CN117431345A - 用于检测AAV基因组滴度的qPCR引物探针组、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于AAV基因组滴度qPCR检测的引物探针组、试剂盒和方法，所述引物探针组包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2所示的反向引物和SEQ ID NO.3所示的探针；或包括序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物、SEQ ID NO.5所示的反向引物和SEQ ID NO.6所示的探针。本发明通过对ITR序列的C‑A’‑D靶位点和CMV启动子设计了两类特异性引物探针组，并对反应体系进行了优化，对AAV基因组滴度进行检测时，无需进行前处理操作，操作简单、特异性强、精密度高、准确率高、耐用性佳、通用性强，检测浓度范围宽，可用于AAV基因治疗药物研发和生产过程基因组滴度的测定，具有应用前景广阔。

Description

用于检测AAV基因组滴度的qPCR引物探针组、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于检测AAV基因组滴度的qPCR引物探针组、试剂盒和方法。

背景技术

基因治疗是通过载体将靶基因递送至患者体内，以治疗由于基因缺陷引起的疾病。腺相关病毒(AAV)是目前基因治疗领域常用的递送载体之一，具有宿主细胞范围广、低免疫原性、表达稳定等优势。截止到2022年6月，全球已进行200多项利用AAV为载体的基因治疗研究，70余项临床试验仍在进行，其中主要涉及血液病，神经系统疾病和视网膜相关疾病。

在AAV药物的质量控制中基因组滴度的准确测定是至关重要的。稳定可靠的滴度才能保证准确的给药剂量，更好的开展临床前研究和临床研究，指导临床用药。重组AAV(rAAV)基因组的两端是两个T形反向末端重复序列(ITR)，主要用作病毒复制起点和包装信号。目前AAV载体的ITR序列来源基本都是AAV2，不同的血清型则与AAV-ITR2搭配，产生重组rAAV。

目前，AAV基因组滴度测定的主要方法有点杂交法(Dot-blot)和PCR法等。其中，点杂交法的原理是将AAV基因组DNA吸附结合到膜上，使之与标记的特异性探针杂交，然后通过荧光或显色的方式来定量AAV基因组滴度。该方法早期应用较为广泛，但由于其操作繁琐，试剂昂贵，重复性差，检测通量低，目前已经较少采用此方法。PCR法是目前AAV基因组滴度检测最常用的方法，该方法操作简单、重复性好、检测通量高、成本低，是目前检测AAV基因组滴度最广泛的方法。针对ITR2以及在重组真核表达中最常用的CMV启动子设计的qPCR检测方法可以快速、准确地得到rAAV2的基因组滴度，由于该方法可以广泛适用，因此对推动AAV滴度检测的标准化有重要意义。然而，目前的qPCR检测AAV基因组滴度的方法，针对ITR2设计的引物，会因为ITR2二级结构构象和非保守区域的影响，而导致定量检测结果偏高；且通常是先对模板基因组进行SmaI酶切前处理，再用ITR引物探针进行检测，操作复杂。

因此，提供一种特异性好并且准确可靠、简单的AAV基因组滴度检测方法，非常有意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种用于检测AAV基因组滴度的qPCR引物探针组、试剂盒和方法。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种用于AAV基因组滴度qPCR检测的引物探针组，包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2所示的反向引物和SEQ ID NO.3所示的探针；或包括序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物、SEQ ID NO.5所示的反向引物和SEQ IDNO.6所示的探针。

本发明的第二方面，提供了一种用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，包括上述引物探针组。

本发明的第三方面，提供了一种AAV基因组滴度qPCR检测方法，包括以下步骤：使用上述用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，对待测样本的DNA进行实时荧光定量PCR扩增。

本发明通过对ITR序列的C-A’-D靶位点和CMV启动子设计了两类特异性引物探针组，并对反应体系进行了优化，对AAV基因组滴度进行检测时，无需进行前处理操作，操作简单、特异性强、精密度高、准确率高、耐用性佳、通用性强，检测浓度范围宽，可用于AAV基因治疗药物研发和生产过程基因组滴度的测定，具有应用前景广阔。

附图说明

图1为ITR二级结构的示意图。

图2为本发明实施例1中使用组合1的引物探针的扩增曲线图。

图3为本发明实施例1中使用组合2的引物探针的扩增曲线图。

图4为本发明实施例1中使用组合3的引物探针的扩增曲线图。

图5为本发明实施例1中使用组合4的引物探针的扩增曲线图。

图6为本发明实施例3中使用组合1的引物探针检测AAV2、E.coli和phelper质粒DNA的扩增曲线图。

图7为本发明实施例3中使用组合2的引物探针检测AAV2、E.coli和phelper质粒DNA的扩增曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

AAV基因组一般由ITR、Promoter、Transgene和PloyA等元件构成，其中，ITR二级结构示意图如图1所示，在ITR二级结构中，由三段回文结构组成T型空间结构，其中B-B'和C-C'构成两个回文臂，A-A'构成和一个长茎回文臂。D序列在AAV基因组的每一端只出现一次，在DNA的复制过程中具有非常重要的作用。CMV启动子/增强子作为哺乳动物组成型启动子，由上游的增强子和下游的启动子构成，被广泛应用于构建高效真核表达载体，用于基因工程、基因治疗和DNA免疫，对启动子区域序列分析发现这一区域有着相间的保守序列。为了克服引物探针结合受到二级结构的影响，本发明创造性地选择在ITR序列的C-A’-D靶位点和CMV启动子/增强子区域进行引物探针的设计，并在这两个靶位点各筛选获得了一组效果最好的引物探针。

更进一步地，本发明的发明人在对qPCR检测体系进行优化时，发现当引物终浓度由0.5μM降低至0.2μM，探针比例减半时，引物探针组的非特异性扩增会显著降低。另外，将模板加入量由2μL提高至5μL，可以有效提高扩增效率，并减少加样误差。

使用优化的引物探针组，采用优化的反应体系，对AAV基因组滴度进行检测，可以解决AAV的qPCR定量检测中使用ITR引物探针因为二级结构构象和非保守区域导致定量结果偏高的问题，特异性强、精密度高、准确率高、耐用性佳，检测浓度范围宽(1.00E+02copies/μL至1.00E+07copies/μL)。本发明的方法可用于AAV基因治疗药物研发和生产过程基因组滴度的测定，可以检测包含不同转基因的rAAV病毒样品，通用性强，应用前景广阔。

在本发明的其中一些实施例中，公开了一种用于AAV基因组滴度qPCR检测的引物探针组，包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2所示的反向引物和SEQ IDNO.3所示的探针；或包括序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物、SEQ ID NO.5所示的反向引物和SEQ ID NO.6所示的探针。优选包括序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物、SEQ ID NO.5所示的反向引物和SEQ ID NO.6所示的探针。

在其中一些实施例中，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

在其中一些实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red，所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、DABCYL、LowaBlackTMRQ或LowaBlack TMFQ。

在其中一些实施例中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，包括上述引物探针组。

在其中一些实施例中，所述引物探针组中，所述正向引物和反向引物的工作浓度均为0.2±0.02μM，所述探针的工作浓度为0.1±0.02μM；作为优选的，所述正向引物和反向引物的工作浓度均为0.2μM，所述探针的工作浓度为0.1μM。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括PCR预混液(也称为Mix)，所述PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTP、镁离子和缓冲溶液。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种AAV基因组滴度qPCR检测方法，包括以下步骤：使用上述用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，对待测样本的DNA进行实时荧光定量PCR扩增。

在其中一些实施例中，还包括步骤：使用上述用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，对AAV定量标准品进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准曲线。根据标准曲线可以计算得到待测样本中AAV基因组滴度。

在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应体系的总体积为20μL，所述反应体系中正向引物和反向引物的终浓度均为0.2±0.02μM，探针终浓度为0.1±0.01μM，模板量为5±0.5μL。

在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应体系为：qPCR预混液10μL、10μM正向引物0.4μL、10μM反向引物0.4μL、10μM探针0.2μL、模板5μL。

在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃下变性10s，60℃下退火延伸30s，40个循环。

除非另有说明，本发明实施例中列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'(从左至右)。本发明中提供的核苷酸和氨基酸采用IUPAC-IUB生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。

在发明中，标准曲线的横坐标(X轴)为起始模板浓度(log10)、纵坐标(Y轴)为CT值，并且扩增效率的计算公式为：E(％)＝(10-1/a-1)×100％。

在以下实施例中，2×TaqMan Fast qPCR预混液(低ROX)购自生工生物，货号为B639275-0005，实时荧光定量PCR仪型号为ABI7500 FAST。标准品质粒由生工生物合成，并经限制性核酸酶单酶切后纯化回收，通过琼脂糖凝胶电泳及数字PCR进行标准品鉴定。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1AAV基因组滴度qPCR检测引物、探针的设计和筛选

针对ITR序列的C-A’-D靶位点和CMV启动子/增强子区域设计了四组引物探针组合。在引物和探针的设计过程中，尽量选取发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成等情况较少的引物探针片段。然后将所设计的引物探针序列在NCBI Blast在线数据库上进行比对分析，尽量避免非特异结合和扩增。生工生物合成引物和探针。

表1中列出了各个引物探针组合的具体信息。其中组合1、组合3为ITR特异性引物探针，组合2、4为目的基因特异性引物探针，各个探针的5'端用荧光报告基团6-FAM进行标记，3'端用荧光淬灭基团TAMRA-N进行标记。

表1

采用表2扩增体系、表3扩增程序，进行实时荧光定量PCR扩增，对比这4组引物探针组合的扩增效率，其中表2中的标准品为含有目的基因序列的线性化质粒(标准品浓度范围为2.00E+06copies/μL至2.00E+02copies/μL，10倍梯度稀释共5个点，STD1-STD5)。

表2

表3

扩增结果如表4所示，扩增曲线如图2～图5所示。

表4

从表4及图2～5结果可知，4种组合的引物探针R²均大于0.990，线性良好；组合1和组合2的引物探针扩增效率超过80％，效果最佳，组合3和组合4的引物探针扩增效率低于70％，效果不佳。本发明的后续实施例中采用组合1和组合2的引物探针进行。

实施例2AAV基因组滴度qPCR检测体系的优化

为了确定引物探针的检测体系，降低引物探针的非特异性扩增，提高扩增效率，本实施例以组合1的引物探针为例，探索反应体系中不同模板加入量、不同引物探针终浓度及不同引物探针配比对荧光PCR反应结果的影响。

将合成的引物探针干粉稀释成浓度均为10μM的工作液，以实施例1的AAV标准品STD1-STD5作为模板，并采用实时荧光定量PCR分析仪ABI7500 FAST平台进行验证。

不同模板加入量的反应体系如表5所示，荧光PCR反应结果如表6所示。

表5

表6

不同引物探针终浓度的反应体系如表7所示，荧光PCR反应结果如表8所示。

表7

表8

不同引物探针配比的反应体系如表9所示，荧光PCR反应结果如表10所示。

表9

表10

表6、表8和表10结果显示，当引物终浓度由0.5μM降低至0.2μM，探针比例减半时，引物探针的非特异性扩增显著降低。另外，将模板加入量由2μL提高至5μL，有效提高了扩增效率，并减少了加样误差。

实施例3本发明的AAV基因组滴度qPCR检测方法的特异性及准确性

以AAV2、E.coli(E.coli残留DNA检测试剂盒(锦博))和phelper质粒(购自Addgene公司)的基因组DNA(提取DNA过程中，使用核酸消化能力强且对待消化体系成分要求不高的BenzoNuclease酶，以彻底消除残留转染质粒对滴度测定的影响，提取的DNA直接用于检测或经梯度稀释后用于检测)为模板，利用实施例2的优化后的检测体系(引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，引物探针比为2:2:1，模板量为5μL)进行检测。

结果如表11所示，扩增曲线图如图6～图7所示。

表11

从表11结果可知，E.coli基因组DNA和phelper质粒DNA的检测CT值均大于30，均为阴性；理论拷贝数为100copies/μL的AAV2基因组DNA的检测CT值均小于30，表明本发明的检测方法能够扩增，且特异性良好。

利用组合1引物探针检测得出AAV2基因组DNA的实际拷贝数为89.0212copies/μL，与理论值的回收率为89.0％，无关DNA的实际检测拷贝数均大于10copies/μL；利用组合2引物探针检测得出AAV2基因组DNA的实际拷贝数为99.6861copies/μL，与理论值的回收率为99.7％，无关DNA的实际检测拷贝数均小于10copies/μL，因此，使用组合2的引物探针进行检测的准确性更高，特异性更好。

实施例4本发明的AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒的准确性

为了进一步验证本发明试剂盒定量的准确性，采用实施例2优化后的检测体系(引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，引物探针比为2:2:1，模板量为5μL)，以方拓生物的rAAV2作为待检样品，利用标准品和本发明组合1的引物探针扩增标准曲线并计算待检样品中AAV滴度，同时利用AAVPrime^TM AAV-qPCR滴度检测试剂盒(购自GeneCopoeia公司)检测相同的待检样品，分别计算检测值与理论值的回收率。结果如表12所示。

表12

由表12结果可知，采用本发明的试剂盒进行检测，检测值更接近样品理论浓度，准确性更高。

实施例5本发明的AAV基因组滴度qPCR检测方法的重复性检测

本实施例平行重复三次实验，每次稀释STD1-STD6共6个点的标准曲线和空白对照，分别利用组合1和组合2的引物探针进行qPCR实验(采用实施例2优化后的检测体系(引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，引物探针比为2:2:1，模板量为5μL))。三次实验结果的CV值(CT>30不考察)分别如表13和表14所示。

表13

表14

从表13和表14结果可知，CV值都小于20％，结果表明本发明的检测方法重复性好。

实施例6本发明的AAV基因组滴度qPCR检测方法的耐用性检测

本实施例考察用于检测AAV基因组滴度的引物探针和标准品的稳定性。分别制备包括组合1和组合2引物探针的预混液，并将两份预混液与标准品模板反复冻融5次以上，再进行qPCR实验(采用实施例2优化后的检测体系(引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，引物探针比为2:2:1，模板量为5μL))。结果分别如表15和表16所示。

表15

表16

从表15和表16结果可知，CV值都小于20％，结果表明本发明的检测方法耐用性好。

实施例7利用本发明的AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒检测真实样本

将来源于和元生物和方拓生物的rAAV2、rAAV5、rAAV8、rAAV9共4种不同血清型的14个样本都使用磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(货号：DP705)进行提取和稀释后，利用本发明的AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒(包括组合1的引物探针)进行检测，再采用荧光定量PCR分析仪Applied Biosystems7500Fast进行扩增，采用实施例2优化后的检测体系(引物终浓度为0.2μM，探针终浓度为0.1μM，引物探针比为2:2:1，模板量为5μL)。扩增结果如表17所示。

表17

表17结果表明，采用本发明的检测试剂盒和检测方法可有效扩增待测样本，与提供的理论浓度计算回收率在83％～106％之间，检测结果准确可靠，双复孔CV在0.0～17.9之间，变异系数小重复性好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于AAV基因组滴度qPCR检测的引物探针组，其特征在于，包括序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物、SEQ ID NO.2所示的反向引物和SEQ ID NO.3所示的探针；或包括序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物、SEQ ID NO.5所示的反向引物和SEQ ID NO.6所示的探针。

2.根据权利要求1所述的用于AAV基因组滴度qPCR检测的引物探针组，其特征在于，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的用于AAV基因组滴度qPCR检测的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red，所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、DABCYL、Lowa Black TMRQ或Lowa BlackTMFQ，作为优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

4.一种用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组。

5.根据权利要求4所述的用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针组中，所述正向引物和反向引物的工作浓度均为0.2±0.02μM，所述探针的工作浓度为0.1±0.02μM；所述正向引物和反向引物的工作浓度均优选为0.2μM，所述探针的工作浓度优选为0.1μM。

6.根据权利要求4或5所述的用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液，所述PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTP、镁离子和缓冲溶液。

7.一种AAV基因组滴度qPCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求4～6任一项所述的用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，对待测样本的DNA进行实时荧光定量PCR扩增。

8.根据权利要求7所述的AAV基因组滴度qPCR检测方法，其特征在于，还包括步骤：使用权利要求4～6任一项所述的用于AAV基因组滴度qPCR检测试剂盒，对AAV定量标准品进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准曲线。

9.根据权利要求7或8所述的AAV基因组滴度qPCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系的总体积为20μL，所述反应体系中正向引物和反向引物的终浓度均为0.2±0.02μM，探针终浓度为0.1±0.01μM，模板量为5±0.5μL；和/或所述实时荧光定量PCR的反应体系为：qPCR预混液10μL、10μM正向引物0.4μL、10μM反向引物0.4μL、10μM探针0.2μL、模板5μL。

10.根据权利要求7或8所述的AAV基因组滴度qPCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃下变性10s，60℃下退火延伸30s，40个循环。