KR20220034212A

KR20220034212A - 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스 헬퍼 벡터 및 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스의 패키징 효율을 개선하기 위한 그의 용도

Info

Publication number: KR20220034212A
Application number: KR1020227004887A
Authority: KR
Inventors: 퀴즈하오 왕
Original assignee: 찰스리버레보레토리스,인코포레이티드
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2022-03-17
Also published as: US20220290178A1; JP2022542828A; WO2021011029A1; US20210017538A1; US10557149B1; CN114450393A; AU2020315770A1; US11001859B2; EP3999625A4; EP3999625A1

Abstract

본 발명은 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 패키징 효율을 증가시킬 수 있는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터 및 이러한 rAAV의 패키징 효율을 개선하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상이한 혈청형의 rAAV의 Rep 단백질과 연관된 AAV P5 및/또는 P40 프로모터와 함께 이러한 rAAV에 의해 인코딩되는 Rep 단백질과 천연적으로 연관된 P5 및/또는 P40 프로모터 서열을 대체(또는 증대)하도록 추가로 변형된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터에 관한 것이다. 이러한 치환 또는 추가 프로모터 서열의 사용은 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스의 생산을 증가시킨다.

Description

재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스 헬퍼 벡터 및 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스의 패키징 효율을 개선하기 위한 그의 용도

발명의 분야

본 발명은 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 패키징 효율을 증가시킬 수 있는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터 및 이러한 rAAV의 패키징 효율을 개선하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상이한 혈청형의 rAAV의 Rep 단백질과 연련된 AAV P5 및/또는 P40 프로모터와 함께 이러한 rAAV에 의해 인코딩되는 Rep 단백질과 천연적으로 연관된 P5 및/또는 P40 프로모터 서열을 대체(또는 증대)하도록 추가로 변형된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터에 관한 것이다. 이러한 치환 또는 추가 프로모터 서열의 사용은 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스의 생산을 증가시킨다.

서열 목록에 대한 참조

이 출원은 37 C.F.R.1.821 et seq.에 따라 하나 이상의 서열 목록을 포함하며, 이는 컴퓨터 판독 가능 매체(파일 이름: 2650-0004US_ST25.txt, 2019년 7월 15일 생성, 84,101 바이트 크기)에 개시되며, 이 파일은 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.

I. 아데노 연관 바이러스( AAV )

아데노 연관 바이러스 (AAV)는 파보비리다에의 데펜도바이러스 속에 속하는 작은 자연 발생 비병원성 바이러스이다(Balakrishnan, B. 등 (2014) "Basic Biology of Adeno-Associated Virus ( AAV ) Vectors Used in Gene Therapy," Curr. Gene Ther. 14(2):86-100; Zinn, E. 등 (2014) "Adeno -Associated Virus: Fit To Serve," Curr. Opin. Virol. 0:90-97). 질환을 일으키지 않음에도 불구하고, AAV는 인간과 다른 영장류를 감염시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며 인간 집단에서 만연한다((Johnson, F.B. 등 (1972) "Immunological Reactivity of Antisera Prepared Against the Sodium Dodecyl Sulfate-Treated Structural Polypeptides of Adenovirus-Associated Virus," J. Virol. 9(6):1017-1026). AAV는 범위의 상이한 세포 유형(예를 들어, 중추신경계, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장의 세포, 망막 색소 상피 또는 광수용체 세포, 또는 골격근 세포)을 감염시킨다. 상이한 조직 감염 능력("굴성(tropisms)")을 나타내는 바이러스의 12가지 혈청형(예를 들어, AAV2, AAV5, AAV6 등)이 확인되었다(Colella, P. 등 (2018) "Emerging Issues in AAV -Mediated In Vivo Gene Therapy," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:87-104; Hocquemiller, M. 등 (2016) "Adeno -Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases," Hum. Gene Ther. 27(7):478-496; Lisowski, L. 등 (2015) "Adeno -Associated Virus Serotypes For Gene Therapeutics," 24:59-67).

AAV는 약 4,800개의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 바이러스의 단백질을 인코딩하는 유전자를 함께 포함하는 5' 절반과 3' 절반이 있는 것으로 설명될 수 있다(도 1). AAV 게놈의 5' 절반은 AAV rep 유전자를 포함하며, 이는 다중 해독틀, 시차를 둔 개시 프로모터(p5, p19 및 p40) 및 교대 스플라이싱을 통해 바이러스 전사 조절 및 복제 및 바이러스 캡슐로의 바이러스 게놈 패키징에 필요한 4개의 비구조적 Rep 단백질(Rep40, Rep52, Rep68 및 Rep78)을 인코딩한다 (Lackner, D.F. 등 (2002) "Studies of the Mechanism of Transactivation of the Adeno -Associated Virus p19 Promoter by Rep Protein," J. Virol. 76(16):8225-8235). 바이러스 단백질(예컨대 Ad 단백질)의 존재에서, P5 프로모터가 활성화되고 전사 조절, 잠복기, 구조 및 바이러스 DNA 복제에 관여하는 Rep68 및 Rep78 단백질의 전사를 매개하여, AAV 수명 주기의 마스터 컨트롤러로서 기능한다 (Murphy, M. 등 (2007) " Adeno -Associated Virus Type 2 p5 Promoter: a Rep-Regulated DNA Switch Element Functioning in Transcription, Replication, and Site-Specific Integration," J. Virol. 81(8):3721-3730). Rep68 및 Rep78 단백질의 발현은 Rep40 및 Rep52 단백질의 전사를 담당하는 P19 프로모터를 활성화한다(Lackner, D.F. 등 (2002) "Studies of the Mechanism of Transactivation of the Adeno -Associated Virus p19 Promoter by Rep Protein," J. Virol. 76(16):8225-8235; Ogasawara, Y. 등 (1998) "The Use of Heterologous Promoters for Adeno -Associated Virus ( AAV ) Protein Expression in AAV Vector Production," Microbiol. Immunol. 42(3):177-185). AAV 게놈의 3' 절반은 VP1, VP2 및 VP3의 세 가지 캡시드 단백질(VP)을 인코딩하는 AAV 캡시드 유전자( cap )를 포함한다. 3개의 캡시드 단백질은 단일 프로모터(AAV2의 경우 P40)에 의해 제어되는 단일 mRNA 전사체에서 번역된다. AAV 게놈의 3' 절반은 또한 AAV 어셈블리 활성화 단백질(AAP)을 인코딩하는 AAP 유전자를 포함한다. 60개의 VP 단량체(VP1의 대략 5개 카피, VP2의 5개 카피 및 VP3의 50개 카피 포함)가 AAV 게놈 주위에 자가 조립되어 성숙한 바이러스 입자의 이십면체 단백질 쉘(캡시드)을 형성한다(B

ning, H. 등 (2019) "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors," Mol. Ther. Meth. Clin. Devel. 12:P248-P265; Van Vliet K.M. 등 (2008) The Role of the Adeno -Associated Virus Capsid in Gene Transfer. In: Drug Delivery Systems, Jain, K.K. (eds.), Meth. Molec. Biol. 437:51-91). AAV AAP 단백질은 새로 생성된 VP 단백질을 안정화시키고 세포질에서 세포 핵으로 수송하는 데 필요한 것으로 여겨진다. AAV 게놈의 3' 절반은 또한 게놈 복제를 지원하는 단백질을 인코딩하는 것으로 여겨지는 AAV X 유전자를 포함한다(Colella, P. 등 (2018) "Emerging Issues in AAV -Mediated In Vivo Gene Therapy," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:87-104; B

ning, H. 등 (2019) "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors," Mol. Ther. Meth. Clin. Devel. 12:P248-P265; Cao, M. 등 (2014) "The X Gene Of Adeno -Associated Virus 2 ( AAV2 ) Is Involved In Viral DNA Replication," PLoS ONE 9, e104596:1-10).

전술한 AAV 유전자-코딩 서열은 145개 뉴클레오티드의 2개의 AAV-특이적 회문형 역전 말단 반복 서열(ITR)에 의해 측접된다(Balakrishnan, B. 등 (2014) "Basic Biology of Adeno -Associated Virus ( AAV ) Vectors Used in Gene Therapy," Curr. Gene Ther. 14(2):86-100; Colella, P. 등 (2018) "Emerging Issues in AAV -Mediated In Vivo Gene Therapy," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:87-104).

AAV는 본질적으로 결함이 있는 바이러스로, 최소한 두 가지 중요한 기능, 즉 바이러스 특이적 산물의 합성을 시작하는 능력 및 그러한 산물을 조립하여 성숙한 감염성 바이러스 입자의 이십면체 단백질 쉘(캡시드)을 형성하는 능력이 부족한 바이러스이다. 따라서 AAV 게놈의 유전자에 의해 인코딩되지 않은 바이러스 연관(VA) RNA를 제공하기 위해 아데노바이러스(Ad), 단순 포진 바이러스(HSV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 백시니아 바이러스 또는 인간 파필로마바이러스와 같은 공동 감염 "헬퍼" 바이러스가 필요하다. 이러한 VA RNA는 번역되지 않지만 다른 바이러스 유전자의 번역을 조절하는 역할을 한다. 유사하게, AAV 게놈은 바이러스 단백질 E1a, E1b, E2a 및 E4를 인코딩하는 유전자를 포함하지 않으며; 따라서 이러한 단백질은 공동 감염 "헬퍼" 바이러스에 의해 제공되어야 한다. E1a 단백질은 생산적인 감염 동안 바이러스 유전자 전사를 크게 자극한다. E1b 단백질은 아데노바이러스에 감염된 세포의 세포자멸사를 차단하여 생산적인 감염이 진행되도록 한다. E2a 단백질은 주형을 풀고 전사 개시를 향상시킴으로써 바이러스 가닥 변위 복제의 연장 단계에서 역할을 한다. E4 단백질은 이식유전자 지속성, 벡터 독성 및 면역원성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(문헌[Grieger, J.C. 등 (2012) "Adeno -Associated Virus Vectorology, Manufacturing, and Clinical Applications," Meth. Enzymol. 507:229-254; Dyson, N. 등 (1992) "Adenovirus E1A Targets Key Regulators Of Cell Proliferation," Canc. Surv. 12:161-195; Jones N.C. (1990) "Transformation By The Human Adenoviruses," Semin. Cancer Biol. 1(6):425-435; Ben-Israel, H. 등 (2002) "Adenovirus and Cell Cycle Control," Front. Biosci. 7:d1369-d1395; Hoeben, R.C. 등 (2013) "Adenovirus DNA Replication," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5:a013003 (pages 1-11); Berk, A.J. (2013) "Adenoviridae: The Viruses And Their Replication, In: Fields Virology, 6^th Edition (Knipe, D.M. 등, Eds.), Vol. 2., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, pages 1704-1731; Weitzman, M.D. (2005) "Functions Of The Adenovirus E4 Proteins And Their Impact On Viral Vectors," Front. Biosci. 10:1106-1117] 참조).

AAV 바이러스는 분열 세포와 비분열 세포를 모두 감염시키고 원형 에피솜 분자로 지속하거나 특정 염색체 유전자좌(아데노 연관 바이러스 통합 부위 또는 AAVS)에서 숙주 세포의 DNA에 통합될 수 있다 (Duan, D. (2016) "Systemic Delivery Of Adeno-Associated Viral Vectors," Curr. Opin. Virol. 21:16-25; Grieger, J.C. 등 (2012) "Adeno -Associated Virus Vectorology , Manufacturing, and Clinical Applications," Meth. Enzymol. 507:229-254). AAV 복제 및 성숙에 필요한 기능을 제공하기 위해 헬퍼 바이러스가 존재하지 않는 한 AAV는 이러한 감염된 세포에 잠복 상태로 남아 있다.

II. rAAV 및 유전자 요법에서의 그의 용도

AAV의 특성에 비추어 볼 때, AAV(rAAV)의 재조합 변형 버전은 유전자 요법을 위한 벡터로서 상당한 유용성을 발견하였다(문헌[Naso, M.F. 등 (2017) "Adeno -Associated Virus ( AAV ) as a Vector for Gene Therapy," BioDrugs 31:317-334; Berns, K. I. 등 (2017) "AAV : An Overview of Unanswered Questions," Human Gene Ther. 28(4):308-313; Berry, G.E. 등 (2016) "Cellular Transduction Mechanisms Of Adeno -Associated Viral Vectors," Curr. Opin. Virol. 21:54-60; Blessing, D. 등 (2016) "Adeno -Associated Virus And Lentivirus Vectors: A Refined Toolkit For The Central Nervous System," 21:61-66; Santiago-Ortiz, J.L. (2016) "Adeno-Associated Virus ( AAV ) Vectors in Cancer Gene Therapy," J. Control Release 240:287-301; Salganik, M. 등 (2015) "Adeno -Associated Virus As A Mammalian DNA Vector," Microbiol. Spectr. 3(4):1-32; Hocquemiller, M. 등 (2016) "Adeno -Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases," Hum. Gene Ther. 27(7):478-496; Lykken, E.A. 등 (2018) "Recent Progress And Considerations For AAV Gene Therapies Targeting The Central Nervous System," J. Neurodevelop. Dis. 10:16:1-10; B

ning, H. 등 (2019) "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors," Mol. Ther. Meth. Clin. Devel. 12:P248-P265; During, M.J. 등 (1998) "In Vivo Expression Of Therapeutic Human Genes For Dopamine Production In The Caudates Of MPTP -Treated Monkeys Using An AAV Vector," Gene The. 5:820-827; Grieger, J.C. 등 (2012) "Adeno -Associated Virus Vectorology , Manufacturing, and Clinical Applications," Meth. Enzymol. 507:229-254; Kotterman, M.A. 등 (2014) "Engineering Adeno -Associated Viruses For Clinical Gene Therapy," Nat. Rev. Genet. 15(7):445-451; Kwon, I. 등 (2007) "Designer Gene Delivery Vectors: Molecular Engineering and Evolution of Adeno -Associated Viral Vectors for Enhanced Gene Transfer," Pharm. Res. 25(3):489-499; 미국 특허 번호: 10,266,845; 10,081,659; 9,890,396; 9,840,719; 9,839,696; 9,834,789; 9,803,218; 9,783,825; 9,777,291; 9,540,659; 9,527,904; 8,236,557; 7,972,593 및 7,943,374] 참조).

rAAV는 일반적으로 원형 플라스미드("rAAV 플라스미드 벡터")를 사용하여 생성된다. AAV rep 및 cap 유전자는 일반적으로 이러한 작제물로부터 결실되고 프로모터, β-글로빈 인트론, 선택된 치료 유전자(이식유전자(transgene))가 삽입된 클로닝 부위 및 폴리-아데닐화 ("polyA") 부위로 대체된다. 그러나, rAAV의 역전 말단 반복 서열(ITR)은 유지되어 rAAV 플라스미드 벡터의 이식유전자 발현 카세트가 AAV ITR 서열에 측접한다(Colella, P. 등 (2018) "Emerging Issues in AAV -Mediated In Vivo Gene Therapy," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:87-104; B

ning, H. 등 (2019) "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors," Mol. Ther. Meth. Clin. Devel. 12:P248-P265). 따라서, 5'에서 3' 방향으로, rAAV는 5' ITR, rAAV의 이식유전자 발현 카세트, 및 3' ITR을 포함한다.

rAAV는 다수의 유전적 질환 중 임의의 것 (예를 들어, 선천성 지질단백질 리파제 결핍 (LPLD), 레버 선천성 흑내장 (LCA), 방향족 L-아미노산 탈탄산효소 결핍 (AADC), 맥락막결손 및 혈우병)로 고통 받고 있는 환자에게 이식 유전자를 전달하기 위해 사용되어 왔고, 새로운 임상 양식, 예컨대 간섭 RNA (RNAi) 요법 및 유전자-변형시키는 전략 예컨대 Crispr / Cas9에 유용하다(US 특허 제8,697,359호, 제10,000,772호, 제10,113,167호, 제10,227,611호; Lino, C.A. 등 (2018) "Delivering CRISPR : A Review Of The Challenges And Approaches," Drug Deliv. 25(1):1234-1237; Ferreira, V. 등 (2014) "Immune Responses To AAV -Vectors, The Glybera Example From Bench To Bedside" Front. Immunol. 5(82):1-15), B

ning, H. 등 (2019) "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors," Mol. Ther. Meth. Clin. Devel. 12:P248-P265; Rastall, D.P.W. (2017) "Current and Future Treatments for Lysosomal Storage Disorders," Curr. Treat Options Neurol. 19(12):45; Kay, M. 등 (2017) "Future Of rAAV Gene Therapy: Platform For RNAi , Gene Editing And Beyond," Human Gene Ther. 28:361-372); Berns, K. I. 등 (2017) "AAV : An Overview of Unanswered Questions," Human Gene Ther. 28(4):308-313). rAAV를 수반하는 150개 초과의 임상 시험이 실시되었다 (B

ning, H. 등 (2019) "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors," Mol. Ther. Meth. Clin. Devel. 12:P248-P265; Clιment, N. 등 (2016) "Manufacturing Of Recombinant Adeno -Associated Viral Vectors For Clinical Trials," Meth. Clin. Develop. 3:16002:1-7). 이러한 재조합으로 변형된 AAV에 대해 가장 일반적으로 사용되는 AAV 혈청형은 중추신경계, 신장, 망막 색소 상피의 세포 및 광수용체 세포를 감염시킬 수 있는 AAV2이다. AAV 혈청형은 근육 세포를 감염시키는 AAV9이며, 또한 널리 사용되어 왔다(Duan, D. (2016) "Systemic Delivery Of Adeno-Associated Viral Vector," Curr. Opin. Virol. 21:16-25). AAV 혈청형은 미국 특허 번호 10,301,650; 10,266,846; 10,265,417; 10,214,785; 10,214,566; 10,202,657; 10,046,016; 9,884,071; 9,856,539; 9,737,618; 9,677,089; 9,458,517; 9,457,103; 9,441,244; 9,193,956; 8,846,389; 8,507,267; 7,906,111; 7,479,554; 7,186,552; 7,105,345; 6,984,517; 6,962,815; 및 6,733,757에 기재되어 있다.

III. rAAV 생산 방법

원하는 이식유전자 발현 카세트를 함유하는 rAAV는 전형적으로 현탁액에서 성장한 인간 세포(예를 들어, HEK293)에 의해 생성된다. 상술한 바와 같이 rAAV는 결함이 있는 바이러스이므로 rAAV를 복제하여 패키징하기 위해서는 추가적인 기능이 제공되어야 한다.

전형적으로, rAAV는 세포를 rAAV 플라스미드 벡터, 및 벡터 전사 조절 및 복제에 필요한 Rep52 및 Rep78 유전자를 제공하는 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 플라스미드 벡터로 일시적으로 형질감염시키고, 바이러스 캡슐로의 바이러스 게놈의 패키징(Rep40 및 Rep68은 rAAV 생산에 필요하지 않음) 및 rAAV를 생산하기 위해 AAV로부터 절제된 cap 유전자에 의해 생산될 수 있다. 제2 플라스미드 벡터는 AAV 증식에 필요한 바이러스 전사 및 번역 인자(E1a, E1b, E2a, VA 및 E4)를 인코딩하는 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하여, rAAV와 협력하여 이중 플라스미드 형질감염 시스템을 포함할 수 있다 (Grimm, D. 등 (1998) "Novel Tools For Production And Purification Of Recombinant Adeno -Associated Virus Vectors," Hum. Gene Ther. 9:2745-2760; Penaud-Budloo, M. 등 (2018) "Pharmacology of Recombinant Adeno -associated Virus Production," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:166-180).

그러나 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드(필요한 rep 및 cap 유전자를 제공함)를 "AAV 헬퍼 플라스미드"로 복제하고 다른 플라스미드(예를 들어, "Ad 헬퍼 플라스미드") 상의 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드(이는 바이러스 전사 및 번역 인자를 인코딩하는 유전자를 제공함)로 복제하여, 이러한 플라스미드는 rAAV 플라스미드 벡터와 협력하여 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 포함한다(도 2). 삼중 플라스미드 형질감염 시스템의 사용은 하나의 cap 유전자를 다른 캡 유전자로 쉽게 전환할 수 있도록 하여 rAAV의 혈청형 변화를 촉진하는 이점이 있다. 헬퍼 바이러스보다 헬퍼 플라스미드를 사용하면 헬퍼 바이러스 입자를 추가로 생성하지 않고 rAAV를 생성할 수 있다 (Franηois, A. 등 (2018) "Accurate Titration of Infectious AAV Particles Requires Measurement of Biologically Active Vector Genomes and Suitable Controls," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 10:223-236; Matsushita, T. 등 (1998) "Adeno -Associated Virus Vectors Can Be Efficiently Produced Without Helper Virus," Gene Ther. 5:938-945).

인산칼슘 공동침전에 의해 rAAV 플라스미드 벡터, AAV rep 및 cap 유전자, 트랜스-작용 AAD 헬퍼 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 HEK293 세포로의 일시적 형질감염은 연구 실험실에서 rAAV를 생산하는 표준 방법이 되었다 (Grimm, D. 등 (1998) "Novel Tools For Production And Purification Of Recombinant Adeno -Associated Virus Vectors," Hum. Gene Ther. 9:2745-2760). 그러나 현탁 배양된 형질감염된 포유동물 세포를 사용한 인산칼슘 매개 형질감염 과정의 사용은 배지 교환을 필요로 하므로 치료 용량의 rAAV를 생산하기 위해 필요한 대규모 rAAV 생산에 이상적인 것으로 간주되지 않다 (Lock, M. 등 (2010) "Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno -Associated Viral Vectors at Scale," Hum. Gene Ther. 21:1259-1271). 이러한 이유로 폴리에틸렌이민(PEI)은 형질감염 시약으로 사용되었으며 인산칼슘 매개 형질감염을 사용하여 얻은 것과 유사한 바이러스 수율을 제공하는 것으로 밝혀졌다 (Durocher, Y. 등 (2007) "Scalable Serum-Free Production Of Recombinant Adeno -Associated Virus Type 2 By Transfection Of 293 Suspension Cells," J. Virol. Meth. 144:32-40).

rAAV는 대안적으로 배큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포(예를 들어, sf9 세포)에서 또는 (예를 들어, 미국 특허 제9,879,282호; 제9,879,279호; 제8,945,918호; 제8,163,543호; 제7,271,002호 및 제6,723,551호)에서, 또는 HSV-감염된 어린 햄스터 신장(BHK) 세포(예를 들어, BHK21) (Franηois, A. 등 (2018) "Accurate Titration of Infectious AAV Particles Requires Measurement of Biologically Active Vector Genomes and Suitable Controls," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 10:223-236). Methods of rAAV production are reviewed in Grieger, J.C. 등 (2012) "Adeno -Associated Virus Vectorology , Manufacturing, and Clinical Applications," Meth. Enzymol. 507:229-254, and in Penaud-Budloo, M. 등 (2018) "Pharmacology of Recombinant Adeno -associated Virus Production," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:166-180)에서 생성될 수 있다

IV. rAAV 정제 및 회수 방법

생산 후, rAAV는 전형적으로 하나 이상의 밤새 CsCl 구배 원심분리에 의해 수집되고 정제되고(Zolotukhin, S. 등 (1999) "Recombinant Adeno -Associated Virus Purification Using Novel Methods Improves Infectious Titer And Yield," Gene Ther. 6:973-985)), 이어서 탈염하여 정제된 rAAV 생산 스톡(stock)을 형성한다. 10¹² 내지 10¹³ 감염성 rAAV 캡시드/mL의 역가를 얻을 수 있다.

rAAV 감염은 세포변성 효과를 일으키지 않기 때문에 플라크 검정을 사용하여 rAAV 제제의 감염 역가를 결정할 수 없다. 따라서 감염 역가는 일반적으로 중앙 조직 배양 감염 용량(TCID50)으로 측정된다. 이 방법에서, HeLa 유래 AAV2 rep- 및 cap -발현 세포주는 96-웰 플레이트에서 성장하고 혈청형 5의 아데노바이러스의 존재하에 rAAV 제제의 복제 10배 연속 희석액으로 감염된다. 감염 후, 벡터 게놈 복제는 정량적 PCR(qPCR)에 의해 결정된다 (Zen, Z. 등 (2004) "Infectious Titer Assay For Adeno-Associated Virus Vectors With Sensitivity Sufficient To Detect Single Infectious Events," Hum. Gene Ther. 15:709-715). 대안적으로, rAAV 제제의 감염 역가는 감염 센터 검정(ICA)을 사용하여 측정할 수 있다. 이 검정은 HeLa rep - cap 세포와 Ad를 사용하지만 인큐베이션 후 세포를 막으로 옮기는 것을 포함한다. 사용된 이식유전자의 일부에 상보적인 표지된 프로브는 혼성화를 통해 감염 센터(개별 감염된 세포를 나타냄)를 검출하는 데 사용된다. 더 널리 사용되지만 TCID50 검정은 ICA보다 배경이 더 높고 ICA에 비해 벡터 감염성을 과대평가하는 것으로 보고되었다 (Franηois, A. 등 (2018) "Accurate Titration of Infectious AAV Particles Requires Measurement of Biologically Active Vector Genomes and Suitable Controls," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 10:223-236). rAAV의 생산 및 정제 방법은 특히 미국 특허 번호 10,294,452; 10,161,011; 10,017,746; 9,598,703; 7,625,570; 7,439,065; 7,419,817; 7,208,315; 6,995,006; 6,989,264; 6,846,665 및 6,841,357에 기재되어 있다.

이러한 모든 이전의 발전에도 불구하고, 현재 rAAV를 유전자 요법에 적용하는 것을 제한하는 문제를 해결할 수 있는 방법을 개발할 필요가 남아 있다 (Grieger, J.C. 등 (2012) "Adeno -Associated Virus Vectorology , Manufacturing, and Clinical Applications," Meth. Enzymol. 507:229-254; Kotterman, M.A. 등 (2014) "Engineering Adeno -Associated Viruses For Clinical Gene Therapy," Nat. Rev. Genet. 15(7):445-451; Kwon, I. 등 (2007) "Designer Gene Delivery Vectors: Molecular Engineering and Evolution of Adeno -Associated Viral Vectors for Enhanced Gene Transfer," Pharm. Res. 25(3):489-499; Naso, M.F. 등 (2017) "Adeno-Associated Virus ( AAV ) as a Vector for Gene Therapy," BioDrugs 31:317-334).

본 발명은 AAV rep 및 cap 유전자의 발현 조절을 통해 AAV 및 rAAV 패키징의 효율을 증가시키는 개선된 방법에 관한 것이다.

상세하게는, 본 발명은 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드, 특히 플라스미드 벡터인 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 비천연(non-native) AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열을 포함한다.

본 발명은 특히 이러한 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스 (AAV) 헬퍼 벡터의 구현예를 포함하고, AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드 벡터는 비천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 서열 및/또는 비천연 AAV 혈청형 P40 프로모터 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 특히 이러한 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스 (AAV) 헬퍼 벡터의 구현예를 포함하고, 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열은 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 대체한다.

본 발명은 또한 특히 이러한 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스 (AAV) 헬퍼 벡터의 구현예를 포함하고, 벡터는 추가로 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 이식유전자 카세트를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 생산 역가를 증가시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 다음으로 형질감염된 세포를 배양하는 것을 포함한다:

(1) rAAV;

(2) 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 전술한 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터;

배양은 rAAV의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 수행되고, 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열의 존재는, 세포가 상기 AAV 헬퍼 기능-제공 폴리뉴클레오티드가 천연 혈청형 P5 및 P40 프로모터를 함유하는 경우에 달성되는 것에 비해 증가된 생산 역가로 rAAV를 생산하도록 한다.

(1) rAAV;

(2) 전술한 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터 중 임의의 것; 및

(3) 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 추가 벡터, 특히 플라스미드 벡터;

배양은 rAAV의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 수행되고, 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열의 존재는, 세포가 상기 AAV 헬퍼 기능-제공 폴리뉴클레오티드가 천연 혈청형 P5 및 P40 프로모터를 함유하는 경우에 달성되는 것에 비해 증가된 생산 역가로 rAAV를 생산하도록 한다.

본 발명은 특히 이러한 방법의 구현예를 포함하며, 이식유전자 카세트는 단백질을 포함하거나, 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태에 대한 치료제(therapeutic)인 전사된 핵산을 포함한다.

본 발명은 또한 특히 다음과 같은 방법의 구체예를 포함한다:

(A) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV1 Cap 단백질을 인코딩(encoding)하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드(hybrid)의 프로모터 서열이고;

(B) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV2 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(C) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV3 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(D) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV4 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(E) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV5 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(F) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV6 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(G) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV7 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(H) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV8 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV7의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이다.

본 발명은 또한 특히 세포가 인간 배아 신장 세포, 어린 햄스터 신장 세포 또는 sf9 곤충 세포인 이러한 방법의 구현예를 포함한다.

본 발명은 추가로 상기 열거된 임의의 방법에 의해 생산된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV), 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

도 1은 야생형(Wt) AAV 게놈의 도식적인 유전자 지도를 제공한다.
도 2는 야생형 AAV2 게놈 (1), 재조합 AAV (rAAV) (2), 보완 "AAV 헬퍼 플라스미드" (3) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 ("Ad 헬퍼 플라스미드") ( 4)의 구조적 도메인의 개략도를 제공한다. 야생형(Wt) AAV2(1)는 AAV 특이적 회문형 역전 말단 반복 서열(ITR), Rep 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 5' 절반 및 Cap 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 3' 절반으로 구성된다. rAAV(2)는 야생형(Wt) AAV2(1)의 Rep 및 Cap 인코딩 유전자를 프로모터(Pro), 관심 있는 외인성 이식유전자 및 폴리아데닐화 부위(pA)를 포함하는 이식유전자 카세트로 대체하여 형성된다. rAAV(2)를 생산하기 위해, 보완 "AAV 헬퍼" 플라스미드 벡터(3) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 벡터(Ad 헬퍼 플라스미드)( 4)가 제공된다. 보완 AAV 헬퍼 플라스미드(3)는 Rep 및 Cap 단백질을 제공한다. Ad 헬퍼 플라스미드(4)는 아데노바이러스 단백질 E1a, E1b, E2a, VA 및 E4를 제공한다.
도 3은 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터 pAAV-RC1(서열번호:1)의 지도를 보여준다.
도 4는 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터 pAAV-RC2(서열번호:2)의 지도를 보여준다.
도 5는 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터 pAAV-RC5(서열번호:3)의 지도를 보여준다.
도 6은 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터 pAAV-RC6(서열번호:4)의 지도를 보여준다.
도 7은 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터 pAAV-RC7(서열번호:5)의 지도를 보여준다.
도 8은 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터 pHelper-Kan(서열번호:6)의 지도를 보여준다.
도 9는 rAAV 플라스미드 벡터 pAV-CMV-EGFP(서열번호:7)의 지도를 보여준다.
도 10은 rAAV 플라스미드 벡터 pAV-TBG-EGFP(서열번호:8)의 지도를 보여준다.
도 11은 본 명세서에 기재된 예시적인 AAV 헬퍼 구축물의 개발에 따른 전체 구조 및 접근 방식을 보여준다. 모(parent) 작제물(pAAV-RC2; 모체-RC)는 Rep 단백질을 인코딩하는 천연 AAV2 rep 유전자(백색 박스형 유전자)의 발현을 지시하는 P5 및 P19 프로모터(실선 검은색 박스)에 대한 AAV2 혈청형 프로모터 서열, 뿐만 아니라 Cap 단백질을 인코딩하는 천연 AAV2 cap 유전자(회색 박스형 유전자)의 발현을 지시하는 P40 프로모터(실선 검은색 박스)의 AAV2 혈청형 프로모터 서열을 포함한다.
P5- RC 작제물은 천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 (실선 검은색 박스) 대신에 비천연 P5 프로모터 (즉, 벡터의 AAV rep 유전자 내에 천연적으로 존재하는 AAV P5 프로모터 (하향 줄무늬 박스))를 사용하여 AAV rep 유전자의 발현을 지시하도록 변형된 모체 플라스미드 AAV RC 의 유도체이고; P5- RC 작제물은 모체 벡터의 천연 AAV 혈청형 P19 및 P40 프로모터 서열 (실선 검은색 박스)를 사용하여 AAV rep 및 cap 유전자의 발현을 지시한다. P40- RC 작제물은 천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 (실선 검은색 박스) 대신에 비천연 P40 프로모터 (즉, 벡터의 AAV rep 유전자 내에 천연적으로 존재하는 AAV P40 프로모터 (하향 줄무늬 박스))를 사용하여 AAV rep 유전자의 발현을 지시하도록 변형된 모체 플라스미드 AAV RC 의 유도체이고; P5- RC 작제물은 모체 벡터의 천연 AAV 혈청형 P5 및 P19 프로모터 서열 (실선 검은색 박스)를 사용하여 AAV rep 및 cap 유전자의 발현을 지시한다. P5/P40- RC 작제물은 천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 (실선 검은색 박스) 대신에 비천연 P5 프로모터 (즉, 벡터의 AAV rep 유전자 내에 천연적으로 존재하는 AAV P5 프로모터 (하향 줄무늬 박스))를 사용하여 AAV rep 유전자의 발현을 지시하도록 변형된 모체 플라스미드 AAV RC 의 유도체이이다. P5/P40- RC 작제물은 추가로 천연 AAV 혈청형 P40 프로모터 (실선 검은색 박스) 대신에 벡터의 비천연 P40 프로모터 (즉, AAV rep 유전자 내에 천연적으로 존재하지 않는 AAV P40 프로모터(상향 줄무늬 박스))을 사용하여 AAV cap 유전자의 발현을 지시하도록 변형되었다. P40- RC 작제물은 모체 벡터의 천연 AAV 혈청형 P19 프로모터 서열 (실선 검은색 박스)를 사용하여 AAV rep 유전자의 발현을 지시한다. 프로모터 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다.
도 12a-12b는 모체 RC2 벡터를 변형하도록 수득된 rAAV의 생산 역가가 이러한 벡터의 rep 유전자와 천연적으로 회합된 AAV2 P5 프로모터 대신에 비천연 P5 프로모터 서열 (도 11; 도 12a; 하향 줄무늬 직사각형)를 포함함을 보여준다. P19 및 P40 프로모터는 모두 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열(실선 검은색 직사각형)이다. 도 12b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. 다음 작제물이 이용되었다: 모체-RC2, P5(2)-RC2, P5(1)-RC2, P5(3)-RC2, P5(4)-RC2, P5(5)-RC2, P5(7)-RC2, 및 P5(8)-RC2. 프로모터 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다. rAAV의 생산 역가는 rAAV 및 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드가 있는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 획득되었다.
도 13a-13b는 모체 RC2 벡터를 변형하도록 수득된 rAAV의 생산 역가가 모체 벡터의 AAV2 혈청형 P40 프로모터 대신에 비천연 P40 프로모터 서열 (도 11; 도 13a; 상향 줄무늬 직사각형)을 포함함을 보여준다. P5 및 P19 프로모터는 모두 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열(실선 검은색 직사각형)이다. 도 13b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. 다음 작제물이 이용되었다: 모체-RC2, P40(1)-RC2, P40(3)-RC2, P40(4)-RC2, P40(5)-RC2, P40(6)-RC2, P40(7)-RC2, 및 P40(8)-RC2. 프로모터 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다. rAAV의 생산 역가는 rAAV 및 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드가 있는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 획득되었다.
도 14a-14b는 모체 RC2 벡터를 변형하도록 수득된 rAAV의 생산 역가가 모체 벡터의 AAV2 혈청형 P5 및 P40 프로모터 대신에 비천연 P5 프로모터 서열 및/또는 비천연 P40 프로모터 서열 (도 11; 도 14a; P5, 하향 줄무늬 직사각형; P40, 상향 줄무늬 직사각형)을 포함함을 보여준다. P19 프로모터는 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열(실선 검은색 직사각형)이다. 다음 작제물이 이용되었다: 모체-RC2, P5(2)-RC2, P5(3)-RC2, P5(5)-RC2, P40(1)-RC2, P5(2)/P40(1)-RC2, P5(3)/P40(1)-RC2, 및 P5(5)/P40(1)-RC2. 프로모터 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다. 도 14b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. rAAV의 생산 역가는 rAAV 및 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드가 있는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 획득되었다.
도 15a 내지 15c는 모체 RC6 벡터를 변형하도록 수득된 rAAV의 생산 역가가 이러한 벡터의 rep 유전자와 천연적으로 회합된 AAV2 P5 프로모터 대신에 비천연 P5 프로모터 서열 (도 11; 도 15a; 하향 줄무늬 직사각형)를 포함함을 보여준다. P19 및 P40 프로모터는 모두 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열(실선 검은색 직사각형)이다. 다음 작제물이 이용되었다: 모체-RC6, P5(1)-RC6, P5(2)-RC6, P5(3)-RC6, P5(7)-RC6 및 P5(8)-RC6. 프로모터 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다. rAAV의 생산 역가는 rAAV 및 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드가 있는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 획득되었다 (도 15b 내지 15c).
도 16a-16b는 모(parental) RC1, RC5, 또는 RC7 벡터를 변형하도록 수득된 rAAV의 생산 역가가 이러한 벡터의 rep 유전자와 천연적으로 회합된 AAV2 P5 프로모터 대신에 비천연 P5 프로모터 서열 (도 11; 도 16a; 하향 줄무늬 직사각형)를 포함함을 보여준다. P19 및 P40 프로모터는 모두 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열(실선 검은색 직사각형)이다. 다음 작제물이 이용되었다: 모체-RC1, 모체-RC5, 모체-RC7, P5(2)-RC1, P5(7)-RC1, P5(8)-RC1, P5(7)-RC5, P5(2)-RC7, P5(7)-RC7 및 P5(8)-RC7. 프로모터 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다. rAAV의 생산 역가(도 16b)는 rAAV 및 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드가 있는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 획득되었다.

I. 본 발명의 방법

본 발명은 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 패키징 효율을 증가시킬 수 있는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터 및 이러한 rAAV의 패키징 효율을 개선하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상이한 혈청형의 rAAV의 Rep 단백질과 연련된 AAV P5 및/또는 P40 프로모터와 함께 이러한 rAAV에 의해 인코딩되는 Rep 단백질과 천연적으로 연관된 P5 및/또는 P40 프로모터 서열을 대체(또는 증대)하도록 추가로 변형된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터에 관한 것이다. 이러한 치환 또는 추가 프로모터 서열의 사용은 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스의 생산을 증가시킨다.

본 발명은 부분적으로 높은 수준의 Rep 및 Cap 단백질이 rAAV 게놈 입자의 양 및 결과적으로 rAAV 패키징의 효율성을 증가시키고 따라서 rAAV 스톡(stock)의 높은 생산 역가를 초래한다는 인식에 기초한다. Cap 단백질의 발현을 지시하는 AAV P5 및/또는 P40 프로모터를 상이한 AAV P5 및/또는 P40 프로모터로 교체하거나, 초기에 존재하는 것 외에 그러한 상이한 AAV P5 및/또는 P40 프로모터를 첨가함으로써 원하는 높은 수준의 rAAV는 달성됨을 예상외로 발견하였다. AAV Rep 단백질은 미국 특허 번호 10,214,730; 7,122,348; 6,821,511; 6,753,419; 9,441,206; 및 7,115,391에 기재되어 있다.

위에서 논의한 바와 같이, AAV 및 rAAV는 캡시드 단백질에 의해 결정되는 혈청형을 기반으로 특성화된다 (Colella, P. 등 (2018) "Emerging Issues in AAV -Mediated In Vivo Gene Therapy," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 8:87-104; Hocquemiller, M. 등 (2016) "Adeno -Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases," Hum. Gene Ther. 27(7):478-496; Lisowski, L. 등 (2015) "Adeno -Associated Virus Serotypes For Gene Therapeutics," 24:59-67; 미국 특허 번호 10,301,650; 10,266,846; 10,265,417; 10,214,785; 10,214,566; 10,202,657; 10,046,016; 9,884,071; 9,856,539; 9,737,618; 9,677,089; 9,458,517; 9,457,103; 9,441,244; 9,193,956; 8,846,389; 8,507,267; 7,906,111; 7,479,554; 7,186,552; 7,105,345; 6,984,517; 6,962,815; 및 6,733,757). 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질을 인코딩하는 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드의 존재 하에 AAV 및 rAAV를 형성함으로써, "하이브리드(hybrid)" 혈청형을 갖는 AAV 및 rAAV를 생성할 수 있다. 이러한 AAV 및 rAAV는 각각의 이러한 캡시드 단백질을 갖는 AAV 및 rAAV의 조합된 영양성(trophism)을 나타낸다.

상이한 AAV 혈청형의 Rep 단백질은 다르지만, 이러한 단백질은 구조적 단백질이 아니기 때문에 차이가 AAV의 관찰된 혈청형에 기여하지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "AAV"는 아데노 연관 바이러스를 나타내기 위한 것이고, 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 모든 하위 유형과 자연 발생 및 재조합 형태를 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "rAAV"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열(즉, AAV에 이종성인 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 AAV의 재조합으로 변형된 버전을 나타내기 위한 것이다. rAAV는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, rAAV는 일반적으로 특정 AAV 유전자가 결핍되어 이중 플라스미드 형질감염 시스템, 또는 보다 바람직하게는 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터, 비- AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터, 및 rAAV 플라스미드 벡터를 포함하는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 생산된다 (도 2) 한 구현예에서, 이러한 이중 또는 삼중 형질감염 시스템의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드는 하이브리드 혈청형을 갖는 rAAV를 형성할 수 있도록 1개 초과의 rep 및/또는 cap 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하이브리드 혈청형을 갖는 rAAV의 형성을 허용하기 위해 제2 또는 추가 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 제2 또는 추가 플라스미드 벡터 상에서)가 제공될 수 있다.

A. 예시적인 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드

본 명세서에 사용된 용어 "AAV 헬퍼 기능"은 rAAV의 복제 및 패키징에 필요한 AAV 단백질(예를 들어, Rep 및 Cap) 및/또는 AAV의 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 이러한 AAV 헬퍼 기능은 "AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드"에 의해 제공되며, 이러한 용어는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 바이러스, 플라스미드 벡터, 비-플라스미드 벡터, 또는 세포 염색체 내로 통합된 폴리뉴클레오티드이며, AAV 헬퍼 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV 헬퍼 플라스미드는 pAAV - RC(Agilent; Addgene; Cell Biolabs), pAAV -RC1, pAAV -RC2, pAAV -RC5, pAAV -RC6, 및 pAAV -RC7을 포함한다.

1. 플라스미드 pAAV -RC1

플라스미드 pAAV -RC1(서열번호:1 ; 도 3)은 AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV1 혈청형 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pAAV -RC1의 P5 및 P40 프로모터는 AAV2 혈청형 프로모터(각각 서열번호:10 및 서열번호:18)이다.

플라스미드 pAAV -RC1의 코딩 가닥( 서열번호:1 ):

서열번호:1에서, pAAV -RC1의 잔기 1-1561은 Rep 단백질, Rep78(AAV2 P19 프로모터에 상응하는 잔기 95-221 및 AAV2 P40 프로모터에 상응하는 잔기 1075-1254(서열번호:18))을 인코딩하고; 잔기 1578-3788은 AAV1 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하고; 잔기 7127-7431은 Rep68 단백질의 일부를 인코딩하고; 잔기 3984-4114는 AAV2 P5 프로모터 서열(서열번호:10)에 해당하고; 잔기 4237-4253은 M13 Rev 서열이고; 잔기 4261-4277은 Lac 작동자 서열이고; 4285-4315는 Lac 프로모터 서열이고; 잔기 4578-5302는 pMB ori 서열에 상응하고, 잔기 5398-6258은 암피실린 내성 결정인자를 인코딩하고; 그리고 잔기 6259-6357은 bla 프로모터 서열이다(도 3).

2. 플라스미드 pAAV -RC2

플라스미드 pAAV -RC2(서열번호:2 ; 도 4)은 AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV2 혈청형 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pAAV -RC2의 P5 및 P40 프로모터는 AAV2 혈청형 프로모터(각각 서열번호:10 및 서열번호:18)이다.

플라스미드 pAAV -RC2의 코딩 가닥( 서열번호:2 ):

서열번호:2에서, pAAV -RC2의 잔기 85-1950은 Rep 단백질인, Rep78 (AAV2 P19 프로모터에 상응하는 잔기 484-663, AAV2 P40 프로모터 (서열번호:18)에 상응하는 잔기 1464-1643 및 공여체 부위인 잔기 1668-1676); 잔기 1967-4174는 AAV2 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하고; 잔기 1992-2016은 Rep68 단백질의 일부를 인코딩하고; 잔기 4175-4256은 polyA 서열을 인코딩하고; 잔기 4357-4487은 서열번호:10의 AAV2 P5 프로모터 서열에 해당하고; 잔기 4610-4626은 M13 Rev 서열이고; 잔기 4634-4650은 Lac 작동자 서열이고; 4658-4688은 Lac 프로모터 서열이고; 잔기 4951-5675는 pMB ori 서열에 상응하고, 잔기 5771-6631은 암피실린 내성 결정인자를 인코딩하고; 그리고 잔기 6632-6730은 bla 프로모터 서열이다(도 4).

3. 플라스미드 pAAV -RC5

플라스미드 pAAV -RC5(서열번호:3 ; 도 5)은 AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV5 혈청형 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pAAV -RC5의 P5 및 P40 프로모터는 AAV2 혈청형 프로모터(각각 서열번호:10 및 서열번호:18)이다.

플라스미드 pAAV -RC5의 코딩 가닥( 서열번호:3 ):

서열번호:3에서, pAAV -RC5의 잔기 1-1561은 Rep 단백질인, Rep78(AAV2 P19 프로모터에 상응하는 잔기 91-221, 및 P40 프로모터 (서열번호:18)에 상응하는 잔기 1075-1254)을 인코딩하고; 잔기 1578-3749는 AAV5 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하고; 잔기 7091-7395는 Rep68 단백질의 일부를 인코딩하고; 잔기 3948-4078은 서열번호:10)의 AAV2 P5 프로모터 서열에 해당하고; 잔기 4201-4217은 M13 Rev 서열이고; 잔기 4225-4241은 Lac 작동자 서열이고; 4249-4279는 Lac 프로모터 서열이고; 잔기 4542-5266은 pMB ori 서열에 상응하고, 잔기 5362-6222는 암피실린 내성 결정인자를 인코딩하고; 잔기 6223-6321은 bla 프로모터 서열이다(도 5).

4. 플라스미드 pAAV -RC6

플라스미드 pAAV -RC6(서열번호:4 ; 도 6)은 AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV6 혈청형 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pAAV -RC6의 P5 및 P40 프로모터는 AAV2 혈청형 프로모터(각각 서열번호:10 및 서열번호:18)이다.

플라스미드 pAAV -RC6의 코딩 가닥( 서열번호:4 ):

서열번호:4에서, pAAV -RC6의 잔기 1-1561은 Rep 단백질인, Rep78(AAV2 P19 프로모터에 상응하는 잔기 91-221, 및 P40 프로모터 (서열번호:18)에 상응하는 잔기 1075-1254)을 인코딩하고; 잔기 1578-3788는 AAV6 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하고; 잔기 736-1281는 Rep68 단백질의 일부를 인코딩하고; 잔기 3984-4114은 서열번호:10)의 AAV2 P5 프로모터 서열에 해당하고; 잔기 4237-4253은 M13 Rev 서열이고; 잔기 4261-4277은 Lac 작동자 서열이고; 4285-4315는 Lac 프로모터 서열이고; 잔기 4578-5302은 pMB ori 서열에 상응하고, 잔기 5398-6258는 암피실린 내성 결정인자를 인코딩하고; 잔기 6259-6357은 bla 프로모터 서열이다(도 6).

5. 플라스미드 pAAV -RC7

플라스미드 pAAV -RC7(서열번호:5 ; 도 7)은 AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 AAV6 혈청형 캡시드 단백질을 발현하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pAAV -RC7의 P5 및 P40 프로모터는 AAV2 혈청형 프로모터(각각 서열번호:10 및 서열번호:18)이다.

플라스미드 pAAV -RC7의 코딩 가닥(서열 번호 5):

서열번호:5에서, pAAV -RC7의 잔기 1-1561은 Rep 단백질인, Rep78(AAV2 P19 프로모터에 상응하는 잔기 91-221, 및 P40 프로모터 (서열번호:18)에 상응하는 잔기 1075-1254)을 인코딩하고; 잔기 1578-3791는 AAV6 VP1 캡시드 단백질을 인코딩하고; 잔기 736-1281는 Rep68 단백질의 일부를 인코딩하고; 잔기 3987-4117은 서열번호:10)의 AAV2 P5 프로모터 서열에 해당하고; 잔기 4240-4256은 M13 Rev 서열이고; 잔기 4264-4280은 Lac 작동자 서열이고; 4288-4318는 Lac 프로모터 서열이고; 잔기 4581-5305은 pMB ori 서열에 상응하고, 잔기 5401-6261는 암피실린 내성 결정인자를 인코딩하고; 잔기 6262-6360은 bla 프로모터 서열이다(도 7).

B. 예시적인 비- AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드

본 명세서에 사용된 용어 "비- AAV 헬퍼 기능"은 Ad, CMV, HSV 또는 기타 비-AAD 바이러스(예를 들어, E1a, E1b, E2a, VA 및 E4)의 단백질 및/또는 rAAV의 복제 및 패키징에 필요한 Ad, CMV, HSV 또는 다른 비-AAD 바이러스의 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 이러한 비-AAV 헬퍼 기능은 "비- AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드"에 의해 제공되며, 이러한 용어는 본 명세서에 사용되는 바와 같이 바이러스, 플라스미드 벡터, 비-플라스미드 벡터, 또는 세포 염색체 내로 통합된 폴리뉴클레오티드이며, 비-AAV 헬퍼 기능을 제공한다. 벡터, pHelper 및 이의 유도체(예컨대 Cell Biolabs, Inc., Invitrogen 및 Stratagene 및 기타 공급원에서 상업적으로 입수 가능한 것)는 적합한 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드이다(예를 들어, 문헌[Matsushita, T. 등 (1998) "Adeno -Associated Virus Vectors Can Be Efficiently Produced Without Helper Virus," Gene Ther. 5:938-945; Sharma, A. 등 (2010) "Transduction Efficiency Of AAV 2/6, 2/8 And 2/9 Vectors For Delivering Genes In Human Corneal Fibroblasts," Brain Res. Bull. 81(2-3):273-278] 참조)

플라스미드 pHelper - Kan(서열번호:6; 도 8)은 비- AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비- AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드이다.

플라스미드 pHelper - Kan의 코딩 가닥( 서열번호:6 ):

서열번호:6에서, pHelper - Kan의 잔기 1-5343은 아데노바이러스로부터 유래되었으며, E2A 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(잔기 258-1847)를 포함하고; 잔기 5344-8535는 아데노바이러스로부터 유래되고, E4orf6 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 잔기 9423-10011은 ori 서열에 해당하고; 잔기 10182-10976은 bla 프로모터 서열(잔기 10977-11081)에 의해 발현되는 카나마이신 내성 결정인자를 인코딩하고; 잔기 11107-11561은 f1 ori 서열에 해당한다(도 8).

C. 예시적인 rAAV 플라스미드 벡터

상기 논의된 바와 같이, AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드 및 비- AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 포함하기 위해 rAAV 플라스미드 벡터와 협력하여 사용된다. 다수의 상업적으로 입수가능한 rAAV 플라스미드 벡터(예를 들어, pAV - CMV - EGFP, pGOI 등(Cell Biolabs, Inc., Invitrogen 및 Stratagene))가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 예시적인 rAAV 플라스미드 벡터는 5' ITR, U6 프로모터, CMV 인핸서 및 프로모터 서열, 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (Gambotto, A. 등 (2000) "Immunogenicity Of Enhanced Green Fluorescent Protein ( EGFP ) In BALB /C Mice: Identification Of An H2- Kd -Restricted CTL Epitope," Gene Ther. 7(23):2036-2040; Tsien, R.Y. (1998) "The Green Fluorescent Protein," Annu. Rev. Biochem. 67:509-544; Cinelli, R.A. 등 (2000) "The Enhanced Green Fluorescent Protein As A Tool For The Analysis Of Protein Dynamics And Localization: Local Fluorescence Study At The Single-Molecule Level," Photochem. Photobiol. 71(6):771-776; Chopra A. (2008) "Recombinant Adenovirus With Enhanced Green Fluorescent Protein," In: Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD), National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD), 발현된 단백질의 회수 또는 국재화를 촉진하기 위한 FLAG 태그 및 6xHis 태그 부위, SV40 폴리(A) 부위 및 3' ITR을 포함하는 pAV - CMV - EGFP(서열번호:7; 도 9)이다.

플라스미드 pAV - CMV - EGFP의 코딩 가닥( 서열번호:7 ):

서열번호:7에서, pAV - CMV - EGFP의 잔기 1-128은 5' ITR에 해당하고; 잔기 201-441은 U6 프로모터 서열이고; 잔기 562-865는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 전초기 인핸서 서열이고; 잔기 866-1068은 CMV 전초기 프로모터를 포함하고; 잔기 1192-1911은 EGFP를 인코딩하는 포유동물 코돈 최적화 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 잔기 1918-1941은 FLAG-태그를 인코딩하고; 잔기 1951-1968은 6xHis-태그를 인코딩하고; 잔기 2139-2260은 SV40 폴리(A) 서열을 인코딩하고; 잔기 2293-2433은 3' ITR에 해당하고; 잔기 2508-22963은 F1 ori 서열에 해당하고; 잔기 3350-4210은 bla 프로모터 서열(잔기 3245-3349)에 의해 발현되는 암피실린 내성 결정인자 및 이의 신호 서열(잔기 3350-3418)을 인코딩하고; 잔기 4381-4969는 ori 서열에 해당한다(도 9).

본 발명에 따라 사용될 수 있는 제2 예시적인 rAAV 플라스미드 벡터는 5' ITR, 갑상선 호르몬-결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현된 단백질의 회수 또는 국소화(localization)를 용이하게 하기 위한 FLAG-태그 및 6xHis-태그 부위, SV40 폴리(A) 부위 및 3' ITR을 포함하는 pAV-TBG-EGFP (서열번호:8 ; 도 10)이다.

플라스미드 pAV - TBG - EGFP의 코딩 가닥( 서열번호:8 ):

서열번호:8에서, pAV - TBG - EGFP의 잔기 1-130은 5' ITR에 해당하고; 잔기 150-854는 TBG 프로모터 서열이고, 잔기 415-824는 TBG 프로모터를 포함하고; 잔기 886-1608은 EGFP를 인코딩하고; 잔기 1630-1653은 FLAG-태그를 인코딩하고; 잔기 1663-1680은 6xHis-태그를 인코딩하고; 잔기 1851-1972는 폴리(A) 서열을 인코딩하고; 잔기 2005-2145는 3' ITR에 해당하고; 잔기 2220-2675는 F1 ori 서열에 해당하고; 잔기 3062-3922는 bla 프로모터 서열(잔기 2957-3061)에 의해 발현되는 암피실린 내성 결정인자 및 이의 신호 서열(잔기 3062-3130)을 인코딩하고; 잔기 4093-4681은 ori 서열에 해당한다(도 10).

본 명세서에 사용된 용어 "천연 AAV 혈청형 프로모터 서열"은 AAV rep 유전자의 전사를 천연적으로 조절하거나 이러한 rep 유전자 내에 천연적으로 존재하는 프로모터 서열을 나타내기 위한 것이다. 예를 들어:

● AAV1 P5 프로모터 서열은 AAV1의 rep 유전자의 전사를 천연적으로 제어하고 AAV1 P40 프로모터 서열은 AAV1의 rep 유전자 내에서 천연적으로 발견된다. 따라서, AAV1 P5 프로모터 서열 및 AAV1 P40 프로모터 서열은 AAV1의 rep 유전자의 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열이고;

● AAV2 P5 프로모터 서열은 AAV2의 rep 유전자의 전사를 천연적으로 제어하고 AAV2 P40 프로모터 서열은 AAV2의 rep 유전자 내에서 천연적으로 발견된다. 따라서, AAV2 P5 프로모터 서열 및 AAV2 P40 프로모터 서열은 AAV2의 rep 유전자의 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열이고;

● AAV5 P5 프로모터 서열은 AAV5의 rep 유전자의 전사를 천연적으로 제어하고 AAV5 P40 프로모터 서열은 AAV5의 rep 유전자 내에서 천연적으로 발견된다. 따라서, AAV5 P5 프로모터 서열 및 AAV5 P40 프로모터 서열은 AAV5의 rep 유전자의 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열이고;

● AAV6 P5 프로모터 서열은 AAV6의 rep 유전자의 전사를 천연적으로 제어하고 AAV6 P40 프로모터 서열은 AAV6의 rep 유전자 내에서 천연적으로 발견된다. 따라서, AAV6 P5 프로모터 서열 및 AAV6 P40 프로모터 서열은 AAV6의 rep 유전자의 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열이고; 그리고

● AAV7 P5 프로모터 서열은 AAV7의 rep 유전자의 전사를 천연적으로 제어하고 AAV7 P40 프로모터 서열은 AAV7의 rep 유전자 내에서 천연적으로 발견된다. 따라서, AAV7 P5 프로모터 서열 및 AAV7 P40 프로모터 서열은 AAV7의 rep 유전자의 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열이고;

AAV 혈청형 1-8에 대한 천연 AAV P5 및 P40 프로모터 서열은 표 1에 보여진다. 전사를 매개할 수 있는 이러한 서열 또는 이의 하위서열은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.

대조적으로, 용어 "비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열"은 AAV의 rep 유전자를 천연적으로 제어하지 않고 이러한 rep 유전자 내에서 천연적으로 발견되지 않는 프로모터 서열을 나타내기 위한 것이다. 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열의 예시적이고 비제한적인 예는 다음을 포함한다: AAV2, AAV5, AAV6, 또는 AAV7 rep 유전자의 발현을 지시하는데 사용되는 경우 AAV1 P5 프로모터; AAV1, AAV5, AAV6, 또는 AAV7 rep 유전자의 발현을 지시하는데 사용되는 경우 AAV2 P5 프로모터; AAV1, AAV2, AAV6 또는 AAV7 rep 유전자의 발현을 지시하는 데 사용되는 경우 AAV5 P5 프로모터; AAV1, AAV2, AAV5 또는 AAV7 rep 유전자의 발현을 지시하는 데 사용되는 경우 AAV6 P5 프로모터; AAV1, AAV2, AAV5, 또는 AAV6 rep 유전자의 발현을 지시하는데 사용되는 경우 AAV7 P5 프로모터; AAV2, AAV5, AAV6 또는 AAV7 rep 유전자 내에 존재하는 경우 AAV1 P40 프로모터; AAV1, AAV5, AAV6 또는 AAV7 rep 유전자 내에 존재하는 경우 AAV2 P40 프로모터; AAV1, AAV2, AAV6 또는 AAV7 rep 유전자 내에 존재하는 경우 AAV5 P40 프로모터; AAV1, AAV2, AAV5 또는 AAV7 rep 유전자 내에 존재하는 경우 AAV6 P40 프로모터; AAV1, AAV2, AAV5 또는 AAV6 rep 유전자 내에 존재하는 경우 AAV7 P40 프로모터 등.

한 구현예에서, 이러한 AAV 혈청형 프로모터 서열 중 하나 이상은 이러한 플라스미드의 기존 P5 또는 P40 프로모터를 대체하거나 증대시키기 위해 Rep 및 Cap 단백질을 제공하도록 설계된 재조합 AAV 헬퍼 플라스미드로 유전적으로 조작될 수 있다. 이러한 변형은 바람직하게는 잘 알려진 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 달성된다.

프로모터 서열의 혈청형의 동일성은 관련된 프로모터(예를 들어, P5, P40 등), 천연적으로 회합된 rep 유전자의 혈청형 및 벡터의 이름을 표시함으로써 본 명세서에 표시된다. 따라서, 예를 들어, AAV2와 천연적으로 회합된 P5 프로모터 서열을 포함하는 pAAV -RC2 플라스미드는 P5(2)-RC2로 표시되고; AAV3과 천연적으로 회합된 P5 프로모터 서열을 포함하는 pAAV -RC2 플라스미드는 P5(3)-RC2로 표시되고; AAV7과 천연적으로 회합된 P40 프로모터 서열을 포함하는 pAAV -RC5 플라스미드는 P40(7)-RC5로 표시되고; AAV3과 천연적으로 회합된 P5 프로모터 서열 및 AAV8과 천연적으로 회합된 P40 프로모터 서열을 포함하는 pAAV -RC2 플라스미드는 P5(3)/P40(8)-RC2로 표시된다; 등.

한 구현예에서, 도입된 AAV 혈청형 프로모터 서열은 초기에 존재하는 AAV 혈청형 프로모터 서열을 대체할 것이다. 다른 구현예에서, 도입된 AAV 혈청형 프로모터 서열은 이러한 초기에 존재하는 AAV 혈청형 프로모터 서열에 추가하여 존재할 것이고, 이러한 초기에 존재하는 AAV 혈청형 프로모터 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치할 것이다. 도입된 뉴클레오티드 서열은 이러한 초기에 존재하는 AAV 혈청형 프로모터 서열에 인접하거나 떨어져 위치할 수 있다.

이러한 AAV 혈청형 프로모터 서열 중 하나 이상의 본 발명의 치환 또는 첨가는 rAAV 생산 역가를 증가시킨다. 본 명세서에 사용된 용어 "생산 역가"는 제제에서 감염성 rAAV의 농도의 양을 나타내기 위한 것이다. 이러한 양 또는 농도는 바람직하게는 이러한 제제에서 AAV 또는 rAAV를 적정함으로써 결정된다. 본 발명의 rAAV 제제의 생산 역가는 바람직하게는 생산 세포(예를 들어, rAAV 플라스미드 벡터, Rep 및 Cap 단백질을 제공하는 AAV 헬퍼 벡터, 및 필요한 아데노바이러스 전사 및 번역 인자를 제공하는 Ad 헬퍼 벡터)에 대해 3 라운드의 동결/해동에 이어 초음파 처리하여 rAAV 입자를 방출한 후에 적정된다. 그런 다음 제제를 원심분리한다. 이용된 AAV 헬퍼 벡터는 상청액에 국한된다. 제제의 분취량을 프로테이나제 K로 처리하고 AAV 게놈의 수를 결정한다. 제제의 분취량을 HeLa-32C2 세포(AAV2 Rep 및 Cap 단백질을 발현함)에 감염시키고 감염 역가를 감염 센터 검정(ICA)을 사용하여 측정한다 (Franηois, A. 등 (2018) "Accurate Titration of Infectious AAV Particles Requires Measurement of Biologically Active Vector Genomes and Suitable Controls," Molec. Ther. Meth. Clin. Develop. 10:223-236) or more preferably, as the median tissue culture infective dose (TCID50) (Zen, Z. 등 (2004) "Infectious Titer Assay For Adeno -Associated Virus Vectors With Sensitivity Sufficient To Detect Single Infectious Events," Hum. Gene Ther. 15:709-715).

본 명세서에 사용된 바와 같이, rAAV 생산 역가는, 본 발명의 방법의 사용으로부터 수득된 생산 역가가 추가로 제공된 이온이 제공되지 않은 유사하게 수행된 생산으로부터 수득된 역가보다 적어도 10% 초과, 더 바람직하게는 적어도 20% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 2-배 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 110% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 120% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 130% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 140% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 2.5-배 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 160% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 170% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 180% 초과, 더욱 더 바람직하게는 적어도 190% 초과, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 3-배 초과인 경우 본 방법에 의해 "증가된" 이라고 한다.

본 발명의 방법을 사용하여 생산 역가가 증가될 수 있는 rAAV는 rAAV가 AAV 캡시드 입자 내에 캡시드화될 수도 있는 rAAV 플라스미드 벡터 내로 패키징되게 하는 임의의 이식유전자 카세트를 포함할 수 있다. 제한 없이, 그러한 이식유전자 카세트(들)는 인간, 영장류 (침팬지, 긴팔원숭이, 고릴라, 오랑우탄 등 포함), 세로피테신 (개코원숭이, 사이노몰구스 원숭이, 벨벳 원숭이 등 포함), 갯과, 설치류 (랫트, 마우스, 햄스터, 기니아 피그 등 포함), 고양이, 양, 염소, 또는 말과 기원의 것일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 이러한 rAAV 또는 rAAV 플라스미드 벡터는 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태과 관련되고, 그러한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 유전자 요법에 사용될 수 있는, 전사된 핵산을 포함하거나, 단백질(예를 들어, 효소, 호르몬, 항체, 수용체, 리간드 등)을 인코딩한다.

본 발명의 방법은 다음으로 추가로 형질감염된 세포에서 rAAV 및 rAAV 플라스미드 벡터의 생산 역가를 증가시키기 위해 사용될 수 있다:

(1) 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 보유하고 이러한 rAAV 또는 rAAV 플라스미드 벡터에 의해 천연적으로 제공되지 않지만 이들의 생산에 필요한 단백질 또는 RNA 분자를 발현할 수 있는 AAD 헬퍼 벡터. 위에서 논의된 바와 같이, 이러한 단백질 또는 RNA 분자는 벡터 전사 조절 및 복제, 바이러스 게놈을 바이러스 캡슐로 패키징하는 데 필요한 Rep52 및 Rep78 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 감염성 입자를 형성하는 데 필요한 VP 캡시드 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 포함한다;

(2) 비-AAV 헬퍼 단백질(예를 들어, E1a, E1b, E2a, VA 및 E4) 또는 이러한 rAAV 또는 rAAV 플라스미드 벡터에 의해 제공되지 않지만 이들의 생산에 필요한 RNA 분자를 제공할 수 있는 Ad 헬퍼 벡터.

본 발명의 rAAV를 생산하기 위한 한 구현예에서, 이러한 유전자 및 RNA 분자 모두는 rAAV와 협력하여 이중 플라스미드 형질감염 시스템을 포함하도록 동일한 헬퍼 바이러스(또는 보다 바람직하게는 헬퍼 벡터)에 제공된다. 그러나, 보다 바람직하게는, 본 발명의 rAAV를 생산하기 위해, 필요한 rep 및 cap 유전자 및 이러한 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 제공하는 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드는 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로부터 분리된 벡터 상에 제공되어, 이러한 벡터 또는 플라스미드는 rAAV와 협력하여 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 포함한다.

따라서 본 발명은 Rep 및 Cap 단백질의 발현이 천연 프로모터 서열이 아닌 프로모터 서열에 의해 지시되도록 함으로써 rAAV의 생산이 증가될 수 있다는 인식으로부터 부분적으로 유래한다. 특정 rAAV를 변형하여 그의 천연 P5 및/또는 P40 AAV 혈청형 프로모터 서열(들)을 비천연 P5 및/또는 P40 AAV 혈청형 프로모터 서열로 대체함으로써 (또는 비-천연 P5 및/또는 P40 AAV 혈청형 프로모터 서열을 이러한 rAAV에 혼입함으로써), 본 발명의 방법은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10 혈청형을 포함하고 하이브리드 혈청형(예를 들어, AAV2/5 및 rAAV2/5, 이는 AAV 혈청형 2 및 5의 하이브리드이고 따라서 이러한 혈청형 둘 다의 영양성을 갖는다)을 포함하는 임의의 혈청역에 속하는 임의의 혈청형에 속하는 rAAV의 생산 역가를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 "헬퍼" RNA 또는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 백시니아 바이러스 또는 파필로마바이러스에 의해 제공되는 단백질을 사용하여 생산될 rAAV의 생산 역가를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 부착성 단층 배양 또는 현탁 배양에서 세포에 의해 생산된 rAAV의 생산 역가를 증가시키기 위해 사용될 수 있고, rAAV를 생산할 수 있는 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, rAAV는 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, 또는 보다 바람직하게는 조직 배양에서 성장한 인간 배아 신장(HEK) 세포를 전술한 플라스미드 벡터로 형질감염시킴으로써 생산된다. 내인성 레트로바이러스가 없는 BHK 세포주 BHK-21(ATCC CCL-10)이 바람직한 BHK 세포주이다. HEK 세포주 HEK293(ATCC CRL-1573) 및 HEK293T(ATCC CRL-3216, 이는 SV40 T-항원에 대한 온도 민감성 유전자가 삽입된 HEK293 세포주의 형질전환 가능성이 높은 유도체임)와 같은 그 유도체 또는 HEK293T/17(ATCC® CRL-11268, 이는 형질감염의 용이성을 위해 선택됨)이 특히 바람직하다. HEK293T/17 SF 세포주(ATCC ACS-4500)는 293T/17 세포주(ATCC CRL-11268)의 유도체이고, 이는 무혈청 배지 및 현탁액에 적합하며 원하는 경우 사용할 수 있다.

이러한 세포를 배양하기 위한 본 발명의 바람직한 기본 배지는 이글스 최소 필수 배지 (ATCC 카탈로그 번호 30-2003) 또는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; Mediatech, Manassas, VA)이다. 우태 혈청(예를 들어, FBS; HyClone Laboratories, South Logan, UT)은 완전한 성장 배지를 만들기 위해 10%의 최종 농도로 첨가된다. 이글스 최소 필수 배지 및 둘베코 변형 이글 배지는 다양한 무기염 외에 아미노산, 비타민, 및 선택적으로 글루코스를 함유하는 복합 배지이다. 배지는, 둘베코 변형된 이글 배지가 이글스 최소 필수 배지의 원래 공식에 존재하는 4배의 비타민과 아미노산, 및 2내지4배의 글루코스를 함유한다는 점에서 다르다. 또한, 황산 제2철 및 pH 표시를 위한 페놀 레드 형태의 철을 함유하고 있다 (Yao, T 등 (2017) "Animal-Cell Culture Media: History, Characteristics, And Current Issues," Reproduc. Med. Biol. 16(2): 99-117).

이러한 형질감염에 사용되는 세포는 바람직하게는 지수 성장 단계에서 세포를 유지하기 위해 매주 2회 계대된다. 소규모 형질감염의 경우, 예를 들어 다중 웰 플레이트 상의 웰당 1 x 10⁶ HEK293 또는 BHK 세포 또는 15-cm 접시당 1.5 x 10⁷ HEK293 세포의 분취량을 사용할 수 있다. 대규모 생산을 위해, HEK293 또는 BHK 세포를 여러 개의 합류 15-cm 플레이트로부터 수집하고 1리터의 완전한 배양 배지를 함유하는 두 개의 10-층 세포 스택(Corning, Corning, NY)으로 분할할 수 있다. 한 구현예에서, 이러한 세포는 형질감염 전에 이러한 배지에서 4일 동안 성장된다. 형질감염 전날, 2개의 세포 스택을 트립신 처리하고 세포(예를 들어, 대략 6 x 10⁸ 세포)를 배지 200 ml에서 재현탁할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 형질감염 전에 24시간 동안 부착되도록 한다. 세포 스택의 합류는 현미경 스테이지에서 세포 스택을 수용하기 위해 위상차 하드웨어가 제거된 Diaphot 도립 현미경(Nikon, Melville, NY)을 사용하여 모니터링할 수 있다.

특히, 따라서 본 발명은 이식유전자 카세트를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 생산 역가를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음으로 형질감염된 세포를 배양하는 것을 포함한다:

(1) rAAV;

(2) AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터로서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 대체하거나 그 외에 비-천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열을 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터; 및

(3) 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;

(1) rAAV; 및

(2) 다음을 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터:

(a) AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드로서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 대체하거나 그 외에 비-천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열을 포함하는, AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드; 및

(b) 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드;

배양은 rAAV의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 수행되고, 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열의 존재는, 세포가 상기 AAV 헬퍼 기능-제공 폴리뉴클레오티드가 천연 혈청형 P5 또는 P40 프로모터를 함유하는 경우에 달성되는 것에 비해 증가된 생산 역가로 rAAV를 생산하도록 한다.

바람직한 구현예에서, 이러한 rAAV의 이식유전자 카세트는 단백질을 인코딩하거나 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태에 대한 치료제인 전사된 핵산을 포함한다.

II. 본 발명의 약제학적 조성물

본 발명은 추가로 본 발명의 방법에 따라 생산된 rAAV의 약제학적으로 허용 가능한 제제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 이러한 약제학적 조성물의 rAAV는 유전성 또는 유전가능한 질환 또는 병태에 대한 치료제인, 전사된 핵산을 포함하거나, 또는 단백질을 인코딩하는 이식유전자 카세트를 포함하고, 이러한 약제학적 조성물에 유효한 양("유효량")으로 존재한다

"약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 동물, 및 보다 구체적으로 인간에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 치료제가 투여되는 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제 완전 및 불완전), 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 물과 같은 멸균 액체 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원을 포함하는 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내 투여될 때 물은 바람직한 담체이다. 식염수, 덱스트로스 및 글리세롤 수용액은 특히 주사용 용액의 경우 액체 담체로 사용할 수도 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 미국 특허 제8,852,607호; 제8,192,975호; 제6,764,845호; 제6,759,050호; 및 제7,598,070호에 기재되어 있다.

일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 개별적으로 또는 단위 복용 형태로 함께 혼합되어, 예를 들어 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서, 또는 바이알과 같은 용봉한 용기 내의 수용액, 활성제의 수량을 나타내는 앰플 또는 샤셰트로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약품 등급의 물 또는 식염수가 들어 있는 주입 병과 함께 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수, 또는 기타 희석제의 앰풀이 제공되어 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 이러한 약제학적 조성물과 같은 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)에는 제약회사 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 임의로 연관될 수 있으며, 이러한 통지서는 인간 투여를 위한 제조, 용도 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.

이러한 약제학적 조성물의 rAAV는 바람직하게는 분자의 양을 표시하고 임의로 사용 설명서를 포함하는 바이알, 앰플 또는 사셰트와 같은 용봉한 용기에 패키징된다. 한 구현예에서, 이러한 키트의 rAAV는 용봉한 용기에 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 예를 들어, 물, 식염수 또는 기타 희석제를 사용하여 대상체에 투여하기에 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 동결건조된 물질은 원래 용기에 넣어 2℃ 내지 8℃에서 보관해야 하며, 물질은 재구성 후 12시간 이내, 바람직하게는 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내 또는 1시간 이내 투여해야 한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키트의 rAAV는 용봉한 용기에 수용액으로서 공급되고, 예를 들어 물, 염수 또는 기타 희석제로 대상체에 투여하기에 적절한 농도로 희석될 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기에 질환 또는 병태의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 및/또는 치료제를 추가로 포함할 수 있고/있거나; 키트는 암과 연관된 하나 이상의 암 항원에 결합하는 하나 이상의 세포독성 항체를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화학요법제이다. 다른 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.

III. 발명의 용도

본 발명의 방법은 rAAV의 생산을 촉진하기 위해 사용될 수 있으며, 특히 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태와 관련이 있어, 그러한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 유전자 요법에 사용될 수 있는 전사된 핵산을 포함하는 rAAV 또는 단백질(예를 들어, 효소, 호르몬, 항체, 수용체, 리간드 등)을 인코딩하는 이식유전자 카세트를 포함하는 rAAV의 생산을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 질환 및 상태의 예는 다음을 포함한다: 색맹 (ACHM); 알파-1 항트립신 (AAT) 결핍; 알츠하이머병; 방향족 L-아미노산 탈탄산효소 (AADC) 결핍; 맥락막결손 (CHM); 암; 뒤센 근육 이상증; 다이스페린 결핍; 폴리스타틴 유전자 결핍 (BMDSIBM); A형 혈우병; B형 혈우병; A형 간염; B형 간염; C형 간염; 헌팅턴병; 특발성 파킨슨병; 후기 유아 신경 세로이드 지질갈색소증 (LINCL, 바텐병의 유아형); 베버(Leber) 선천성 흑내장 (LCA); 레버 선천성 시신경병증 (LHON); 팔다리 이음 근육 이상증 1B (LGMD1B); 팔다리 이음 근육 이상증 1C (LGMD1C); 팔다리 이음 근육 이상증 2A (LGMD2A); 팔다리 이음 근육 이상증 2B (LGMD2B); 팔다리 이음 근육 이상증 2I (LGMD2I); 팔다리 이음 근육 이상증 2L (LGMD2L); 지질단백질 리파제 (LPL) 결핍; 이염성 백질이상증; 신경적 장애; 신경운동 결손; 신경골격 손상; 파킨슨병; 류마티스성 관절염; 산필립포 A 증후군; 척추 근육 위축증 (SMA); X-연결된 망막층간분리증 (XLRS); α-사르코글리칸 결핍 (LGMD2D); β-사르코글리칸 결핍 (LGMD2E); γ-사르코글리칸 결핍 (LGMD2C) 및 δ-사르코글리칸 결핍 (LGMD2F).

IV. 본 발명의 구현예

본 발명은 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터, 및 그의 용도 및 조성물에 관한 것이다. 특히 하기 구현예 E1 내지 E16에 관한 것이다:

E1. AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터로서, 폴리뉴클레오타이드는 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열을 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.

E2. E1에 있어서, 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드 벡터는 비천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 서열을 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.

E3. E1 또는 E2 중 어느 하나의 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터로서, AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드 벡터는 비천연 AAV 혈청형 P40 프로모터 서열을 포함한다.

E4. E1 내지 E3 중 어느 하나에 있어서, 벡터는 플라스미드 벡터인, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.

E5. E1에 있어서, 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열은 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 대체하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.

E6. E1 내지 E5 중 어느 하나에 있어서, 벡터는 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.

E7. 이식유전자 카세트를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 생산 역가를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은,

(1) rAAV;

(2) E6의 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 것을 포함하고;

E8. 이식유전자 카세트를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 생산 역가를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은,

(1) rAAV;

(2) E1 내지 E6 중 어느 하나의 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터; 및

(3) 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 추가 벡터, 특히 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 것을 포함하고;

E9. E7-E8 중 어느 하나의 방법으로서,

(A) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV1 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;

(G) 벡터의 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV7 Cap 단백질을 인코딩하고, 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV8의 AAV, 또는 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이거나; 또는

E10. E7 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 세포는 인간 배아 신장 세포, 어린 햄스터 신장 세포 또는 sf9 곤충 세포인, 방법.

E11. E10에 있어서, 세포는 HEK293 인간 배아 신장 세포인, 방법.

E12. E10에 있어서, 세포는 BHK21 어린 햄스터 신장 세포인, 방법.

E13. E7 내지 E12 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자 카세트는 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태에 대한 치료제인, 전사된 핵산을 포함하거나 단백질을 인코딩하는, 방법.

E14. E13의 방법에 의해 생산된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 제제.

E15. E13의 방법에 의해 생산된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

E16. 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 E14의 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 제제, 또는 E15의 약제학적 조성물.

실시예

이제 본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 이는 하기 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 하기 실시예는 예시로서 제공되며, 특정되지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

비천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 서열을 갖는 AAV RC2 헬퍼 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포에 의한 rAAV 생산 역가의 비교

rAAV의 생산 역가에 영향을 미치는 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열의 능력을 입증하기 위해, 이러한 플라스미드 (도 12a; 하향 줄무늬 직사각형) 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터의 대신에 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열 (도 11)를 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC2 (AAV2 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 cap 유전자를 가짐)의 유도체가 작제되었다. 작제물의 P19 및 P40 프로모터는 변경되지 않았으므로 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열 둘다였다(도 12a; 실선 검은색 직사각형).

다음 작제물이 이용되었고; 프로모터 영역의 서열은 표 1에 나타낸다:

(1) 모체-RC2 - AAV2 rep 유전자 및 전체 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열 (서열번호:10)의 부분적 부분, 및 발현이 천연 AAV2 P40 프로모터 서열 (서열번호:18)에 의해 조절되는 AAV2 cap 유전자를 함유하는 pAAV-RC2 (서열번호:2);

(2) P5(1)-RC2 - 천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 1의 P5 프로모터 서열(서열번호:9)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(3) P5(2)-RC2 - 모체-RC2의 부분 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 2의 전장 P5 프로모터 서열(서열번호:10)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(4) P5(3)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 3의 P5 프로모터 서열(서열번호:11)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(5) P5(4)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 4의 P5 프로모터 서열(서열번호:12)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(6) P5(5)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 5의 P5 프로모터 서열(서열번호:13)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(7) P5(6)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 6의 P5 프로모터 서열(서열번호:14)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(8) P5(7)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 7의 P5 프로모터 서열(서열번호:15)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV-RC2의 유도체; 및

(9) P5(8)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 8의 P5 프로모터 서열(서열번호:16)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

도 12b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. rAAV의 생산 역가는 rAAV(pGOI; BBa_K404119) 및 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 Ad 헬퍼 플라스미드(pHelper)가 있는 삼중 플라스미드 형질감염 시스템을 사용하여 획득되었다. 플라스미드 pGOI는 5'에서 3' 방향으로 5' ITR, CMV 프로모터, β-글로빈 인트론, 황색 형광 단백질 mVenus를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 플라스미드 벡터이다(Nagai, T. 등 (2002) "A Variant Of Yellow Fluorescent Protein With Fast And Efficient Maturation For Cell-Biological Applications," Nat. Biotechnol. 20(1):87-90), 인간 성장 호르몬의 polyA 도메인 및 3' ITR을 포함하는 rAAV 플라스미드 벡터이다. 도 12b는, P5 프로모터의 혈청형이 rAAV 생산 역가에 영향을 미친다는 것을 나타내고, 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 천연 AAV2 P5 프로모터를 AAV5 혈청형 P5 프로모터로 대체하는 것이 rAAV 생산 역가를 크게 감소시킨 반면, 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 천연 AAV2 P5 프로모터를 AAV 혈청형 1, 3, 5, 7 또는 8의 P5 프로모터로 대체하는 것이 rAAV 생산 역가를 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 2

비천연 AAV 혈청형 P40 프로모터 서열을 갖는 AAV RC2 헬퍼 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포에 의한 rAAV 생산 역가의 비교

rAAV의 생산 역가에 영향을 미치는 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열의 능력을 추가로 입증하기 위해, 이러한 플라스미드 (도 13a; 상향 줄무늬 직사각형) 천연 혈청형 P40 프로모터의 대신에 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열 (도 11)를 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC2 (AAV2 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 cap 유전자를 가짐)의 유도체가 작제되었다. 작제물의 P5 및 P19 프로모터는 변경되지 않았으므로 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열 둘다였다(도 13a; 실선 검은색 직사각형).

(2) P40(1)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 1의 P40 프로모터 서열(서열번호:17)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(3) P40(2)-RC2 - 모체-RC2의 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 2의 P40 프로모터 서열(서열번호:18)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(4) P40(3)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 3의 P40 프로모터 서열(서열번호:19)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(5) P40(4)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 4의 P40 프로모터 서열(서열번호:20)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(6) P40(5)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 5의 P40 프로모터 서열(서열번호:21)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(7) P40(6)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 6의 P40 프로모터 서열(서열번호:22)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(8) P40(7)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 7의 P40 프로모터 서열(서열번호:23)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체; 및

(9) P40(8)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 8의 P40 프로모터 서열(서열번호:24)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

도 13b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. rAAV의 생산 역가는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다. 조사의 결과는 P40 프로모터의 혈청형이 rAAV 생산 역가에 영향을 미치고, 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 천연 AAV2 P40 프로모터를 AAV5 혈청형 P40 프로모터로 대체하는 것이 rAAV 생산 역가를 크게 감소시킨 반면, 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 천연 AAV2 P40 프로모터를 AAV1 혈청형 P40 프로모터로 대체하거나 AAV8 혈청형 P40 프로모터로 대체하는 것은 rAAV 생산 역가를 크게 증가시켰음을 나타낸다.

실시예 3

비천연 AAV 혈청형 P5 및 P40 프로모터 서열을 갖는 AAV RC2 헬퍼 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포에 의한 rAAV 생산 역가의 비교

rAAV의 생산 역가에 영향을 미치는 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열의 능력을 추가로 입증하기 위해, 이러한 플라스미드의 천연 AAV2 혈청형 P5 (도 14a; 하향 줄무늬 직사각형) 및 P40 (도 14a; 상향 줄무늬 직사각형) 프로모터 대신에 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열 (도 11)를 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC2 (AAV2 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 cap 유전자를 가짐)의 유도체가 작제되었다. 작제물의 AAV2 P19 프로모터는 변경되지 않았으므로 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열이었다(도 14a; 실선 검은색 직사각형).

(2) P5(2)-RC2 - 모체-RC2의 부분 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 2의 전장 P5 프로모터 서열(서열번호:10)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(3) P5(3)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV 혈청형 3의 P5 프로모터 서열(서열번호:11)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(4) P5(5)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV5의 P5 프로모터 서열(서열번호:13)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(5) P40(1)-RC2 - 천연 AAV2 혈청형 P40 프로모터 서열이 AAV 혈청형 1의 P40 프로모터 서열(서열번호:17)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(6) P5(2)/P40(1)-RC2 -천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열은 AAV2의 P5 프로모터 서열 (서열번호:10)로 대체되었고 천연 P40 프로모터 서열은 AAV1의 P40 프로모터 서열 (서열번호:17)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV-RC2의 유도체;

(7) P5(3)/P40(1)-RC2 -천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열은 AAV3의 P5 프로모터 서열 (서열번호:11)로 대체되었고 천연 P40 프로모터 서열은 AAV1의 P40 프로모터 서열 (서열번호:17)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV-RC2의 유도체; 및

(8) P5(5)/P40(1)-RC2 -천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열은 AAV5의 P5 프로모터 서열 (서열번호:13)로 대체되었고 천연 P40 프로모터 서열은 AAV1의 P40 프로모터 서열 (서열번호:17)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV-RC2의 유도체.

rAAV의 생산 역가는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다. 도 14b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. 도 14b에 나타낸 바와 같이, pAAV -RC2의 천연 P5 및 P40 프로모터를 AAV3 또는 AAV5의 P5 프로모터 서열 및 AAV1의 P40 프로모터 서열로 대체하는 것은 rAAV 생산 역가는 상승작용적으로 증가시켰다.

실시예 4

비천연 AAV 혈청형 P5 및 P40 프로모터 서열을 갖는 AAV RC6 헬퍼 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포에 의한 rAAV 생산 역가의 비교

rAAV의 생산 역가에 영향을 미치는 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열의 능력을 추가로 입증하기 위해, 이러한 플라스미드의 천연 AAV2 혈청형 P5 (도 15a; 하향 줄무늬 직사각형) 및 P40 (도 15a; 하향 줄무늬 직사각형) 프로모터 대신에 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열 (도 11)를 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC2 (AAV6 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 cap 유전자를 가짐)의 유도체가 작제되었다. 작제물의 AAV2 P19 프로모터는 변경되지 않았으므로 천연 AAV2 혈청형 프로모터 서열이었다(도 15a; 실선 검은색 직사각형).

(1) 모체-RC6 - AAV2 rep 유전자 및 그의 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열 (서열번호:10), 및 발현이 천연 AAV2 P40 프로모터 서열 (서열번호:18)에 의해 조절되는 AAV6 cap 유전자를 함유하는 pAAV-RC6 (서열번호:4);

(2) P5(1)-RC6 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV1의 P5 프로모터 서열(서열번호:9)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(3) P5(2)-RC6 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV2의 P5 프로모터 서열(서열번호:10)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(4) P5(3)-RC6 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV3의 P5 프로모터 서열(서열번호:11)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체;

(5) P5(7)-RC6 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV7의 P5 프로모터 서열(서열번호:15)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체; 및

(6) P5(8)-RC6 - 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV8의 P5 프로모터 서열(서열번호:16)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC2의 유도체.

도 15b는 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 수득한 rAAV의 생산 역가를 보여준다. rAAV의 생산 역가는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다.

조사 결과는 도 15b 및 15c에 나타나 있으며, 이러한 AAV 헬퍼 플라스미드 벡터를 사용하여 얻은 rAAV의 생산 역가를 나타낸다. 이러한 도면에 나타낸 바와 같이, pAAV-RC6의 천연 P5 및 P40 프로모터를 AAV 혈청형 1, 2, 3, 7 또는 8의 P5 프로모터 서열로 대체하는 것은 rAAV 생산 역가를 증가시켰다.

실시예 5

비천연 AAV 혈청형 P5 및 P40 프로모터 서열을 갖는 AAV RC1, AAV RC5 또는 AAV RC7 헬퍼 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포에 의한 rAAV 생산 역가의 비교

rAAV의 생산 역가에 영향을 미치는 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열의 능력을 추가로 입증하기 위해, 이러한 플라스미드의 천연 AAV2 혈청형 P5 (도 16a; 하향 줄무늬 직사각형) 및/또는 P40 (도 16a; 상향 줄무늬 직사각형) 프로모터 서열 대신에 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열 (도 11)을 포함하는 AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC1의 유도체 (AAV1 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 및 cap 유전자 를 가짐), AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC5의 유도체 (AAV5 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 및 cap 유전자 를 가짐) 및 AAV 헬퍼 플라스미드 AAV RC7의 유도체 (AAV7 혈청형의 Cap 단백질을 인코딩하는 AAV2 rep 유전자 및 cap 유전자 를 가짐)가 작제되었다.

(1) 모체-RC1 - AAV2 rep 유전자 및 그의 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열 (서열번호:10), 및 발현이 천연 AAV2 P40 프로모터 서열 (서열번호:18)에 의해 조절되는 AAV1 cap 유전자를 함유하는 pAAV-RC1 (서열번호:1);

(2) 모체-RC5 - AAV2 rep 유전자 및 그의 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열 (서열번호:10), 및 발현이 천연 AAV2 P40 프로모터 서열 (서열번호:18)에 의해 조절되는 AAV5 cap 유전자를 함유하는 pAAV-RC5 (서열번호:3);

(3) 모체-RC7 - AAV2 rep 유전자 및 그의 천연 AAV2 혈청형 P5 프로모터 서열 (서열번호:10), 및 발현이 천연 AAV2 P40 프로모터 서열 (서열번호:18)에 의해 조절되는 AAV7 cap 유전자를 함유하는 pAAV-RC7 (서열번호:5);

(4) P5(2)-RC1 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV2의 P5 프로모터 서열(서열번호:10)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC1의 유도체;

(5) P5(7)-RC1 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV7의 P5 프로모터 서열(서열번호:15)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC1의 유도체;

(6) P5(8)-RC1 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV8의 P5 프로모터 서열(서열번호:16)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC1의 유도체;

(7) P5(7)-RC5 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV7의 P5 프로모터 서열(서열번호:15)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC5의 유도체;

(8) P5(2)-RC7 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV2의 P5 프로모터 서열(서열번호:10)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC7의 유도체;

(9) P5(7)-RC7 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV7의 P5 프로모터 서열(서열번호:15)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV-RC7의 유도체; 및

(10) P5(8)-RC7 - 천연 AAV1 혈청형 P5 프로모터 서열이 AAV8의 P5 프로모터 서열(서열번호:16)로 대체된 플라스미드 벡터 pAAV -RC7의 유도체;

rAAV의 생산 역가는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다. 조사 결과는 도 16b에 나타나 있으며, pAAV -RC1, pAAV -RC5, 및 pAAV -RC7의 천연 P5 프로모터 서열을 AAV 혈청형 2, 7 또는 8의 P5 프로모터 서열로 대체하는 것은 rAAV 생산 역가를 증가시킨다는 것을 나타낸다.

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 본 발명을 그의 특정 구현예와 관련하여 기재하였지만, 본 발명은 추가의 변형이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르는 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적합화를 포함하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 공지되거나 통상적인 실시 내에 있고 상기 기재된 본질적인 특징에 적용될 수 있는 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈을 포함하는 것으로 의도됨을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Vigene Biosciences, Inc. Wang, Qizhao <120> Recombinantly-Modified Adeno-Associated Virus Helper Vectors and Their Use to Improve the Packaging Efficiency of Recombinantly-Modified Adeno-Associated Virus <130> 2650.0004US <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding Strand of Plasmid pAAV-RC1 <400> 1 catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg 60 cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg 120 aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca 180 gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct 240 cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca 300 gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc 360 caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg 420 gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca 480 aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga 540 ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt 600 ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa 660 aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa 720 catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga 780 gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat 840 gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga 900 ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc gtgatcgtca cctccaacac 960 caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc aacgaccttc gaacaccagc agccgttgca 1020 agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg ccgtctggat catgactttg ggaaggtcac 1080 caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg ggcaaaggat cacgtggttg aggtggagca 1140 tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagaccc gcccccagtg acgcagatat 1200 aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca tcgacgtcag acgcggaagc 1260 ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatct 1320 gatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag aatgaatcag aattcaaata tctgcttcac 1380 tcacggacag aaagactgtt tagagtgctt tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt 1440 cgtcaaaaag gcgtatcaga aactgtgcta cattcatcat atcatgggaa aggtgccaga 1500 cgcttgcact gcctgcgatc tggtcaatgt ggatttggat gactgcatct ttgaacaata 1560 aatgatttaa atcaggtatg gctgccgatg gttatcttcc agattggctc gaggacaacc 1620 tctctgaggg cattcgcgag tggtgggact tgaaacctgg agccccgaag cccaaagcca 1680 accagcaaaa gcaggacgac ggccggggtc tggtgcttcc tggctacaag tacctcggac 1740 ccttcaacgg actcgacaag ggggagcccg tcaacgcggc ggacgcagcg gccctcgagc 1800 acgacaaggc ctacgaccag cagctcaaag cgggtgacaa tccgtacctg cggtataacc 1860 acgccgacgc cgagtttcag gagcgtctgc aagaagatac gtcttttggg ggcaacctcg 1920 ggcgagcagt cttccaggcc aagaagcggg ttctcgaacc tctcggtctg gttgaggaag 1980 gcgctaagac ggctcctgga aagaaacgtc cggtagagca gtcgccacaa gagccagact 2040 cctcctcggg catcggcaag acaggccagc agcccgctaa aaagagactc aattttggtc 2100 agactggcga ctcagagtca gtccccgatc cacaacctct cggagaacct ccagcaaccc 2160 ccgctgctgt gggacctact acaatggctt caggcggtgg cgcaccaatg gcagacaata 2220 acgaaggcgc cgacggagtg ggtaatgcct caggaaattg gcattgcgat tccacatggc 2280 tgggcgacag agtcatcacc accagcaccc gcacctgggc cttgcccacc tacaataacc 2340 acctctacaa gcaaatctcc agtgcttcaa cgggggccag caacgacaac cactacttcg 2400 gctacagcac cccctggggg tattttgatt tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac 2460 gtgactggca gcgactcatc aacaacaatt ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca 2520 aactcttcaa catccaagtc aaggaggtca cgacgaatga tggcgtcaca accatcgcta 2580 ataaccttac cagcacggtt caagtcttct cggactcgga gtaccagctt ccgtacgtcc 2640 tcggctctgc gcaccagggc tgcctccctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattccgc 2700 aatacggcta cctgacgctc aacaatggca gccaagccgt gggacgttca tccttttact 2760 gcctggaata tttcccttct cagatgctga gaacgggcaa caactttacc ttcagctaca 2820 cctttgagga agtgcctttc cacagcagct acgcgcacag ccagagcctg gaccggctga 2880 tgaatcctct catcgaccaa tacctgtatt acctgaacag aactcaaaat cagtccggaa 2940 gtgcccaaaa caaggacttg ctgtttagcc gtgggtctcc agctggcatg tctgttcagc 3000 ccaaaaactg gctacctgga ccctgttatc ggcagcagcg cgtttctaaa acaaaaacag 3060 acaacaacaa cagcaatttt acctggactg gtgcttcaaa atataacctc aatgggcgtg 3120 aatccatcat caaccctggc actgctatgg cctcacacaa agacgacgaa gacaagttct 3180 ttcccatgag cggtgtcatg atttttggaa aagagagcgc cggagcttca aacactgcat 3240 tggacaatgt catgattaca gacgaagagg aaattaaagc cactaaccct gtggccaccg 3300 aaagatttgg gaccgtggca gtcaatttcc agagcagcag cacagaccct gcgaccggag 3360 atgtgcatgc tatgggagca ttacctggca tggtgtggca agatagagac gtgtacctgc 3420 agggtcccat ttgggccaaa attcctcaca cagatggaca ctttcacccg tctcctctta 3480 tgggcggctt tggactcaag aacccgcctc ctcagatcct catcaaaaac acgcctgttc 3540 ctgcgaatcc tccggcggag ttttcagcta caaagtttgc ttcattcatc acccaatact 3600 ccacaggaca agtgagtgtg gaaattgaat gggagctgca gaaagaaaac agcaagcgct 3660 ggaatcccga agtgcagtac acatccaatt atgcaaaatc tgccaacgtt gattttactg 3720 tggacaacaa tggactttat actgagcctc gccccattgg cacccgttac cttacccgtc 3780 ccctgtaagg cgcgccaccg gttgcttgtt aatcaataaa ccgtttaatt cgtttcagtt 3840 gaactttggt ctctgcgtat ttctttctta tctagtttcc atgctctagg atccactagt 3900 aacggccgcc agtgtgctgg aattcggctt tgtagttaat gattaacccg ccatgctact 3960 tatctacgta gccatgctct agaggtcctg tattagaggt cacgtgagtg ttttgcgaca 4020 ttttgcgaca ccatgtggtc acgctgggta tttaagcccg agtgagcacg cagggtctcc 4080 attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccaagccg aattctgcag atatccaaac 4140 actggcggcc gctcgactag agcggccgcc accgcggtgg agctccagct tttgttccct 4200 ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 4260 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 4320 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 4380 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 4440 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4500 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4560 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4620 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4680 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4740 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4800 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4860 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4920 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4980 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 5040 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 5100 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 5160 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5220 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5280 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5340 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5400 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 5460 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5520 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5580 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 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ggtcctgtat tagaggtcac gtgagtgttt tgcgacattt tgcgacacca tgtggtcacg 60 ctgggtattt aagcccgagt gagcacgcag ggtctccatt ttgaagcggg aggtttgaac 120 gcgcagccgc c 131 <210> 11 <211> 131 <212> DNA <213> adeno-associated virus 3 <220> <221> 'misc_feature <222> (1)..(131) <223> P5 Promoter of AAV3 <400> 11 ccagctgcgt cagcagtcag gtgacccttt tgcgacagtt tgcgacacca cgtggccgct 60 gagggtatat attctcgagt gagcgaacca ggagctccat tttgaccgcg aaatttgaac 120 gagcagcagc c 131 <210> 12 <211> 192 <212> DNA <213> adeno-associated virus 4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(192) <223> P5 Promoter of AAV4 <400> 12 ggtccctgta ttagcagtca cgtgagtgtc gtatttcgcg gagcgtagcg gagcgcatac 60 caagctgcca cgtcacagcc acgtggtccg tttgcgacag tttgcgacac catgtggtca 120 ggagggtata taaccgcgag tgagccagcg aggagctcca ttttgcccgc gaattttgaa 180 cgagcagcag cc 192 <210> 13 <211> 131 <212> DNA <213> adeno-associated virus 5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(131) <223> P5 Promoter of AAV5 <400> 13 atgtgatgtg ttttatccaa taggaagaaa gcgcgcgtat 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<211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV1 <400> 17 ggtgacaaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcg caggatcacg tgaccgaggt 60 ggcgcatgag ttctacgtca gaaagggtgg agccaacaaa agacccgccc ccgatgacgc 120 ggataaaagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180 <210> 18 <211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV2 <400> 18 ggtcaccaag caggaagtca aagacttttt ccggtgggca aaggatcacg tggttgaggt 60 ggagcatgaa ttctacgtca aaaagggtgg agccaagaaa agacccgccc ccagtgacgc 120 agatataagt gagcccaaac gggtgcgcga gtcagttgcg cagccatcga cgtcagacgc 180 <210> 19 <211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 3 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV3 <400> 19 ggtcaccaaa caggaagtaa aggacttttt ccggtgggct tccgatcacg tgactgacgt 60 ggctcatgag ttctacgtca gaaagggtgg agctaagaaa cgccccgcct ccaatgacgc 120 ggatgtaagc gagccaaaac gggagtgcac gtcacttgcg cagccgacaa cgtcagacgc 180 <210> 20 <211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 4 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV4 <400> 20 ggtcaccaag caggaagtca aagacttttt ccggtgggcg tcagatcacg tgaccgaggt 60 gactcacgag ttttacgtca gaaagggtgg agctagaaag aggcccgccc ccaatgacgc 120 agatataagt gagcccaagc gggcctgtcc gtcagttgcg cagccatcga cgtcagacgc 180 <210> 21 <211> 227 <212> DNA <213> adeno-associated virus 5 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(227) <223> P40 Promoter of AAV5 <400> 21 gattactaag caggaagtca aggacttttt tgcttgggca aaggtcaatc aggtgccggt 60 gactcacgag tttaaagttc ccagggaatt ggcgggaact aaaggggcgg agaaatctct 120 aaaacgccca ctgggtgacg tcaccaatac tagctataaa agtctggaga agcgggcctg 180 gagcatgagg ctctcatttg ttcccgagac gcctcgcagt tcagacg 227 <210> 22 <211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV6 <400> 22 ggtgacaaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcg caggatcacg tgaccgaggt 60 ggcgcatgag ttctacgtca gaaagggtgg agccaacaag agacccgccc ccgatgacgc 120 ggataaaagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180 <210> 23 <211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 7 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV7 <400> 23 ggtgacgaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcc agtgatcacg tgaccgaggt 60 ggcgcatgag ttctacgtca gaaagggcgg agccagcaaa agacccgccc ccgatgacgc 120 ggatataagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180 <210> 24 <211> 180 <212> DNA <213> adeno-associated virus 8 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(180) <223> P40 Promoter of AAV8 <400> 24 ggtgacaaag caggaagtca aagagttctt ccgctgggcc agtgatcacg tgaccgaggt 60 ggcgcatgag ttttacgtca gaaagggcgg agccagcaaa agacccgccc ccgatgacgc 120 ggataaaagc gagcccaagc gggcctgccc ctcagtcgcg gatccatcga cgtcagacgc 180

Claims

AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열을 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.
제1항에 있어서, 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드 벡터는 비천연 AAV 혈청형 P5 프로모터 서열을 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.
제1항에 있어서, 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드 벡터는 비천연 AAV 혈청형 P40 프로모터 서열을 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터인, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.
제1항에 있어서, 상기 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열은 천연 AAV 혈청형 프로모터 서열을 대체하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터.
이식유전자 카세트를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 생산 역가를 증가시키는 방법으로서,
(1) 상기 rAAV; 및
(2) 제6항의 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 것을 포함하고;
상기 배양은 상기 rAAV의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 수행되고, 상기 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열의 존재는, 상기 세포가 상기 AAV 헬퍼 기능-제공 폴리뉴클레오티드가 천연 혈청형 P5 및 P40 프로모터를 함유하는 경우에 달성되는 것에 비해 증가된 생산 역가로 상기 rAAV를 생산하도록 하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 이식유전자 카세트는 단백질을 인코딩하거나, 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태에 대한 치료제인 전사된 핵산을 포함하는, 방법.
제7항에 있어서,
(A) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV1 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(B) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV2 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(C) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV3 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(D) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV4 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(E) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV5 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(F) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV6 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(G) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV7 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이거나; 또는
(H) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV8 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV7의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열인, 방법
제7항에 있어서, 상기 세포는 인간 배아 신장 세포, 어린 햄스터 신장 세포 또는 sf9 곤충 세포인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 인간 배아 신장 세포인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 세포는 BHK21 어린 햄스터 신장 세포인, 방법.
이식유전자 카세트를 포함하는 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV)의 생산 역가를 증가시키는 방법으로서,
(1) 상기 rAAV;
(2) 제1항의 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(AAV) 헬퍼 벡터; 및
(3) 비-AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오티드를 포함하는 추가 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 것을 포함하고;
상기 배양은 상기 rAAV의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 수행되고, 상기 비천연 AAV 혈청형 P5 또는 P40 프로모터 서열의 존재는, 상기 세포가 상기 AAV 헬퍼 기능-제공 폴리뉴클레오티드가 천연 혈청형 P5 및 P40 프로모터를 함유하는 경우에 달성되는 것에 비해 증가된 생산 역가로 상기 rAAV를 생산하도록 하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 이식유전자 카세트는 단백질을 인코딩하거나, 유전적 또는 유전 가능한 질환 또는 병태에 대한 치료제인 전사된 핵산을 포함하는, 방법.
제13항에 있어서,
(A) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV1 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(B) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV2 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(C) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV3 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(D) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV4 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(E) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV5 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV6, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(F) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV6 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이고;
(G) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV7 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV8의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열이거나; 또는
(H) 상기 벡터의 상기 AAV 헬퍼 기능 제공 폴리뉴클레오타이드는 AAV8 Cap 단백질을 인코딩하고, 상기 비천연 AAV 혈청형 프로모터 서열은 혈청형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 또는 AAV7의 AAV, 또는 상기 혈청형 중 하나 이상의 하이브리드의 프로모터 서열인, 방법
제13항에 있어서, 상기 세포는 인간 배아 신장 세포, 어린 햄스터 신장 세포 또는 sf9 곤충 세포인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 인간 배아 신장 세포인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포는 BHK21 어린 햄스터 신장 세포인, 방법.
제6항의 방법에 의해 생산된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제13항의 방법에 의해 생산된 재조합으로 변형된 아데노 연관 바이러스(rAAV) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.