GC/mL为合适滴度，放置-80℃备用。
实施例3：宿主细胞的DNA残留检测
使用宿主细胞DNA残留检测试剂盒(PGA0010，购自广州派真生物技术有限公司)检测实施例2纯化的各个AAV样品中宿主细胞DNA的残留。
具体如下：
(1)样品及标准品制备
取5μL待测样品，稀释10倍。将稀释后的待测样品与HCD裂解液以1：1比例混匀，作为检测模板。将用于制作标准曲线的HEK293 DNA定量参考品用TE稀释液进行梯度稀释，浓度分别为3000pg/μL、300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、0.3pg/μL和0.03pg/μL。
(2)荧光定量PCR体系配制
取相应数目的qPCR管，每管分20μL反应液，分别加入10μL稀释后样品、10μL不同浓度的用于制作标准曲线的HEK293 DNA定量参考品、10μL无模板对照(NTC)TE稀释液，加样完毕，盖上配对的透明盖子，轻轻振荡混匀，快速离心10s。
反应体系成分如表1。
表1反应体系
按每个样品做3个重复孔计算，配制相应体积的反应液，每孔分20μL，再各自加入10μL样品。
(3)荧光定量PCR条件
预变性：95℃10min
循环：40cycle:95℃15sec；60℃1min。
实施例2中各个宿主细胞DNA残留(HCD)检测结果如图3所示。结果表明，与P5启动子在Rep2之前的“P5+RC+Helper”辅助质粒相比，将P5启动子放在RC+Helper后面的“RC+Helper+P5”辅助载体能降低宿主细胞DNA残留至原来的50％，在此基础上增加DA’序列的“RC+Helper+DA’+P5”和“RC+DA’+Helper+P5”辅助载体分别能降低宿主细胞DNA残留至原来的30％和38％。将P5启动子放在RC和Helper中间的“RC+P5+Helper”辅助载体能降低宿主细胞DNA残留至原来的38％，在此基础上增加DA’序列的“RC+DA’+P5+Helper”和“RC+P5+Helper+DA’”的辅助载体分别降低宿主细胞DNA残留至原来的32％和36％。以上结果表明，P5启动子在Rep2Cap9之后的辅助质粒具有降低宿主细胞DNA残留的作用。在加入DA’序列的情况下，宿主细胞DNA残留进一步降低。
实施例中采用了具体血清型(Rep2Cap9)的辅助质粒，本领域技术人员应理解的是，本发明并不限于此两类具体血清型，而是可利用目前已知和未来可能继续发现的其他血清型辅助质粒来实施本发明。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞DNA残留的辅助质粒，其特征在于，包括骨架质粒和重组序列；
所述重组序列从5’至3’方向依次包括以下任意一种：
i、Rep、Cap蛋白编码序列，E2A、E4、VA RNA序列，启动子序列；
ii、Rep、Cap蛋白编码序列，E2A、E4、VA RNA序列，DA’序列，启动子序列；
iii、Rep、Cap蛋白编码序列，DA’序列，E2A、E4、VA RNA序列，启动子序列；
iv、Rep、Cap蛋白编码序列，启动子序列，E2A、E4、VA RNA序列；
v、Rep、Cap蛋白编码序列，DA’序列，启动子序列，E2A、E4、VA RNA序列；
vi、Rep、Cap蛋白编码序列，启动子序列，E2A、E4、VA RNA序列，DA’序列；
所述启动子序列如SEQ ID NO：2所示；
所述DA’序列如SEQ ID NO：3所示；
所述Rep、Cap蛋白编码序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
所述E2A、E4、VA RNA序列依次如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。
2.根据权利要求1所述的辅助质粒，其特征在于，所述启动子为P5启动子；所述Rep来自2型腺相关病毒，所述Cap来自9型腺相关病毒。
3.一种低宿主细胞DNA残留的AAV生产系统，其特征在于，由权利要求1或2所述辅助质粒转化宿主细胞而得。
4.权利要求1或2所述辅助质粒、权利要求3所述AAV生产系统在AAV生产中的应用。
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