WO2023219414A1 - 인터루킨21 변이체, 이를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

인터루킨21 변이체, 이를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023219414A1
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fusion protein
mono
variant
cells
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PCT/KR2023/006343
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김용성
김은지
김준호
이경미
유영빈
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아주대학교산학협력단
고려대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to interleukin 21 variants, fusion proteins comprising the interleukin 21 variants and an antibody heavy chain constant region, and uses thereof.
  • the present invention relates to interleukin 21 variants in which some amino acids are substituted and/or deleted in wild-type interleukin 21, and to the interleukin 21 variants.
  • a fusion protein in which an antibody (immunoglobulin) heavy chain constant region (Fc) pair containing a first Fc region and a second Fc region is fused, and the use of the interleukin 21 variant or fusion protein for cancer prevention or treatment, and the use of the interleukin 21 variant or fusion protein This relates to the immune cell culture method used.
  • Cytokine is one of the relatively small immune proteins contained in the blood. Cytokines play an important role in cell signaling by influencing other cells or the secreting cell itself after being secreted from a cell.
  • Cytokines are essential proteins for regulating the body and induce proliferation and differentiation of cells, promoting changes in function and activity, and are related to immune system diseases, allergies, atopy, inflammation, and various types of tumors.
  • cytokine proteins are essential proteins for regulating the body and induce proliferation and differentiation of cells, promoting changes in function and activity, and are related to immune system diseases, allergies, atopy, inflammation, and various types of tumors.
  • Interleukin-21 is a cytokine.
  • IL21 is a member of the IL2 family of cytokines, which includes IL4, IL7, IL9, IL13, and IL15. Proteins from this family have been shown to have both anticancer and antiviral effects.
  • IL21 is produced by activated helper T (CD4+ helper T cells, TH1) cells and natural killer T (NK-T) cells, and is known to be an important regulator of immunity. In particular, it activates the proliferation and cytotoxicity effector function of CD8+ killer T cells (CD8+ cytotoxic T lymphocytes) and natural killer (NK) cells, two classes of lymphocytes that eradicate tumors and virus-infected cells. (Spolski et al., Nat Rev Drug Discov. 2014;13(5):379-95). Additionally, IL21 stimulates select classes of B-cells. Therefore, IL21 is a cytokine that induces the proliferation and activation of immune cells, especially NK cells, and is essential for immune cell therapy.
  • CD8+ cytotoxic T lymphocytes CD8+ cytotoxic T lymphocytes
  • NK natural killer cells
  • IL-2 is the only cytokine that has been clinically approved for direct administration to patients.
  • IL2 increases the viability and activity of NK cells and is relatively inexpensive, but it has the disadvantage of suppressing anticancer immune function by activating regulatory T cells, which are immunosuppressive cells. Therefore, there is an urgent need to commercialize cytokines that activate NK cells without activating regulatory T cells.
  • IL21 has recently been in the spotlight in anticancer immunotherapy. Similar to IL2, IL21 promotes the proliferation and differentiation of CD4-positive T cells and CD8-positive T cells, but on the contrary, it has been reported to have no effect on the proliferation of regulatory T cells, so it is expected to be administered in combination with anti-cancer immune cell therapy ( Al-Chami et al., Cytokine, 2016;82:33-37). In addition, IL21 promotes the differentiation of CD8 T cells into memory cells (Li et al., Journal of Immunology, 2005), and in particular, recent studies have shown that when treated with HDAC inhibitors, it induces genetic reprogramming of differentiated T cells and induces stable cells.
  • IL21 has been reported to be related to NK cells: 1) When Fms-like tyrosine kinase-3 (FLT3-L) is present together with IL15, it promotes the proliferation of NK cells derived from human CD34-positive hematopoietic progenitor cells (Parrish) -Novak et al.
  • Recombinant human IL21 has shown antitumor activity in preclinical and clinical trials. However, when administered systemically, it has a short half-life and is exhausted by other immune cells expressing the IL21 receptor, making it difficult to target to the tumor site, so it has to be administered in high concentrations, and due to toxicity due to its pleiotropic function that acts simultaneously on various immune cells. It failed in a phase 1 clinical trial (Petrella et al., Journal of Clinical Oncology, 2013). It failed in phase 1 clinical trials due to toxicity due to its pleiotropic function that acts simultaneously on various immune cells. Several attempts have been made to overcome these shortcomings.
  • Human antibodies immunoglobulin G (IgG), IgM, IgD, IgE, IgA
  • IgG immunoglobulin G
  • IgM immunoglobulin M
  • IgD immunoglobulin D
  • IgE immunoglobulin A
  • homodimerization between two identical heavy chains occurs at the last domain of the constant region of the antibody (CH3 domain for IgG, IgD, IgA, CH4 domain for IgM, and CH2 and CH4 domains for IgE). It is induced by non-covalent interactions between the two regions and disulfide bonds between the hinge regions.
  • Antibody-derived heterodimeric heavy chain constant region (heterodimeric Fc) technology is used to improve the interaction between the last domains of the constant region, which greatly contributes to the homodimerization of naturally occurring antibodies (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE).
  • This is a technology that forms a heavy chain constant region in the form of a heterodimer by engineering a bond that favors heterodimerization and disfavors or excludes homodimerization through specific non-covalent bonds. More specifically, mutations are induced in the CH3 domains of two different antibody heavy chains through genetic manipulation, so that the two heavy chains have a structure very similar to that of a naturally occurring antibody and form a heterodimer with minimal deviation in sequence.
  • the EW-RVT heterodimeric Fc mutant used in the present invention is a new mutation strategy, forming selective electrostatic bonding on the CH3 domain interaction surface by analyzing the interaction of the existing mutants above in sequence and structure.
  • K360E CH3A -Q347R CH3B a mutant that enhances the formation of heterodimers by forming complementary hydrophobic bonds instead of existing electrostatic bonds (K409W CH3A -D399V CH3B /F405T CH3B ) (U.S. Patent No. 9,951,145 Ho; Republic of Korea Patent No. 1,522,954; Choi HJ et al.
  • the existing mono-IL21-Fc fusion protein was produced based on the EW-RVT heterodimeric Fc ( ⁇ 1/2/4, EW-RVT) in which the hinge-CH2-CH3 region introduced human IgG1, IgG2, and IgG4 sequences ( Republic of Korea Patent Registration 10-1928981; US Patent Registration US10800825B2).
  • the mono-IL21-Fc fusion protein prepared in this way shows an excellent NK cell proliferation promotion function compared to bi-IL21-Fc in which IL21 is fused to wild-type Fc ( ⁇ 1/2/4), and is water-soluble with frequent administration in the body. It was confirmed that it can induce a superior anti-tumor effect compared to IL21 or Bi-IL21-Fc (Korean patent registration 10-1928981; US patent registration US10800825B2).
  • IL21 amino acids with a positively charged side chain are cytokines that influence the regulation of proliferation and activation of CD8+ killer T cells (CD8+ cytotoxic T lymphocytes) and natural killer (NK) cells.
  • CD8+ cytotoxic T lymphocytes CD8+ cytotoxic T lymphocytes
  • NK natural killer cells.
  • IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IFNs CD8+ killer T cells
  • IL21 has an isoelectric point (pI) of 9.42, and as a result, IL21 has a net charge under body pH conditions. It was confirmed that it has the property of being positively charged.
  • an interleukin 21 variant in which some amino acids are substituted and/or deleted in wild-type interleukin 21, an antibody (immunoglobulin) comprising the interleukin 21 variant, a first Fc region, and a second Fc region.
  • a fusion protein containing a pair of heavy chain constant regions (Fc) and a heterodimer containing a mutation in the CH3 domain of the first or second Fc region was developed, and the present invention was completed.
  • the variant developed according to the present invention was found to have superior biological activity and anti-tumor activity compared to the existing mono-IL21-Fc fusion protein.
  • the purpose of the present invention is to provide interleukin 21 variants in which one or more amino acid sequences are substituted or deleted from wild type interleukin 21.
  • the purpose of the present invention is to provide a fusion protein comprising the interleukin 21 variant and an antibody (immunoglobulin) heavy chain constant region (Fc) pair.
  • the purpose of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the interleukin 21 variant or fusion protein.
  • the purpose of the present invention is to provide an expression vector containing the above nucleic acid.
  • the purpose of the present invention is to provide transformed recombinant cells containing the above expression vector.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for producing the interleukin 21 variant or fusion protein.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for preventing or treating cancer containing the interleukin 21 variant or fusion protein as an active ingredient.
  • a method for preventing or treating cancer comprising the interleukin 21 variant or fusion protein as an active ingredient.
  • the purpose of the present invention is to provide a use of the interleukin 21 variant or fusion protein in the production of a composition for preventing or treating cancer.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer comprising administering the interleukin 21 variant or fusion protein to a patient.
  • the purpose of the present invention is to provide a culture method comprising treating immune cells with the interleukin 21 variant or fusion protein.
  • the present invention provides one or more amino acids selected from the group consisting of positions 50, 54, 75 to 88, and 124 based on the N-terminus in interleukin 21 (IL21) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It relates to interleukin 21 variants with sequence substitutions or deletions.
  • the present invention also provides the interleukin 21 variant; And an antibody (immunoglobulin) heavy chain constant region (Fc) pair comprising a first Fc region and a second Fc region, wherein the Fc pair is a heterologous antibody comprising a mutation in the CH3 domain of the first Fc region or the second Fc region. It concerns a fusion protein, which is a heterodimer.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the interleukin 21 variant or fusion protein.
  • the present invention relates to an expression vector containing the above nucleic acid.
  • the present invention relates to a transformed recombinant cell containing the above expression vector.
  • the present invention relates to a method for producing an interleukin 21 variant or fusion protein comprising the following steps:
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer comprising the interleukin 21 variant or fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating cancer comprising administering the interleukin 21 variant or fusion protein to a patient.
  • the present invention relates to the use of the interleukin 21 variant or fusion protein in the production of an agent for preventing or treating cancer.
  • the present invention relates to a culture method comprising treating immune cells with the interleukin 21 variant or fusion protein.
  • FIG. 1a is a schematic diagram of a mono-IL21-Fc fusion protein (IL21 monomer-Fc fusion protein) constructed by constructing the human IL21 cytokine in the form of a monovalent monomer to EW-RVT heterodimeric Fc.
  • the EW-RVT heterodimeric Fc used here is an Fc ( ⁇ 1/4) containing the hinge region sequence of human IgG1 and the CH2-CH3 region of human IgG4, with the EW-RVT mutation introduced.
  • Mono means monovalent monomer.
  • Figure 1b is a comparative example of Figure 1a, a schematic diagram of the Bi-IL21-Fc fusion protein (IL21 dimer-Fc fusion protein) constructed by constructing human IL21 cytokine in a bivalent form to wild-type Fc.
  • Wild-type Fc is an Fc ( ⁇ 1/4) that has the hinge region sequence of human IgG1 and the CH2-CH3 region of human IgG4.
  • Bi means bivalent dimer.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of CH3A (EW) of Fc ( ⁇ 1/4) and CH3B (RVT) of Fc ( ⁇ 1/4) as an expression vector for expressing and purifying the fusion protein of Figure 1a in animal cells.
  • Figure 3 shows the indicated wild-type Fc ( ⁇ 1/4, WT), heterodimeric heavy chain constant region Fc ( ⁇ 1/4, EW-RVT), Bi-IL21-Fc and mono-IL21-Fc fusion protein (mono-IL21-Fc).
  • the ratio of the CH3A (EW):CH3B (RVT) expression vector used for animal cell transformation 1:1, 1.5:1, 2:1)
  • the fusion protein was temporarily transformed into HEK293F cells through co-transformation. After expression and purification, 5 ⁇ g of protein was separated on 10% SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions, and analyzed for size and combination form through Coomasie Blue staining.
  • Non-reducing is a non-reducing condition
  • reducing is a reducing condition
  • M is a protein marker.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the running buffer was 1X PBS (pH 7.4, 12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl), the flow rate was 0.75 ml/min, and the protein input amount was 30 ⁇ g (30 ⁇ l injection at 1 mg/ml).
  • Figure 5 shows the structure of human IL21 wild type (PDB ID: 3tgx) visualized using the Chimera Blue represents amino acids with positively charged side chains, red represents amino acids with negatively charged side chains, gray represents amino acids with hydrophobic side chains, and green represents other amino acids.
  • Figure 6a shows the results of analyzing the constructed mono-IL21-Fc fusion protein using size exclusion chromatography.
  • the running buffer was 1X PBS (pH 7.4, 137 mM NaCl)
  • the flow rate was 0.75 ml/min
  • the protein input amount was 30 ⁇ g (30 ⁇ l injection at 1 mg/ml).
  • Figure 6b shows the results of analysis of the constructed mono-IL21-Fc fusion protein using size exclusion chromatography.
  • the running buffer is High Salt PBS (pH7.4, 12mM phosphate, 2.7mM KCl, 500mM NaCl), the flow rate is 0.75 ml/min, and the protein input amount is 30 ⁇ g (1mg/ml, 30 ⁇ l). injection).
  • Figure 7 shows the changed sequences among the sequences of IL21 amino acid substitution variants constructed in the present invention compared to the human IL21 wild type, and illustrates the nomenclature and rationale.
  • Figure 8 shows mono-IL21-Fc fusion protein amino acid substitution variants, mono-IL21(NKQ)-Fc and mono-IL21(DDD)-Fc, transiently expressed and purified in HEK293F cells through co-transformation, and then in control cells. This is the result of separating 5 ⁇ g of protein along with the mono-IL21-Fc fusion protein on 10% SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions, and analyzing the size and combination form through Coomasie Blue staining.
  • Non-reducing is a non-reducing condition
  • reducing is a reducing condition
  • M is a protein marker.
  • Figure 9 shows mono-IL21-Fc fusion protein amino acid substitution variants mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NKQ)-Fc, and mono-IL21(NQNT)-Fc as a control. This is the result of analysis using size exclusion chromatography.
  • the running buffer was 1X PBS (pH 7.4, 137 mM NaCl)
  • the flow rate was 0.75 ml/min
  • the protein input amount was 30 ⁇ g (30 ⁇ l injection at 1 mg/ml).
  • Figure 10 shows the changed sequences among the IL21 ortholog sequence graft variants constructed in the present invention compared to the human IL21 wild type, and illustrates the nomenclature and rationale.
  • Figure 11 shows mono-IL21-Fc fusion protein ortholog sequence graft variants, mono-IL21(Helix 1)-Fc and mono-IL21(Helix 2)-Fc, transiently expressed in HEK293F cells through co-transformation.
  • 5 ⁇ g of protein along with the control mono-IL21-Fc fusion protein were separated on 10% SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions, and analyzed for size and combination form through Coomasie Blue staining.
  • Non-reducing is a non-reducing condition
  • reducing is a reducing condition
  • M is a protein marker.
  • Figure 12 shows mono-IL21-Fc fusion protein fusion protein ortholog sequence graft variant mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc as a control, mono-IL21-Fc fusion protein, This is the result of analysis using size exclusion chromatography with mono-IL21-Fc fusion protein, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, and mono-IL21(DDD NQNT)-Fc.
  • the running buffer was 1XPBS
  • the flow rate of the running buffer was 0.75 ml/min
  • the protein input amount was 30 ⁇ g (30 ⁇ l injection at 1 mg/ml).
  • FIG. 13 shows FACS analysis of the extent to which IL21 of mono-IL21-Fc fusion protein and mono-IL21-Fc fusion protein variants binds to the IL21 receptor on the cell surface.
  • Figure 14 shows the results showing the NK cell proliferation effect by mono-IL21-Fc fusion protein and mono-IL21-Fc fusion protein variants.
  • NK cells were generated by adding IL-2 (30 ng/ml monomeric IL-2 Fc) to PBMC isolated from normal human blood in the presence of 100 gray gamma-irradiated Jurkat (KL-1) cells and EBV-transformed LCL cells. Cultured.
  • Figure 15 shows the results showing the NK cell proliferation effect by mono-IL21-Fc fusion protein and mono-IL21-Fc fusion protein variants.
  • NK cells were induced by adding IL-2 (30 ng/ml monomeric IL-2 Fc) to PBMC from which CD4/CD8 T cells were removed in the presence of 100 gray gamma-irradiated Jurkat (KL-1) cells and EBV-transformed LCL cells. was cultured.
  • the present invention is a substitution of one or more amino acid sequences selected from the group consisting of positions 50, 54, 75 to 88, and 124 based on the N-terminus in interleukin 21 (IL21) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Or it relates to a deleted interleukin 21 variant.
  • IL21 interleukin 21
  • Human with SEQ ID NO: 4 consisting of amino acid residues positions 1 to 131 corresponding to the mature form sequence of human IL21 cytokine (herein referred to as positions 1 to 131, excluding signal peptide and propeptide). May contain some amino acid substitutions or deletions in IL21.
  • the physical properties of a therapeutic protein can determine its therapeutic efficacy, pharmacokinetics, and presence or absence of side effects.
  • the physical properties of therapeutic proteins can be reduced due to the net charge of the protein in the body, the degree of hydrophobicity, and improper folding of the protein. If the net charge in the body is strongly positive or negative, if the protein is too hydrophobic and cannot be dissolved in the body's water-soluble environment, or if the protein cannot maintain its folded state properly in the body, its physical properties may deteriorate. This can be improved by selecting and alternately mutating amino acids that cause deterioration in physical properties while maintaining the structure and function of the protein.
  • the structure of human IL21 has four helices (helix A, B, C, to D) arranged in an up-up-down-down pattern, which is typical for class 1 cytokines, and a loop structure connecting the helices.
  • helix A, B, C, to D helices
  • amino acids 4 to 23 are Helix A
  • amino acids 41 to 56 are Helix B
  • amino acids 62 to 74 are Helix C
  • amino acids 102 to 120 are Helix B.
  • Amino acids form Helix D.
  • IL21 residues and 16 IL21 receptor residues form a van der Waals bond, of which arginine 3, arginine 7, glutamine 10 in the IL21 Helix A sequence, and 74 in the Helix C sequence.
  • Arginine and lysine at number 71 are known to be the most important amino acids.
  • an amino acid substitution strategy and a centromere sequence transplantation strategy are used to improve the in vivo biological properties of wild-type IL21 without affecting its structure and function.
  • the interleukin 21 variant may include one or more amino acid substitutions or deletions selected from the group consisting of the following in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4:
  • the interleukin 21 variant may include one or more amino acid substitutions and/or deletions selected from the group consisting of the following in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4:
  • a mono-IL21-Fc fusion protein centromere sequence graft variant was constructed by replacing the sequences from K75 to R88, including the atypical region of IL21, with the complementary human IL4 sequence and the centromere IL4 sequence, respectively.
  • the interleukin 21 variant may include one or more amino acid substitutions and/or deletions selected from the group consisting of the following in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4:
  • the interleukin 21 variant may include a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 10.
  • mutation refers to a modification of a protein that includes replacing an amino acid with an amino acid with similar biochemical properties that does not cause loss of the structure and biological or biochemical function of the protein.
  • Amino acid substitution is a substitution that maintains the amino acid structure but replaces it with an amino acid with a side chain with different chemical properties. Amino acids that exist in nature can be classified into amino acids with side chains with similar characteristics, and this is well known.
  • amino acids with basic side chains e.g., lysine, arginine, histidine
  • amino acids with acidic side chains e.g., aspartic acid, glutamic acid
  • amino acids with uncharged polar side chains e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • amino acids with nonpolar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acids with beta-branched side chains Includes amino acids (e.g., threonine, valine, isoleucine) and amino acids with aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • the present invention provides an IL21 variant constructed from human IL21 through an amino acid substitution strategy, and shows that it can still retain activity.
  • isotope sequence transplantation refers to the same sequence region of IL21 by referring to a specific sequence region of cytokines (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15) of the same family as IL21. It means substitution with an amino acid in the region of the position.
  • cytokines IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15
  • the CD loop structure from Helix C to Helix D and the C-terminal region are structurally undetermined atypical regions.
  • the human IL21 variant of the present invention may include not only the sequence of the IL21 variant described herein, but also its biological equivalent, to the extent that the desired function is maintained.
  • additional changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the physical properties or other biological characteristics of IL21.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. That is, as seen above, it is based on the relative similarity of amino acid residue substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • the present invention includes an antibody (immunoglobulin) heavy chain constant region (Fc) pair comprising the IL21 variant, a first Fc region, and a second Fc region, and CH3 of the first Fc region or the second Fc region. It relates to a fusion protein, which is a heterodimer containing mutations in the domain.
  • Fc immunoglobulin heavy chain constant region
  • Interleukin-21 a fusion protein in which the cytokine is fused to the antibody heterodimeric heavy chain constant region Fc (Heterodimeric Fc) in monomeric form ("IL21 monomer-Fc fusion protein", “Heterodimeric Fc-fused IL21 monomer proteins ", or "mono-IL21-Fc fusion protein”) or a fusion protein in which a variant of interleukin 21 is fused to the antibody heterodimeric heavy chain constant region Fc (Heterodimeric Fc) in monomeric form (“IL21 monomer-Fc fusion protein” (named “variant”, “Heterodimeric Fc-fused IL21 variant monomer proteins”, or “mono-IL21-Fc fusion protein variant”).
  • Interleukin-21 a fusion protein in which the cytokine is fused in a dimer form to the heavy chain constant region Fc (Heterodimeric Fc) of an antibody heterodimeric (“IL21 dimer-Fc fusion protein variant”, “Heterodimeric Fc-fused IL21 variant” “dimeric proteins”, or “dimer-IL21-Fc fusion protein variants”).
  • a mutant was designed to reduce the non-specific reactivity of IL21 and increase structural stability through amino acid mutation of wild-type IL21, and when expressed in the form of a mono-IL21-Fc fusion protein variant, the amount of expression of the fusion protein was reduced. It increases and reduces the formation of undesirable oligomers under physiological conditions, and improves biological properties so that it can exist in monomer form.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein which is a fusion protein of wild-type IL21, but its physical properties were improved to preserve the ability to bind to IL21 receptors expressed on the cell surface and the proliferation ability of immune cells. This is a technology for developing IL21 variants.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein which is a fusion protein containing wild-type IL21, 1) reducing side effects that may occur in the body, 2) improving pharmacokinetics, 3)
  • wild-type IL21 is a heterodimeric heavy chain constant region EW-RVT heterodimeric Fc ( ⁇ 1/ 4, EW-RVT), a monomeric fusion protein of mono-IL21-Fc fusion protein was constructed. Afterwards, the structure of wild-type IL21 was analyzed, sequences that could affect the physical properties and specificity of the protein were selected, and amino acid-level substitutions or sequences of the same family of cytokines were grafted onto the design to design mono-IL21. -A variant of the mono-IL21-Fc fusion protein that can be expressed in the form of an Fc fusion protein, increasing the amount of expression and reducing the formation of undesirable oligomers under physiological conditions, and can exist in the form of a monomer. was developed.
  • EW-RVT heterodimer Fc ( ⁇ 1/4, EW-RVT) is introduced with an EW-RVT mutation based on Fc ( ⁇ 1/4), which has the hinge region sequence of IgG1 and the CH2-CH3 region of human IgG4.
  • Fc ⁇ 1/4
  • wild-type Fc ( ⁇ 1/4, WT)
  • Bi-IL21-Fc fusion protein (IL21 dimer-Fc fusion protein) was produced. was constructed and compared.
  • the present invention provides a mono-IL21-Fc fusion protein variant in which the wild-type IL21 amino acid sequence of the mono-IL21-Fc fusion protein is replaced or the ortholog cytokine sequence is transplanted. More specifically, the basis for constructing IL21 for the development of mono-IL21-Fc fusion protein variants is 1) improving the stability of the material by reducing non-specific interactions in the body by reducing the positive charge on the surface of the IL21 protein, and reducing non-specific interactions in the body, thereby reducing the positive charge on the surface of the IL21 protein.
  • Heterodimeric Fc-fused protein variants including interleukin 21 variants according to the present invention, provide a form of protein that can maintain its function and activity by maintaining the structure of the previously constructed mono-IL21-Fc fusion protein. .
  • Fc region refers to a region containing an antibody-derived hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain.
  • the expression "the first Fc region and the second Fc region are mutated to promote the formation of a heterodimeric heavy chain constant region (heterodimeric Fc)” means that the two Fc regions of an antibody existing in nature have the same sequence. Branches have a homodimeric heavy chain constant region (homodimeric Fc), and by causing mutations in some sequences of this Fc region, a heterodimeric heavy chain constant region is formed through a specific non-covalent bond between the first Fc region and the second Fc region. This means that the formation of heterodimeric Fc) is promoted and the formation of homodimers is reduced or, preferably, mutated so that it almost never occurs.
  • the mutation that promotes the formation of a heterodimeric heavy chain constant region (heterodimeric Fc) of the first Fc region and the second Fc region according to the present invention is included in the first Fc region and the second Fc region derived from the antibody.
  • Each CH3 domain may contain mutations that promote the formation of a heterodimeric heavy chain constant region (heterodimeric Fc).
  • the heterodimeric heavy chain constant region includes a first Fc region and a second Fc region, and the first Fc region and the second Fc region have a CH3 domain to promote the formation of the heterodimeric heavy chain constant region. It refers to a heteroduplex heavy chain constant region that is characterized as being mutated.
  • the CH3 domain mutation of the first Fc region or the second Fc region includes one or more mutations selected from the following group, and the mutation location is characterized in that it follows the EU index:
  • the CH3 domain of the first Fc region or the second Fc region may further include the following and the mutation position may be according to the EU index:
  • the mutation in the CH3 domain of the first Fc region or the second Fc region may be characterized as including one or more mutations selected from the following group: (However, the mutation location is according to the EU index)
  • the CH3 domain of the first Fc region or the second Fc region may further include the following and the mutation position may be according to the EU index:
  • the CH3 domain mutations of the first Fc region and the second Fc region include (1) substitution of K360E at position K360 and substitution of K409W at position K409 in the CH3 domain of the first Fc region; and (2) substitution of E347R at position E347 in the CH3 domain of the second Fc region; and a substitution at the F405 position with F405T and a substitution at the D399 position with D399V, and the mutation position may be characterized as being according to the EU index (hereinafter referred to as EW-RVT).
  • EU index hereinafter referred to as EU index
  • the EW-RVT heterodimeric Fc is an EW-RVT heterodimeric Fc introduced with the above EW-RVT mutation based on an Fc ( ⁇ 1/4) that has the hinge region sequence of IgG1 and the CH2-CH3 region of human IgG4. ( ⁇ 1/4, EW-RVT).
  • the CH3 domain included in the first Fc region and the second Fc region derived from the antibody according to the present invention has a sequence selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. You can do this.
  • the first Fc region and the second Fc region may each be derived from an Fc region selected from the group consisting of human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD and IgE, preferably the first Fc region.
  • the Fc region and the second Fc region may be derived from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, respectively, and the first Fc region and the second Fc region may be derived from an isotype antibody.
  • the first Fc region and the second Fc region derived from the antibody according to the present invention have the sequence of the CH3 domain shown in Table 1 derived from IgG4.
  • the term ' ⁇ 1/4' refers to the hinge region of the constant region domain of the heavy chain of an antibody using the IgG1 isotype, which is widely adopted in commercial therapeutic antibodies due to its high stability, and the CH2 to CH3 region used for unwanted ADCC (ADCC) Using the IgG4 isotype, which does not exhibit antibody-specific functions such as antibody-dependent cellular cytotoxicity (antibody-dependent cellular cytotoxicity)/CDC (complement-dependent cytotoxicity), the Fc fused to this is called Fc ( ⁇ 1/4).
  • the fusion protein according to the present invention is an interleukin 21 variant comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to 10, a first Fc region comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, and a sequence of SEQ ID NO: 2.
  • An antibody (immunoglobulin) comprising a second Fc region may include a heavy chain constant region (Fc) pair.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the interleukin 21 variant or fusion protein.
  • the interleukin 21 variant or fusion protein can be recombinantly produced by isolating the nucleic acid encoding the interleukin 21 variant or fusion protein of the present invention.
  • Nucleic acid is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, the basic structural unit of nucleic acids, include not only natural nucleotides but also analogues with modified sugar or base sites. .
  • the sequence of the nucleic acid encoding the IL21 variant of the invention may be modified. The modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • DNA encoding the interleukin 21 variant or fusion protein can be extracted using conventional molecular biology methods (for example, by using oligonucleotide probes that can specifically bind to CH3A (EW) and CH3B (RVT) DNA). It can be easily isolated or synthesized, and the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or further expression. Based on this, the present invention relates to a recombinant expression vector containing the above nucleic acid from another perspective.
  • EW CH3A
  • RVT CH3B
  • the term “expression vector” refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell, including viruses such as plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors. Includes vectors, etc.
  • Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Nucleic acids encoding interleukin 21 variants or fusion proteins are operably linked, such as promoter and transcription termination sequences.
  • “Operably linked” means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is a functional linkage between the other nucleic acid sequence. regulates transcription and/or translation.
  • a nucleic acid expression control sequence e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionein promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • Promoters derived from viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV
  • viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV
  • the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein-Barr virus (EBV), and the promoter of Roux Sarcoma virus (RSV) can be used, and generally
  • the present invention relates to host cells transformed with the above recombinant expression vector.
  • the host cell used to produce the fusion protein of the present invention may be a prokaryotic cell, yeast, or higher eukaryotic cell, but is not limited thereto.
  • Strains of the genus Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas, such as Pseudomonas putida ( Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida, Proteus mirabilis, and Staphylococcus (e.g., Staphylocus carnosus) can be used.
  • Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces
  • Pseudomonas such as Pseudomonas putida
  • Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida, Proteus mirabilis
  • Staphylococcus e.g., Staphylocus carnosus
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • fusion refers to the integration of two molecules with different or the same function or structure, where a heavy chain constant region (Fc) pair of an antibody (immunoglobulin) comprising a first Fc region and a second Fc region binds to the interleukin 21 variant. Fusion can be done by any possible physical, chemical or biological method.
  • the fusion may preferably be by a linker peptide, and this linker peptide is a variety of interleukin 21 variants of the present invention and an antibody (immunoglobulin) heavy chain constant region (Fc) pair comprising a first Fc region and a second Fc region. It can relay fusion with the bioactive molecule at the site.
  • the interleukin 21 variant may bind to the N-terminus of the first Fc region or the second Fc region.
  • the interleukin 21 variant may be fused to the N-terminus of either the first Fc region or the second Fc region in monomeric form.
  • the IL-21 or its variant may be connected to the first Fc region or the second Fc region with a linker.
  • the linker may be a peptide linker and may have a length of about 10-25 aa.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included, but are not limited thereto.
  • the linker may include, for example, (GS) n , (GGS) n , (GSGGS) n , or (G n S) m (n, m are each 1 to 10), but the linker is For example, it may be (G n S) m (n and m are each 1 to 10).
  • composition for preventing or treating cancer containing the interleukin 21 variant or fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a method for preventing and treating cancer, comprising administering the interleukin 21 variant or fusion protein according to the present invention in an effective amount required to a patient.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein variant according to the present invention activates the proliferation of T cells and/or NK cells and increases toxicity, showing anti-tumor or anti-cancer effects.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein variant according to the present invention is used for the treatment of cancer-related diseases.
  • the cancer may be selected from the group consisting of, for example, colon cancer, melanoma, breast cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, prostate cancer, ovarian cancer, small intestine cancer, esophageal cancer, cervical cancer, lung cancer, lymphoma, and blood cancer.
  • the present invention further relates to a composition for culturing immune cells containing the interleukin 21 variant or fusion protein according to the present invention.
  • the present invention further relates to a culture method comprising treating immune cells with the interleukin 21 variant or fusion protein according to the present invention.
  • the cell culture medium may additionally include any one selected from the group consisting of medium, serum, supplements, and combinations thereof.
  • the medium may contain any one selected from the group consisting of amino acids, sugars, inorganic salts, and vitamins.
  • the cell culture medium may contain all amino acids, sugars, mineral salts, and vitamins.
  • the composition includes a medium used for culturing cells, and specifically includes a medium for culturing NK cells, more specifically CD3-CD56+ cells. It contains ingredients that cells need for cell growth and survival in vitro, or contains ingredients that help cell growth and survival. Specifically, the ingredients may be vitamins, essential or non-essential amino acids, and trace elements.
  • the medium consists of amino acid ingredients, vitamin ingredients, mineral salt ingredients, other ingredients, and purified water,
  • the amino acid components include glycine, L-alanine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-serine, L-cysteine, L-methionine, L-aspartic acid, L-asparagine, L- -Glutamic acid, L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-proline, ⁇ -alanine, ⁇ -aminobutyric acid, ornithine, citrulline, homo It is at least one amino acid selected from the group consisting of serine, triiodotyrosine, thyroxine, and deoxyphenylalanine, or a combination thereof, preferably glycine, L-alanine, L-arginine, L-cysteine, L-glutamine, L -At
  • the vitamin ingredient is at least one selected from the group consisting of biotin, calcium D-pantothenate, folic acid, niacinamide, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B12, choline chloride, i-inositol, and ascorbic acid. It is a vitamin or a combination thereof, preferably at least one vitamin or a combination thereof selected from the group consisting of i-inositol, thiamine hydrochloride, niacinamide and pyridoxine hydrochloride,
  • the inorganic salt components include calcium chloride (CaCl2) (anhydrous), copper sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O), ferric sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O), magnesium chloride (anhydrous), magnesium sulfate (MgSO4) (anhydrous), and potassium chloride.
  • KCl sodium chloride (NaCl), disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4), sodium hydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4-H2O), zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4-7H2O), ferric nitrate nonahydrate (Fe(NO3)3 ⁇ 9H2O) and at least one inorganic salt selected from the group consisting of sodium bicarbonate (NaHCO3) or a combination thereof, preferably sodium chloride (NaCl), sodium bicarbonate (NaHCO3), potassium chloride (KCl), calcium chloride (CaCl2) At least one inorganic salt selected from the group consisting of anhydrous) and sodium hydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4-H2O), or a combination thereof,
  • the above other ingredients are D-glucose (dextrose), sodium pyruvate, hypoxanthine Na, thymidine, linoleic acid, lipoic acid, adenosine, cytidine, guanosine, uridine, 2'-deoxyadenosine, 2 It may be at least one other ingredient selected from the group consisting of '-deoxycytidine HCl and 2'-deoxyguanosine, or a combination thereof, and preferably, it may be sodium pyruvate.
  • Purified water is used to dissolve the amino acids, vitamins, mineral salts, and other ingredients, and may be obtained through one or more distillations, or may be water purified through a filter.
  • the composition may further include growth factors or cytokines.
  • growth factors include IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF, or PDGF, etc., which can be used alone or in combination of two or more, but are not particularly limited thereto.
  • cytokines include IL-1, IL-4, IL-6, IFN- ⁇ , IL-10, IL-15, IL-17, or IL-21, which can be used alone or in combination with two or more types, but are specifically limited thereto. That is not the case.
  • composition may further include antibodies for activating natural killer cells.
  • Anti-CD3 antibodies, anti-CD2 antibodies, anti-CD335 antibodies, etc. can be used alone or in combination as the activating antibodies, but are not particularly limited thereto. It may also include beads to which the antibody for activating natural killer cells is bound.
  • the medium composition for NK culture may further include any one selected from the group consisting of IL-15, IL-21, and combinations thereof.
  • the IL-15 and IL-21 are a type of interleukin (IL) and refer to protein-based biological substances produced by immune cells such as lymphocytes, monocytes, and macrophages.
  • IL-15 and IL-21 promote the proliferation of natural killer cells and can be used when culturing natural killer cells using monocytes as raw material cells. However, when they are used alone or in combination, the proliferation rate and purity are reduced. There is a low problem (Biossel L. et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 14, 1031-1038, 2008).
  • serum used in the present invention refers to the transparent supernatant released from the blood after the blood is completely coagulated. Additionally, when cultivating animal cells, serum must be added to the synthetic medium, and it is common to use serum from cows, horses, or humans. In the case of bovine serum, fetal bovine serum (FBS), newborn bovine serum, calf serum, bovine serum, etc. can be used depending on the time of blood collection. There is. In the case of human-derived serum, human serum from a donor whose blood type is AB is used, and human AB serum, which can minimize immune reactivity because it does not have antibodies against A and B blood group antigens, can be used. Additionally, CTS Immune Cell SR, etc. can be used as a substitute for the “serum”. In one example of the present invention, human AB serum or CTS Immune Cell SR was used.
  • the supplement may use GlutaMAX (Gibco), an L-Glutamine substitute, to improve stability and cell activity during cell culture. Additionally, the supplement may be NK MACS supplement (Miltenyi Biotec, 130-113-102).
  • the immune cells include T cells, NK cells, Cytokine Induced Killer cells (CIK), Cytotoxic T Lymphocytes (CTL), macrophages, and Tumor-Infiltrating Lymphocytes. , TIL), and may be one or more selected from the group consisting of dendritic cells.
  • Immune cells particularly NK cells, prepared by the above method are provided.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the NK cells is determined by the type of disease, the severity of the disease, the type and content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of dosage form and the patient's age, weight, general health, gender and diet, administration time, It can be adjusted according to various factors, including the route of administration and secretion rate of the composition, treatment period, and concurrently used drugs.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 1x10 2 cells/kg to 1.0x10 13 cells/kg, and 1x10 7 cells/kg to 1.5x10 11 cells/kg based on NK cells, which are active ingredients. At this time, administration can be done once a day, or it can be administered in several doses.
  • the Fc variant for construction of the fusion protein was a heterodimer heavy chain constant region Fc ( ⁇ 1/4, EW-RVT), which is based on IgG4 and the EW-RVT mutation is introduced to form a heterodimer.
  • Fc heavy chain constant region
  • human IL21 was linked to the heavy chain constant region using the hinge region without an additional peptide linker to facilitate interaction with the IL21 receptor.
  • the hinge region used at this time was the commonly used IgG1-derived hinge, and excluding the cysteine residue in the core hinge region for duplex formation, the remaining cysteine residues in the upper hinge region were used. was substituted with a serine residue to prevent unwanted disulfide bonds from forming during protein fusion (Mutated hinge, Figure 2).
  • IgG4-based variant (IgG4-EW-RVT, Choi et al, 2013; Korean patent)
  • a human IL21 (Interleukin 21, Table 2, SEQ ID NO: 5) fusion protein was constructed using Registration No. 10-1522954.
  • IL21 which exists in nature, is a cytokine that operates as a monomer, and is active when one IL21 binds to one IL21 receptor (IL21R) and one ⁇ c-chain.
  • one IL21 is linked to only one of the different Fc variants (CH3A or CH3B) to maintain the monomeric form of IL21 that exists in nature. I wanted to do it.
  • Figure 1a shows a schematic diagram of the mono-IL21-Fc fusion protein into which a pair of CH3 mutants were introduced.
  • the DNA encoding IL21-Fc ( ⁇ 1/4, EW) into which the CH3 mutant pair was introduced was transferred to pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA), an animal cell expression vector with a CMV promoter, signal sequence-IL21 mature form-Mutated. It was cloned in-frame using NotI/HindIII to have Hinge-CH2-CH3A.
  • the IL21 used at this time was human IL21 (Uniprot entry name, Q9HBE4; SEQ ID NO. 4), and only the DNA sequence encoding the mature form, excluding the signal sequence, was used.
  • Bi-IL21-Fc fused to wild-type Fc was constructed.
  • the DNA sequence encoding human IL21 mature form was transferred to pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA), an animal cell expression vector containing wild-type IgG4 CH3 signal sequence-IL21 mature form-Mutated Hinge-CH2- It was cloned in-frame to have CH3 using NotI/HindIII restriction enzymes.
  • Table 2 shows the amino acid sequence of human IL21 used to construct the mono-IL21-Fc fusion protein and Bi-IL21-Fc fusion protein.
  • the amino acid sequence was constructed as a 131-amino acid peptide of the IL21 mature form (from amino acid number 32 to amino acid number 162 of human IL21) (Parrish-Novak et al. Nature, 2000;408(6808):57-63), and the numbering is mono-IL21-Fc is ranked the same as the previous research (Korean Patent Registration 10-1928981; US Patent Registration US10800825B2). That is, in this patent specification, the mature form of IL21 is named residues 32 to 1 and residues 1-131 (see Tables 2 and 4).
  • HEK293-F cells were seeded in 90 ml of medium at a density of 1.0 24 hours later, to produce fusion proteins containing each heterodimeric heavy chain constant region, the corresponding CH3A and CH3B plasmids were added to 4 ml FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen) at 125 ⁇ g for Fc ( ⁇ 1/4, WT);
  • FreeStyle 293 expression medium Invitrogen
  • the reacted mixed medium is added to the cells previously seeded at 90 ml and cultured for as short as 5 days or as long as 7 days.
  • the proteins produced by the cells are secreted outside the cells and accumulated in the medium. Therefore, the protein was purified from the cell culture supernatant collected by centrifugation at 3800 rpm for 25 minutes after cell culture using a Protein A Sepharose column (GE healthcare).
  • the purification method referred to the standard protocol provided by the Protein A column company, and the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with 1X PBS using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator.
  • the absorbance of the purified protein was measured at a wavelength of 562 nm using a solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve.
  • the results were expressed as the standard error of the mean (mean ⁇ SD) after performing three independent experiments. As a result of confirming the yield, it was confirmed that the mono-IL21-Fc fusion protein showed a much higher level of yield compared to the Bi-IL21-Fc fusion protein.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein was observed at 71 kDa and the Bi-IL21-Fc fusion protein at 86 kDa, and under reducing conditions, only one band was observed at 43 kDa for Bi-IL21-Fc, and IL21
  • the mono-IL21-Fc fusion protein which consists of two plasmids fused with the heterodimeric heavy chain constant region CH3A (EW) and the heterodimeric heavy chain constant region CH3B (RVT)
  • the expected protein size for heterodimer heavy chain constant regions CH3A and CH3B is about 25 kDa each, and 15 kDa for human IL21.
  • the reason why bands larger than the expected protein size were observed under reducing and non-reducing conditions is that human IL21 and It was judged to be due to N-Glycosylation within Fc. Looking at the SDS-PAGE results of the mono-IL21-Fc fusion protein under non-reducing conditions, it was found that the results differed depending on the plasmid ratio.
  • EW:RVT 1:1, 1.5:1, the mono-IL21-Fc fusion protein, which is a 1:1 combination of the heterodimeric heavy chain constant region CH3A (EW) and CH3B (RVT), cannot be formed, resulting in a heterodimeric heavy chain.
  • Figure 4 shows expressed wild-type Fc ( ⁇ 1/4, WT), heterodimeric heavy chain constant region Fc ( ⁇ 1/4, EW-RVT), and mono-IL21-Fc fusion protein (heterodimeric heavy chain constant region CH3A upon transformation).
  • EW:CH3B(RVT) expression vector ratio 1:1, 1.5:1, 2:1) to analyze physical properties
  • SEC Size Exclusion Chromatography, SEC was performed and time (minutes) was measured.
  • the buffer flows into the tube and is injected into the column.
  • a buffer containing a sample passes through a column with compressed porous resin, there is a difference in the elution time out of the column depending on the molecular weight, or size, of the protein in the sample.
  • chromatography is obtained by measuring the change in absorbance at 280 nm. Physical properties were analyzed through grams.
  • the chromatogram can be interpreted based on the principle that the smaller the protein, the more it passes through the inside of the porous resin and elutes at a later time, and the larger the protein, the faster it passes through the outside of the porous resin and elutes through the column. You can.
  • Example 4 Analysis of changes in SEC results of mono-IL21-Fc fusion protein according to analysis buffer composition
  • Example 3 the physical properties of the mono-IL21-Fc fusion protein were judged to be poor.
  • the structure of human IL21 was analyzed, and the results are shown in Figure 5.
  • the isoelectric point of IL21 is 9.42, and at pH 7.4, IL21 is positively charged. Through this, it was assumed that the positively charged side chain on the surface of IL21 interacts non-specifically with the column used during SEC analysis.
  • Example 5 Construction and expression/purification of IL21 variant of mono-IL21-Fc fusion protein
  • mutants mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-L21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT) in which amino acids with positive side chains are substituted.
  • -Fc was constructed (sequence information is specified in Table 4). Specifically, first, to obtain amino acid information revealed on the surface of IL21, the structure was analyzed using the Chimera X program using the already known protein structure (PDB ID: 3TGX) as a sample.
  • the atypical region greatly contributes to the formation of an unstable structure, and in the case of IL21, there are three arginines (85R, 86R, 126R) within the atypical region, which increases non-specificity and increases the possibility of forming oligomers, worsening physical properties, especially It was judged that non-specific interaction with the SEC column could lead to the results shown in Figure 4. Therefore, new clones were constructed by replacing arginine in the atypical region with an uncharged polar amino acid or lysine, which has a weaker positive charge than arginine, referring to the centromere (rabbit, pig) sequence (R85N, R86K, R126Q). This was named mono-IL21(NKQ)-Fc (SEQ ID NO: 5).
  • a new clone was constructed with amino acid substitutions (K52N, K56Q, R85D, R86D, K88N, R90T, R126D) including both mono-IL21(DDD)-Fc and mono-IL21(NQNT)-Fc substitution strategies. This was named mono-IL21(DDD NQNT)-Fc (SEQ ID NO: 8).
  • mono-IL21(NKQ)-Fc mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, and mono-IL21(DDD NQNT)-Fc clones
  • the animal cell expression vector pcDNA3.1 ( +) were cloned in-frame using NotI/HindIII to have each signal sequence-IL21 (variants) mature form-Mutated Hinge-CH2-CH3A (IgG4, EW).
  • mono-IL21-Fc fusion protein mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc are human IL21 wild type and mutant (NKQ or DDD or NQNT or DDD NQNT) expression vectors of IgG4 CH3A (EW) and IgG4 CH3B (RVT) fused at a ratio of 2:1 and polyethylenimine (PEI) (Polyscinece) were mixed into HEK293-F. This is accomplished by transient transfection of cells (Invitrogen) and culturing them in a shake flask containing serum-free FreeStyleTM 293 expression medium (Invitrogen). The detailed method is as follows.
  • 375 ⁇ g of PEI was mixed with 6ml of diluted medium (3.75 ⁇ g/ml) and reacted at room temperature for 10 minutes. Afterwards, the reacted mixed medium is added to the cells previously seeded at 90 ml and cultured for as short as 5 days or as long as 7 days.
  • the protein produced by the cells that is, the fusion protein containing the heterodimeric heavy chain constant region
  • the protein was purified from the cell culture supernatant collected by centrifugation at 3800 rpm for 25 minutes after cell culture using a Protein A Sepharose column (GE healthcare).
  • the purification method referred to the standard protocol provided by the Protein A column company, and the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with storage buffer (PBS pH 7.4) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator. did.
  • the absorbance of the purified protein was measured at a wavelength of 562 nm using a solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve (Table 5). The results were expressed as the standard error of the mean (mean ⁇ SD) after performing two independent experiments.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein variants showed an overall increased yield compared to the mono-IL21-Fc fusion protein. Through this, it was confirmed that there was no problem with the expression of the mono-IL21-Fc fusion protein amino acid substitution mutant constructed through the rationale.
  • mono-IL21-Fc fusion protein mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD) consisting of two plasmids, heterodimeric heavy chain constant region CH3A (EW) and heterodimeric heavy chain constant region CH3B (RVT). )-Fc, two bands were observed at 43 and 28 kDa.
  • the expected protein size for heterodimer heavy chain constant regions CH3A and CH3B is about 25 kDa each and 15 kDa for human IL21, but the reason why bands larger than the expected protein size were observed under reducing and non-reducing conditions is that human IL21 and Fc It was judged to be due to N-Glycosylation. As a result, it was confirmed that there was no problem in the expression of each heterodimeric heavy chain constant region of the amino acid substitution variant of the mono-IL21-Fc fusion protein and in the formation of the fusion protein through SDS-PAGE analysis.
  • FIG. 8 shows that SEC (Size Exclusion Chromatography, SEC) was performed to analyze the physical properties of the expressed mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, and mono-IL21(NQNT)-Fc, and the time ( This is a chromatogram showing the mAU value at 280 nm according to (min). It was measured using an HPLC (Agilent Technologies, USA) instrument and a Superdex200 10/300 GL column (Cytiva, USA) according to the following specific protocol.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • mono-IL21(NKQ)-Fc mono-IL21(DDD)-Fc
  • mono-IL21(NQNT)-Fc mono-IL21(NQNT)
  • the peak corresponding to the expressed fusion protein increased significantly compared to the mono-IL21-Fc fusion protein.
  • the peak did not appear as expected during SEC analysis due to the positive surface charge of human IL21, resulting in non-specific interaction with the column, and the biological properties of the mono-IL21-Fc fusion protein variant that alleviated this were investigated. This means that non-specific interactions are reduced when injected into the body, drug side effects are reduced, and pharmacokinetics can be increased.
  • Example 7 Construction and expression/purification of IL21 ortholog sequence graft variant of mono-IL21-Fc fusion protein
  • the mono-IL21-Fc fusion protein was constructed using a new strategy.
  • Helix C of IL21 was shorter than that of IL2 and IL4, the loop structure from Helix C to Helix D was significantly longer, and an irregular region between the loop structures also existed. It was determined that the structure of IL21 may also become unstable due to these structural differences. Therefore, we compared the complementary sequences of the corresponding regions of IL2 and IL4 with IL21, and used the sequence of IL4, which has relatively more hydrophilic residues than human IL2, which can cause structural instability when transplanting the sequence, which has many hydrophobic amino acid residues, to mono- An IL21-Fc fusion protein centromere sequence graft variant was constructed.
  • sequences from K77 to R90 including the atypical region of IL21, were replaced with the complementary human IL4 sequence and the centromere IL4 sequence, respectively, to construct a mono-IL21-Fc fusion protein centromere sequence graft variant (sequence information is specified in Table 6).
  • the variant using the human IL4 sequence was named mono-IL21(Helix 1)-Fc (SEQ ID NO: 9), and the variant using the centromeric IL4 sequence was named mono-IL21(Helix 2)-Fc (SEQ ID NO: 10).
  • mono-IL21-Fc fusion protein mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc is human IL21 wild type or IL21(Helix 1) or IL21(Helix 2) fused IgG4 CH3A(EW ) and IgG4 CH3B (RVT) expression vector at a ratio of 2:1 and polyethylenimine (PEI) (Polyscinece) were transiently transfected into HEK293-F (Invitrogen) cells to produce serum-free FreeStyle. This is achieved by culturing in shake flasks containing TM 293 expression medium (Invitrogen). The detailed method is as follows.
  • the protein was purified from the cell culture supernatant collected by centrifugation at 3800 rpm for 25 minutes after cell culture using a Protein A Sepharose column (GE healthcare).
  • the purification method referred to the standard protocol provided by the Protein A column company, and the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with storage buffer (PBS pH 7.4) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator. did.
  • the absorbance of the purified protein was measured at a wavelength of 562 nm using a solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve (Table 7).
  • Example 8 Evaluation of physical properties of IL21 centromere sequence graft variant of mono-IL21-Fc fusion protein
  • Figure 12 shows the previously constructed mono-IL21-Fc fusion protein, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT) for the expressed mono-IL21-Fc fusion protein ortholog sequence graft variant monomer fusion protein.
  • This is a chromatogram showing the mAU value at 280 nm by performing SEC (Size Exclusion Chromatography, SEC) for comparative analysis of physical properties with -Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc. It was measured using an HPLC (Agilent Technologies, USA) instrument and a Superdex200 10/300 GL column (Cytiva, USA) according to the following specific protocol.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • the mono-IL21-Fc fusion protein, mono-IL21 was tested using the Jurkat cell line, a CD4-positive human T cell line that expresses the IL21 receptor.
  • the receptor binding ability of -Fc and mono-IL21(DDD)-Fc was evaluated. Specifically, cells were prepared in an amount of 2.0 Mono-IL21(DDD)-Fc was treated in amounts of 200 nM and 50 nM, respectively, for 1 hour at 4°C. After washing with washing buffer again, the secondary antibody, anti-human IgG4 FITC, was treated for 30 minutes at 4°C under light-shielded conditions. Afterwards, it was washed with washing buffer and analyzed using a flow cytometry instrument, FACScalibur (BD bioscience, USA).
  • the binding ability to the IL21 receptor was evaluated by measuring the intensity of the fluorescence signal after labeling the experimental group that included the treatment with mono-IL21-Fc fusion protein and mono-IL21(variants)-Fc and the control group that did not with a fluorescent substance.
  • the results are shown in Figure 13.
  • mono-IL21(variants)-Fc also showed a similar fluorescence signal compared to the mono-IL21-Fc fusion protein, and as the concentration of the processed protein increased, the signal intensity also increased. there is.
  • the receptor binding ability of mono-IL21(variants)-Fc is maintained and there is no problem with biological activity.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • the expected limitation of the existing mono-IL21-Fc fusion protein mentioned in the present invention is that due to the high isoelectric point of wild-type IL21, the net charge is positive in the body pH environment, and a cationic patch is formed on the surface, forming a cationic patch on the surface, which is associated with various tissues in addition to the IL21 receptor.
  • the point is that it can interact non-specifically with cells. Accordingly, when the mono-IL21-Fc fusion protein is injected into the body, it has poor biological properties, side effects such as excessive immune response through non-specific interactions with other cells and tissues, and short pharmacokinetics. You can.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein in which human IL21 or a variant thereof is fused to the heterodimeric heavy chain constant region Fc ( ⁇ 1/4, EW-RVT) or a variant thereof is used to replace the existing mono-IL21-Fc.
  • Fc heterodimeric heavy chain constant region
  • the mono-IL21-Fc fusion protein or its variant according to the present invention is easy to develop as a therapeutic drug through high production yield, and the binding ability of the existing mono-IL21-Fc fusion protein to the IL21 receptor is maintained, thereby maintaining the original biological function ( Effective anti-cancer activity can be expected by maintaining T cell proliferation and toxicity, increased proliferation and toxicity for NK cells.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein or its variant according to the present invention can be used as a pharmacological composition that can increase the proliferation and activation ability of T cells and NK cells used in immune cell therapy in vitro and in vivo.
  • the mono-IL21-Fc fusion protein or its variant according to the present invention is used for basic experiments in immune cell culture to increase the proliferation and activation ability of T cells and NK cells used in immune cell therapy and for research use in the development of cell therapy. can be used as
  • the strategy for constructing a mono-IL21-Fc fusion protein or a variant thereof according to the present invention is to treat and prevent various diseases in which, in addition to IL21, it has a high positive charge in the body, has poor biological properties, is expected to cause side effects, and is expected to worsen pharmacokinetics.

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Abstract

본 발명은 인터루킨21 변이체, 상기 인터루킨21 변이체와 항체 중쇄불변부위를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 야생형 인터루킨21에서 일부 아미노산이 치환 및/또는 결실된 인터루킨21 변이체, 상기 인터루킨21 변이체에 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍이 융합된 융합단백질 및 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질의 암 예방 또는 치료 용도 및 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 이용한 면역세포 배양방법에 관한 것이다.

Description

인터루킨21 변이체, 이를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
본 발명은 인터루킨21 변이체, 상기 인터루킨21 변이체와 항체 중쇄불변부위를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 야생형 인터루킨21에서 일부 아미노산이 치환 및/또는 결실된 인터루킨21 변이체, 상기 인터루킨21 변이체에 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍이 융합된 융합단백질 및 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질의 암 예방 또는 치료 용도 및 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 이용한 면역세포 배양방법에 관한 것이다.
사이토카인(cytokine)은 혈액 속에 함유되어 있는 비교적 작은 크기의 면역 단백질 중 하나다. 사이토카인은 세포로부터 분비된 후 다른 세포나 분비한 세포 자신에게 영향을 주어, 세포 신호화(cell signaling)에 중요한 역할을 한다.
사이토카인은 생체 조절에 필수적인 단백질로서 세포의 증식과 분화를 유도하고, 기능과 활성의 변화를 촉진하여 면역계 질환, 알러지, 아토피, 염증 및 다양한 형태의 종양에 관련되어 있다. 최근 면역항암제 및 면역세포치료제 발달과 더불어, 면역세포 배양의 기초실험과 세포치료제 개발에 사용되는 연구용, 의학품용 사이토카인류 단백질의 수요가 기하급수적으로 증가하고 있다.
인터루킨21 (Interleukin-21, IL21)는 사이토카인(cytokine)이다. IL21은 IL4, IL7, IL9, IL13, 및 IL15를 포함하는 사이토카인의 IL2 과(family)의 구성원이다. 이 과의 단백질은 항암 및 항바이러스 효과 모두를 가지는 것으로 나타났다.
IL21은 활성화된 헬퍼 T (CD4+ helper T cells, TH1) 세포 및 natural killer T (NK-T) 세포에 의해 생산되며, 면역에 있어서 중요한 조절자로 알려져 있다. 특히, 종양 및 바이러스로 감염된 세포를 박멸하는 두개의 림프구 클래스인, CD8+ 킬러 T 세포 (CD8+ cytotoxic T lymphocyte) 및 natural killer (NK) 세포의 증식(proliferation) 및 세포독성 기능(cytotoxicity effector function)을 활성화한다 (Spolski et al., Nat Rev Drug Discov. 2014;13(5):379-95). 또한, IL21은 B-세포의 선택 클래스를 자극한다. 따라서, IL21은 면역세포, 특히, NK 세포의 증식 및 활성화를 유도하는 사이토카인으로서 면역세포치료에 필수적이다. 그러나 현재까지 환자에게 직접 투여할 수 있도록 임상에 시판 승인된 사이토카인은 IL-2가 유일한 실정이다. IL2는 NK 세포의 생존능과 활성을 증대시키며 비용도 상대적으로 저가이지만, 면역억제세포인 조절 T 세포 (Regulatory T cells)를 활성화시켜 항암면역기능을 억제시키는 단점이 있다. 따라서, 조절 T 세포를 활성화시키지 않고 NK 세포를 활성화시키는 사이토카인의 상용화가 절실한 실정이다.
이러한 관점에서 최근 IL21이 항암면역 치료에 있어서 각광을 받고 있다. IL21은 IL2와 유사하게 CD4 양성 T 세포와 CD8 양성 T 세포의 증식과 분화를 촉진하나, 반대로 조절 T 세포의 증식에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고되어 항암면역 세포치료제와의 병용투여가 기대되고 있다 (Al-Chami et al., Cytokine, 2016;82:33-37). 또한 IL21은 CD8 T 세포에서 기억세포로의 분화를 촉진시키며 (Li et al., Journal of Immunology, 2005), 특히 최근 연구에서는 HDAC 억제제와 함께 처리시 분화된 T세포의 유전자 리프로그래밍을 유도하며 stable memory-associated transcriptional signature를 획득하여 (increased Lef1 and Tcf7)기억세포로 Dedifferentiaion 을 가능케하는 것이 보고 되었다 (Wang et al., Cancer Immunology Research, 2020). IL21이 NK 세포 관련하여 보고된 바로는 1) IL15과 함께 Fms-like tyrosine kinase-3 (FLT3-L)가 존재할 때 사람 유래 CD34 양성 hematopoietic progenitor cells에서 유래한 NK 세포의 증식을 촉진한다는 결과 (Parrish-Novak et al. Nature, 2000;408(6808):57-63), 2)영양 세포주로 사용하는 K562세포에 membrane bound form IL21을 발현시키면 NK 세포의 체외 확장을 촉진시키고 노화가 억제되는 결과 (Lee DA et al. PlosOne, 2012;7(1):e30264), 3) Canine NK 세포의 배양 시 IL2 plus IL15에 의한 증식을 촉진하는 결과 (Shin et al., Vet Immunol Immunopathol. 2015;165(1):1-13) 4) Human NK 세포에서 STAT3를 활성화시켜 NKG2D수용체의 발현을 촉진시키는 결과 (Zhu et al., Blood, 2014;124(3):403-411) 등이 있다.
재조합 인간 IL21(recombinant human IL21)은 전임상 및 임상시험에서 항암활성(antitumor activity)을 보였다. 하지만, 전신투여시 짧은 반감기와 IL21 수용체를 발현하는 타 면역세포들에 의하여 소진되어 종양부위로 타겟팅이 어려워 고농도로 투여를 하게 되었고, 다양한 면역세포에 동시작용하는 다면활성(Pleiotropic function) 따른 독성으로 임상 1상시험에서 실패했다 (Petrella et al., Journal of Clinical Oncology, 2013). 다양한 면역세포에 동시작용하는 다면활성(Pleiotropic function) 따른 독성으로 임상 1상시험에서 실패했다. 이런 단점을 극복하기 위해 여러 시도가 있어왔다. 반감기를 늘리기 위해 IL21을 항체의 이종이중체 중쇄불변부위 (Heterodimeric Fc)에 단량체 형태로 결합한 형태인 mono-IL21-Fc 융합단백질이 있다 (대한민국 특허등록 10-1928981; 미국특허등록 US10800825B2). 또한 IL21에 종양을 표적하는 항체에 융합한 이뮤노사이토카인(antibody-cytokine conjugate, immunocytokine)을 개발하려는 시도가 있었다 (Shen et al. Front. Immunol. 2020;11:832). 하지만, IL21의 단백질 구조가 많은 양전하(positive charge)을 띠는 아미노산들이 표면에 노출되어 있고, 구조적으로도 다른 IL2및 IL4에 비해 안정성(stability)이 감소하는 문제가 있다. 이러한 단점은 전신 투여 시에, 체내의 다른 세포 및 조직에 분포하고 쉽게 분해되어 짧은 혈액반감기(serum half-life)을 유도하여, 궁극적으로 짧은 약물동력학 (Pharmacokinetics)을 초래하여 치료제로서 바람직하지 않은 특성을 가지고 있다. 이를 개선하기 위해서 재조합 IL21 형태에서 양전하를 줄이려는 돌연변이를 도입 및 다른 구조적 안정성을 부여하는 시도는 있어왔다 (미국등록특허 US8,475,784B2; Bondensgaard et al. J. BioI. Chem. 2007;282(32):23326-23336). 그럼에도 불구하고, IL21의 물성이 개량되어 긴 반감기를 부여할 수 있는 변이체 개발은 여전히 요구되는 실정이다.
자연계에 존재하는 인간 항체(Immunoglobulin G (IgG), IgM, IgD, IgE, IgA)는 동일한 아미노산 서열을 가진 두 개의 중쇄와 동일한 서열을 가진 두 개의 경쇄가 조합 (assembly)된 형태로 존재한다. 이 때, 동일한 두 개의 중쇄 간의 동종이중화 (homodimerization)는 항체의 불변영역(Constant Region)의 마지막 도메인(IgG, IgD, IgA의 경우 CH3 도메인, IgM의 경우 CH4 도메인, IgE의 경우 CH2 및 CH4 도메인)간의 비공유결합(non-covalent interaction) 및 힌지(hinge)영역 간의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 유도된다.
항체 유래 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 기술은 앞선 자연발생적 항체(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)의 동종이중화(homodimerization)에 큰 기여를 하는 불변영역의 마지막 도메인간의 상호작용면에 특정 비공유결합을 통해 이종이중화(heterodimerization)가 선호되고 동종이중화가 비선호되거나 배척되는 결합을 가지도록 엔지니어링함으로써 이종이중체 형태의 중쇄불변부위가 형성되게 하는 기술이다. 더 자세하게는 유전자 조작을 통해 각기 다른 두 개의 항체 중쇄의 CH3 도메인에 돌연변이를 유도하여, 두 개의 중쇄가 자연발생적 항체와 구조가 매우 유사하고, 서열에 있어 최소한의 편차를 가지면서 이종이중체를 형성하도록 유도하는 것이다. 그 중에서도 본 발명에서 사용한 EW-RVT heterodimeric Fc 돌연변이체는 기존의 위와 같은 돌연변이체의 상호작용을 서열 및 구조적으로 분석하여, 새로운 돌연변이 전략인 CH3 도메인 상호작용면의 선택적인 정전기적 결합이 형성되게 하고 (K360ECH3A-Q347RCH3B), 기존의 정전기적 결합 대신 상호보완적인 소수성 결합을 형성하도록 (K409WCH3A-D399VCH3B/F405TCH3B)하여 이종이중체의 형성을 증진시킨 돌연변이체이다 (미국등록특허 제9,951,145호; 대한민국 등록특허 제1,522,954호; Choi HJ et al. Molecular Cancer Therapeutics, 2013;12(12): 2748-2759). 기존의 mono-IL21-Fc 융합단백질은 hinge-CH2-CH3영역이 human IgG1, IgG2, IgG4의 서열을 도입한 EW-RVT heterodimeric Fc(γ1/2/4, EW-RVT)에 기반해 제작했다 (대한민국 특허등록 10-1928981; 미국특허등록 US10800825B2). 이렇게 제조한 mono-IL21-Fc 융합단백질은 IL21이 야생형 Fc(γ1/2/4)에 융합된 bi-IL21-Fc에 비교하여 우수한 NK 세포 증식 촉진 기능을 보이며, 체내에서 적인 빈도의 투여로 수용성 IL21이나 Bi-IL21-Fc에 비해 월등한 항종양 효과를 유도 가능하다는 것을 확인하였다 (대한민국 특허등록 10-1928981; 미국특허등록 US10800825B2).
IL21의 분자 구조 분석 결과, 양전하를 띠는 곁사슬을 가진 아미노산이 CD8+ 킬러 T 세포 (CD8+ cytotoxic T lymphocyte) 및 natural killer (NK) 세포의 증식(proliferation) 및 활성화(Activation) 조절에 영향을 미치는 사이토카인 (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IFNs)들과 비교했을 때 상대적으로 많으며, 결과적으로 IL21는 9.42의 등전점(isoelectric point, pI)을 가져, 체내 pH 조건에서 순전하가 양으로 하전되는 성질을 가짐을 확인했다. 또한, 3차 구조 상 표면에 양전하를 띠는 아미노산이 모여 있는 이온 패치를 형성하여 체내에서 여러 다른 수용체 및 세포와 비특이적인 상호작용을 하여 체내로 투여되었을 때 이로 인한 부작용을 나타낼 수 있음이 예상되었다.
이러한 기술적 배경 및 한계점 하에서, 본 출원의 발명자들은 야생형 인터루킨21에서 일부 아미노산이 치환 및/또는 결실된 인터루킨 21 변이체, 상기 인터루킨21 변이체, 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함하고 상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인이 변이를 포함하는 이종이중체 (heterodimer)인 융합단백질을 개발하고, 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따라 개발된 변이체는 기존 mono-IL21-Fc 융합단백질과 비교하여 우수한 생물학적 활성능과 항 종양활성을 지니는 것을 발견하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 야생형 인터루킨21에서 하나 이상의 아미노산 서열이 치환 또는 결실된 인터루킨21 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 인터루킨21 변이체 및 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환 재조합 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다. 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 암의 예방 또는 치료용 조성물 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 면역세포에 처리하는 것을 포함하는 배양방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨21 (IL21)에서 N-말단을 기준으로 50, 54, 75 내지 88 및 124번 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열이 치환 또는 결실된 인터루킨21 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 인터루킨21 변이체; 및 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함하고, 상기 Fc쌍은 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 변이를 포함하는 이종이중체 (heterodimer)인, 융합단백질에 관한 것이다.
본 발명은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 상기 핵산을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는, 형질전환 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 회수하는 단계.
본 발명은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 암의 예방 또는 치료용 제제의 제조에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 면역세포에 처리하는 것을 포함하는 배양방법에 관한 것이다.
도 1a는 인간 IL21 사이토카인을 EW-RVT heterodimeric Fc에 monovalent 단량체 형태로 구축한 mono-IL21-Fc 융합단백질 (IL21 단량체-Fc 융합단백질)의 모식도이다. 여기에서 사용된 EW-RVT heterodimeric Fc는 인간 IgG1의 hinge 영역 서열과 인간 IgG4의 CH2-CH3 영역을 가지고 있는 Fc(γ1/4)에 EW-RVT 돌연변이를 도입한 것이다. Mono는 단량체(monovalent monomer)를 의미한다.
도 1b는 도 1a의 비교예로, 인간 IL21 사이토카인을 야생형 Fc에 bivalent 형태로 구축한 Bi-IL21-Fc 융합단백질(IL21 이량체-Fc 융합단백질)의 모식도이다. 야생형 Fc는 인간 IgG1의 hinge 영역 서열과 인간 IgG4의 CH2-CH3 영역을 가지고 있는 Fc(γ1/4)이다. Bi는 이량체 (bivalent dimer)을 의미한다.
도 2는 도 1a의 융합단백질을 동물세포에서 발현 및 정제하기 위한 발현 벡터 Fc(γ1/4)의 CH3A(EW) 및 Fc(γ1/4)의 CH3B(RVT)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 명시된 야생형 Fc (γ1/4, WT), 이종이중체 중쇄불변부위 Fc (γ1/4, EW-RVT), Bi-IL21-Fc와 mono-IL21-Fc 융합단백질 (mono-IL21-Fc 융합단백질의 경우, 동물세포 형질전환 시 사용된 CH3A (EW):CH3B(RVT) 발현벡터의 비율=1:1, 1.5:1, 2:1) 융합단백질을 HEK293F 세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 5μg의 단백질을 비환원성 조건과 환원성 조건의 10% SDS-PAGE 상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다. Non-reducing은 비환원성 조건, Reducing은 환원성 조건, M은 단백질 마커 (marker)이다.
도 4는 상기 구축된 mono-IL21-Fc 융합단백질 (동물세포 형질전환 시 사용된 CH3A(EW):CH3B(RVT) 발현벡터 비율=1:1, 1.5:1, 2:1)를 야생형 Fc(γ1/4, WT), 그리고 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT)와 함께 크기 배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatography, SEC)를 이용하여 분석한 결과이다. SEC분석에서 running buffer는 1X PBS (pH 7.4, 12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl), Flow rate은 0.75 ml/min, 단백질 투입량은 30 μg (1mg/ml 로 30 μl injection)이었다.
도 5는 인간 IL21 야생형 (PDB ID:3tgx)의 구조를 Chimera X 프로그램을 통해 시각화 시키고, 각 아미노산 곁사슬의 특성에 따라 지정된 색으로 강조한 것이다. 파란색은 양전하 곁사슬을 가지는 아미노산, 빨간색은 음전하 곁사슬을 가지는 아미노산, 회색은 소수성 곁사슬을 가지는 아미노산, 그리고 초록색은 그 외의 아미노산을 나타낸다.
도 6a는 상기 구축된 mono-IL21-Fc 융합단백질을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다. 상기 크기 배제 크로마토그래피에서 running buffer는 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl), Flow rate는 0.75 ml/min, 단백질 투입량은 30 μg (1mg/ml 로 30 μl injection)이었다.
도 6b는 상기 구축된 mono-IL21-Fc 융합단백질을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다. 상기 크기 배제 크로마토그래피에서 running buffer는 High Salt PBS(pH7.4, 12mM phosphate, 2.7mM KCl, 500 mM NaCl)이고, Flow rate는 0.75 ml/min, 단백질 투입량은 30 μg (1mg/ml 로 30 μl injection)이었다.
도 7은 인간 IL21 야생형에 비교하여 본 발명에서 구축한 IL21 아미노산 치환 변이체들의 서열 중 바뀐 서열을 나타내며 그 명명법 및 근거에 대한 그림을 나타낸 것이다.
도 8은 mono-IL21-Fc 융합단백질 아미노산 치환 변이체인 mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc을 HEK293F 세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 대조군인 mono-IL21-Fc 융합단백질과 함께 5μg의 단백질을 비환원성 조건과 환원성 조건의 10% SDS-PAGE 상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다. Non-reducing은 비환원성 조건, Reducing은 환원성 조건, M은 단백질 마커 (marker)이다.
도 9는 mono-IL21-Fc 융합단백질 아미노산 치환 변이체인 mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc를 대조군인 mono-IL21-Fc 융합단백질과 함께 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다. 상기 SEC분석에서 running buffer는 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl)이고, Flow rate는 0.75 ml/min, 단백질 투입량은 30 μg (1mg/ml 로 30 μl injection)이었다.
도 10은 인간 IL21 야생형에 비교하여 본 발명에서 구축한 IL21 동원체(ortholog) 서열 이식 변이체들의 서열 중 바뀐 서열을 나타내며 그 명명법 및 근거에 대한 그림을 나타낸 것이다.
도 11은 mono-IL21-Fc 융합단백질 동원체(ortholog) 서열 이식 변이체인 mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc를 HEK293F 세포에 공동형질 전환을 통해 일시적으로 발현 및 정제한 다음, 대조군인 mono-IL21-Fc 융합단백질과 함께 5μg의 단백질을 비환원성 조건과 환원성 조건의 10% SDS-PAGE 상에서 분리하고, Coomasie Blue 염색을 통해 크기 및 조합형태로 분석한 결과이다. Non-reducing은 비환원성 조건, Reducing은 환원성 조건, M은 단백질 마커 (marker)이다.
도 12는 mono-IL21-Fc 융합단백질 융합단밸질 동원체(ortholog) 서열 이식 변이체인 mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc를 대조군인 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc와 함께 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다. 상기 SEC분석에서 running buffer는 1XPBS이고, running buffer의 Flow rate은 0.75 ml/min, 단백질 투입량은 30 μg (1mg/ml 로 30 μl injection)이었다.
도 13은 mono-IL21-Fc 융합단백질 및 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체의 IL21이 세포표면의 IL21 수용체 (IL21 receptor)에 결합하는 정도를 FACS로 분석한 것이다. 인간 IL21 수용체를 발현하는 Jurkat 세포주(human CD4+ T-cell line)에 40nM, 200nM의 농도로 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc 및 야생형 Fc를 처리한 후, 항-인간 IgG4 항체와 형광물질인 FITC가 융합된 항체로 형광표지하여 FACScalibur를 통해 형광 세기를 측정한 것이다.
도 14는 mono-IL21-Fc 융합단백질 및 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체에 의한 NK세포 증식효과를 나타낸 결과이다. 정상인의 혈액에서 분리한 PBMC에 100 grey의 감마 방사선 조사된 Jurkat (KL-1) 세포와 EBV-transformed LCL 세포 존재 하에 IL-2 (30 ng/ml monomeric IL-2 Fc)를 첨가하여 NK 세포를 배양하였다.
a, NK세포 배양 방법 및 스케줄에 대한 타임라인이다.
b, Day 0, 6, 14 에 획득한 NK세포의 수득률과 NK세포의 퍼센트를 나타낸 테이블이다.
c, Day 0, 6, 14 에 획득한 NK세포의 수득률을 나타낸 라인 그래프이다.
c, Day 0, 6, 14 에 획득한 NK세포의 수득률을 나타낸 바 그래프이다.
도 15는 mono-IL21-Fc 융합단백질 및 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체에 의한 NK세포 증식효과를 나타낸 결과이다. CD4/CD8 T 세포를 제거한 PBMC에 100 grey의 감마 방사선 조사된 Jurkat (KL-1) 세포와 EBV-transformed LCL 세포 존재 하에 IL-2 (30 ng/ml monomeric IL-2 Fc)를 첨가하여 NK 세포를 배양하였다.
a, NK세포 배양 방법 및 스케줄에 대한 타임라인이다.
b, Day 0, 6, 14 에 획득한 NK세포의 수득률과 NK세포의 퍼센트를 나타낸 테이블이다.
c, Day 0, 6, 14 에 획득한 NK세포의 수득률을 나타낸 라인 그래프이다.
c, Day 0, 6, 14 에 획득한 NK세포의 수득률을 나타낸 바 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨21 (IL21)에서 N-말단을 기준으로 50, 54, 75 내지 88 및 124번 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열이 치환 또는 결실된 인터루킨21 변이체에 관한 것이다.
인간 IL21 사이토카인의 성숙형태 (mature form) 서열에 해당하는 아미노산 잔기 1번 내지 131 위치로 구성된(본 명세서에는 signal peptide 및 propeptide를 제외하고, 1번-131번으로 표기), 서열번호 4의 인간 IL21에서 일부 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있다.
(1) IL21 구조 분석을 통해 물성 악화에 원인이 될 가능성이 높은 아미노산 서열 및 영역을 선정하는 단계; (2) 상기 선정한 아미노산 자리 및 영역에, 물성 향상을 위해 치환될 아미노산을 디자인하는 단계; 및 (3) 상기 디자인한 IL21 변이체를 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT)와 융합하여 발현/정제한 후, 생물학적 물성을 분석하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
치료용 단백질 후보의 물성을 확인 및 개량은 치료용 단백질 제작에 중요하다. 치료용 단백질의 물성은 그 단백질의 치료 효능 및 약물동력학, 부작용의 유무를 좌우할 수 있다. 치료용 단백질의 물성은 단백질의 체내 순전하, 소수성 정도, 단백질의 부적절한 폴딩으로 인해 감소할 수 있다. 체내 순전하가 양 또는 음으로 강하게 하전되거나, 소수성이 강해 체내 수용성 환경에 용해될 수 없거나, 단백질이 체내에서 적절하게 폴딩 상태를 유지할 수 없는 경우 물성이 나빠질 수 있다. 이는 그 단백질의 구조 및 기능은 유지시키면서 물성 악화의 원인이 되는 아미노산을 선별하여 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다.
인간 IL21의 구조는 클래스 1 사이토카인에 대해 전형적으로 나타나는 업-업-다운-다운으로 배열된 4개의 나선(helix A, B, C, 내지 D) 구조와 나선 구조를 이어주는 루프 구조를 가진다. 구조적인 특성으로는, 인간 IL21의 mature form의 서열에서, 4번 내지 23번 아미노산이 Helix A, 41번 내지 56번 아미노산이 Helix B, 62번 내지 74번 아미노산이 Helix C, 102번 내지 120번 아미노산이 Helix D를 형성한다. IL21 수용체와의 결합에서는 14개의 IL21 잔기와 16개의 IL21 수용체 잔기가 반데르발스 결합을 형성하고, 그 중 IL21 Helix A 서열 내 3번 아르기닌, 7번 아르기닌, 10번 글루타민, Helix C 서열 내 74번 아르기닌, 71번 라이신이 가장 주된 아미노산이라고 알려져 있다. 본 발명에서는 이와 같은 야생형 IL21의 구조 및 기능에 영향을 주지 않으면서 생체 내 생물학적 물성을 향상시키기 위해서, 아미노산 치환 전략과 동원체 서열 이식 전략을 이용한다.
구체적으로, 상기 인터루킨21 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열 중 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있다:
(1) K50N,
(2) K54Q,
(3) K75L,
(4) P76D,
(5) P77R,
(6) S78N,
(7) T79L,
(8) R83N, R83D, R83L,
(9) R84K, R84D, R84W,
(10) Q85G, Q85S,
(11) K86N, K86L,
(12) H87A,
(13) R88T, R88G, R88N,
(14) R124Q, R124D,
(15) 79 내지 82번 위치의 아미노산 결실, 및
(16) 81 내지 84번 위치의 아미노산 결실.
본 발명에 따르면, IL21의 표면 양전하를 줄이기 위해서 양전하 곁사슬을 가진 아미노산이 치환된 IL21변이체를 구축하였다. 이를 바탕으로, 상기 인터루킨21 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열 중 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다:
(1) R83N, R84K, R124Q;
(2) R83D, R84D, R124D;
(3) K50N, K54Q, R86N, R88T; 및
(4) K50N, K54Q, R83D, R84D, R86N, R88T, R124D.
본 발명에 따르면, IL21의 비정형 영역을 포함한 K75~R88까지의 서열을 각각 상보적인 인간 IL4 서열과 동원체 IL4 서열로 바꾸어 mono-IL21-Fc 융합단백질 동원체 서열 이식 변이체를 구축하였다. 이를 바탕으로, 상기 인터루킨21 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열 중 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다:
(1) K75L, P76D, P77R, S78N, 79 내지 82번 위치의 아미노산 결실, R83L, R84W, Q85G, K86L, H87A, R88G; 및
(2) K75L, P76D, P77R, S78N, T79L, 81 내지 84번 위치의 아미노산 결실, Q85S, K86L, H87A, R88N.
구체적 실시예에서, 상기 인터루킨21 변이체는 서열번호 5 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "변이"란 아미노산을 해당 단백질의 구조 및 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 단백질의 변형을 의미한다. "아미노산 치환"은 해당 아미노산을 구조적으로는 유지시키나, 다른 화학적 특성을 가지는 곁사슬을 가진 아미노산으로 대체시키는 치환이다. 자연계 존재하는 아미노산은 유사한 특성을 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류될 수 있고, 이는 잘 알려져 있다. 이들 분류는 염기성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명은 인간 IL21을 아미노산 치환 전략을 통해 구축한 IL21 변이체를 제공하며, 여전히 활성을 보유할 수 있음을 보인다.
본 명세서에서 "동원체 서열 이식"이란 IL21과 같은 과(family)의 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15)의 특정 서열 영역을 참고하여 IL21의 동일한 위치의 영역의 아미노산과 치환하는 것을 의미한다. IL21의 구조 분석 결과 Helix C에서 Helix D로 넘어가는 CD 루프 구조와 C 말단 영역이 구조적으로 결정이 되지 않는 비정형 영역이다. 비정형 영역의 형성은 여러 원인이 있지만, 그 중 가장 큰 원인이 불안정한 구조의 형성이므로, 해당 영역에 IL21과 같은 계열의 사이토카인의 서열을 참고하여, 가장 안정한 구조를 이룰 수 있을 것이라고 예상되는 CD 루프의 서열을 이식하여 이를 적용한 IL21의 변이체는 야생형과 비교하여 더 향상된 물성을 가질 것이라고 추측되었다.
본 발명의 인간 IL21 변이체는 목적하는 기능을 유지하는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 IL21 변이체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, IL21의 물성 또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 즉, 앞서 본 바와 같이 아미노산 잔기 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 잔기 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 IL21 변이체, 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함하고, 상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 변이를 포함하는 이종이중체 (heterodimer)인, 융합단백질에 관한 것이다.
인터루킨21 (Interleukin-21, IL21) 사이토카인이 항체 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(Heterodimeric Fc)에 단량체 형태로 융합한 융합단백질 ("IL21 단량체-Fc 융합단백질", "Heterodimeric Fc-fused IL21 monomer proteins", 또는 "mono-IL21-Fc 융합단백질"로 명명됨) 또는 인터루킨 21의 변이체가 항체 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(Heterodimeric Fc)에 단량체 형태로 융합한 융합단백질 ("IL21 단량체-Fc 융합단백질 변이체", "Heterodimeric Fc-fused IL21 variant monomer proteins", 또는 "mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체"로 명명됨)에 관한 것이다.
인터루킨21 (Interleukin-21, IL21) 사이토카인이 항체 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(Heterodimeric Fc)에 다이머 형태로 융합한 융합단백질 ("IL21 다이머-Fc 융합단백질 변이체", "Heterodimeric Fc-fused IL21 variant dimeric proteins", 또는 "dimer-IL21-Fc 융합단백질 변이체"로 명명됨)에 관한 것이다.
인터루킨21 변이체의 경우 야생형 IL21의 아미노산 돌연변이를 통해 IL21의 비특이적 반응성을 감소시키고 및 구조적 안정성을 증가시킨 돌연변이체를 디자인하여, 이를 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체 형태로 발현했을 경우 융합단백질의 발현양도 증가시키고 생리학적 조건(Physiological conditions)에서 바람직하지 않은 올리고머 (oligomer) 형성을 줄이고, 모노머 (monomer) 형태로 존재할 수 있도록 생물학적 물성을 개량한 것이다.
구체적으로, 야생형 IL21의 융합단백질인 mono-IL21-Fc 융합단백질에 비해 생물학적 물성이 향상되었지만, 세포표면에 발현된 IL21 수용체 (IL21 receptors)와 결합 능력 및 면역세포의 증식능을 보존하는 물성을 향상시킨 IL21 변이체를 개발하기 위한 기술이다.
야생형 IL21을 포함하는 융합단백질인 mono-IL21-Fc 융합단백질의 생리학적 조건에서 비특이적 상호작용을 줄임으로써 1) 체내에서 발생 가능한 부작용을 감소시키고, 2) 약물동력학 (pharmacokinetics)을 향상시키고, 3) 재조합 단백질 IL21 사이토카인의 짧은 반감기로 인하여 요구되는 빈번한 생체투여를 대체할 수 있으며, 4) 이에 따른 고가비용의 단점을 해결할 수 있는 IL21 변이체 포함 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체를 개발하기 위한 기술이다.
먼저 야생형 IL21이 인간 IgG1의 hinge 영역 서열과 인간 IgG4의 CH2-CH3 영역을 가지고 있는 Fc(γ1/4)에 기반한 EW-RVT 돌연변이를 도입한 이종이중체 중쇄불변부위 EW-RVT heterodimeric Fc(γ1/4, EW-RVT)에 융합된 mono-IL21-Fc 융합단백질 단량체 융합단백질을 구축하였다. 이후에, 야생형의 IL21의 구조를 분석하고, 단백질의 물성 및 특이성에 영향을 줄 수 있는 서열을 선정하여 아미노산 단위로 치환하거나 같은 계열의 사이토카인의 서열을 이식한 것을 디자인하고, 이를 mono-IL21-Fc 융합단백질 형태로 발현시켜, 발현양도 증가시키고 생리학적 조건(Physiological conditions)에서 바람직하지 않은 올리고머 (oligomer) 형성을 줄이고, 모노머 (monomer) 형태로 존재할 수 있는 mono-IL21-Fc 융합단백질의 변이체를 개발하였다.
본 발명에서는 IgG1의 hinge 영역 서열과 인간 IgG4의 CH2-CH3 영역을 가지고 있는 Fc(γ1/4)에 기반한 EW-RVT 돌연변이를 도입한 EW-RVT 이종이중체 Fc(γ1/4, EW-RVT)를 사용했다. 또한 비교예로 인간 IgG1의 hinge 영역 서열과 인간 IgG4의 CH2-CH3 영역을 가지고 있는 야생형 Fc(γ1/4, WT)을 이용하여, Bi-IL21-Fc 융합단백질(IL21 이량체-Fc 융합단백질)을 구축하여 비교하였다.
이를 바탕으로, 본 발명은 mono-IL21-Fc 융합단백질의 야생형 IL21 아미노산 서열을 치환하거나, 동원체(ortholog)의 사이토카인의 서열을 이식한 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체를 제공한다. 더욱 구체적으로 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체 개발을 위한 IL21 구축 근거는 1) IL21 단백질 표면 양전하를 줄여 체내 비특이적 상호작용을 줄임으로써 물질의 안정성을 향상시키고, 체내 비특이적 상호작용을 줄이며, 이를 통해 더 긴 체내 반감기를 가지는 융합단백질의 제작, 2) IL21과 같은 과(family)의 사이토카인의 IL-2, IL-4와의 서열을 비교하여 IL21 구조 상, 불안정성을 야기할 수 있는 서열을 IL-2, IL-4의 서열로 이식시킴으로써 IL-2, IL-4가 가지는 더 나은 체내 안정성을 모방, 3) mono-IL21-Fc 융합단백질과 비교하였을 때 인간 IL21 수용체를 보이는 세포주에서의 수용체 결합능이 유지되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따른 인터루킨21 변이체 포함 융합단백질 변이체 (heterodimeric Fc-fused protein variants)는 기존 구축된 mono-IL21-Fc 융합단백질의 구조는 유지함으로써, 그 기능과 활성을 유지할 수 있는 형태의 단백질을 제공한다.
"Fc 영역"은 항체 유래의 힌지 영역(hinge domain), CH2 도메인, CH3 도메인을 포함하는 영역을 의미한다. 본 발명에서의 "제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역은 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 형성이 촉진되도록 변이"되었다는 표현은 자연계에 존재하는 항체는 2개의 Fc 영역이 서로 동일한 서열을 가지는 동종이중체 중쇄불변부위(homodimeric Fc) 형태를 가지게 되는데, 이러한 Fc 영역의 일부 서열에 변이를 유발시킴으로써, 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역 간의 특정 비공유 결합을 통해 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 형성이 촉진되며, 동종이중체의 형성이 감소되거나, 바람직하게는 거의 일어나지 않도록 변이되었다는 것을 의미한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역의 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 형성이 촉진되도록 하는 변이는, 상기 항체 유래 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역에 포함된 CH3 도메인 각각이 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)의 형성이 촉진되도록 하는 변이를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 이종이중체 중쇄불변부위는 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하고, 상기 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역은 이종이중체 중쇄불변부위의 형성이 촉진되도록 CH3 도메인이 변이된 것임을 특징으로 하는 이종이중체 중쇄불변부위를 의미한다.
상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 변이는 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하고 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 한다:
(1) 제 1 Fc 영역의 CH3 도메인 중 K370 위치에서 K370E, K370R, K370M, K370D 또는 K370H로 치환;
(2) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인 중 K409 위치에서 K409W로 치환;
(3) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 E357 위치에서 E357N, E357D, E357A, E357I, E357G 또는 E357M로 치환, 및 S364 위치에서 S364T 또는 S364W로 치환; 및
(4) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 F405 위치에서 F405T로 치환, 및 D399 위치에서 D399V로 치환.
상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 다음을 추가로 포함하고 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 할 수 있다:
(i) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인 내 Y349 위치에 치환된 시스테인 (C); 또는
(ii) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인 내 S354 위치에 치환된 시스테인 (C).
구체적으로, 상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인의 변이는 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다: (단, 변이 위치는 EU index에 따름)
(1) 제 1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K360 위치에서의 K360E의 아미노산 잔기의 치환;
(2) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인의 E347 위치에서의 E347R의 아미노산 잔기의 치환;
(3) 제 1 Fc 영역의 CH3 도메인의 K409 위치에서의 K409W의 아미노산 잔기의 치환; 및
(4) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인의 F405 위치에서의 F405T 아미노산 잔기의 치환 및 D399 위치에서의 D399V의 아미노산 잔기의 치환.
상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 다음을 추가로 포함하고 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 할 수 있다:
(i) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인 내 Y349 위치에 치환된 시스테인 (C); 또는
(ii) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인 내 S354 위치에 치환된 시스테인 (C).
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 상기 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 변이는 (1) 제 1 Fc 영역의 CH3 도메인 중 K360 위치에서 K360E로 치환, K409 위치에서 K409W로 치환; 및 (2) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 E347 위치에서 E347R로 치환; 및 F405 위치에서 F405T로 치환 및 D399 위치에서의 D399V로 치환을 포함하고, 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 할 수 있다 (이하, EW-RVT로 명명됨).
본 발명에 있어서, EW-RVT 이종이중체 Fc는 IgG1의 hinge 영역 서열과 인간 IgG4의 CH2-CH3 영역을 가지고 있는 Fc(γ1/4)에 기반한 상기 EW-RVT 돌연변이를 도입한 EW-RVT heterodimeric Fc(γ1/4, EW-RVT)를 의미한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체 유래 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역에 포함된 CH3 도메인은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열번호로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 영역 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 각각 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래인 것을 특징으로 하고, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역은 동종형(isotype) 항체 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 항체 유래 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역은 IgG4 유래의 표 1에 기재된 CH3 도메인의 서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 용어, 'γ1/4'는 항체 중쇄의 불변영역 도메인 중 힌지 영역은 높은 안정성으로 시중 치료용 항체에 많이 채택되는 IgG1 동종형을 사용하고, CH2 내지 CH3 영역은 원치 않는 ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity)/CDC(complement-dependent cytotoxicity)와 같은 항체 고유 기능이 나타나지 않도록 하는 IgG4 동종형을 사용하여, 이가 융합된 Fc를 Fc(γ1/4)라 한다.
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구체적으로, 본 발명에 따른 융합단백질은 서열번호 5 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 인터루킨21 변이체, 서열번호 1의 서열을 포함하는 제 1 Fc 영역 및 서열번호 2의 서열을 포함하는 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 코딩하는 핵산을 분리하여 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 재조합적으로 생산할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 IL21 변이체를 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, CH3A(EW) 및 CH3B(RVT) DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "발현벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질을 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "융합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 인터루킨21 변이체에 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍이 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 인터루킨21 변이체 및 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
상기 인터루킨21 변이체는 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 N-말단에 결합할 수 있다. 상기 인터루킨21 변이체는 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역 중 어느 하나의 N-말단에 단량체 형태로 융합될 수 있다. 야생형 IL21의 아미노산 돌연변이를 통해 IL21의 비특이적 반응성을 감소시키고 및 구조적 안정성을 증가시킨 돌연변이체를 디자인하여, 이를 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체 형태로 발현했을 경우 융합단백질의 발현양도 증가시키고 생리학적 조건(Physiological conditions)에서 바람직하지 않은 올리고머 형성을 줄이고, 모노머 형태로 존재할 수 있도록 생물학적 물성을 개량한 것이다.
상기 IL-21 또는 이의 변이체는 링커로 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역에 연결될 수 있다. 상기 링커는 상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다.
다른 관점에서, 상기 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체는 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 활성화시키고 독성능을 증가시켜 항종양 또는 항암 효과를 보인다. 본 발명에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체는 암과 관련된 질환의 치료에 사용된다.
상기 암은 예를 들어 대장암, 흑생종, 유방암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 소장암, 식도암, 자궁경부암, 폐암, 림프종 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 더욱이, 본 발명에 따른 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 포함하는 면역세포 배양용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이, 본 발명에 따른 인터루킨21 변이체 또는 융합단백질을 면역세포에 처리하는 단계를 포함하는 배양방법에 관한 것이다.
경우에 따라서, 배지, 혈청, 보충제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 배지는 아미노산(amino acids), 당류(sugars), 무기염(inorganic salts) 및 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 세포 배양용 배지는 아미노산, 당류, 무기염 및 비타민을 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 세포를 배양하기 위해 사용된 배지를 포함하며, 구체적으로 NK 세포, 보다 구체적으로 CD3-CD56+ 세포를 배양하기 위한 배지를 포함한다. 시험관 내에서(in vitro) 세포 성장 및 생존을 위해 세포가 필요로 하는 성분을 함유하거나, 세포 성장 및 생존을 돕는 성분을 함유한다. 구체적으로, 상기 성분은 비타민, 필수 또는 비필수 아미노산, 및 미량 원소일 수 있다.
상기 배지는 아미노산 성분, 비타민 성분, 무기염 성분, 기타 성분 및 정제수로 구성되며,
a) 상기 아미노산 성분은 글리신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-세린, L-시스테인, L-메티오닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-글루탐산, L-글루타민, L-리신, L-아르기닌, L-히스티딘, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, L-프롤린, β-알라닌, 膨-아미노부티르산, 오르니틴, 시트룰린, 호모세린, 트리요드티로신, 티록신 및 디옥시페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 글리신, L-알라닌, L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, L-히스티딘, L-라이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌 및 L-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 또는 이의 조합이며,
b) 상기 비타민 성분은 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, 염화콜린, i-이노시톨 및 아스코르브산으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 비타민 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아마이드 및 피리독신 하이드로클로라이드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 비타민 또는 이의 조합이며,
c) 상기 무기염 성분은 염화칼슘(CaCl2)(무수), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), 질산제이철 노나하이드레이트(Fe(NO3)3ㅇ9H2O) 및 탄산수소나트륨(NaHCO3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 무기염 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2)(무수) 및 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 무기염 또는 이의 조합이며,
d) 상기 기타 성분은 D-글루코즈 (덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 티미딘, 리놀레산, 리포산, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시시티딘 HCl 및 2'-데옥시구아노신으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 기타 성분 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 소듐 피루베이트일 수 있다.
e) 정제수는 상기 아미노산, 비타민, 무기염 및 기타 성분을 용해시키기 위해 사용되며, 1차 이상의 증류를 거쳐 수득되거나, 필터를 통해 정제된 물일 수 있다.
또한, 상기 조성물에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10, IL-15, IL-17 또는 IL-21 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물에 자연살해세포 활성용 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 활성용 항체로써 항 CD3 항체, 항 CD2 항체, 항 CD335 항체 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 자연살해세포 활성용 항체가 결합된 비드를 포함할 수 있다.
특히, 상기 NK 배양용 배지 조성물은 IL-15, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 IL-15 및 IL-21은 인터루킨(Interleukin, IL)의 한 종류로서, 림프구나 단핵구 및 대식세포 등 면역담당세포가 생산하는 단백질성 생물 활성물질을 의미한다. 상기 IL-15 및 IL-21는 자연살해세포를 증식을 촉진시켜 단핵세포를 원료세포로 사용하여 자연살해세포를 배양하는 경우에 사용할 수 있으나, 이들 만을 단독 또는 혼합하여 사용할 경우, 증식률 및 순도가 낮은 문제가 있다(Biossel L. et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 14, 1031-1038, 2008).
구체적으로, 상기 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, a-MEM(a-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, AIM-V Medium, X-vivo™ 15 Medium, NK MACS Medium과 같은 통상의 동물세포 배양용 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 배지로서 AIM-V Medium, X-vivo™ 15 Medium 및 NK MACS Medium을 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혈청"이란, 혈액이 완전 응고된 후 혈액으로부터 유리된 투명한 상층액을 의미한다. 또한, 동물세포의 배양에는 합성배지에 혈청을 필수적으로 첨가해야 하며, 소나 말, 인간의 혈청을 사용하는 것이 일반적이다. 소 유래 혈청의 경우, 채혈시기에 따라 소의 태자혈청(fetal bovine serum; FBS), 소의 신생자혈청(newborn bovine serum), 새끼소혈청(calf serum), 어미소혈청(bovine serum) 등을 사용할 수 있다. 인간 유래 혈청의 경우, 혈액형이 AB형인 공여자의 인간 혈청을 사용하며, A 및 B 혈액형 항원에 대한 항체가 없어 면역 반응성을 최소화할 수 있는 인간 AB 혈청(Human AB serum)을 사용할 수 있다. 또한 상기 "혈청"의 대채제로써 CTS Immune Cell SR 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간 AB 혈청 또는 CTS Immune Cell SR을 사용하였다.
상기 보충제는 세포 배양시 안정성과 세포 활성을 개선하기 위해, L-Glutamine 대체제인 GlutaMAX(Gibcoㄾ)를 사용할 수 있다. 또한, 상기 보충제는 NK MACS supplement(Miltenyi Biotec, 130-113-102)일 수 있다.
상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 면역세포, 특히 NK 세포를 제공한다. 상기 NK 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 유효성분인 NK 세포를 기준으로 1x102 cells/㎏ 내지 1.0x1013 cells/㎏일 수 있고, 1x107 cells/㎏ 내지 1.5x1011 cells/㎏일 수 있다. 이때 투여는 하루에 한 번 투여할 수 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. mono-IL21-Fc 융합단백질 구축
융합단백질의 구축을 위한 Fc 변이체는 IgG4를 기반으로 하여 EW-RVT 돌연변이가 도입되어 이종이중체를 형성하는 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT)를 사용하였다. 기존 보고에 따르면, 항체와 사이토카인을 융합한 형태인 이뮤노사이토카인 (Immunocytokine)의 구축에 있어 IgG1이 가지는 ADCC/CDC와 같은 항체 고유 기능이 오히려 생체 내 제거현상(clearance)을 촉진한다. 따라서 본 명세서에 명시된 모든 융합단백질의 구축에 ADCC/CDC의 기능이 IgG1과 비교하였을 때 거의 나타나지 않는 IgG4 동종형을 사용하였다. (Gillies SD et al., 1999). 특히, 인간 IL21은 IL21 수용체와 상호작용이 용이하도록 추가의 펩타이드 링커 없이, hinge 영역을 이용하여 중쇄불변부위와 연결하였다. 이때 사용한 hinge 영역은 기존에 많이 사용하는 IgG1 유래 hinge를 사용하였고, 이중체 형성을 위한 중심 hinge 영역 (core hinge region) 내의 시스테인(cysteine) 잔기를 제외한 나머지 상부 hinge 영역 (upper hinge region)의 시스테인 잔기는 단백질 융합 시, 원하지 않는 이황화 결합이 생기는 것을 막기 위해 세린(serine) 잔기로 치환하였다 (Mutated hinge, 도 2).
기존에 이종이중체 형성능이 기존에 보고된 IgG1 기반 EW-RVT 변이체와 유사한 정도로 유지될 것이라 예상되는 동종형별 변이체 중에서 IgG4를 기반으로 한 변이체 (IgG4-EW-RVT, Choi et al, 2013; 대한민국 특허등록 제10-1522954호)를 이용하여 인간 IL21(Interleukin 21, 표 2, 서열번호 5) 융합단백질이 구축되었다. 자연계에 존재하는 IL21은 단량체로 작동하는 사이토카인으로, 하나의 IL21이 하나의 IL21 수용체(IL21R) 및 하나의 γc-chain과 결합함으로써 활성을 가진다. 따라서 상기 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT)를 이용하여, 하나의 IL21을 서로 다른 Fc 변이체 (CH3A 또는 CH3B) 중 하나에만 연결하여 자연계에 존재하는 IL21의 단량체 형태를 유지하고자 하였다.
도 1a는 CH3 돌연변이체 쌍이 도입된 mono-IL21-Fc 융합단백질의 모식도를 나타낸 것이다. CH3 돌연변이체 쌍이 도입된 IL21-Fc(γ1/4,EW)를 암호화하는 DNA를 CMV 프로모터를 지닌 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA)에 signal sequence-IL21 mature form-Mutated Hinge-CH2-CH3A를 가지도록 인 프레임 (in-frame)으로 NotI/HindIII를 이용하여 클로닝하였다. 이 때 사용된 IL21은 인간 IL21(Uniprot entry name, Q9HBE4; 서열번호 4)로, signal sequence를 제외한 mature form을 코딩하는 DNA 서열만을 사용하였다.
mono-IL21-Fc 융합단백질에 대한 비교예로 야생형 Fc를 융합한 Bi-IL21-Fc를 구축하였다. 상기와 유사한 방법으로 인간 IL21 mature form을 코딩하는 DNA 서열을 야생형 IgG4 CH3가 들어가 있는 동물세포 발현벡터인 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA)에 signal sequence-IL21 mature form-Mutated Hinge-CH2-CH3를 가지도록 인 프레임 (in-frame)으로 NotI/HindIII 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 표 2는 mono-IL21-Fc 융합단백질및 Bi-IL21-Fc 융합단백질구축에 사용된 인간 IL21의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 아미노산 서열은 IL21 mature form의 131개 아미노산 펩타이드 (인간 IL21의 아미노산 번호 32부터 아미노산 번호 162)로 구축되었으며 (Parrish-Novak et al. Nature, 2000;408(6808):57-63), 그 Numbering은 mono-IL21-Fc 선행 연구 내용과 동일하게 매겨진 것이다 (대한민국 특허등록 10-1928981; 미국특허등록 US10800825B2). 즉, 본 특허 명세서에서는 IL21의mature form 32번부터 1번잔기로 명명하여 1-131번 잔기로 명명하였다 (표 2 및 표 4 참조).
Figure PCTKR2023006343-appb-img-000002
실시예 2. Fc 및 mono-IL21-Fc 융합단백질 구축 및 발현/정제
야생형 Fc(γ1/4, WT) 및 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT), Bi-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21-Fc 융합단백질 (mono-IL21-Fc 융합단백질은 인간 IL21이 융합된 CH3A(EW) 및 CH3B(RVT)의 발현 벡터를 1:1, 1.5:1, 2:1 비율로 함)의 발현은 각 단백질을 암호화하는 플라스미드와 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscinece)의 혼합물을 HEK293-F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)하여 무혈청 FreeStyle™ 293 발현배지 (Invitrogen)가 들어 있는 진탕 플라스크에서 배양함으로써 이루어진다. 자세한 방법은 다음과 같다.
진탕 플라스크 (Corning)에 100 mL 일시적 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 1.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 90 ml에 파종하여, 135 rpm, 8% CO2에서 배양하였다. 24시간 후, 각각의 이종이중체 중쇄불변부위를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해 그에 따른 CH3A 및 CH3B 플라스미드를 4 ml FreeStyle쪠 293 발현 배지 (Invitrogen)에 Fc(γ1/4, WT)의 경우 125μg, 이종이중체 중쇄돌연변위 이종이중체 중쇄불변부위 Fc (γ1/4, EW-RVT)의 경우 CH3A 62.5μg, CH3B 62.5μg, bi-IL21-Fc의 경우 125μg, mono-IL21-Fc 융합단백질 CH3A (EW):CH3B(RVT)=1:1의 경우 CH3A 62.5μg, CH3B 62.5μg, CH3A (EW):CH3B(RVT)=1.5:1의 경우 CH3A 75μg, CH3B 50μg, CH3A (EW):CH3B (RVT)=2:1의 경우 CH3A 83.3μg, CH3B 41.7μg 총 125μg (1.25μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 375 μg을 희석한 6ml의 배지 (3.75 μg/ml)와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90 ml로 파종한 세포에 넣어 짧게는 5일에서 길게는 7일 동안 배양하게 되면, 세포가 생산한 단백질은 세포에 의해 세포 바깥으로 분비되어 배지에 쌓이게 된다. 때문에 단백질은 세포 배양 후 3800 rpm에서 25분간 원심분리하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질 A 세파로오스 컬럼 (protein A Sepharose column, GE healthcare)을 이용하여 정제하였다. 이 때, 정제방법은 단백질 A 컬럼 회사에서 제공하는 표준 프로토콜을 참조하였으며, 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 1X PBS로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 표 3은 발현된 야생형 Fc(γ1/4, WT), 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT), mono-IL21-Fc 융합단백질(형질전환 시 사용된 CH3A(EW):CH3B(RVT) 발현벡터의 비율=1:1, 1.5:1, 2:1), Bi-IL21-Fc의 정제 수율을 나타낸 것이다. 결과 값은 3회 독립적인 실험을 수행한 후 평균의 표준오차 (mean ± SD)로 나타내었다. 수율 확인 결과, mono-IL21-Fc 융합단백질이 Bi-IL21-Fc 융합단백질과 비교해 월등히 높은 수준의 수율을 보이는 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2023006343-appb-img-000003
상기 정제된 야생형 Fc(γ1/4, WT) 및 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT), mono-IL21-Fc 융합단백질 (형질전환 시 CH3A(EW) 및 CH3B(RVT)의 발현 벡터 비율=1:1, 1.5:1, 2:1) 및 Bi-IL21-Fc 융합단백질 5μg을 10% 비환원성 및 환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 3). 비환원성 조건에서 mono-IL21-Fc 융합단백질은 71 kDa, Bi-IL21-Fc 융합단백질은 86 kDa에서 관찰되었고, 환원성 조건에서는 Bi-IL21-Fc는 43 kDa에서 하나의 밴드만 관찰되었고, IL21이 융합된 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A (EW)와 이종이중체 중쇄불변부위 CH3B (RVT) 두 개의 플라스미드로 이루어져 있는 mono-IL21-Fc 융합단백질의 경우에는 43, 28 kDa에서 두 개의 밴드가 관찰되었다. 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A, CH3B 각각은 약 25kDa, 인간 IL21은 15kDa가 예상되는 단백질 사이즈이지만, 환원성 및 비환원성 조건에서 예상되는 단백질 사이즈보다 더 큰 사이즈의 밴드가 관찰된 이유는, 인간 IL21 및 Fc 내 N-글리코실화(N-Glycosylation)로 인한 것으로 판단되었다. 비환원성 조건의 mono-IL21-Fc 융합단백질 SDS-PAGE 결과를 보면, 플라스미드 비율에 따라서 결과가 다름을 알 수 있었다. EW:RVT=1:1, 1.5:1에서는 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A(EW)와 CH3B(RVT)가 1:1로 결합한 형태인 mono-IL21-Fc 융합단백질을 이루지 못해, 이종이중체 중쇄불변부위 CH3B (RVT)의 단량체 2개로 형성된 이량체로 보이는 밴드가 관찰되었고, EW:RVT=2:1에서는 이와 같은 밴드가 관찰되지 않았다. 따라서 하기 언급될 mono-IL21-Fc 융합단백질 및 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체는 모두 플라스미드 비율 EW:RVT=2:1로 구축되었다.
실시예 3. mono-IL21-Fc 융합단백질 물성 평가
도 4는 발현시킨 야생형 Fc(γ1/4, WT), 이종이중체 중쇄불변부위 Fc (γ1/4,EW-RVT), mono-IL21-Fc 융합단백질 (형질 전환 시 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A(EW):CH3B(RVT)의 발현벡터 비율=1:1, 1.5:1, 2:1)에 대해 물성 분석을 위해서 SEC (크기 배제 크로마토그래피, Size Exclusion Chromatography, SEC)을 수행하여 시간(분)에 따른 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 크로마토그램이다. HPLC (Agilent Technologies, USA) 기기 및 Superdex200 10/300 GL 컬럼(Cytiva, USA)을 사용하여 다음의 구체적인 프로토콜에 의하여 측정하였다.
필터와 탈기 과정(degassing)을 거친 3차수, 1X PBS (pH 7.4, 12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl)를 준비한다. 야생형 Fc(γ1/4, WT), 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4,EW-RVT), Bi-IL21-Fc, mono-IL21-Fc 융합단백질 (플라스미드 비율 CH3A(EW):CH3B(RVT)=1:1, 1.5:1, 2:1)을 1μg/ml의 농도로 희석하여 준비하고, 각 45μl씩 250μl inserts with Polyemer Feet, 100/PK (Agilent Technologies, USA)에 넣고 이를 Autosampler vial에 넣어 최종적으로 분석할 시료를 준비했다. 또한, 미지 단백질 시료의 사이즈를 구별할 수 있도록 하는 마커 역시 같은 농도 조건으로 준비하였다. 150kDa에 해당하는 마커는 Alcohol dehydrogenase, 66kDa에 해당하는 마커는 BSA이다.
먼저 컬럼 부피의 2~3배의 3차수를 0.5ml/min으로 흘려, 초기 컬럼 내 storage buffer(20% 에탄올)를 제거함과 동시에 표준화 과정을 진행하였고, 이가 완료되면, 2~3배 부피의 생리학적 조건의 running buffer인 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl)를 0.75ml/min으로 흘려주어 분석 시작 전 표준화 과정을 완료하였다. 준비된 분석용 시료를 기기에 위치시킨 후, 유속은 0.75ml/min, 주입량은 30μg (준비된 45μl의 시료 중 30μl만 주입), 40분 분석 후 10분 포스트 타임 (post time)으로 설정하여 분석을 수행하였다. 샘플 주입기가 설정된 주입량만큼 샘플을 주입하면 버퍼가 흐르는 관으로 흘러들어가고, 이가 컬럼에 주입된다. 시료가 든 버퍼가 다공성의 수지가 압축된 컬럼을 통과하게 되면, 시료 내 단백질의 분자량, 즉 크기에 따라서 컬럼 밖으로 용출되는 시간에 차이가 생기고, 이 때 280nm에서의 흡광도의 변화를 측정하여 얻어지는 크로마토그램을 통해 물성을 분석하였다. 이 때, 단백질의 크기가 작을수록 다공성 수지의 내부를 많이 통과하여 더 늦은 시간에 용출되고, 단백질의 크기가 클수록 다공성 수지의 외부를 타고 컬럼을 통과해 더 빠르게 용출되는 원리로써 크로마토그램을 해석할 수 있다.
SEC 분석을 통해 야생형 Fc (γ1/4, WT), 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT), mono-IL21-Fc 융합단백질 (형질전환 시 CH3A(EW):CH3B(RVT)=1:1, 1.5:1, 2:1)의 물성을 분석한 결과, mono-IL21-Fc 융합단백질의 피크가 마커와 비교했을 때 예상되는 크기에 맞는 피크가 관찰되지 않고 더 크기가 작은 단백질임을 의미하는 피크가 관찰됨을 확인하였다. 이는 추후 기술할 원인으로 인해, 생리학적 조건의 storage buffer인 1X PBS에서 mono-IL21-Fc 융합단백질 단백질의 생물학적 물성이 좋지 않음을 의미하였다. 생물학적 물성이 안정하지 못함은 체내에서 바람직한 기능을 하지 못하고, 부작용 및 면역원성(immunogenicity)을 가질 수 있음을 의미하기 때문에 mono-IL21-Fc 융합단백질의 생물학적 물성을 향상시키는 개량이 필수적임을 의미하였다.
실시예 4. 분석 버퍼 조성에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 SEC 결과 변화 분석
실시예 3에서 수행한 SEC 분석 결과 mono-IL21-Fc 융합단백질의 물성이 좋지 않게 판단되었다. 이에 대한 원인 규명을 위해 인간 IL21의 구조를 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. IL21의 표면에 양전하 곁사슬을 가진 아미노산은 22개 존재하였으며, 양전하 곁사슬을 가진 아미노산 중 가장 큰 영향을 끼치는 아르기닌은 10개 존재하였다. IL21의 등전점은 9.42이며 pH 7.4 조건에서 IL21은 양으로 하전된다. 이를 통해 IL21 표면 양전하 곁사슬이 SEC 분석 시 사용되는 컬럼과 비특이적 상호작용을 한다고 추측하였다. 따라서, IL21 표면 양전하를 상쇄시킬 수 있는 환경을 조성하는 고농도의 염을 포함한 running buffer인 High Salt PBS (12mM phosphate, 500mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)를 사용하여 실시예 4에서 묘사한 SEC 분석 방법과 동일하게 SEC 분석을 수행하였고, mono-IL21-Fc 융합단백질을 의미하는 크기의 피크가 관찰됨을 알 수 있었다. 그 결과를 도 6b에 나타내었다. 그 대조군으로, running buffer로 생체 조건의 환경을 제공하는 1X PBS를 사용하여 SEC 분석을 진행한 mono-IL21-Fc 융합단백질의 결과를 도 6a에 나타내었다. 결과 분석 시, mono-IL21-Fc 융합단백질의 단백질 크기에 맞는 피크가 관찰됨을 확인하였으며, 결과적으로 인간 IL21이 생리학적 조건의 버퍼에서 강하게 양으로 하전되는 특성으로 인해 SEC 분석 시 컬럼과 비특이적 상호작용하여 1X PBS 조건에서는 피크가 보이지 않음을 증명하였다. IL21의 표면 양전하는 SEC 분석 시 이외에도 생체 내로 주입되었을 때, IL21 수용체가 아닌 다른 세포 및 조직에 비특이적 결합으로 인한 부작용을 나타내며, 짧은 약물동력학을 초래하여 치료제로서 바람직한 기능을 할 수 없으므로, 이후 실시예에서는 IL21의 표면 양전하를 줄인 변이체를 구축하였다.
실시예 5. mono-IL21-Fc 융합단백질의 IL21 변이체 구축 및 발현/정제
IL21의 표면 양전하를 줄이기 위해서 양전하 곁사슬을 가진 아미노산이 치환된 변이체 mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-L21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc를 구축하였다 (표 4에 서열정보 명시). 구체적으로는, 먼저 IL21의 표면에 드러난 아미노산 정보를 얻기 위해 이미 밝혀진 단백질 구조 (PDB ID: 3TGX)를 견본으로 하여 Chimera X 프로그램을 통해 구조를 분석하였다. 구조 분석 결과 표면 양전하를 띠는 아미노산이 22개, 이 중 높은 수용액상 pKa(~13.8)를 갖는 아미노산인 아르기닌이 10개 존재하였다. 그리고 Chimera X 프로그램을 통해 구조를 살펴보았을 때, 구조가 정확하게 밝혀지지 않은 비정형 영역을 관찰할 수 있었다. mono-IL21-Fc 융합단백질 아미노산 치환 변이체는 비정형 영역 내의 아미노산을 치환하거나, 구조가 밝혀진 영역의 아미노산 치환을 통해 구축되었다.
비정형 영역은 불안정한 구조의 형성에 크게 기여하며, IL21의 경우 비정형 영역 내에 아르기닌이 3개 (85R, 86R, 126R) 존재하여 비특이성을 증가시키고, Oligomer를 형성할 가능성을 높여 물성을 악화시키고, 특히 SEC 컬럼과도 비특이적인 상호작용을 하여 도 4와 같은 결과가 도출될 수 있다고 판단되었다. 따라서 비정형 영역 내 아르기닌을 동원체(토끼, 돼지) 서열을 참고하여 전하를 띠지 않는 극성 아미노산 또는 아르기닌보다 양전하의 성질이 약한 라이신으로 치환하여 새로운 클론을 구축하였다(R85N, R86K, R126Q). 이를 mono-IL21(NKQ)-Fc (서열번호 5)라 명명하였다.
비정형 영역 내 아르기닌 (R85, R86, R126)을 아미노산 중 가장 강한 음전하 곁사슬을 가지는 아스파라긴산으로 치환한 새로운 클론을 구축하였다(R85D, R86D, R126D). 이를 mono-IL21(DDD)-Fc (서열번호 6)라 명명하였다.
또한 Chimera X 프로그램을 통하여 IL21 구조를 분석하였을 때 (PDB ID: 3TGX), L21 수용체 결합 영역이거나 주변 잔기와 의미 있는 결합을 하지 않고, 곁사슬 방향이 표면을 향하고 있는 아미노산을 선별하였고 (K52, K56, K88, R90) 이를 동원체 서열을 참고하여, 전하를 띠지 않는 극성 아미노산으로 치환한 (K52N, K56Q, K88N, R90T) 새로운 클론을 구축하였다. 이를 mono-IL21(NQNT)-Fc (서열번호 7)라 명명하였다.
mono-IL21(DDD)-Fc와 mono-IL21(NQNT)-Fc의 치환 전략을 모두 포함하여 아미노산을 치환한 (K52N, K56Q, R85D, R86D, K88N, R90T, R126D) 새로운 클론을 구축하였다. 이를 mono-IL21(DDD NQNT)-Fc (서열번호 8)라 명명하였다.
본 실시예에서 구축한 클론들에 대한 근거에 대한 그림 및 치환 전략을 도 7에 명시하였다.
mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc 클론을 구축하기 위해 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA)에 각각 signal sequence- IL21 (variants) mature form-Mutated Hinge-CH2-CH3A (IgG4, EW)를 가지도록 인 프레임 (in-frame)으로 NotI/HindIII를 이용하여 클로닝하였다.
mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc은 인간 IL21 야생형 및 변이체 (NKQ 또는 DDD 또는 NQNT 또는 DDD NQNT)가 융합된 IgG4 CH3A(EW) 및 IgG4 CH3B(RVT)의 발현 벡터를 2:1 비율로 하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscinece)의 혼합물을 HEK293-F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)하여 무혈청 FreeStyle™ 293 발현배지 (Invitrogen)가 들어 있는 진탕 플라스크에서 배양함으로써 이루어진다. 자세한 방법은 다음과 같다.
진탕 플라스크 (Corning)에 100 mL 일시적 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 1.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 90 ml에 파종하여, 135 rpm, 8% CO2에서 배양하였다. 24시간 후, 각각의 이종이중체 중쇄불변부위를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해 그에 따른 CH3A 및 CH3B 플라스미드를 4ml FreeStyle™ 293 발현 배지 (Invitrogen)에 IgG4 CH3A (EW): IgG4 CH3B (RVT)=2:1=83.3μg:41.7μg, 총 125μg (1.25μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 375 μg을 희석한 6ml의 배지 (3.75 μg/ml)와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90 ml로 파종한 세포에 넣어 짧게는 5일에서 길게는 7일 동안 배양하게 되면, 세포가 생산한 단백질 즉, 이종이중체 중쇄불변부위를 포함한 융합단백질은 세포에 의해 세포 바깥으로 분비되어 배지에 쌓이게 된다. 때문에 단백질은 세포 배양 후 3800 rpm에서 25분간 원심분리하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질 A 세파로오스 컬럼 (protein A Sepharose column, GE healthcare)을 이용하여 정제하였다. 이 때, 정제방법은 단백질 A 컬럼 회사에서 제공하는 표준 프로토콜을 참조하였으며, 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 storage buffer (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다 (표 5). 결과 값은 2회 독립적인 실험을 수행한 후 평균의 표준오차 (mean ± SD)로 나타내었다. 수율 확인 결과, mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체들이 mono-IL21-Fc 융합단백질과 비교해 전체적으로 상승한 수준의 수율을 보이는 것으로 확인되었다. 이를 통해 상기 rationale을 통해 구축한 mono-IL21-Fc 융합단백질 아미노산 치환 변이체의 발현에는 문제가 없음을 확인하였다.
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Figure PCTKR2023006343-appb-img-000005
상기 정제된 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc 5μg을 10% 비환원성 및 환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 8). 비환원성 조건에서 mono-IL21-Fc 융합단백질 mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc는 71 kDa에서 관찰되었고, 환원성 조건에서는 인간 야생형 IL21 및 변이체(NKQ 또는 DDD)가 융합된 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A (EW)와 이종이중체 중쇄불변부위 CH3B (RVT) 두 개의 플라스미드로 이루어져 있는 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc는 43, 28 kDa에서 두 개의 밴드가 관찰되었다. 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A, CH3B 각각은 약 25kDa, 인간 IL21은 15kDa가 예상되는 단백질 사이즈이지만, 환원성 및 비환원성 조건에서 예상되는 단백질 사이즈보다 더 큰 사이즈의 밴드가 관찰된 이유는 인간 IL21 및 Fc 내 N-글리코실화(N-Glycosylation)로 인한 것으로 판단되었다. 결과적으로 SDS-PAGE 분석 시에도 mono-IL21-Fc 융합단백질 아미노산 치환 변이체의 각 이종이중체 중쇄불변부위의 발현 및 이를 통한 융합 단백질 형성에는 문제가 없는 것으로 확인되었다.
실시예 6. mono-IL21-Fc 융합단백질 아미노산 치환 변이체의 물성 평가
도 8은 발현시킨 mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc에 대한 물성 분석을 위해서 SEC (Size Exclusion Chromatography, SEC)을 수행하여 시간(분)에 따른 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 크로마토그램이다. HPLC (Agilent Technologies, USA) 기기 및 Superdex200 10/300 GL 컬럼 (Cytiva, USA)을 사용하여 다음의 구체적인 프로토콜에 의하여 측정하였다.
필터와 탈기 과정(degassing)을 거친 3차수, 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl) (12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)를 준비한다. Mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc를 1μg/ml의 농도로 희석하여 준비하고, 각 45μl씩 250μl inserts with Polyemer Feet, 100/PK (Agilent Technologies, USA)에 넣고 이를 Autosampler vial에 넣어 최종적으로 분석할 시료를 준비했다. 또한, 미지 단백질 시료의 사이즈를 구별할 수 있도록 하는 마커 역시 같은 농도 조건으로 준비하였다. 150kDa에 해당하는 마커는 Alcohol dehydrogenase, 66kDa에 해당하는 마커는 BSA이다.
먼저 컬럼 부피의 2~3배의 3차수를 0.5ml/min으로 흘려, 초기 컬럼 내 storage buffer(20% 에탄올)를 제거함과 동시에 표준화 과정을 진행하였고, 이가 완료되면, 2~3배 부피의 running buffer인 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl)를 0.75ml/min으로 흘려주어 분석 시작 전 표준화 과정을 완료하였다. 준비된 분석용 시료를 기기에 위치시킨 후, 유속은 0.75ml/min, 주입량은 30μg (준비된 45μl의 시료 중 30μl만 주입), 40분 분석 후 10분 포스트 타임 (post time)으로 설정하여 분석을 수행하였다.
SEC 분석을 통해 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc의 물성을 분석한 결과 mono-IL21(NQNT)-Fc 융합단백질 변이체에 대해서, 발현시킨 융합단백질에 해당하는 피크가 mono-IL21-Fc 융합단백질과 비교해 크게 증가함을 확인하였다. 이를 통해, 인간 IL21의 표면 양전하로 인해 SEC 분석 시 컬럼와 비특이적 상호작용을 하여, 분석 시 피크가 예상대로 나오지 않았다는 추측이 타당했으며, 이를 완화시킨 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체에 대해 그 생물학적 물성이 향상되었고, 체내 주입 시 비특이적 상호작용이 감소하며, 그로 인한 약물 부작용이 감소하며 약물동력학은 증가할 수 있음을 의미하였다.
실시예 7. mono-IL21-Fc 융합단백질의 IL21 동원체(ortholog) 서열 이식 변이체 구축 및 발현/정제
mono-IL21-Fc 융합단백질의 생물학적 물성의 추가적인 향상을 위해 실시예 6에서 수행했던 아미노산 치환을 이용해 mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체를 구축한 것과 달리 새로운 전략을 통해 mono-IL21-Fc 융합단백질의 변이체를 개발하고자 하였다. 구체적으로는 먼저, IL21과 같은 계열의 사이토카인인 IL-2 (PDB ID: 1IAR)와 IL-4 (PDB ID: 2B5I)와의 다중 서열 정렬 및 2차 구조 예측 플랫폼인 PSIPRED를 통해 세 사이토카인 간 2차 구조 형성 양상을 비교해보았다. 서열 분석 결과, IL21의 Helix C는 IL2, IL4보다 짧고, Helix C에서 Helix D로 이어지는 루프 구조는 현저히 길며, 루프 구조 사이 비정형 영역도 존재하였다. 이와 같은 구조적인 차이로 인해 IL21의 구조 역시 불안정해질 수 있다고 판단하였다. 따라서 IL2와 IL4의 해당 영역의 상보적인 서열을 IL21과 비교하고, 소수성 아미노산 잔기가 많아 서열을 이식하였을 때, 구조 불안정성을 야기시킬 수 있는 인간 IL2보다는 친수성 잔기가 비교적 많은 IL4의 서열을 이용해 mono-IL21-Fc 융합단백질 동원체 서열 이식 변이체를 구축하였다. 그리하여 IL21의 비정형 영역을 포함한 K77~R90까지의 서열을 각각 상보적인 인간 IL4 서열과 동원체 IL4 서열로 바꾸어 mono-IL21-Fc 융합단백질 동원체 서열 이식 변이체를 구축하였고 (표 6에 서열정보 명시.), 인간 IL4 서열을 이용한 변이체를 mono-IL21(Helix 1)-Fc (서열번호 9), 동원체 IL4 서열을 이용한 변이체를 mono-IL21(Helix 2)-Fc (서열번호 10)으로 명명하였다.
본 실시예에서 구축한 클론들에 대한 근거에 대한 그림 및 치환 전략을 도 9에 명시하였다.
mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc를 구축하기 위해 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA)에 각각 signal sequence- IL21 (Helix 1) mature form-Mutated Hinge-CH2-CH3A (IgG4, EW), signal sequence- IL21 (Helix 2) mature form-Mutated Hinge-CH2-CH3A (IgG4, EW)를 가지도록 인 프레임 (in-frame)으로 NotI/HindIII를 이용하여 클로닝하였다.
mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc는 인간 IL21 야생형 또는 IL21(Helix 1) 또는 IL21(Helix 2)가 융합된 IgG4 CH3A(EW) 및 IgG4 CH3B(RVT)의 발현 벡터를 2:1 비율로 하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscinece)의 혼합물을 HEK293-F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)하여 무혈청 FreeStyle™ 293 발현배지 (Invitrogen)가 들어 있는 진탕 플라스크에서 배양함으로써 이루어진다. 자세한 방법은 다음과 같다.
진탕 플라스크 (Corning)에 100 mL 일시적 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 1.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 90 ml에 파종하여, 135 rpm, 8% CO2에서 배양하였다. 24시간 후, 각각의 이종이중체 중쇄불변부위를 포함한 융합단백질을 생산하기 위해 그에 따른 CH3A 및 CH3B 플라스미드를 4ml FreeStyle쪠 293 발현 배지 (Invitrogen)에 CH3A (EW):CH3B (RVT)=2:1=83.3μg:41.7μg, 총 125μg (1.25μg/ml)으로 희석 및 필터하여, PEI 375 μg을 희석한 6ml의 배지 (3.75 μg/ml)와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90 ml로 파종한 세포에 넣어 짧게는 5일에서 길게는 7일 동안 배양하게 되면, 세포가 생산한 단백질 즉, 이종이중체 중쇄불변부위를 포함한 융합단백질은 세포에 의해 세포 바깥으로 분비되어 배지에 쌓이게 된다. 때문에 단백질은 세포 배양 후 3800 rpm에서 25분간 원심분리하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질 A 세파로오스 컬럼 (protein A Sepharose column, GE healthcare)을 이용하여 정제하였다. 이 때, 정제방법은 단백질 A 컬럼 회사에서 제공하는 표준 프로토콜을 참조하였으며, 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 storage buffer (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다 (표 7). 결과 값은 3회 독립적인 실험을 수행한 후 평균의 표준오차 (mean ± SD)로 나타내었다. 수율 확인 결과, mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc의 수율은 mono-IL21-Fc 융합단백질과 유사한 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2023006343-appb-img-000006
Figure PCTKR2023006343-appb-img-000007
상기 정제된 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc 5μg을 10% 비환원성 및 환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 11). 비환원성 조건에서 mono-IL21-Fc 융합단백질 mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc는 71 kDa에서 관찰되었고, 환원성 조건에서는 인간 야생형 IL21 및 IL21(Helix 1)가 융합된 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A(EW)와 이종이중체 중쇄불변부위 CH3B (RVT) 두 개의 플라스미드로 이루어져 있는 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc는 43, 28 kDa에서 두 개의 밴드가 관찰되었다. IL21(Helix 2)가 융합된 이종이중체 중쇄불변부위 CH3A(EW)는 43kDa보다 더 큰 크기를 가지는 밴드가 관찰되었다. 이는 IL21(Helix 2) 구축 시, 동원체의 IL4 서열이 이식될 때 N-글리코실화(N-Glycosylation) 영역이 하나 더 생성되었고 (N90~T92), 이로 인한 결과로 판단되었다. 결과적으로 SDS-PAGE 상에서 분석했을 때 각 이종이중체 중쇄불변부위에 대한 발현 및 이를 통한 융합 단백질 형성에는 문제가 없는 것으로 확인되었다.
실시예 8. mono-IL21-Fc 융합단백질의 IL21 동원체 서열 이식 변이체 물성 평가
도 12는 발현시킨 mono-IL21-Fc 융합단백질 동원체(ortholog) 서열 이식 변이체 단량체 융합단백질에 대해 기존 구축된 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc와의 물성 비교 분석을 위해서 SEC (Size Exclusion Chromatography, SEC)을 수행하여 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 크로마토그램이다. HPLC (Agilent Technologies, USA) 기기 및 Superdex200 10/300 GL 컬럼(Cytiva, USA)을 사용하여 다음의 구체적인 프로토콜에 의하여 측정하였다.
필터와 탈기 과정(degassing)을 거친 3차수, 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl)를 준비한다. 구축된 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(DDD)-Fc, mono-IL21(NQNT)-Fc, mono-IL21(DDD NQNT)-Fc, mono-IL21(Helix 1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc를 1μg/ml의 농도로 희석하여 준비하고, 각 45μl씩 250μl inserts with Polyemer Feet, 100/PK (Agilent Technologies, USA)에 넣고 이를 Autosampler vial에 넣어 최종적으로 분석할 시료를 준비했다. 또한, 미지 단백질 시료의 사이즈를 구별할 수 있도록 하는 표준 시료 역시 같은 농도 조건으로 준비하였다. 150kDa에 해당하는 표준 시료는 Alcohol dehydrogenase, 66kDa에 해당하는 표준 시료는 BSA이다.
먼저 컬럼 부피의 2~3배의 3차수를 0.5ml/min으로 흘려, 초기 컬럼 내 storage buffer(20% 에탄올)를 제거함과 동시에 표준화 과정을 진행하였고, 이가 완료되면, 2~3배 부피의 running buffer인 1X PBS (pH7.4, 137 mM NaCl)를 0.75ml/min으로 흘려주어 분석 시작 전 표준화 과정을 완료하였다. 준비된 분석용 시료를 기기에 위치시킨 후, 유속은 0.75ml/min, 주입량은 30μg (준비된 45μl의 시료 중 30μl만 주입), 40분 분석 후 10분 포스트 타임 (post time)으로 설정하여 분석을 수행하였다.
크기 배제 크로마토그래피를 통해 mono-IL21-Fc 융합단백질 동원체 서열 이식 변이체의 물성을 분석한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, mono-IL21(Helix1)-Fc, mono-IL21(Helix 2)-Fc는 mono-IL21-Fc 융합단백질에 비해 높은 메인 피크를 관찰할 수 있었다. 특히 mono-IL21(Helix 2)-Fc에 대해 mono-IL21-Fc 융합단백질에 비해서 oligomer 비율이 적고, 메인 피크의 높이가 높음을 관찰할 수 있다. 이는 서열이 바뀐 부분에 대하여 곁사슬이 양전하를 띠는 아르기닌이 3개에서 1개로 줄어들었고, 비정형 영역을 Helix 구조로 치환해주어, 구조적인 안정성이 더 부여되었기 때문에 관찰된 결과라고 추측되었다.
실시예 9. mono-IL21-Fc 융합단백질의 수용체 결합능 평가
구축한 mono-IL21-Fc 융합단백질 variants의 IL21 수용체에 대한 결합능을 평가하기 위해서, IL21 수용체를 발현하는 CD4 양성 인간 T 세포주인 Jurkat 세포주를 통해 mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc, mono-IL21(DDD)-Fc의 수용체 결합능을 평가하였다. 구체적으로는, 2.0X106 cells/sample의 양으로 세포를 준비한 다음, 워싱버퍼 (PBS+ 1% FBS)를 통해 워싱한 후, mono-IL21-Fc 융합단백질, mono-IL21(NKQ)-Fc. mono-IL21(DDD)-Fc를 각각 200nM, 50nM의 양으로 4℃ 조건으로 1시간 처리하였다. 이후 다시 워싱버퍼를 통해 워싱한 후, 2차 항체인 항-인간 IgG4 FITC를 4℃, 차광 조건에서 30분동안 처리하였다. 그 후 워싱버퍼로 워싱한 후 유세포 분석 기기인 FACScalibur (BD bioscience, USA)를 통해 분석되었다.
IL21 수용체에 대한 결합능은 mono-IL21-Fc 융합단백질 및 mono-IL21(variants)-Fc를 처리하는 과정을 포함한 실험군과 그렇지 않은 대조군을 형광물질로 표지한 후 형광 신호의 세기를 측정함으로써 평가되었다. 이에 대한 결과를 도 13에 나타내었다. 그 결과, mono-IL21(variants)-Fc 역시 mono-IL21-Fc 융합단백질과 비교하였을 때, 형광 신호가 유사하게 나타나며, 처리한 단백질 농도를 늘림에 따라, 신호 강도의 세기 역시 증가함을 확인할 수 있다. 이로써 mono-IL21(variants)-Fc의 수용체 결합능이 유지되어 생물학적 활성에는 문제가 없음을 알 수 있다.
실시예 10. mono-IL21-Fc 융합단백질 변이체의 생물학적 활성능 평가
적법 절차에 따라 동의 하에 사람의 혈액을 채취하였고 Ficoll (Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare)을 이용하여 1:2비율로 Ficoll 층 위에 혈액을 조심히 올려 2500 rpm 에서 30분간 원심분리하고 밀도(비중) 차이에 의해 분리된 연막층(buffy coat)에서 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하였다 (도 14). 또한군은 Ficoll로 분리한 PBMC에서 NK세포를 Enrich 하기 위해 CD4 T cell 과 CD8 T cell을 magnetic bead (Myltenyi Biotech)를 사용하여 제거한후 배양을 시작하였다 (도 15). 그리고 100 Gy 감마 방사선 조사한 Jurkat 세포와 EBV- LCL 세포를 말초혈액 단핵세포와 1:1 비율로 RPMI 1640(Corning)에 10% FBS(Fetal Bovine Serum, HyClone)와 1% Penicillin streptomycin(Gibco), IL-2-Fc (monomer, 30 ng/ml)가 첨가된 media에 배양하였다. 이 때 mono Fc-IL21 융합단백질 변이체 7종(Mono-IL21-Fc, Mono-IL21 (NKQ)-Fc, Mono-IL21 (DDD)-Fc, Mono-IL21 (NQNT)-Fc, Mono-IL21 (DDD NQNT)-Fc, Mono-IL21 (Helix 1)-Fc, Mono-IL21 (Helix 2)-Fc)을 Day 0에 한번 30ng/ml로 처리하였다. 3~4일마다 IL-2-Fc (monomer)가 30 ng/ml가 함유된 RPMI 배지를 첨가하였고 세포 수는 2.5x105 cells/ml로 맞춰 6일째 플라스크로 옮겨 배양하였다. Day 6와 Day 10에 세포들을 CD3-(FITC), CD56+(APC)으로 형광 염색하여 Flow cytometry를 통해 NK 세포의 %를 측정하고 최종적으로 NK 세포의 확장배율을 계산하였다. 그 결과, PBMC를 사용한 경우, NQNT, DDD-NQNT가 WT-IL21 보다 월등히 높은 수득율을 보였고 (도 14), CD4와 CD8 T세포를 제거한 PBMC를 사용한 경우, NQNT, helix-1 에서 높은 수득율을 보였다 (도 15). 이를 통해 mono Fc-IL21 융합단백질 변이체를 처리한 군에서 NK세포 증식 확장능이 향상됨을 확인할 수 있었다. NK 세포 치료제의 체외 확장 배양 시 기존 처리 방법에서 mono Fc-IL21 융합단백질 변이체를 추가로 처리해주면 기존의 방법에 비해 다량의 NK 세포 확장 유도가 가능함을 알 수 있었다.
본 발명에서 언급한 기존 mono-IL21-Fc 융합단백질의 예상되는 한계점은 야생형 IL21의 높은 등전점으로 인해 체내 pH 환경에서 순전하가 양으로 하전되며, 표면에 양이온 패치가 형성되어 IL21 수용체 이외에도 여러 조직과 세포에 비특이적으로 상호작용할 수 있다는 점이다. 이에 따라서 체내로 mono-IL21-Fc 융합단백질이 주입되었을 때, 체내에서 생물학적 물성이 좋지 않고, 다른 세포와 조직과의 비특이적 상호작용을 통해 과한 면역반응을 보이는 부작용이 일어나고, 짧은 약물동력학이 초래될 수 있다. 이를 극복하기 위한 전략으로, 상기 이종이중체 중쇄불변부위 Fc(γ1/4, EW-RVT)에 인간 IL21 또는 이의 변이체가 융합된 mono-IL21-Fc 융합단백질 또는 이의 변이체는 기존 mono-IL21-Fc 융합단백질의 구조, IL21 수용체에 대한 결합능 및 T 세포 및 NK 세포에 대한 증식능 및 활성화능을 포함한 생물학적 활성능을 유지하여, 항종양 기능은 유지시키면서, 체내 물성은 향상되고, 부작용은 감소하며, 반감기를 증가시키는 효과를 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 또는 이의 변이체는 높은 생산 수율을 통해 치료 약물로 개발이 용이하며, 기존 mono-IL21-Fc 융합단백질의 IL21 수용체에 대한 결합능이 유지되어 원래의 생물학적 기능 (T 세포 증식능 및 독성능 증가, NK 세포에 대한 증식능 및 독성능 증가)이 유지되어 효과적인 항암 활성을 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 또는 이의 변이체는 면역세포치료제에 쓰이는 T 세포 및 NK 세포에 대한 증식능 및 활성화능을 체외 및 체내에서 증가시킬 수 있는 약물학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 또는 이의 변이체는 면역세포치료제에 쓰이는 T 세포 및 NK 세포에 대한 증식능 및 활성화능을 증가시키기 위한 면역세포 배양의 기초실험과 세포치료제 개발에 사용되는 연구용 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 mono-IL21-Fc 융합단백질 또는 이의 변이체의 구축 전략은 IL21 외에도 체내에서 높은 양전하를 가져 생물학적 물성이 좋지 않고, 부작용이 예상되며, 약물동력학이 악화될 것이라고 예상되는 다양한 질병 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로 활용되는 물질에 적용될 수 있는 변이체 구축 전략을 제공한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (25)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨21 (IL21)에서 N-말단을 기준으로 50, 54, 75 내지 88 및 124번 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열이 치환 또는 결실된 인터루킨21 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열 중 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 인터루킨21 변이체:
    (1) K50N,
    (2) K54Q,
    (3) K75L,
    (4) P76D,
    (5) P77R,
    (6) S78N,
    (7) T79L,
    (8) R83N, R83D, R83L,
    (9) R84K, R84D, R84W,
    (10) Q85G, Q85S,
    (11) K86N, K86L,
    (12) H87A,
    (13) R88T, R88G, R88N,
    (14) R124Q, R124D,
    (15) 79 내지 82번 위치의 아미노산 결실, 및
    (16) 81 내지 84번 위치의 아미노산 결실.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열 중 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하는 인터루킨21 변이체:
    (1) R83N, R84K, R124Q;
    (2) R83D, R84D, R124D;
    (3) K50N, K54Q, R86N, R88T;
    (4) K50N, K54Q, R83D, R84D, R86N, R88T, R124D;
    (5) K75L, P76D, P77R, S78N, 79 내지 82번 위치의 아미노산 결실, R83L, R84W, Q85G, K86L, H87A, R88G; 및
    (6) K75L, P76D, P77R, S78N, T79L, 81 내지 84번 위치의 아미노산 결실, Q85S, K86L, H87A, R88N.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 5 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 인터루킨21 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 인터루킨21 변이체를 포함하는, 융합단백질.
  6. 제5항에 있어서, 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함하고, 상기 Fc쌍은 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 변이를 포함하는 이종이중체 (heterodimer)인 융합단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인터루킨21 변이체는 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 N-말단에 결합하는 융합단백질.
  8. 제6항에 있어서, 상기 IL-21 또는 이의 변이체는 링커로 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역에 연결되어 있는 융합단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커는 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는 융합단백질.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제1 Fc 영역 및 제2 Fc 영역 각각은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 Fc 영역 유래인 융합단백질.
  11. 제6항에 있어서, 상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 변이는 다음의 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하고 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 하는 융합단백질:
    (1) 제 1 Fc 영역의 CH3 도메인 중 K360 위치에서 K360E로 치환;
    (2) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인 중 K409 위치에서 K409W로 치환;
    (3) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 E347 위치에서 E347R로 치환; 및
    (4) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 F405 위치에서 F405T로 치환 및 D399 위치에서의 D399V로 치환.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제 1 Fc 영역 또는 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 다음을 추가로 포함하고 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 하는 융합단백질:
    (i) 제1 Fc 영역의 CH3 도메인 내 Y349 위치에 치환된 시스테인 (C); 또는
    (ii) 제2 Fc 영역의 CH3 도메인 내 S354 위치에 치환된 시스테인 (C).
  13. 제6항에 있어서, 상기 제 1 Fc 영역 및 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 변이는 다음의 변이를 포함하고 변이 위치는 EU index에 따르는 것을 특징으로 하는 융합단백질:
    (1) 제 1 Fc 영역의 CH3 도메인 중 K360 위치에서 K360E로 치환, K409 위치에서 K409W로 치환; 및 (2) 제 2 Fc 영역의 CH3 도메인 중 E347 위치에서 E347R로 치환; 및 F405 위치에서 F405T로 치환 및 D399 위치에서의 D399V로 치환.
  14. 제6항에 있어서, 서열번호 5 내지 10으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 인터루킨21 변이체, 서열번호 1의 서열을 포함하는 제 1 Fc 영역 및 서열번호 2의 서열을 포함하는 제 2 Fc 영역을 포함하는 항체(immunoglobulin) 중쇄불변부위 (Fc) 쌍을 포함하는, 융합단백질.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인터루킨21 변이체를 코딩하는 핵산.
  16. 제14항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  17. 제15항의 발현벡터를 포함하는, 형질전환 재조합 세포.
  18. 다음 단계를 포함하는 인터루킨21 변이체의 제조방법:
    (a) 제16항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계.
  19. 제5항의 융합단백질을 코딩하는 핵산.
  20. 제19항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  21. 제20항의 발현벡터를 포함하는, 형질전환 재조합 세포.
  22. 다음 단계를 포함하는 융합단백질의 제조방법:
    (a) 제21항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 융합단백질을 회수하는 단계.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인터루킨21 변이체 또는 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인터루킨21 변이체 또는 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항의 융합단백질을 면역세포에 처리하는 것을 포함하는 배양방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 배양방법.
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