CN114450393A - 重组修饰腺相关病毒辅助载体及其在提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的用途 - Google Patents
重组修饰腺相关病毒辅助载体及其在提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及能够提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的包装效率的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其在提高这种rAAV的包装效率的用途。特别地，本发明涉及重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其被进一步修饰为使用与不同血清型的rAAV的Rep蛋白相关的AAV P5和/或P40启动子替换(或增加)与通过这种rAAV编码的Rep蛋白天然相关的P5和/或P40启动子序列。使用这种替换或另外的启动子序列造成重组修饰腺相关病毒的生产增加。
Description
技术领域
本发明涉及能够提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的包装效率的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其在提高这种rAAV的包装效率的用途。特别地，本发明涉及重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其被进一步修饰为使用与不同血清型的rAAV的Rep蛋白相关的AAV P5和/或P40启动子替换(或增加)与通过这种rAAV编码的Rep蛋白天然相关的P5和/或P40启动子序列。这种取代或另外的启动子序列造成重组修饰腺相关病毒的生产增加。
序列表引用
本申请包括一种或多种按照37C.F.R.1.821et seq.的序列表，其以计算机可读介质(文件名：2650-0004US_ST25.txt，创建于2019年7月15日，文件大小为84,101字节)公开，该文件通过引用全部并入本文。
背景技术
I.腺相关病毒(AAV)
腺相关病毒(AAV)是小的、自然形成的、非致病性的病毒，属于细小病毒科的依赖病毒属(Balakrishnan,B.et al.(2014)“Basic Biology of Adeno-Associated Virus(AAV)Vectors Used in Gene Therapy,”Curr.Gene Ther.14(2):86-100；Zinn,E.et al.(2014)“Adeno-Associated Virus:Fit To Serve,”Curr.Opin.Virol.0:90-97)。尽管没有造成疾病，已知AAV能够感染人类和其他灵长类动物，并且在人类群体中流行(Johnson,F.B.et al.(1972)“Immunological Reactivity of Antisera Prepared Against theSodium Dodecyl Sulfate-Treated Structural Polypeptides of Adenovirus-Associated Virus,”J.Virol.9(6):1017-1026)。AAV感染大范围的不同细胞类型(例如，中枢神经系统细胞、心脏细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、胰腺细胞、视网膜色素上皮细胞或感光细胞或骨骼肌细胞)。已经识别出病毒的十二种血清型(例如，AAV2、AAV5、AAV6等)，其表现出不同的组织感染能力(“向性”)(Colella,P.et al.(2018)“Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87-104；Hocquemiller,M.et al.(2016)“Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNSDiseases,”Hum.Gene Ther.27(7):478-496；Lisowski,L.et al.(2015)“Adeno-Associated Virus Serotypes For Gene Therapeutics,”24:59-67)。
AAV是单链DNA病毒，由大约4,800个核苷酸组成。病毒基因组可以描述为具有5’半和3’半，其共同构成编码病毒蛋白的基因(图1)。AAV基因组的5’半包括AAV rep基因，其通过使用多种阅读框架、交错的启动子(P5、P19和P40)和可变剪接编码四种非结构Rep蛋白(Rep40、Rep52、Rep68和Rep78)，这是病毒转录控制和复制和将病毒包装到病毒衣壳所需的(Lackner,D.F.et al.(2002)“Studies of the Mechanism of Transactivation of theAdeno-Associated Virus p19 Promoter by Rep Protein,”J.Virol.76(16):8225-8235)。在存在病毒蛋白(例如Ad蛋白)的情况下，P5启动子被激活并且介导Rep68和Rep78蛋白的转录，其涉及转录控制、潜伏(latency)、拯救(rescue)以及病毒DNA复制，因此作为AAV生命周期的主要控制子(Murphy,M.et al.(2007)“Adeno-Associated Virus Type 2p5Promoter:a Rep-Regulated DNA Switch Element Functioning in Transcription,Replication,and Site-Specific Integration,”J.Virol.81(8):3721-3730)。Rep68和Rep78蛋白的表达激活P19启动子，P19启动子负责Rep40和Rep52蛋白的转录(Lackner,D.F.Et al.(2002)“Studies of the Mechanism of Transactivation of the Adeno-Associated Virus p19 Promoter by Rep Protein,”J.Virol.76(16):8225-8235；Ogasawara,Y.et al.(1998)“The Use of Heterologous Promoters for Adeno-Associated Virus(AAV)Protein Expression in AAV Vector Production,”Microbiol.Immunol.42(3):177-185)。AAV基因组的3’半包括AAV衣壳基因(cap)，该基因编码三种衣壳蛋白(VP)：VP1、VP2和VP3。这三种衣壳蛋白从由单个启动子(在AAV2的情况下，P40)控制的单个mRNA转录物翻译而来。AAV基因组的3’半还包括AAP基因，该基因编码AAV组装活化蛋白(AAP)。六十个VP单体(包括大约VP1的5个副本、VP2的5个副本和VP3的50个副本)在AAV基因组周围自组装以形成成熟病毒颗粒的二十面体蛋白壳(衣壳)(Büning,H.etal.(2019)“Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy ofAAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248-P265；Van Vliet K.M.et al.(2008)The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.In:DrugDelivery Systems,Jain,K.K.(eds.),Meth.Molec.Biol.437:51-91)。AAV AAP蛋白被认为是稳定和将新产生的VP蛋白质从细胞质运输到细胞核中所需的。AAV基因组的3’半还包括AAV X基因，该基因被认为是编码支持基因复制的蛋白质(Colella,P.et al.(2018)“Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87-104；Büning,H.et al.(2019)“CapsidModifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248-P265；Cao,M.et al.(2014)“The X Gene Of Adeno-Associated Virus 2(AAV2)Is Involved In Viral DNA Replication,”PLoS ONE 9,e104596:1-10)。
上述AAV基因编码序列的两侧是145个核苷酸的两个AAV特异性的回文反向重复序列(ITR)(Balakrishnan,B.et al.(2014)“Basic Biology of Adeno-Associated Virus(AAV)Vectors Used in Gene Therapy,”Curr.Gene Ther.14(2):86-100；Colella,P.etal.(2018)“Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87-104)。
AAV是一种天生有缺陷的病毒，缺乏执行以下至少两种至关重要的功能的能力：启动病毒特异性产物合成的能力和组装这种产物以形成成熟的感染性病毒颗粒的十二面体蛋白质壳(衣壳)的能力。因此，AAV需要共感染“辅助(helper)”病毒，例如腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、牛痘病毒或人乳头瘤病毒以提供病毒相关(VA)RNA，该RNA不是由AAV基因组的基因编码的。这种VA RNA没有进行翻译，但在调节其他病毒基因的翻译方面发挥作用。类似地，该AAV基因组不包括编码病毒蛋白E1a、E1b、E2a和E4的基因；因此，这些蛋白还必须由共感染“辅助”病毒提供。E1a蛋白极大地促进了增殖性感染过程中的病毒基因转录。E1b阻断了在腺病毒感染的细胞中的凋亡，因此允许增殖性感染继续进行。E2a蛋白通过展开模板和增强转录的启动，在病毒链置换复制的伸长阶段发挥作用。E4蛋白已被证明会影响转基因持久性、载体毒性和免疫原性(参见Grieger,J.C.et al.(2012)“Adeno-Associated Virus Vectorology,Manufacturing,and Clinical Applications,”Meth.Enzymol.507:229-254；Dyson,N.et al.(1992)“Adenovirus E1A Targets KeyRegulators Of Cell Proliferation,”Canc.Surv.12:161-195；Jones N.C.(1990)“Transformation By The Human Adenoviruses,”Semin.Cancer Biol.1(6):425-435；Ben-Israel,H.et al.(2002)“Adenovirus and Cell Cycle Control,”Front.Biosci.7:D1369-d1395；Hoeben,R.C.et al.(2013)“Adenovirus DNA Replication,”Cold SpringHarb.Perspect.Biol.5:a013003(pages 1-11)；Berk,A.J.(2013)“Adenoviridae:TheViruses And Their Replication,In:Fields Virology,6th Edition(Knipe,D.M.et al.,Eds.),Vol.2.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,pages 1704-1731；Weitzman,M.D.(2005)“Functions Of The Adenovirus E4 Proteins And Their ImpactOn Viral Vectors,”Front.Biosci.10:1106-1117)。
AAV病毒同时感染分裂细胞和非分裂细胞，并持续作为环状游离分子或可以在特定的染色体位点(腺相关病毒整合位点或AAVS)整合到宿主细胞的DNA(Duan,D.(2016)“Systemic Delivery Of Adeno-Associated Viral Vectors,”Curr.Opin.Virol.21:16-25；Grieger,J.C.et al.(2012)“Adeno-Associated Virus Vectorology,Manufacturing,and Clinical Applications,”Meth.Enzymol.507:229-254)。AAV仍然潜伏于这种受感染的细胞中，除非存在辅助病毒以提供AAV复制和成熟所需的功能。
II.rAAV及其在基因治疗的用途
鉴于AAV的特性，AAV的重组修饰版本(rAAV)已发现作为基因治疗的载体的实质性效用(参见Naso,M.F.et al.(2017)“Adeno-Associated Virus(AAV)as a Vector forGene Therapy,”BioDrugs 31:317-334；Berns,K.I.et al.(2017)“AAV:An Overview ofUnanswered Questions,”Human Gene Ther.28(4):308-313；Berry,G.E.et al.(2016)“Cellular Transduction Mechanisms Of Adeno-Associated Viral Vectors,”Curr.Opin.Virol.21:54-60；Blessing,D.et al.(2016)“Adeno-Associated Virus AndLentivirus Vectors:A Refined Toolkit For The Central Nervous System,”21:61-66；Santiago-Ortiz,J.L.(2016)“Adeno-Associated Virus(AAV)Vectors in CancerGene Therapy,”J.Control Release 240:287-301；Salganik,M.et al.(2015)“Adeno-Associated Virus As AMammalian DNA Vector,”Microbiol.Spectr.3(4):1-32；Hocquemiller,M.et al.(2016)“Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNSDiseases,”Hum.Gene Ther.27(7):478-496；Lykken,E.A.et al.(2018)“Recent ProgressAnd Considerations For AAV Gene Therapies Targeting The Central NervousSystem,”J.Neurodevelop.Dis.10:16:1-10；Büning,H.et al.(2019)“CapsidModifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248-P265；During,M.J.et al.(1998)“In VivoExpression Of Therapeutic Human Genes For Dopamine Production In The CaudatesOf MPTP-Treated Monkeys Using An AAV Vector,”Gene The.5:820-827；Grieger,J.C.et al.(2012)“Adeno-Associated Virus Vectorology,Manufacturing,andClinical Applications,”Meth.Enzymol.507:229-254；Kotterman,M.A.et al.(2014)“Engineering Adeno-Associated Viruses For Clinical Gene Therapy,”Nat.Rev.Genet.15(7):445-451；Kwon,I.et al.(2007)“Designer Gene DeliveryVectors:Molecular Engineering and Evolution of Adeno-Associated Viral Vectorsfor Enhanced Gene Transfer,”Pharm.Res.25(3):489-499)；美国专利号：10,266,845；10,081,659；9,890,396；9,840,719；9,839,696；9,834,789；9,803,218；9,783,825；9,777,291；9,540,659；9,527,904；8,236,557；7,972,593和7,943,374)。
通常使用环形质粒(“rAAV质粒载体”)产生rAAV。通常从这种构建体中删除AAVrep和cap基因并替换成启动子、β球蛋白内含子、插入所选治疗基因(转基因)的克隆位点和多聚腺苷酸化(“polyA”)位点。然而，仍然保留rAAV的末端反向重复序列(ITR)，使得rAAV质粒载体的转基因表达盒的两侧是AAV ITR序列(Colella,P.et al.2018)“Emerging Issuesin AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87-104；Büning,H.et al.(2019)“Capsid Modifications for Targeting and Improving theEfficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248-P265)。因此，在5’至3’方向，rAAV包括5’ITR、rAAV的转基因表达盒和3’ITR。
rAAV已被用于向患有大量基因疾病(例如，遗传性脂蛋白酯酶缺乏症(LPLD)、莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)、芳香族L-胺基酸类脱羧基酶缺乏症(AADC)、无脉络膜症和血友病)中的任一种的患者递送基因，并且在新型临床形式中具有效用，例如RNA干扰(RNAi)治疗和基因修饰策略，例如Crispr/Cas9(美国专利号8,697,359、10,000,772、10,113,167、10,227,611；Lino,C.A.et al.(2018)“Delivering CRISPR:A Review Of The ChallengesAnd Approaches,”Drug Deliv.25(1):1234-1237；Ferreira,V.et al.(2014)“ImmuneResponses To AAV-Vectors,The Glybera Example From Bench To Bedside”Front.Immunol.5(82):1-15),Büning,H.et al.(2019)“Capsid Modifications forTargeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248-P265；Rastall,D.P.W.(2017)“Current and FutureTreatments for Lysosomal Storage Disorders,”Curr.Treat Options Neurol.19(12):45；Kay,M.et al.(2017)“Future Of rAAV Gene Therapy:Platform For RNAi,GeneEditing And Beyond,”Human Gene Ther.28:361-372)；Berns,K.I.et al.(2017)“AAV:AnOverview of Unanswered Questions,”Human Gene Ther.28(4):308-313)。已经建立超过150个涉及rAAV的临床试验(Büning,H.et al.(2019)“Capsid Modifications forTargeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248-P265；Clément,N.et al.(2016)“Manufacturing OfRecombinant Adeno-Associated Viral Vectors For Clinical Trials,”Meth.Clin.Develop.3:16002:1-7)。这种重组修饰AAV最常用的AAV血清型是AAV2，其能够感染中枢神经系统细胞、肾细胞、视网膜色素上皮细胞和感光细胞。AAV血清型是AAV9，其感染肌肉细胞，还得到了广泛使用(Duan,D.(2016)“Systemic Delivery Of Adeno-Associated Viral Vectors,”Curr.Opin.Virol.21:16-25)。AAV血清型描述于美国专利号10,301,650；10,266,846；10,265,417；10,214,785；10,214,566；10,202,657；10,046,016；9,884,071；9,856,539；9,737,618；9,677,089；9,458,517；9,457,103；9,441,244；9,193,956；8,846,389；8,507,267；7,906,111；7,479,554；7,186,552；7,105,345；6,984,517；6,962,815；和6,733,757。
III.rAAV的生产方法
含有所需的转基因表达盒的rAAV通常由悬浮生长的人类细胞(例如HEK293)细胞所产生。如上所述，因为rAAV是缺陷型病毒，必须提供另外的功能以复制和包装rAAV。
rAAV可以由具有rAAV质粒载体和第二质粒载体的瞬时转染细胞产生，第二质粒载体包括AAV辅助功能提供多核苷酸，该多核苷酸提供载体转录控制和复制以及将病毒基因组包装至病毒衣壳所需的Rep52和Rep78基因(Rep40和Rep68不是rAAV生产所需的)，和从AAV中删除以产生rAAV的cap基因。第二质粒载体可另外包括非AAV辅助功能提供多核苷酸，其编码AAV增殖所需的病毒转录和翻译因子(E1a、E1b、E2a、VA和E4)，以便与rAAV一起构成双质粒转染系统(Grimm,D.et al.(1998)“Novel Tools For Production AndPurification Of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors,”Hum.Gene Ther.9:2745-2760；Penaud-Budloo,M.et al.(2018)“Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:166-180)。
然而，克隆AAV辅助功能提供多核苷酸(其提供所需的rep和cap基因)到AAV辅助质粒和在不同质粒(例如，“Ad辅助质粒”)上克隆非AAV辅助功能提供多核苷酸(其提供编码病毒转录和翻译因子的基因)变得越来越普遍，使得这种质粒与rAAV质粒载体一起构成三质粒转染系统(图2)。使用三质粒转染系统的优点是允许一个cap基因简单切换到另一cap基因，从而促进rAAV血清型变化。使用辅助质粒，而不是辅助病毒，允许在没有另外产生辅助病毒颗粒的情况下产生rAAV(
A.et al.(2018)“Accurate Titration ofInfectious AAV Particles Requires Measurement of Biologically Active VectorGenomes and Suitable Controls,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.10:223-236；Matsushita,T.et al.(1998)“Adeno-Associated Virus Vectors Can Be EfficientlyProduced Without Helper Virus,”Gene Ther.5:938-945)。
通过磷酸钙共沉淀法将包含rAAV质粒载体、AAV rep和cap基因以及反式作用AAD辅助基因的质粒DNA瞬时转染到HEK293细胞中，已经变成在研究实验室中产生rAAV的标准方法(Grimm,D.et al.(1998)“Novel Tools For Production And Purification OfRecombinant Adeno-Associated Virus Vectors,”Hum.Gene Ther.9:2745-2760)。然而，将这种磷酸钙介导的转染方法与悬浮培养的转染哺乳动物细胞一起使用需要更换培养基，因此不被认为是为了产生治疗剂量的rAAV所需的大规模rAAV生产的理想方法(Lock,M.etal.(2010)“Rapid,Simple,and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale,”Hum.Gene Ther.21:1259-1271)。出于这一原因，将聚乙烯亚胺(PEI)用作转染试剂，并且已发现提供与那些使用磷酸钙介导的转导所获得的病毒产量相似的病毒产量(Durocher,Y.et al.(2007)“Scalable Serum-FreeProduction Of Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2By Transfection Of293Suspension Cells,”J.Virol.Meth.144:32-40)。
或者，可在昆虫细胞(例如，sf9细胞)中使用杆状病毒载体(参见，例如美国专利号9,879,282；9,879,279；8,945,918；8,163,543；7,271,002和6,723,551)，或在HSV感染的幼仓鼠肾(BHK)细胞(例如，BHK21)中(
A.et al.(2018)“Accurate Titration ofInfectious AAV Particles Requires Measurement of Biologically Active VectorGenomes and Suitable Controls,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.10:223-236)产生rAAV。rAAV生产方法记载于Grieger,J.C.et al.(2012)“Adeno-Associated VirusVectorology,Manufacturing,and Clinical Applications,”Meth.Enzymol.507:229-254，以及在Penaud-Budloo,M.et al.(2018)“Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:166-180中。
IV.rAAV纯化和回收的方法
通常，在生产后，通过一种或多种过夜CsCl梯度离心法(Zolotukhin,S.et al.(1999)“Recombinant Adeno-Associated Virus Purification Using Novel MethodsImproves Infectious Titer And Yield,”Gene Ther.6:973-985)收集和纯化rAAV，然后通过脱盐以形成纯化的rAAV生产储备。可获得滴度为1012-1013的感染性rAAV衣壳/mL。
因为rAAV感染没有造成细胞病变效应，所以空斑测定不能用于确定rAAV制剂的感染性滴度。因此，感染性滴度通常测量为半数组织培养感染剂量(TCID50)。以这种方法，HeLa衍生AAV2 rep和cap表达细胞系在96孔板中生长，并在存在血清型5的腺病毒情况下，使用rAAV制剂的10倍连续稀释液重复感染。在感染后，载体基因组复制由定量PCR(qPCR)确定(Zen,Z.et al.(2004)“Infectious Titer Assay For Adeno-Associated VirusVectors With Sensitivity Sufficient To Detect Single Infectious Events,”Hum.Gene Ther.15:709-715)。或者，可以使用感染中心测定(ICA)测量rAAV制剂的感染性滴度。这一检测使用HeLa rep-cap细胞和Ad，但是，在孵育后，涉及将细胞转移到膜上。将与所采用的转基因的一部分互补的标记探针通过杂交用于检测感染中心(表示个别受感染的细胞)。尽管得到更广泛的应用，TCID50测定已被报道造成比ICA更高的背景，并且相对于ICA高估了载体感染性(
A.et al.(2018)“Accurate Titration of InfectiousAAV Particles Requires Measurement of Biologically Active Vector Genomes andSuitable Controls,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.10:223-236)。产生和纯化rAAV的方法除其他外描述于美国专利号10,294,452；10,161,011；10,017,746；9,598,703；7,625,570；7,439,065；7,419,817；7,208,315；6,995,006；6,989,264；6,846,665和6,841,357。
尽管取得了全部这些先前的优势，但是仍然需要发展能够解决目前限制rAAV对基因治疗的实用性的问题的方法(Grieger,J.C.et al.(2012)“Adeno-Associated VirusVectorology,Manufacturing,and Clinical Applications,”Meth.Enzymol.507:229-254；Kotterman,M.A.et al.(2014)“Engineering Adeno-Associated Viruses ForClinical Gene Therapy,”Nat.Rev.Genet.15(7):445-451；Kwon,I.et al.(2007)“Designer Gene Delivery Vectors:Molecular Engineering and Evolution of Adeno-Associated Viral Vectors for Enhanced Gene Transfer,”Pharm.Res.25(3):489-499；Naso,M.F.et al.(2017)“Adeno-Associated Virus(AAV)as a Vector for GeneTherapy,”BioDrugs 31:317-334)。
本发明涉及通过调节AAV rep和cap基因的表达来提高AAV和rAAV包装效率的方法。
发明内容
本发明涉及能够提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其在提高这种rAAV的包装效率的用途。特别地，本发明涉及重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其被进一步修饰为使用与不同血清型的rAAV的Rep蛋白相关的AAVP5和/或P40启动子替换(或增加)与通过这种rAAV编码的Rep蛋白天然相关的P5和/或P40启动子序列。使用这种替换或另外的启动子序列造成重组修饰腺相关病毒的生产增加。
详细地，本发明提供包含AAV辅助功能提供多核苷酸(特别是作为质粒载体的AAV辅助功能提供多核苷酸)的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该多核苷酸包含非天然AAV血清型P5或P40启动子序列。
特别地，本发明包括这种重组修饰腺相关病毒(AAV)的实施例，其中AAV辅助功能提供多核苷酸载体包含非天然AAV血清型P5启动子序列和/或非天然AAV血清型P40启动子序列。
特别地，本发明还包括这种重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体的实施例，其中非天然AAV血清型P5或P40启动子序列替换天然AAV血清型启动子序列。
特别地，本发明还包括这种重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体的实施例，其中该载体还包括非AAV辅助功能提供多核苷酸。
本发明还提供提高包含转基因盒的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中该方法包括培养已用以下转染的细胞：
(1)rAAV；
(2)上述重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其另外包含非AAV辅助功能提供多核苷酸；
其中在足以允许rAAV产生的条件下在培养基中进行培养，并且其中存在非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致细胞以相对于如果AAV辅助功能多核苷酸含有天然血清型P5或P40启动子会达到的生产滴度提高的生产滴度产生rAAV。
本发明还提供提高包含转基因盒的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中该方法包括培养已用以下转染的细胞：
(1)rAAV；
(2)上述重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体的任一种；和
(3)另外的载体，特别是包含非AAV辅助功能提供多核苷酸的质粒载体；
其中在足以允许rAAV产生的条件下在培养基中进行培养，并且其中存在非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致细胞以相对于如果AAV辅助功能多核苷酸含有天然血清型P5或P40启动子会达到的生产滴度提高的生产滴度产生rAAV。
特别地，本发明包括这种方法的实施例，其中转基因盒编码蛋白质，或包含转录核酸，其有助于治疗基因或可遗传性疾病或病况。
特别地，本发明还包括这种方法的实施例，其中：
(A)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV1 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(B)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV2 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(C)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV3 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(D)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV4 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(E)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV5 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(F)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV6 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(G)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV7 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(H)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV8 Cap蛋白，并且非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列。
特别地，本发明还包括这种方法的实施例，其中细胞是人胚胎肾细胞、幼仓鼠肾细胞或sf9昆虫细胞。
本发明另外提供药物组合物，该药物组合物包括由上述方法中任一种产生的重组修饰腺相关病毒(rAAV)和药学上可接受的载剂。
附图说明
图1提供了野生型(Wt)AAV基因组的遗传图谱示意图。
图2提供了野生型AAV2基因组(1)、重组AAV(rAAV)(2)、互补“AAV辅助质粒”(3)和腺病毒辅助质粒(“Ad辅助质粒”)(4)的结构域示意图。野生型(Wt)AAV2(1)是由AAV特异性回文末端反向重复序列(ITR)、含有编码Rep蛋白的基因的5’半和含有编码Cap蛋白的基因的3’半组成。通过将野生型(Wt)AAV2(1)的Rep和Cap编码基因替换成包括启动子(Pro)、感兴趣的外源性转基因和多腺苷酸化位点(pA)的转基因盒，形成rAAV(2)。为了产生rAAV(2)，提供互补“AAV辅助”质粒载体(3)和腺病毒辅助质粒载体(Ad辅助质粒)(4)。互补AAV辅助质粒(3)提供Rep和Cap蛋白。Ad辅助质粒(4)提供腺病毒蛋白E1a、E1b、E2a、VA和E4。
图3示出了AAV辅助质粒载体pAAV-RC1(SEQ ID NO：1)的图谱。
图4示出了AAV辅助质粒载体pAAV-RC2(SEQ ID NO：2)的图谱。
图5示出了AAV辅助质粒载体pAAV-RC5(SEQ ID NO：3)的图谱。
图6示出了AAV辅助质粒载体pAAV-RC6(SEQ ID NO：4)的图谱。
图7示出了AAV辅助质粒载体pAAV-RC7(SEQ ID NO：5)的图谱。
图8示出了非AAV辅助质粒载体pHelper-Kan(SEQ ID NO：6)的图谱。
图9示出了rAAV质粒载体pAV-CMV-EGFP(SEQ ID NO：7)的图谱。
图10示出了rAAV质粒载体pAV-TBG-EGFP(SEQ ID NO：8)的图谱。
图11示出了开发本文所述的示例性AAV辅助构建体所遵循的整体结构和方法。亲本构建体(pAAV-RC2；亲本-RC)包括P5和P19的AAV2血清型启动子序列(实心黑色方块)，其指导表达编码Rep蛋白的天然AAV2 rep基因(白色方块基因)，和P40启动子的AAV2血清型启动子(实心黑色方块)，其指导表达编码Cap蛋白的天然AAV2 cap基因(灰色方块基因)。
P5-RC构建体是亲本质粒AAV RC的衍生物，其已被修饰为使用非天然P5启动子(即AAV P5启动子天然不存在于载体的AAV rep基因内(向下条纹方块))替代天然AAV血清型P5启动子(实心黑色方块)指导表达AAV rep基因；P5-RC构建体使用亲本载体的天然AAV血清型P19和P40启动子序列(实心黑色方块)指导表达AAV rep和cap基因。P40-RC构建体是亲本质粒AAV RC的衍生物，其已被修饰为使用非天然P40启动子(即AAV P40启动子天然不存在于载体的AAV rep基因内(向上条纹方块))替代天然AAV血清型P40启动子(实心黑色方块)指导表达AAV cap基因；P40-RC构建体使用亲本载体的天然AAV血清型P5和P19启动子序列(实心黑色方块)指导表达AAV rep基因。P5/40-RC构建体是亲本质粒AAV RC的衍生物，其已被修饰为使用非天然P5启动子(即AAV P5启动子天然不存在于载体的AAV rep基因内(向下条纹方块))替代天然AAV血清型P5启动子(实心黑色方块)指导表达AAV rep基因。P5/40-RC已被另外修饰为使用非天然P40启动子(即AAV P40启动子天然不存在于载体的AAV rep基因内(向上条纹方块))替代天然AAV血清型P40启动子(实心黑色方块)指导表达AAV cap基因。P40-RC构建体使用亲本载体的天然AAV血清型P19启动子序列(实心黑色方块)指导表达AAV rep基因。启动子区域的序列如表1所示。
图12A-12B示出了通过修饰亲本RC2载体以包含替代与这种载体的rep基因天然相关的AAV2 P5启动子的非天然P5启动子序列(图11；图12A；向下条纹长矩形)所获得的rAVV的生产滴度。P19和P40启动子都是天然AAV2血清型启动子序列(实心黑色矩形)。图12B示出了使用这种AAV辅助质粒载体所获得的rAAV的生产滴度。采用以下构建体：亲本-RC2、P5(2)-RC2、P5(1)-RC2、P5(3)-RC2、P5(4)-RC2、P5(5)-RC2、P5(7)-RC2和P5(8)-RC2。启动子区域的序列如表1所示。使用具有rAAV和提供所需的腺病毒功能的Ad辅助质粒的三质粒转染系统获得rAAV的生产滴度。
图13A-13B示出了通过修饰亲本RC2载体以包含替代亲本载体的AAV2血清型P40启动子的非天然P40启动子序列(图11；图13A；向上条纹长矩形)所获得的rAVV的生产滴度。P5和P19启动子都是天然AAV2血清型启动子序列(实心黑色方块)。图13B示出了使用这种AAV辅助质粒载体所获得的rAAV的生产滴度。采用以下构建体：亲本-RC2、P40(1)-RC2、P40(3)-RC2、P40(4)-RC2、P40(5)-RC2、P40(6)-RC2、P40(7)-RC2和P40(8)-RC2。启动子区域的序列如表1所示。使用具有rAAV和提供所需的腺病毒功能的Ad辅助质粒的三质粒转染系统获得rAAV的生产滴度。
图14A-14B示出了通过修饰亲本RC2载体以包含替代亲本载体的AAV2血清型P5和P40启动子的非天然P5启动子序列和/或非天然P40启动子序列(图11；图14A；P5，向下条纹矩形；P40，向上条纹矩形)所获得的rAVV的生产滴度。P19启动子是天然AAV2血清型启动子序列(实心黑色矩形)。采用以下构建体：亲本-RC2、P5(2)-RC2、P5(3)-RC2、P5(5)-RC2、P40(1)-RC2、P5(2)/P40(1)-RC2、P5(3)/P40(1)-RC2和P5(5)/P40(1)-RC2。启动子区域的序列如表1所示。图14B示出了使用这种AAV辅助质粒载体所获得的rAAV的生产滴度。使用具有rAAV和提供所需的腺病毒功能的Ad辅助质粒的三质粒转染系统获得rAAV的生产滴度。
图15A-15C示出了通过修饰亲本RC6载体以包含替代与这种载体天然相关的rep基因的AAV2血清型P5启动子的非天然P5启动子序列(图11；图15A；向下条纹矩形)所获得的rAVV的生产滴度。P19和P40启动子都是天然AAV2血清型启动子序列(实心黑色矩形)。采用以下构建体：亲本-RC6、P5(1)-RC6、P5(2)-RC6、P5(3)-RC6、P5(7)-RC6和P5(8)-RC6。启动子区域的序列如表1所示。使用具有rAAV和提供所需的腺病毒功能的Ad辅助质粒的三质粒转染系统获得rAAV的生产滴度(图15B-15C)。
图16A-16B示出了通过修饰亲本RC1、RC5或RC7载体以包含替代与这种载体的rep基因天然相关的AAV2血清型P5启动子的非天然P5启动子(图11；图16A；向下条纹矩形)所获得的rAAV的生产滴度。P19和P40启动子都是天然AAV2血清型启动子序列(实心黑色矩形)。采用以下构建体：亲本-RC1、亲本-RC5、亲本-RC7、P5(2)-RC1、P5(7)-RC1、P5(8)-RC1、P5(7)-RC5、P5(2)-RC7、P5(7)-RC7和P5(8)-RC7。启动子区域的序列如表1所示。使用具有rAAV和提供所需的腺病毒功能的Ad辅助质粒的三质粒转染系统获得rAAV的生产滴度(图16B)。
具体实施方式
I.本发明的方法
本发明涉及能够提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其在提高这种rAAV的包装效率的用途。特别地，本发明涉及重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其被进一步修饰为使用与不同血清型的rAAV的Rep蛋白相关的AAVP5和/或P40启动子替换(或增加)与通过这种rAAV编码的Rep蛋白天然相关的P5和/或P40启动子序列。这种取代或另外的启动子序列造成重组修饰腺相关病毒的生产增加。
本发明部分基于认识到高水平Rep和Cap蛋白提高所产生的rAAV基因组颗粒的数量，从而提高了rAAV的包装效率，因此导致rAAV储备的高生产滴度。意外发现，通过使用不同的AAV P5和/或P40启动子替换直接表达Cap蛋白的AAV P5和/或P40启动子、或通过添加除了那些起始存在的不同的AAV P5和/或P40启动子，导致达到所需高水平的rAAV。AAV Rep蛋白描述于美国专利号10,214,730；7,122,348；6,821,511；6,753,419；9,441,206和7,115,391。
如上所讨论的，基于AAV和rAAV的血清型对AAV和rAAV进行表征，通过其衣壳蛋白确定(Colella,P.et al.(2018)“Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo GeneTherapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87-104；Hocquemiller,M.et al.(2016)“Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases,”Hum.Gene Ther.27(7):478-496；Lisowski,L.et al.(2015)“Adeno-Associated Virus Serotypes For GeneTherapeutics,”24:59-67；美国专利号10,301,650；10,266,846；10,265,417；10,214,785；10,214,566；10,202,657；10,046,016；9,884,071；9,856,539；9,737,618；9,677,089；9,458,517；9,457,103；9,441,244；9,193,956；8,846,389；8,507,267；7,906,111；7,479,554；7,186,552；7,105,345；6,984,517；6,962,815；和6,733,757)。通过在存在编码不同血清型的两种或多种衣壳蛋白的AAV辅助功能提供多核苷酸的情况下形成AAV和rAAV，可以产生具有“杂交型”血清型的AAV和rAAV。这种AAV和rAAV表现出具有每种这种衣壳蛋白的AAV和rAAV的组合向性。
不同AAV血清型的Rep蛋白是不同的，然而，因为这种蛋白不是结构蛋白，这些区别对所观察的AAV血清型没有贡献。
如本文所使用的，术语“AAV”旨在表示腺相关病毒，可用于指代病毒本身或其衍生物。术语涵盖所有亚型以及自然形成和重组形式。如本文所使用的，术语“rAAV”旨在表示AAV的重组修饰版本，包含非是AAV来源的多核苷酸序列(即与AAV异源的多核苷酸)。rAAV可以是单链或双链的，可由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成。如上所讨论的，rAAV通常缺乏某些AAV基因，因此使用双质粒转染系统，或更优选地三质粒转染系统产生rAAV，三质粒转染系统包含包括AAV辅助功能提供多核苷酸的质粒载体、包括非AAV辅助功能提供多核苷酸的质粒载体和rAAV质粒载体(图2)。在一个实施例中，这种双质粒转染系统或三质粒转染系统的AAV辅助功能提供多核苷酸可包含超过一个rep和/或cap基因，以便于能够形成具有杂交型血清型的rAAV。在另一实施例中，可提供第二或另外的AAV辅助功能提供多核苷酸(例如在第二或另外的质粒载体上)以允许形成具有杂交型血清型的rAAV。
A.说明性AAV辅助功能提供多核苷酸
如本文所使用的，术语“AAV辅助功能”表示rAAV复制和包装所需的AAV蛋白(例如，Rep和Cap)和/或AAV的多核苷酸。这种AAV辅助功能由“AAV辅助功能提供多核苷酸”提供，正如本文所使用的该术语是被整合到细胞染色体中的病毒、质粒载体、非质粒载体或多核苷酸，其提供AAV辅助功能。可根据本发明使用AAV辅助质粒以提供AAV辅助功能，包括pAAV-RC(Agilent；Addgene；Cell Biolabs)、pAAV-RC1、pAAV-RC2、pAAV-RC5、pAAV-RC6和pAAV-RC7。
1.质粒pAAV-RC1
质粒pAAV-RC1(SEQ ID NO：1；图3)是表达AAV1血清型衣壳蛋白的AAV辅助质粒，可根据本发明使用该质粒以提供AAV辅助功能。pAAV-RC1的P5和P40启动子是AAV2血清型启动子(分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18)。
质粒pAAV-RC1的编码链(SEQ ID NO：1)：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccgcgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaacaaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgtggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagcatctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtgatcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcggagaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtcccaaatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtgggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatccccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggctgtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacgggtgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggaggaggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtggaccagaaatgc aagtcctcgg 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在SEQ ID NO：1中，pAAV-RC1的残基1-1561编码Rep蛋白Rep78(残基95-221对应于AAV2 P19启动子，残基1075-1254对应于AAV2 P40启动子(SEQ ID NO：18))；残基1578-3788编码AAV1 VP1衣壳蛋白；残基7127-7431编码Rep68蛋白的一部分；残基3984-4114对应于AAV2 P5启动子序列(SEQ ID NO：10)；残基4237-4253是M13 Rev序列；残基4261-4277是Lac操作子序列；4285-4315是Lac启动子序列；残基4578-5302对应于pMB ori序列，残基5398-6258编码氨苄青霉素抗性决定簇；和残基6259-6357是bla启动子序列(图3)。
2.质粒pAAV-RC2
质粒pAAV-RC2(SEQ ID NO：2；图4)是表达AAV2血清型衣壳蛋白的AAV辅助质粒，可根据本发明使用该质粒以提供AAV辅助功能。pAAV-RC2的P5和P40启动子是AAV2血清型启动子(分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18)。
质粒pAAV-RC2的编码链(SEQ ID NO：2)：
ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ggggagctcg cagggtctcc attttgaagcgggaggtttg aacgcgcagc cgccatgccg gggttttacg agattgtgat taaggtcccc agcgaccttgacgagcatct gcccggcatt tctgacagct ttgtgaactg ggtggccgag aaggaatggg agttgccgccagattctgac atggatctga atctgattga gcaggcaccc ctgaccgtgg ccgagaagct gcagcgcgactttctgacgg aatggcgccg tgtgagtaag gccccggagg ctcttttctt tgtgcaattt gagaagggagagagctactt ccacatgcac gtgctcgtgg aaaccaccgg ggtgaaatcc atggttttgg gacgtttcctgagtcagatt cgcgaaaaac tgattcagag aatttaccgc gggatcgagc cgactttgcc aaactggttcgcggtcacaa agaccagaaa tggcgccgga ggcgggaaca aggtggtgga tgagtgctac atccccaattacttgctccc caaaacccag cctgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaacagtatt taagcgcctgtttgaatctc acggagcgta aacggttggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcagaacaaagaga atcagaatcc caattctgat gcgccggtga tcagatcaaa aacttcagcc aggtacatggagctggtcgg gtggctcgtg gacaagggga ttacctcgga gaagcagtgg atccaggagg accaggcctcatacatctcc ttcaatgcgg cctccaactc gcggtcccaa atcaaggctg ccttggacaa tgcgggaaagattatgagcc tgactaaaac cgcccccgac tacctggtgg gccagcagcc cgtggaggac atttccagcaatcggattta taaaattttg gaactaaacg ggtacgatcc ccaatatgcg gcttccgtct ttctgggatgggccacgaaa aagttcggca agaggaacac catctggctg tttgggcctg caactaccgg gaagaccaacatcgcggagg ccatagccca cactgtgccc ttctacgggt gcgtaaactg gaccaatgag aactttcccttcaacgactg tgtcgacaag atggtgatct ggtgggagga ggggaagatg accgccaagg tcgtggagtcggccaaagcc attctcggag gaagcaaggt gcgcgtggac cagaaatgca agtcctcggc ccagatagacccgactcccg tgatcgtcac ctccaacacc aacatgtgcg ccgtgattga cgggaactca acgaccttcgaacaccagca gccgttgcaa gaccggatgt tcaaatttga actcacccgc cgtctggatc atgactttgggaaggtcacc aagcaggaag tcaaagactt tttccggtgg gcaaaggatc acgtggttga ggtggagcatgaattctacg tcaaaaaggg tggagccaag aaaagacccg cccccagtga cgcagatata agtgagcccaaacgggtgcg cgagtcagtt gcgcagccat cgacgtcaga cgcggaagct tcgatcaact acgcagacaggtaccaaaac aaatgttctc gtcacgtggg catgaatctg atgctgtttc cctgcagaca atgcgagagaatgaatcaga attcaaatat ctgcttcact cacggacaga aagactgttt agagtgcttt cccgtgtcagaatctcaacc cgtttctgtc gtcaaaaagg cgtatcagaa actgtgctac attcatcata tcatgggaaaggtgccagac gcttgcactg cctgcgatct ggtcaatgtg gatttggatg actgcatctt tgaacaataaatgatttaaa tcaggtatgg ctgccgatgg ttatcttcca gattggctcg aggacactct ctctgaaggaataagacagt ggtggaagct caaacctggc ccaccaccac caaagcccgc agagcggcat aaggacgacagcaggggtct tgtgcttcct gggtacaagt acctcggacc cttcaacgga ctcgacaagg gagagccggtcaacgaggca gacgccgcgg ccctcgagca cgacaaagcc tacgaccggc agctcgacag cggagacaacccgtacctca agtacaacca cgccgacgcg gagtttcagg agcgccttaa agaagatacg tcttttgggggcaacctcgg acgagcagtc ttccaggcga aaaagagggt tcttgaacct ctgggcctgg ttgaggaacctgttaagacg gctccgggaa aaaagaggcc ggtagagcac tctcctgtgg agccagactc ctcctcgggaaccggaaagg cgggccagca gcctgcaaga aaaagattga attttggtca gactggagac gcagactcagtacctgaccc ccagcctctc ggacagccac cagcagcccc ctctggtctg ggaactaata cgatggctacaggcagtggc gcaccaatgg cagacaataa cgagggcgcc gacggagtgg gtaattcctc gggaaattggcattgcgatt ccacatggat gggcgacaga gtcatcacca ccagcacccg aacctgggcc ctgcccacctacaacaacca cctctacaaa caaatttcca gccaatcagg 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ctacggagca gtatggttctgtatctacca acctccagag aggcaacaga caagcagcta ccgcagatgt caacacacaa ggcgttcttccaggcatggt ctggcaggac agagatgtgt accttcaggg gcccatctgg gcaaagattc cacacacggacggacatttt cacccctctc ccctcatggg tggattcgga cttaaacacc ctcctccaca gattctcatcaagaacaccc cggtacctgc gaatccttcg accaccttca gtgcggcaaa gtttgcttcc ttcatcacacagtactccac gggacaggtc agcgtggaga tcgagtggga gctgcagaag gaaaacagca aacgctggaatcccgaaatt cagtacactt ccaactacaa caagtctgtt aatgtggact ttactgtgga cactaatggcgtgtattcag agcctcgccc cattggcacc agatacctga ctcgtaatct gtaattgctt gttaatcaataaaccgttta attcgtttca gttgaacttt ggtctctgcg tatttctttc ttatctagtt tccatgctctaggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg ctttgtagtt aatgattaac ccgccatgctacttatctac gtagccatgc tctagaggtc ctgtattaga ggtcacgtga gtgttttgcg acattttgcgacaccatgtg gtcacgctgg gtatttaagc ccgagtgagc acgcagggtc tccattttga agcgggaggtttgaacgcgc agccgccaag ccgaattctg cagatatcca aacactggcg gccgctcgac tagagcggccgccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc 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在SEQ ID NO：2中，pAAV-RC2的残基85-1950编码Rep蛋白Rep78(残基484-663对应于AAV2 P19启动子，残基1464-1643对应于AAV2 P40启动子(SEQ ID NO：18)和残基1668-1676是供体位点)；残基1967-4174编码AAV2 VP1衣壳蛋白；残基1992-2016编码Rep68蛋白的一部分；残基4175-4256编码polyA序列；残基4357-4487对应于SEQ ID NO：10的AAV2 P5启动子序列；残基4610-4626是M13 Rev序列；残基4634-4650是Lac操作子序列；4658-4688是Lac启动子序列；残基4951-5675对应于pMB ori序列，残基5771-6631编码氨苄青霉素抗性决定簇；和残基6632-6730是bla启动子序列(图4)。
3.质粒pAAV-RC5
质粒pAAV-RC5(SEQ ID NO：3；图5)是表达AAV5血清型衣壳蛋白的AAV辅助质粒，可根据本发明使用该质粒以提供AAV辅助功能。pAAV-RC5的P5和P40启动子是AAV2血清型启动子(分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18)。
质粒pAAV-RC5的编码链(SEQ ID NO：3)：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccgcgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaacaaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgtggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagcatctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtgatcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcggagaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtcccaaatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtgggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatccccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggctgtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacgggtgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggaggaggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtggaccagaaatgc aagtcctcgg 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在SEQ ID NO：3中，pAAV-RC5的残基1-1561编码Rep蛋白Rep78(残基91-221对应于AAV2 P19启动子，残基1075-1254对应于P40启动子(SEQ ID NO：18))；残基1578-3749编码AAV5 VP1衣壳蛋白；残基7091-7395编码Rep68蛋白的一部分；残基3948-4078对应于SEQ IDNO：10的AAV2 P5启动子序列；残基4201-4217是M13 Rev序列；残基4225-4241是Lac操作子序列；4249-4279是Lac启动子序列；残基4542-5266对应于pMB ori序列，残基5362-6222编码氨苄青霉素抗性决定簇；和残基6223-6321是bla启动子序列(图5)。
4.质粒pAAV-RC6
质粒pAAV-RC6(SEQ ID NO：4；图6)是表达AAV6血清型衣壳蛋白的AAV辅助质粒，可根据本发明使用该质粒以提供AAV辅助功能。pAAV-RC6的P5和P40启动子是AAV2血清型启动子(分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18)。
质粒pAAV-RC6的编码链(SEQ ID NO：4)：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccgcgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaacaaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgtggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagcatctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtgatcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcggagaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtcccaaatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtgggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatccccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggctgtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacgggtgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggaggaggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtggaccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc gtgatcgtca cctccaacac caacatgtgcgccgtgattg acgggaactc aacgaccttc gaacaccagc agccgttgca agaccggatg ttcaaatttgaactcacccg ccgtctggat catgactttg ggaaggtcac caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtgggcaaaggat cacgtggttg aggtggagca tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagacccgcccccagtg acgcagatat aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca tcgacgtcagacgcggaagc ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatctgatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag aatgaatcag aattcaaata tctgcttcac tcacggacagaaagactgtt tagagtgctt tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt cgtcaaaaag gcgtatcagaaactgtgcta cattcatcat atcatgggaa aggtgccaga cgcttgcact gcctgcgatc tggtcaatgtggatttggat gactgcatct ttgaacaata aatgatttaa atcaggtatg gctgccgatg gttatcttccagattggctc gaggacaacc tctctgaggg cattcgcgag tggtgggact tgaaacctgg agccccgaaacccaaagcca accagcaaaa gcaggacgac ggccggggtc tggtgcttcc tggctacaag tacctcggacccttcaacgg actcgacaag ggggagcccg tcaacgcggc ggatgcagcg gccctcgagc acgacaaggcctacgaccag cagctcaaag cgggtgacaa 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在SEQ ID NO：4中，pAAV-RC6的残基1-1561编码Rep蛋白Rep78(残基91-221对应于AAV2 P19启动子，残基1075-1254对应于P40启动子(SEQ ID NO：18))；残基1578-3788编码AAV6 VP1衣壳蛋白；残基736-1281编码Rep68蛋白的一部分；残基3984-4114对应于SEQ IDNO：10的AAV2 P5启动子序列；残基4237-4253是M13 Rev序列；残基4261-4277是Lac操作子序列；4285-4315是Lac启动子序列；残基4578-5302对应于pMB ori序列，残基5398-6258编码氨苄青霉素抗性决定簇；和残基6259-6357是bla启动子序列(图6)。
5.质粒pAAV-RC7
质粒pAAV-RC7(SEQ ID NO：5；图7)是表达AAV6血清型衣壳蛋白的AAV辅助质粒，可根据本发明使用该质粒以提供AAV辅助功能。pAAV-RC7的P5和P40启动子是AAV2血清型启动子(分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18)。
质粒pAAV-RC7的编码链(SEQ ID NO：5)：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccgcgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaacaaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgtggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagcatctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtgatcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcggagaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtcccaaatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtgggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatccccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggctgtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacgggtgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggaggaggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtggaccagaaatgc aagtcctcgg 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actgcctgga gtacttcccc tctcagatgctgagaacggg caacaacttt gagttcagct acagcttcga ggacgtgcct ttccacagca gctacgcacacagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc cctcatcgac cagtacttgt actacctggc cagaacacagagtaacccag gaggcacagc tggcaatcgg gaactgcagt tttaccaggg cgggccttca actatggccgaacaagccaa gaattggtta cctggacctt gcttccggca acaaagagtc tccaaaacgc tggatcaaaacaacaacagc aactttgctt ggactggtgc caccaaatat cacctgaacg gcagaaactc gttggttaatcccggcgtcg ccatggcaac tcacaaggac gacgaggacc gctttttccc atccagcgga gtcctgatttttggaaaaac tggagcaact aacaaaacta cattggaaaa tgtgttaatg acaaatgaag aagaaattcgtcctactaat cctgtagcca cggaagaata cgggatagtc agcagcaact tacaagcggc taatactgcagcccagacac aagttgtcaa caaccaggga gccttacctg gcatggtctg gcagaaccgg gacgtgtacctgcagggtcc catctgggcc aagattcctc acacggatgg caactttcac ccgtctcctt tgatgggcggctttggactt aaacatccgc ctcctcagat cctgatcaag aacactcccg ttcccgctaa tcctccggaggtgtttactc ctgccaagtt tgcttcgttc atcacacagt acagcaccgg acaagtcagc gtggaaatcgagtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagattcag 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在SEQ ID NO：5中，pAAV-RC7的残基1-1561编码Rep蛋白Rep78(残基91-221对应于AAV2 P19启动子，残基1075-1254对应于P40启动子(SEQ ID NO：18))；残基1578-3791编码AAV7 VP1衣壳蛋白；残基736-1281编码Rep68蛋白的一部分；残基3987-4117对应于SEQ IDNO：10的AAV2 P5启动子序列；残基4240-4256是M13 Rev序列；残基4264-4280是Lac操作子序列；4288-4318是Lac启动子序列；残基4581-5305对应于pMB ori序列，残基5401-6261编码氨苄青霉素抗性决定簇；和残基6262-6360是bla启动子序列(图7)。
B.说明性非AAV辅助功能多核苷酸
如本文所使用的，术语“非AAV辅助功能”表示rAAV复制和包装所需的Ad、CMV、HSV或其他非AAD病毒蛋白(例如，E1a、E1b、E2a、VA和E4)和/或Ad、CMV、HSV或其他非AAD病毒的多核苷酸。这种非AAV辅助功能由“非AAV辅助功能提供多核苷酸”提供，正如本文所使用的该术语是被整合到细胞染色体的病毒、质粒载体、非质粒载体或多核苷酸，其提供非AAV辅助功能。载体pHelper及其衍生物(例如那些可从Cell Biolabs,Inc.、Invitrogen、Stratagene和其他来源购买得到的)是合适的非AAV辅助功能提供多核苷酸(参见，例如Matsushita,T.et al.(1998)“Adeno-Associated Virus Vectors Can Be EfficientlyProduced Without Helper Virus,”Gene Ther.5:938-945；Sharma,A.et al.(2010)“Transduction Efficiency Of AAV 2/6,2/8And 2/9Vectors For Delivering Genes InHuman Corneal Fibroblasts,”Brain Res.Bull.81(2-3):273-278)。
质粒pHelper-Kan(SEQ ID NO：6；图8)是非AAV辅助功能提供多核苷酸，可根据本发明使用该质粒以提供非AAV辅助功能。
质粒pHelper-Kan的编码链(SEQ ID NO：6)：
ggtacccaac tccatgctta acagtcccca ggtacagccc accctgcgtc gcaaccaggaacagctctac agcttcctgg agcgccactc gccctacttc cgcagccaca gtgcgcagat taggagcgccacttcttttt gtcacttgaa aaacatgtaa aaataatgta ctaggagaca ctttcaataa aggcaaatgtttttatttgt acactctcgg gtgattattt accccccacc cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaaggggttctgcc gcgcatcgct atgcgccact ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccacttaaactcagg cacaaccatc cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaacgcgtttagc aggtcgggcg ccgatatctt gaagtcgcag ttggggcctc cgccctgcgc gcgcgagttgcgatacacag ggttgcagca ctggaacact atcagcgccg ggtggtgcac gctggccagc acgctcttgtcggagatcag atccgcgtcc aggtcctccg cgttgctcag ggcgaacgga gtcaactttg gtagctgccttcccaaaaag ggtgcatgcc caggctttga gttgcactcg caccgtagtg gcatcagaag gtgaccgtgcccggtctggg cgttaggata cagcgcctgc atgaaagcct tgatctgctt aaaagccacc tgagcctttgcgccttcaga gaagaacatg ccgcaagact tgccggaaaa ctgattggcc ggacaggccg cgtcatgcacgcagcacctt gcgtcggtgt tggagatctg caccacattt cggccccacc ggttcttcac gatcttggccttgctagact gctccttcag 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gccagagcgtcccgaccatg gagcactttt tgccgctgcg caacatctgg aaccgcgtcc gcgactttcc gcgcgcctccaccaccgccg ccggcatcac ctggatgtcc aggtacatct acggattacg tcgacgttta aaccatatgatcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgagcaaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgcccccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagataccaggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgtccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgtaggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggtaactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacaggattagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactagaagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttgatccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaaaaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgttaagggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagttttaaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gtcagaagaa ctcgtcaaga aggcgatagaaggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgccaagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggccacagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtcacgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctgatgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcgatgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagccatgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatagcagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagtaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagccacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaaccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtcatagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc 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在SEQ ID NO：6中，pHelper-Kan的残基1-5343来源于腺病毒，并包括编码E2A蛋白的多核苷酸(残基258-1847)；残基5344-8535来源于腺病毒，并包括编码E4orf6蛋白的多核苷酸；残基9423-10011对应于ori序列；残基10182-10976编码由bla启动子序列(残基10977-11081)表达的卡那霉素抗性决定簇；残基11107-11561对应于fl ori序列(图8)。
C.说明性rAAV质粒载体
如上所讨论的，通常采用AAV辅助功能提供多核苷酸和非AAV辅助功能提供多核苷酸与rAAV质粒载体一起构成三质粒转染系统。多种市售可得的rAAV质粒载体(例如，pAV-CMV-EGFP、pGOI等(Cell Biolabs,Inc.、Invitrogen和Stratagene))可根据本发明进行使用。可根据本发明使用的说明性rAAV质粒载体是pAV-CMV-EGFP(SEQ ID NO：7；图9)，包括5’ITR、U6启动子、CMV增强子和启动子序列、编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的多核苷酸(Gambotto,A.et al.(2000)“Immunogenicity Of Enhanced Green Fluorescent Protein(EGFP)In BALB/CMice:Identification Of An H2-Kd-Restricted CTL Epitope,”GeneTher.7(23):2036-2040；Tsien,R.Y.(1998)“The Green Fluorescent Protein,”Annu.Rev.Biochem.67:509-544；Cinelli,R.A.et al.(2000)“The Enhanced GreenFluorescent Protein As A Tool For The Analysis Of Protein Dynamics AndLocalization:Local Fluorescence Study At The Single-Molecule Level,”Photochem.Photobiol.71(6):771-776；Chopra A.(2008)“Recombinant Adenovirus WithEnhanced Green Fluorescent Protein,”In:Molecular Imaging and Contrast AgentDatabase(MICAD),National Center for Biotechnology Information,Bethesda MD)、用于促进表达蛋白回收或定位的FLAG标签和6xHis标签位点、SV40 poly(A)位点和3’ITR。
质粒pAV-CMV-EGFP的编码链(SEQ ID NO：7)：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgacctttggtcgcccgg ccctccagtg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgcggccgcacgc gtctagttat taatagtaat cgaattcgtg ttactcataa ctagtaaggt cgggcaggaagagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaattaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggtagtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgatttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga cgcgggatcc actggaccag gcagcagcgt cagaagacttttttggaaaa gcttgactag taatactgta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatatatggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccattgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtggagtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgacgtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggcagtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtggatagcggttt gactcacggg 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在SEQ ID NO：7中，pAV-CMV-EGFP的残基1-128对应于5’ITR；残基201-441是U6启动子序列；残基562-865是人巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子序列；残基866-1068包含CMV即刻早期启动子；残基1192-1911包含编码EGFP的哺乳动物密码子优化多核苷酸；残基1918-1941编码FLAG标签；残基1951-1968编码6xHis标签；残基2139-2260编码SV40 poly(A)序列；残基2293-2433对应于3’ITR；残基2508-22963对应于F1 ori序列；残基3350-4210编码由bla启动子序列(残基3245-3349)表达的氨苄青霉素抗性决定簇及其信号序列(残基3350-3418)；残基4381-4969对应于ori序列(图9)。
可根据本发明使用的第二说明性rAAV质粒载体是pAV-TBG-EGFP(SEQ ID NO：8；图10)，包含5’ITR、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的多核苷酸、用于促进表达蛋白的回收或定位的FLAG标签和6xHis标签位点、SV40 poly(A)位点和3’ITR。
质粒pAV-TBG-EGFP的编码链(SEQ ID NO：8)：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgacctttggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcctgcggccggtc gcgtctagta ctagtaggtt aatttttaaa aagcagtcaa aagtccaagt ggcccttggcagcatttact ctctctgttt gctctggtta ataatctcag gagcacaaac attccagatc caggttaatttttaaaaagc agtcaaaagt ccaagtggcc cttggcagca tttactctct ctgtttgctc tggttaataatctcaggagc acaaacattc cagatccggc gcgccagggc tggaagctac ctttgacatc atttcctctgcgaatgcatg tataatttct acagaaccta ttagaaagga tcacccagcc tctgcttttg tacaactttcccttaaaaaa ctgccaattc cactgctgtt tggcccaata gtgagaactt tttcctgctg cctcttggtgcttttgccta tggcccctat tctgcctgct gaagacactc ttgccagcat ggacttaaac ccctccagctctgacaatcc tctttctctt ttgttttaca tgaagggtct ggcagccaaa gcaatcactc aaagttcaaaccttatcatt ttttgctttg ttcctcttgg ccttggtttt gtacatcagc tttgaaaata ccatcccagggttaatgctg gggttaattt ataactaaga gtgctctagt tttgcaatac aggacatgct ataaaaatggaaagatgttg ctttctgaga gacaggtacc gaggagatct gccgccgcga tcgccaccat ggtgagcaagggcgaggagc tgttcaccgg 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在SEQ ID NO：8中，pAV-TBG-EGFP的残基1-130对应于5’ITR；残基150-854是TBG启动子序列，残基415-824包含TBG启动子；残基886-1608编码EGFP；残基1630-1653编码FLAG标签；残基1663-1680编码6xHis；残基1851-1972编码poly(A)序列；残基2005-2145对应于3’ITR；残基2220-2675对应于F1 ori序列；残基3062-3922编码由bla启动子序列(残基2957-3061)表达的氨苄青霉素抗性决定簇及其信号序列(残基3062-3130)；残基4093-4681对应于ori序列(图10)。
如本文所使用的，术语“天然AAV血清型启动子序列”旨在表示天然控制AAV rep基因的转录或天然存在于这种rep基因中的启动子序列。例如：
·AAV1 P5启动子序列天然控制AAV1的rep基因的转录，并且AAV1 P40启动子序列天然存在于AAV1的rep基因中。因此，AAV1 P5启动子序列和AAV1 P40启动子序列是AAV1的rep基因的天然AAV血清型启动子序列。
·AAV2 P5启动子序列天然控制AAV2的rep基因的转录，并且AAV2 P40启动子序列天然存在于AAV2的rep基因中。因此，AAV2 P5启动子序列和AAV2 P40启动子序列是AAV2的rep基因的天然AAV血清型启动子序列。
·AAV5 P5启动子序列天然控制AAV5的rep基因的转录，并且AAV5 P40启动子序列天然存在于AAV5的rep基因中。因此，AAV5 P5启动子序列和AAV5 P40启动子序列是AAV5的rep基因的天然AAV血清型启动子序列。
·AAV6 P5启动子序列天然控制AAV6的rep基因的转录，并且AAV6 P40启动子序列天然存在于AAV6的rep基因中。因此，AAV6 P5启动子序列和AAV6 P40启动子序列是AAV6的rep基因的天然AAV血清型启动子序列；以及
·AAV7 P5启动子序列天然控制AAV7的rep基因的转录，并且AAV7P40启动子序列天然存在于AAV7的rep基因中。因此，AAV7 P5启动子序列和AAV7 P40启动子序列是AAV7的rep基因的天然AAV血清型启动子序列。
用于AAV血清型1-8的天然AAV P5和P40启动子序列如表1所示。这种能够介导转录的序列或其子序列可根据本发明的方法使用。
相反，术语“非天然AAV血清型启动子序列”旨在表示不天然控制AAV的rep基因并且不天然存在于这种rep基因中的启动子序列。非天然AAV血清型启动子序列的说明性、非限制性示例包括：当用于指导表达AAV2、AAV5、AAV6或AAV7 rep基因时，AAV1 P5启动子；当用于指导表达AAV1、AAV5、AAV6或AAV7 rep基因时，AAV2 P5启动子；当用于指导表达AAV1、AAV2、AAV6或AAV7 rep基因时，AAV5 P5启动子；当用于指导表达AAV1、AAV2、AAV5或AAV7rep基因，AAV6 P5启动子；当用于指导表达AAV1、AAV2、AAV5或AAV6 rep基因，AAV7 P5启动子；当存在于AAV2、AAV5、AAV6或AAV7 rep基因中时，AAV1 P40启动子；当存在于AV1、AAV5、AAV6或AAV7 rep基因中时，AAV2 P40启动子；当存在于AAV1、AAV2、AAV6或AAV7 rep基因中时，AAV5 P40启动子；当存在于AAV1、AAV2、AAV5或AAV7 rep基因中时，AAV6 P40启动子；当存在于AAV1、AAV2、AAV5或AAV6 rep基因中时，AAV7 P40启动子等。
在一个实施例中，这种AAV血清型启动子序列的一种或多种可以基因工程化为重组AAV辅助质粒，该质粒设计为提供Rep和Cap蛋白以替换或增加这种质粒现有的P5和P40启动子。优选地，使用重组DNA技术的已知方法完成这种修饰。
本文通过表示涉及的启动子(例如，P5、P40等)、与其天然相关的rep基因的血清型和载体名称来指示启动子序列的血清型的身份。因此，例如，包含与AAV2天然相关的P5启动子序列的pAAV-RC2质粒表示为P5(2)-RC2；包含与AAV3天然相关的P5启动子序列的pAAV-RC2质粒表示为P5(3)-RC2；包含与AAV7天然相关的P40启动子序列的pAAV-RC5质粒表示为P40(7)-RC5；包含与AAV3天然相关的P5启动子序列和与AAV8天然相关的P40启动子序列的pAAV-RC2质粒表示为P5(3)/P40(8)-RC2；等等。
在一个实施例中，所引入的AAV血清型启动子序列会替换起始存在的AAV血清型启动子序列。在其他实施例中，所引入的AAV血清型启动子序列会存在于除这种起始存在的AAV血清型启动子序列外，并且会定位5’或3’至这种起始存在的AAV血清型启动子序列。所引入的多核苷酸序列可定位于与这种起始存在的AAV血清型启动子序列相邻或远离的位置。
本发明中这种AAV血清型启动子序列的一种或多种的替换或添加提高rAAV生产滴度。如本文所使用的，术语“生产滴度”旨在表示制剂中感染性rAAV浓度的量。这种含量或浓度优选地通过滴定这种制剂中的AAV或rAAV确定。优选地，将生产细胞(例如，HEK293，其使用rAAV质粒载体、提供Rep和Cap蛋白的AAV辅助载体和提供所需的腺相关转录和翻译因子的Ad辅助载体进行转化)经过三轮冷冻/解冻，然后超声处理以释放rAAV颗粒，滴定本发明的rAAV制剂的生产滴度。然后将制剂离心。所采用的AAV辅助载体位于上清液中。使用蛋白酶K处理制剂的等分试样，并且测定AAV基因组的数量。将制剂的等分试样感染到HeLa-32C2细胞(其表达AAV2 Rep和Cap蛋白)中，使用感染中心测定(ICA)测量感染性滴度(
A.et al.(2018)“Accurate Titration of Infectious AAV Particles RequiresMeasurement of Biologically Active Vector Genomes and Suitable Controls,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.10:223-236)，或更优选地，作为半数组织培养感染剂量(TCID50)(Zen,Z.et al.(2004)“Infectious Titer Assay For Adeno-Associated VirusVectors With Sensitivity Sufficient To Detect Single Infectious Events,”Hum.Gene Ther.15:709-715)。
如本文所使用的，如果使用本发明的方法获得的生产滴度比从类似进行生产所获得的生产滴度(其中未提供另外提供的离子)大至少10％，更优选地大至少20％，仍然更优选地大至少30％，仍然更优选地大至少40％，仍然更优选地大至少50％，仍然更优选地大至少60％，仍然更优选地大至少70％，仍然更优选地大至少80％，仍然更优选地大至少90％，仍然更优选地大至少2倍，仍然更优选地大至少110％，仍然更优选地大至少120％，仍然更优选地大至少130％，仍然更优选地大至少140％，仍然更优选地大至少2.5倍，仍然更优选地大至少160％，仍然更优选地大至少170％，仍然更优选地大至少180％，仍然更优选地大至少190％，仍然更优选地大至少3倍，则称为通过本发明的方法“增加”rAAV生产滴度。
使用本发明的方法可增加其生产滴度的rAAV可包括任何允许将rAAV包装到可封装在AAV衣壳颗粒内的rAAV质粒载体的转基因盒。在没有限制的情况下，这种转基因盒可以是源于人类、灵长类(包括黑猩猩、长臂猿、大猩猩、红毛猩猩等)、猴(包括狒狒、食蟹猕猴、黑长尾猴(velvet monkey)等)、犬科、鼠科(包括大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠等)、猫科、绵羊科、山羊科或马科。
在优选实施例中，这种rAAV或rAAV质粒载体会编码蛋白质(例如，酶、激素、抗体、受体、配体等)或包括转录核酸，其与基因或可遗传性疾病或病况相关，使其可用于基因治疗以治疗这种疾病或病况。
可使用本发明的方面以提高细胞中rAAV和rAAV质粒载体的生产滴度，该细胞还使用以下进行转染：
(1)AAD辅助载体，其具有非天然AAV血清型启动子序列，能够表达这种rAAV或rAAV质粒载体未天然提供但是其生产所需的蛋白质或RNA分子。如上所讨论的，这种蛋白质或RNA分子包括编码载体转录控制和复制以及将病毒基因组包装至病毒衣壳中所需的Rep52和Rep78蛋白的基因，以及编码形成感染性颗粒所需的VP衣壳蛋白的cap基因；和
(2)Ad辅助载体，其可提供这种AAV或rAAV质粒载体未提供但是其生产所需的非AAV辅助蛋白(例如，E1a、E1b、E2a、VA和E4)或RNA分子。
在生产本发明的rAAV的一个实施例中，所有这些基因和RNA分子在相同辅助病毒(或更优选地，辅助载体)上提供，以便与rAAV一起构成双质粒转染系统。然而，更优选地，为生产本发明的rAAV，提供所需的rep和cap基因的AAV辅助功能提供多核苷酸和这种非天然AAV血清型启动子序列在载体上提供，该载体与包含非AAV辅助功能提供多核苷酸的载体分开，使得这种载体或质粒与rAAV一起构成三质粒转染系统。
因此，本发明部分来源于认识到可通过导致由不是天然启动子序列的启动子序列引导的Rep和Cap蛋白的表达来提高rAAV的生产。因此，通过修饰特定的rAAV以使用非天然P5和/或P40 AAV血清型启动子序列替代其天然P5和/或P40 AAV血清型启动子序列(或通过将非天然P5和/或P40 AAV血清型启动子序列并入这种rAAV中)，可采用本发明的方法以提高属于任何血清型的rAAV的生产滴度，包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10血清型，并且包括杂交型血清型(例如，AAV2/5和rAAV2/5，其为AAV血清型2和5的杂交型，因此具有这两种血清型的向性)。
可采用本发明的方法以提高使用由腺病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、牛痘病毒或乳头瘤病毒提供的“辅助”RNA或蛋白质生产的rAAV的生产滴度。
可采用本发明的方法以提高由单层贴壁培养或悬浮培养中的细胞生产的rAAV的生产滴度，并且可以与任何能够生产rAAV的方法使用。然而，优选地，通过转染幼仓鼠肾(BHK)细胞或更优选地在具有上述质粒载体的组织培养中生长的人胚胎肾(HEK)细胞来生产rAAV。缺乏内源性逆转录病毒的BHK细胞系BHK-21(ATCC CCL-10)是优选的BHK细胞系。HEK细胞系HEK293(ATCC CRL-1573)及其衍生物，例如HEK293T(ATCC CRL-3216，其为HEK293细胞系的高度可转染衍生物，其中插入SV40 T抗原的温敏基因)或HEK293T/17(
CRL-11268，出于便于转染而选择)是特别优选的。HEK293T/17SF细胞系(ATCC ACS-4500)是293T/17细胞系(ATCC CRL-11268)的衍生物，适于不含血清的培养基和悬浮液，如果需要可以采用。
优选的用于培养这类细胞的本发明中的基础培养基是伊格尔最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，ATCC目录号30-2003)或杜氏改良伊格尔培养基(DMEM；Mediatech，马萨纳斯，弗吉尼亚)。将胎牛血清(例如FBS；HyClone Laboratories，南洛根，犹他州)添加到10％的最终浓度中以制造完全生长培养基。伊格尔最低必需培养基和杜氏改良伊格尔培养基是除了各种无机盐外含有氨基酸、维生素和可选地葡萄糖的复合培养基。培养基的区别在于，杜氏改良伊格尔培养基含有大约四倍存在于伊格尔最低必需培养基的原始制剂中的维生素和氨基酸和两至四倍的葡萄糖。另外，其含有硫酸铁形式的离子和用于指示pH的酚红(Yao,T et al.(2017)“Animal-Cell Culture Media:History,Characteristics,And Current Issues,”Reproduc.Med.Biol.16(2):99-117)。
用于这种转染的细胞优选地每周传代两次以维持其在指数增长阶段。针对小规模转染，可以采用等分试样，例如，在多孔板上每孔1×106HEK293或BHK细胞或每15cm板培养皿1.5×107HEK293细胞。针对大规模生产，可从多个汇合的15cm板收集HEK293或BHK细胞，并分成两个10层细胞堆(cell stack)(Corning，康宁，纽约州)，其中含有1升完全培养基。在一个实施例中，在转染前这种细胞在这种培养基中生长4天。在转染前一天，对这两个细胞堆进行胰蛋白酶消化并且将细胞(例如，大约6×108细胞)重新悬浮在200ml培养基中。优选地，在转染前允许细胞附着24小时。可以使用Diaphot倒置显微镜(Nikon，梅尔维尔，纽约州)监测细胞堆的汇合度，相差硬件已从中移除，以便在显微镜载物台上容纳细胞堆。
特别地，本发明因此提供用于提高包含转基因盒的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中该方法包括培养已用以下进行转染的细胞：
(1)rAAV；
(2)包含AAV辅助功能提供多核苷酸的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中这种多核苷酸包含替换天然AAV血清型启动子序列或除此之外的非天然AAV血清型P5或P40启动子序列；和
(3)包含非AAV辅助功能提供多核苷酸的载体；
其中在足以允许生产rAAV的条件下，在培养基进行培养，并且其中存在非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致细胞以相对于如果AAV辅助功能提供多核苷酸含有天然血清型P5和P40启动子会获得的生产滴度而提高的生产滴度来生产rAAV。
本发明还提供提高包含转基因盒的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中该方法包含培养已用以下转染的细胞：
(1)rAAV；和
(2)重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，包含：
(a)AAV辅助功能提供多核苷酸，其中这种多核苷酸包含替换天然AAV血清型启动子序列或除此之外的非天然AAV血清型P5或P40启动子序列；和
(b)非AAV辅助功能提供多核苷酸；
其中在足以允许rAAV生产的条件下，在培养基中进行培养，并且其中存在非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致细胞以相对于如果AAV辅助功能提供多核苷酸含有天然血清型P5和P40启动子会获得的生产滴度而提高的生产滴度来生产rAAV。
在优选实施例中，这种rAAV的转基因盒编码蛋白质或包含转录核酸，其治疗基因或可遗传性疾病或病况。
II.本发明的药物组合物
本发明另外包括药物组合物，该药物组合物包含根据本发明方法所生产的rAAV的药学上可接受的制剂和药学上可接受的载剂。这种药物组合物的rAAV包含编码蛋白质的转基因盒或包括转录核酸，其治疗基因或可遗传性疾病或病况，并且以有效的量(“有效量”)存在于这种药物组合物中。
术语“药学上可接受的”是指联邦管理机构或州政府批准的或U.S.药典中或其他用于动物(尤其是人类)的普遍认可的药典所列的。术语“载剂”是指稀释剂、佐剂(例如，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、赋形剂或用于施用治疗的媒介物。这种药学上可接受的载剂可以是无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、蔬菜或合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当通过静脉注射施用药物组合物时，水是优选的载剂。还可采用盐溶液和葡萄糖水溶液和丙三醇溶液作为液体载剂，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、壳粉(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。合适的药物赋形剂描述于美国专利号8,852,607；8,192,975；6,764,845；6,759,050；和7,598,070。
通常，本发明组合物的成分分开或以单位剂量形式混合在一起供应，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，或作为水溶液在不透气的密封容器中，例如标明活性剂的量的小瓶、安瓿、或小袋。在通过输液施用组合物的情况下，可以用含有无菌医药级水或盐水的输液瓶配药。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供一安瓿注射用无菌水或生理盐水或其他稀释剂，以便在给药前混合成分。
本发明还提供了包括一个或多个容器的药物组合物的药包或试剂盒。可选地，与这种容器相关的是由监管药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告示，该告示反映了该机构对制造、使用或销售用于人类施用的批准。
这种药物组合物的rAAV优选地包装在不透气的密封容器中，例如标明分子数量的小瓶、安瓿或小袋，并可选地包括使用说明。在一个实施例中，这种试剂盒的rAAV是以不透气的密封容器中的干燥灭菌冻干粉末或无水浓缩物的形式提供的，并且可以复溶，例如用水、生理盐水或其他稀释剂复溶到适当的浓度施用给受试者。冻干材料应储存在2℃到8℃之间的原始容器，该材料应该在复溶后12小时内施用，优选地在6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在另一实施例中，这种试剂盒的rAAV以水溶液的形式在不透气的密封容器中提供，并且可以稀释，例如用水、生理盐水或其他稀释剂稀释到适当的浓度施用给受试者。该试剂盒还可包括在一个或多个容器中的一种或多种对治疗疾病或病况有用的预防和/或治疗剂；和/或该试剂盒还可包括一种或多种与癌症相关的一种或多种癌症抗原结合的细胞毒性抗体。在某些实施例中，其他预防或治疗剂是化学治疗剂。在其他实施例中，预防或治疗剂是生物或激素治疗剂。
III.本发明的用途
本发明的方法可用于促进rAAV的生产，特别是可用于促进包含转基因盒的rAAV的生产，该转基因盒编码蛋白质(例如，酶、激素、抗体、受体、配体等)，或包含转录核酸的rAAV的生产，其与基因或可遗传性疾病或病况相关，从而可用于基因治疗以治疗这种疾病或病况。这种疾病或病况的示例包括：全色盲(ACHM)；α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症；阿尔茨海默病；芳香族L-胺基酸类脱羧基酶(AADC)缺乏症；无脉络膜症(CHM)；癌症；杜氏肌营养不良症；dysferlin缺乏症；卵泡抑素基因缺乏症(BMDSIBM)；血友病A；血友病B；甲肝；乙肝；丙肝；亨廷顿氏病；特发性帕金森氏病；晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病(LINCL，贝敦氏症的婴儿型)；莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)；莱伯氏遗传性视神经病(LHON)；肢带型肌营养不良症1B(LGMD1B)；肢带型肌营养不良症1C(LGMD1C)；肢带型肌营养不良症2A(LGMD2A)；肢带型肌营养不良症2B(LGMD2B)；肢带型肌营养不良症12I(LGMD2I)；肢带型肌营养不良症2L(LGMD2L)；脂蛋白脂肪酶(LPL)缺乏症；异染性脑白质营养不良；神经性疾病；神经运动障碍；神经骨骼损伤；帕金森氏病；类风湿性关节炎；Sanfilippo A综合征；脊髓性肌萎缩症(SMA)；X连锁视网膜劈裂(XLRS)；α-肌多糖缺乏症(LGMD2D)；β-肌多糖缺乏症(LGMD2E)；γ-肌多糖缺乏症(LGMD2C)和δ-肌多糖缺乏症(LGMD2F)。
IV.本发明的实施例
本发明涉及包含AAV辅助功能提供多核苷酸的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体及其用途和组合物。特别是针对以下实施例E1-E16：
E1.包含AAV辅助功能提供多核苷酸的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该多核苷酸包含非天然AAV血清型P5或P40启动子序列。
E2.根据E1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该AAV辅助功能提供多核苷酸载体包含非天然AAV血清型P5启动子序列。
E3.根据E1或E2中任一项所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该AAV辅助功能提供多核苷酸载体包含非天然AAV血清型P40启动子序列。
E4.根据E1-E3中任一项所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该载体是质粒载体。
E5.根据E1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该非天然AAV血清型P5或P40启动子替代天然AAV血清型启动子序列。
E6.根据E1-E5中任一项所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中该载体另外包含非AAV辅助功能提供多核苷酸。
E7.一种提高包含转基因盒的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中该方法包含培养已用以下进行转染的细胞：
(1)rAAV；
(2)根据E6所述的重组修饰腺相关病毒(rAAV)辅助载体；
其中在足以允许rAAV生产的条件下，在培养基进行培养，并且其中存在非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致细胞以相对于如果AAV辅助功能提供多核苷酸含有天然血清型P5和P40启动子获得的生产滴度而提高的生产滴度来生产rAAV。
E8.一种提高包含转基因盒的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中该方法包括培养已用以下进行转染的细胞：
(1)rAAV；
(2)根据E1-E6中任一项所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体；和
(3)另外的载体，特别是质粒载体，其包含非AVV辅助功能提供多核苷酸；
其中在足以允许rAAV生产的条件下，在培养基中进行培养，并且其中存在非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致细胞以相对于如果AAV辅助功能提供多核苷酸含有天然血清型P5和P40启动子获得的生产滴度而提高的生产滴度来生产rAAV。
E9.根据E7-E8任一项所述的方法，其中：
(A)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV1 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(B)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV2 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(C)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV3 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(D)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV4 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(E)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV5 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(F)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV6 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(G)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV7 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV8或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；或
(H)载体的AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV8 Cap蛋白，非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV7或这些血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列。
E10.根据E7-E9中任一项所述的方法，其中该细胞是人胚胎肾细胞、幼仓鼠肾细胞或sf9昆虫细胞。
E11.根据E10所述的方法，其中该细胞是HEK293人胚胎肾细胞。
E12.根据E10所述的方法，其中该细胞是BHK21幼仓鼠肾细胞。
E13.根据E7-E12中任一项所述的方法，其中该转基因盒编码蛋白，或包含转录核酸，其治疗基因或可遗传性疾病或病况。
E14.通过根据E13所述的方法生产的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的制剂。
E15.药物组合物，包括通过E13所述的方法生产的重组修饰腺相关病毒(rAAV)和药学上可接受的载剂。
E16.根据E14所述的重组修饰腺相关病毒(rAAV)的制剂或根据E15所述的药物组合物，用于治疗基因或可遗传性疾病或病况。
示例
现在对本发明进行一般性描述，通过以下示例将更容易理解本发明，这些示例是以说明的方式提供的，除非特别说明，否则不对本发明进行限制。
示例1
通过使用具有非天然AAV血清型P5启动子序列的AAV RC2辅助质粒载体转染的细胞的rAAV生产滴度的比较
为了证明非天然AAV血清型启动子序列影响rAAV的生产滴度的能力，构建了AAV辅助质粒AAV RC2(具有AAV2 rep基因和编码AAV2血清型Cap蛋白的cap基因)的衍生物，其包括非天然AAV血清型启动子序列(图11)以替代这种质粒的天然AAV2血清型P5启动子(图12A；向下条纹矩形)。构建体的P19和P40启动子没有改变，因此都是天然AAV2血清型启动子序列(图12A；黑色实心矩形)。
采用以下构建体；启动子区域的序列如表1所示：
(1)亲本-RC2–pAAV-RC2(SEQ ID NO：2)，其含有AAV2 rep基因和完整的AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)的部分和AAV2 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQ ID NO：18)控制；
(2)P5(1)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型1的P5启动子序列(SEQ ID NO：9)替换天然AAV血清型P5启动子序列；
(3)P5(2)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型2的全长P5启动子序列(SEQ ID NO：10)替换亲本-RC2的部分AAV2血清型P5启动子序列；
(4)P5(3)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型3的P5启动子序列(SEQ ID NO：11)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(5)P5(4)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型4的P5启动子序列(SEQ ID NO：12)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(6)P5(5)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型5的P5启动子序列(SEQ ID NO：13)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(7)P5(6)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型6的P5启动子序列(SEQ ID NO：14)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(8)P5(7)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型7的P5启动子序列(SEQ ID NO：15)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；和
(9)P5(8)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型8的P5启动子序列(SEQ ID NO：16)替换天然AAV2血清型P5启动子序列。
图12B示出了使用这种AAV辅助质粒载体获得的rAAV的生产滴度。使用三质粒转染系统获得rAAV的生产滴度，其中该三质粒转染系统具有rAAV(pGOI；BBa_K404119)和提供所需腺病毒功能的Ad辅助质粒(pHelper)。质粒pGOI是rAAV质粒载体，其在5’到3’方向包括5’ITR、CMV启动子、β-球蛋白内含子、编码黄色荧光蛋白mVenus的多核苷酸(Nagai,T.et al.(2002)“A Variant Of Yellow Fluorescent Protein With Fast And EfficientMaturation For Cell-Biological Applications,”Nat.Biotechnol.20(1):87-90)、人类生长激素的polyA结构域和3’ITR。图12B揭示了P5启动子的血清型会影响rAAV的生产滴度，并表明用AAV5血清型P5启动子替换质粒载体pAAV-RC2的天然AAV2 P5启动子会极大降低rAAV的生产滴度，而用AAV血清型1、3、5、7或8的P5启动子替换质粒载体pAAV-RC2的天然AAV2 P5启动子会极大提高rAAV的生产滴度。
示例2
通过使用具有非天然AAV血清型P40启动子序列的AAV RC2辅助质粒载体转染的细胞的rAAV生产滴度的比较
为了进一步证明非天然AAV血清型启动子序列影响rAAV的生产滴度的能力，构建了AAV辅助质粒AAV RC2(具有AAV2 rep基因和编码AAV2血清型Cap蛋白的cap基因)的衍生物，其包括非天然AAV血清型启动子序列(图11)以替代这种质粒的天然血清型P40启动子(图13A；向上条纹矩形)。构建体的P5和P19启动子没有改变，因此都是天然AAV2血清型启动子序列(图13A；黑色实心矩形)。
采用以下构建体；启动子区域的序列如表1所示：
(1)亲本-RC2–pAAV-RC2(SEQ ID NO：2)，其含有AAV2 rep基因和完整的AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)的部分和AAV2 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQ ID NO：18)控制；
(2)P40(1)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型1的P40启动子序列(SEQ ID NO：17)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；
(3)P40(2)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型2的P40启动子序列(SEQ ID NO：18)替换亲本-RC2的AAV2血清型P40启动子序列；
(4)P40(3)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型3的P40启动子序列(SEQ ID NO：19)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；
(5)P40(4)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型4的P40启动子序列(SEQ ID NO：20)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；
(6)P40(5)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型5的P40启动子序列(SEQ ID NO：21)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；
(7)P40(6)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型6的P40启动子序列(SEQ ID NO：22)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；
(8)P40(7)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型7的P40启动子序列(SEQ ID NO：23)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；和
(9)P40(8)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型8的P40启动子序列(SEQ ID NO：24)替换天然AAV2血清型P40启动子序列。
图13B示出了使用这种AAV辅助质粒载体获得的rAAV的生产滴度。基本上如示例1所述获得rAAV的生产滴度。研究结果揭示，P40启动子的血清型也会影响rAAV的生产滴度，并表明用AAV5血清型P40启动子替换质粒载体pAAV-RC2的天然AAV2 P40启动子会极大降低rAAV的生产滴度，而用AAV1血清型P40启动子或用AAV8血清型P40启动子替换质粒载体pAAV-RC2的天然AAV2 P40启动子会极大提高rAAV的生产滴度。
示例3
通过使用具有非天然AAV血清型P5和P40启动子序列的AAV RC2辅助质粒载体转染的细胞的rAAV生产滴度的比较
为了进一步证明非天然AAV血清型启动子序列影响rAAV的生产滴度的能力，构建了AAV辅助质粒AAV RC2(具有AAV2 rep基因和编码AAV2血清型Cap蛋白的cap基因)的衍生物，其包括非天然AAV血清型启动子序列(图11)以替代这种质粒的天然AAV2血清型P5(图14A；向下条纹矩形)和P40(图14A；向上条纹矩形)启动子。构建体的AAV2 P19启动子没有改变，因此是天然AAV2血清型启动子序列(图14A；黑色实心矩形)。
采用以下构建体；启动子区域的序列如表1所示：
(1)亲本-RC2–pAAV-RC2(SEQ ID NO：2)，其含有AAV2 rep基因和完整的AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)的部分和AAV2 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQ ID NO：18)控制；
(2)P5(2)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV血清型2的全长P5启动子序列(SEQ ID NO：10)替换亲本-RC2的部分AAV2血清型P5启动子序列；
(3)P5(3)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV3的P5启动子序列(SEQ ID NO：11)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(4)P5(5)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV5的P5启动子序列(SEQ ID NO：13)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(5)P40(1)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV1的P40启动子序列(SEQ ID NO：17)替换天然AAV2血清型P40启动子序列；
(6)P5(2)/P40(1)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV2的P5启动子序列(SEQ ID NO：10)替换天然AAV2血清型P5启动子序列，并且其中使用AAV1的P40启动子序列(SEQ ID NO：17)替换天然P40启动子序列；
(7)P5(3)/P40(1)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV3的P5启动子序列(SEQ ID NO：11)替换天然AAV2血清型P5启动子序列，并且其中使用AAV1的P40启动子序列(SEQ ID NO：17)替换天然P40启动子序列；和
(8)P5(5)/P40(1)-RC2——质粒载体pAAV-RC2的衍生物，其中使用AAV5的P5启动子序列(SEQ ID NO：13)替换天然AAV2血清型P5启动子序列，并且其中使用AAV1的P40启动子序列(SEQ ID NO：17)替换天然P40启动子序列；
基本上如示例1所示获得rAAV的生产滴度。图14B示出了使用这种AAV辅助质粒载体获得的rAAV的生产滴度。如图14B所示，用AAV3或AAV5的P5启动子序列和AAV1的P40启动子序列替换pAAV-RC2的天然P5和P40启动子，协同提高rAAV的生产滴度。
示例4
通过使用具有非天然AAV血清型P5和P40启动子序列的AAV RC6辅助质粒载体转染的细胞的rAAV生产滴度的比较
为了进一步证明非天然AAV血清型启动子序列影响rAAV的生产滴度的能力，构建了AAV辅助质粒AAV RC6(具有AAV2 rep基因和编码AAV6血清型的Cap蛋白的cap基因)的衍生物，其包括非天然AAV血清型启动子序列(图11)以替代这种质粒的天然AAV2血清型P5(图15A；向下条纹矩形)和P40(图15A；向上条纹矩形)启动子。构建体的AAV2 P19启动子没有改变，因此是天然AAV2血清型启动子序列(图15A；黑色实心矩形)。
采用以下构建体；启动子区域的序列如表1所示：
(1)亲本-RC6-pAAV-RC6(SEQ ID NO：4)，其含有AAV rep基因和其天然AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)和AAV6 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQID NO：18)控制；
(2)P5(1)-RC6——质粒载体pAAV-RC6的衍生物，其中使用AAV1的P5启动子序列(SEQ ID NO：9)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(3)P5(2)-RC6——质粒载体pAAV-RC6的衍生物，其中使用AAV2的P5启动子序列(SEQ ID NO：10)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(4)P5(3)-RC6——质粒载体pAAV-RC6的衍生物，其中使用AAV3的P5启动子序列(SEQ ID NO：11)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；
(5)P5(7)-RC6——质粒载体pAAV-RC6的衍生物，其中使用AAV7的P5启动子序列(SEQ ID NO：15)替换天然AAV2血清型P5启动子序列；和
(6)P5(8)-RC6——质粒载体pAAV-RC6的衍生物，其中使用AAV8的P5启动子序列(SEQ ID NO：16)替换天然AAV2血清型P5启动子序列。
图15B示出了使用这种AAV辅助质粒载体获得的rAAV的生产滴度。基本上如示例1所示获得rAAV的生产滴度。
研究结果如图15B和15C所示，并揭示了使用这种rAAV辅助质粒载体所获得的rAAV生产滴度。如图所示，用AAV血清型1、2、3、7或8的P5启动子序列替换pAAV-RC6的天然P5和P40启动子提高rAAV生产滴度。
示例5
通过使用具有非天然AAV血清型P5和P40启动子序列的AAV RC1、AAV RC5或AAVRC7辅助质粒载体转染的细胞的rAAV生产滴度的比较
为了进一步证明非天然AAV血清型启动子序列影响rAAV的生产滴度的能力，构建了AAV辅助质粒AAV RC1(具有AAV2 rep基因和编码AAV1血清型Cap蛋白的cap基因)的衍生物、AAV辅助质粒AAV RC5(具有AAV2 rep基因和编码AAV5血清型Cap蛋白的cap基因)的衍生物和AAV辅助质粒AAV RC7(具有AAV2 rep基因和编码AAV7血清型Cap蛋白的cap基因)的衍生物，其包括非天然AAV血清型启动子序列(图11)以替代这种质粒的天然AAV2血清型P5(图16A；向下条纹矩形)和/或P40(图16A；向上条纹矩形)启动子序列。
采用以下构建体；启动子区域的序列如表1所示：
(1)亲本-RC1-pAAV-RC1(SEQ ID NO：1)，其含有AAV2 rep基因及其天然AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)，以及AAV1 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQ ID NO：18)控制；
(2)亲本-RC5-pAAV-RC5(SEQ ID NO：3)，其含有AAV2 rep基因及其天然AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)，以及AAV5 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQ ID NO：18)控制；
(3)亲本-RC7-pAAV-RC7(SEQ ID NO：5)，其含有AAV2 rep基因及其天然AAV2血清型P5启动子序列(SEQ ID NO：10)，以及AAV7 cap基因，其表达由天然AAV2 P40启动子序列(SEQ ID NO：18)控制；
(4)P5(2)-RC1——pAAV-RC1质粒载体的衍生物，其中使用AAV2的P5启动子序列(SEQ ID NO：10)替换天然AAV1血清型P5启动子序列；
(5)P5(7)-RC1——pAAV-RC1质粒载体的衍生物，其中使用AAV7的P5启动子序列(SEQ ID NO：15)替换天然AAV1血清型P5启动子序列；
(6)P5(8)-RC1——pAAV-RC1质粒载体的衍生物，其中使用AAV8的P5启动子序列(SEQ ID NO：16)替换天然AAV1血清型P5启动子序列；
(7)P5(7)-RC5——pAAV-RC5质粒载体的衍生物，其中使用AAV7的P5启动子序列(SEQ ID NO：15)替换天然AAV5血清型P5启动子序列；
(8)P5(2)-RC7——pAAV-RC7质粒载体的衍生物，其中使用AAV2的P5启动子序列(SEQ ID NO：10)替换天然AAV7血清型P5启动子序列；
(9)P5(7)-RC7——pAAV-RC7质粒载体的衍生物，其中使用AAV7的P5启动子序列(SEQ ID NO：15)替换天然AAV7血清型P5启动子序列；和
(10)P8(7)-RC7——pAAV-RC7质粒载体的衍生物，其中使用AAV8的P5启动子序列(SEQ ID NO：16)替换天然AAV7血清型P5启动子序列。
基本上如示例1所示获得rAAV的生产滴度。研究结果如图16B所示，并揭示了使用AAV血清型2、7或8的P5启动子序列替换pAAV-RC1、pAAV-RC5和pAAV-RC7的天然P5启动子序列提高rAAV生产滴度。
本说明书中提及的所有出版物和专利通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请特别或单独指明通过引用而全部并入一样。虽然本发明已结合其具体实施例进行描述，但应理解的是，其能够进一步修改，本申请旨在涵盖本发明的任何变化、使用或修改，一般来说，遵循本发明的原则，并包括本发明所述领域内的已知或常规做法的以及可能适用于本文前述的基本特征的与本发明的偏离。
序列表
<110> 查尔斯河实验室股份有限公司
王启钊
<120> 重组修饰腺相关病毒辅助载体及其在提高重组修饰腺相关病毒的包装效率的用途
<130> 2650.0004US
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pAAV-RC1的编码链
<400> 1
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg 60
cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg 120
aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca 180
gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct 240
cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca 300
gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc 360
caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg 420
gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca 480
aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga 540
ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt 600
ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa 660
aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa 720
catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga 780
gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat 840
gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga 900
ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc gtgatcgtca cctccaacac 960
caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc aacgaccttc gaacaccagc agccgttgca 1020
agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg ccgtctggat catgactttg ggaaggtcac 1080
caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg ggcaaaggat cacgtggttg aggtggagca 1140
tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagaccc gcccccagtg acgcagatat 1200
aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca tcgacgtcag acgcggaagc 1260
ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatct 1320
gatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag aatgaatcag aattcaaata tctgcttcac 1380
tcacggacag aaagactgtt tagagtgctt tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt 1440
cgtcaaaaag gcgtatcaga aactgtgcta cattcatcat atcatgggaa aggtgccaga 1500
cgcttgcact gcctgcgatc tggtcaatgt ggatttggat gactgcatct ttgaacaata 1560
aatgatttaa atcaggtatg gctgccgatg gttatcttcc agattggctc gaggacaacc 1620
tctctgaggg cattcgcgag tggtgggact tgaaacctgg agccccgaag cccaaagcca 1680
accagcaaaa gcaggacgac ggccggggtc tggtgcttcc tggctacaag tacctcggac 1740
ccttcaacgg actcgacaag ggggagcccg tcaacgcggc ggacgcagcg gccctcgagc 1800
acgacaaggc ctacgaccag cagctcaaag cgggtgacaa tccgtacctg cggtataacc 1860
acgccgacgc cgagtttcag gagcgtctgc aagaagatac gtcttttggg ggcaacctcg 1920
ggcgagcagt cttccaggcc aagaagcggg ttctcgaacc tctcggtctg gttgaggaag 1980
gcgctaagac ggctcctgga aagaaacgtc cggtagagca gtcgccacaa gagccagact 2040
cctcctcggg catcggcaag acaggccagc agcccgctaa aaagagactc aattttggtc 2100
agactggcga ctcagagtca gtccccgatc cacaacctct cggagaacct ccagcaaccc 2160
ccgctgctgt gggacctact acaatggctt caggcggtgg cgcaccaatg gcagacaata 2220
acgaaggcgc cgacggagtg ggtaatgcct caggaaattg gcattgcgat tccacatggc 2280
tgggcgacag agtcatcacc accagcaccc gcacctgggc cttgcccacc tacaataacc 2340
acctctacaa gcaaatctcc agtgcttcaa cgggggccag caacgacaac cactacttcg 2400
gctacagcac cccctggggg tattttgatt tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac 2460
gtgactggca gcgactcatc aacaacaatt ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca 2520
aactcttcaa catccaagtc aaggaggtca cgacgaatga tggcgtcaca accatcgcta 2580
ataaccttac cagcacggtt caagtcttct cggactcgga gtaccagctt ccgtacgtcc 2640
tcggctctgc gcaccagggc tgcctccctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattccgc 2700
aatacggcta cctgacgctc aacaatggca gccaagccgt gggacgttca tccttttact 2760
gcctggaata tttcccttct cagatgctga gaacgggcaa caactttacc ttcagctaca 2820
cctttgagga agtgcctttc cacagcagct acgcgcacag ccagagcctg gaccggctga 2880
tgaatcctct catcgaccaa tacctgtatt acctgaacag aactcaaaat cagtccggaa 2940
gtgcccaaaa caaggacttg ctgtttagcc gtgggtctcc agctggcatg tctgttcagc 3000
ccaaaaactg gctacctgga ccctgttatc ggcagcagcg cgtttctaaa acaaaaacag 3060
acaacaacaa cagcaatttt acctggactg gtgcttcaaa atataacctc aatgggcgtg 3120
aatccatcat caaccctggc actgctatgg cctcacacaa agacgacgaa gacaagttct 3180
ttcccatgag cggtgtcatg atttttggaa aagagagcgc cggagcttca aacactgcat 3240
tggacaatgt catgattaca gacgaagagg aaattaaagc cactaaccct gtggccaccg 3300
aaagatttgg gaccgtggca gtcaatttcc agagcagcag cacagaccct gcgaccggag 3360
atgtgcatgc tatgggagca ttacctggca tggtgtggca agatagagac gtgtacctgc 3420
agggtcccat ttgggccaaa attcctcaca cagatggaca ctttcacccg tctcctctta 3480
tgggcggctt tggactcaag aacccgcctc ctcagatcct catcaaaaac acgcctgttc 3540
ctgcgaatcc tccggcggag ttttcagcta caaagtttgc ttcattcatc acccaatact 3600
ccacaggaca agtgagtgtg gaaattgaat gggagctgca gaaagaaaac agcaagcgct 3660
ggaatcccga agtgcagtac acatccaatt atgcaaaatc tgccaacgtt gattttactg 3720
tggacaacaa tggactttat actgagcctc gccccattgg cacccgttac cttacccgtc 3780
ccctgtaagg cgcgccaccg gttgcttgtt aatcaataaa ccgtttaatt cgtttcagtt 3840
gaactttggt ctctgcgtat ttctttctta tctagtttcc atgctctagg atccactagt 3900
aacggccgcc agtgtgctgg aattcggctt tgtagttaat gattaacccg ccatgctact 3960
tatctacgta gccatgctct agaggtcctg tattagaggt cacgtgagtg ttttgcgaca 4020
ttttgcgaca ccatgtggtc acgctgggta tttaagcccg agtgagcacg cagggtctcc 4080
attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccaagccg aattctgcag atatccaaac 4140
actggcggcc gctcgactag agcggccgcc accgcggtgg agctccagct tttgttccct 4200
ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 4260
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 4320
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 4380
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 4440
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4500
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4560
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4620
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4680
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4740
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4800
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4860
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4920
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4980
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 5040
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 5100
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 5160
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5220
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5280
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5340
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5400
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 5460
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5520
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5580
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5640
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5700
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5760
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5820
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5880
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5940
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 6000
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 6060
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 6120
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6180
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6240
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6300
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6360
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 6420
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 6480
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 6540
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<211> 11569
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<213> 人工序列
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ggtcaccaaa caggaagtaa aggacttttt ccggtgggct tccgatcacg tgactgacgt 60
ggctcatgag ttctacgtca gaaagggtgg agctaagaaa cgccccgcct ccaatgacgc 120
ggatgtaagc gagccaaaac gggagtgcac gtcacttgcg cagccgacaa cgtcagacgc 180
<210> 20
<211> 180
<212> DNA
<213> 腺相关病毒4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(180)
<223> AAV4的P40启动子
<400> 20
ggtcaccaag caggaagtca aagacttttt ccggtgggcg tcagatcacg tgaccgaggt 60
gactcacgag ttttacgtca gaaagggtgg agctagaaag aggcccgccc ccaatgacgc 120
agatataagt gagcccaagc gggcctgtcc gtcagttgcg cagccatcga cgtcagacgc 180
<210> 21
<211> 227
<212> DNA
<213> 腺相关病毒5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(227)
<223> AAV5的P40启动子
<400> 21
gattactaag caggaagtca aggacttttt tgcttgggca aaggtcaatc aggtgccggt 60
gactcacgag tttaaagttc ccagggaatt ggcgggaact aaaggggcgg agaaatctct 120
aaaacgccca ctgggtgacg tcaccaatac tagctataaa agtctggaga agcgggcctg 180
gagcatgagg ctctcatttg ttcccgagac gcctcgcagt tcagacg 227
<210> 22
<211> 180
<212> DNA
<213> 腺相关病毒6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(180)
<223> AAV6的P40启动子
<400> 22
ggtgacaaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcg caggatcacg tgaccgaggt 60
ggcgcatgag ttctacgtca gaaagggtgg agccaacaag agacccgccc ccgatgacgc 120
ggataaaagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180
<210> 23
<211> 180
<212> DNA
<213> 腺相关病毒7
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(180)
<223> AAV7的P40启动子
<400> 23
ggtgacgaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcc agtgatcacg tgaccgaggt 60
ggcgcatgag ttctacgtca gaaagggcgg agccagcaaa agacccgccc ccgatgacgc 120
ggatataagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180
<210> 24
<211> 180
<212> DNA
<213> 腺相关病毒8
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(180)
<223> AAV8的P40启动子
<400> 24
ggtgacaaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcc agtgatcacg tgaccgaggt 60
ggcgcatgag ttttacgtca gaaagggcgg agccagcaaa agacccgccc ccgatgacgc 120
ggataaaagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180
Claims (20)
1.重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，所述载体包括AAV辅助功能提供多核苷酸，其中所述多核苷酸包含非天然AAV血清型P5或P40启动子序列。
2.根据权利要求1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中所述AAV辅助功能提供多核苷酸载体包含非天然AAV血清型P5启动子序列。
3.根据权利要求1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中所述AAV辅助功能提供多核苷酸载体包含非天然AAV血清型P40启动子序列。
4.根据权利要求1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中所述载体是质粒载体。
5.根据权利要求1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中所述非天然AAV血清型P5或P40启动子序列替换天然AAV血清型启动子序列。
6.根据权利要求1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体，其中所述载体另外包含非AAV辅助功能提供多核苷酸。
7.一种提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，所述重组修饰腺相关病毒包含转基因盒，其中所述方法包括培养已用以下转染的细胞：
(1)所述rAAV；和
(2)根据权利要求6所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体；
其中在足以允许生产所述rAAV的条件下，在培养基中进行所述培养；并且其中存在所述非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致所述细胞以相对于如果所述AAV辅助功能提供多核苷酸含有天然血清型P5和P40启动子会获得的生产滴度而提高的生产滴度来生产所述rAAV。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因盒编码蛋白质，或包含转录核酸，其对基因或可遗传性疾病具有治疗作用。
9.根据权利要求7所述的方法，其中：
(A)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV1 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(B)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV2 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(C)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV3 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(D)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV4 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(E)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV5 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(F)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV6 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(G)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV7 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；或
(H)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV8 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV7或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是人胚胎肾细胞、幼仓鼠肾细胞或sf9昆虫细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞是HEK293人胚胎肾细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞是BHK21幼仓鼠肾细胞。
13.一种提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，所述重组修饰腺相关病毒包含转基因盒，其中所述方法包括培养已用以下转染的细胞：
(1)所述rAAV；
(2)根据权利要求1所述的重组修饰腺相关病毒(AAV)辅助载体；和
(3)另外的载体，所述另外的载体包括非AAV辅助功能提供多核苷酸；
其中在足以允许生产所述rAAV的条件下，在培养基中进行所述培养；并且其中存在所述非天然AAV血清型P5或P40启动子序列导致所述细胞以相对于如果所述AAV辅助功能提供多核苷酸含有天然血清型P5和P40启动子会获得的生产滴度而提高的生产滴度来生产所述rAAV。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述转基因盒编码蛋白质，或包含转录核酸，其对于基因或可遗传性疾病有治疗作用。
15.根据权利要求13所述的方法，其中：
(A)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV1 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(B)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV2 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(C)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV3 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(D)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV4 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(E)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV5 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(F)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV6 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；
(G)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV7 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV8或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列；或
(H)所述载体的所述AAV辅助功能提供多核苷酸编码AAV8 Cap蛋白，以及所述非天然AAV血清型启动子序列是血清型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6或AAV7或所述血清型的一种或多种的杂交型的AAV的启动子序列。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞是人胚胎肾细胞、幼仓鼠肾细胞或sf9昆虫细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是HEK293人胚胎肾细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是BHK21幼仓鼠肾细胞。
19.药物组合物，所述药物组合物包括通过权利要求6所述的方法生产的重组修饰腺相关病毒(rAAV)和药学上可接受的载剂。
20.药物组合物，所述药物组合物包括通过权利要求13所述的方法生产的重组修饰腺相关病毒(rAAV)和药学上可接受的载剂。
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