JP2022542828A

JP2022542828A - 組換え修飾アデノ随伴ウイルスのパッケージング効率を改善するための組換え修飾アデノ随伴ウイルスヘルパーベクターおよびそれらの使用

Info

Publication number: JP2022542828A
Application number: JP2022502941A
Authority: JP
Inventors: ワング，チィツァオ
Original assignee: チャールズ・リバー・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2022-10-07
Also published as: EP3999625A1; US11001859B2; AU2020315770A1; KR20220034212A; CN114450393A; US10557149B1; US20210017538A1; EP3999625A4; US20220290178A1; WO2021011029A1

Abstract

本発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージング効率を高めることができる組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、およびそのようなｒＡＡＶのパッケージング効率を改善するためのそれらの使用に関する。本発明は、特に、そのようなｒＡＡＶによってコードされるＲｅｐタンパク質と天然に会合するＰ５および／またはＰ４０プロモーター配列を、異なる血清型のｒＡＡＶのＲｅｐタンパク質と会合するＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターと置換（または増強）するようにさらに改変された組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターに関する。このような代替または追加のプロモーター配列の使用は、組換え修飾アデノ随伴ウイルスの産生増加を引き起こす。【選択図】図１

Description

本発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージング効率を高めることができる組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、およびそのようなｒＡＡＶのパッケージング効率を改善するためのそれらの使用に関する。本発明は、特に、そのようなｒＡＡＶによってコードされるＲｅｐタンパク質と天然に会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）するＰ５および／またはＰ４０プロモーター配列を、異なる血清型のｒＡＡＶのＲｅｐタンパク質と会合するＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターと置換（または増強）するようにさらに改変された組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターに関する。このような代替または追加のプロモーター配列の使用は、組換え修飾アデノ随伴ウイルスの産生増加を引き起こす。
配列表の参照

本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１以下に従った一以上の配列一覧を含み、この配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：２６５０－０００４ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（２０１９年７月１５日作成、サイズ８４，１０１バイト））に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

Ｉ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅのＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する小型の自然発生非病原性ウイルスである（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．他（２０１４）“ＢａｓｉｃＢｉｏｌｏｇｙｏｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＶｅｃｔｏｒｓＵｓｅｄｉｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１４（２）：８６－１００；Ｚｉｎｎ，Ｅ．他（２０１４）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＦｉｔＴｏＳｅｒｖｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．０：９０－９７）。疾患を引き起こさないにもかかわらず、ＡＡＶはヒトおよび他の霊長類に感染し、ヒト集団で流行することが知られる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｂ．他（１９７２）“ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡｎｔｉｓｅｒａＰｒｅｐａｒｅｄＡｇａｉｎｓｔｔｈｅＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ－ＴｒｅａｔｅｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９（６）：１０１７－１０２６）。ＡＡＶは広範囲の異なる細胞型（例えば、中枢神経系、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、網膜色素上皮の細胞、または光受容細胞、または骨格筋細胞）に感染する。異なる組織感染能（「トロピズム」）を示すウイルスの１２の血清型（例：ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６など）が同定されている（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｓｓｕｅｓｉｎＡＡＶ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｎＶｉｖｏＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ－ＢａｓｅｄＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣＮＳＤｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＳｅｒｏｔｙｐｅｓＦｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”２４：５９－６７）。

ＡＡＶは約４，８００ヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を一緒に含む５’ハーフおよび３’ハーフを有するものとして記載することができる（図１）。ＡＡＶゲノムの５’ハーフはＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含み、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、複数のリーディングフレーム、スタガード開始プロモーター（Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０）、および選択的スプライシングを用いて、ウイルスの転写制御および複製、ならびにウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要な４つの非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、およびＲｅｐ７８）をコードする（Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．他（２００２）“ＳｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｐ１９ＰｒｏｍｏｔｅｒｂｙＲｅｐＰｒｏｔｅｉｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１６）：８２２５－８２３５）。ウイルスタンパク質（Ａｄタンパク質など）の存在下では、Ｐ５プロモーターが活性化され、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８タンパク質の転写を媒介する。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８タンパク質は、転写制御、潜伏、レスキュー、およびウイルスＤＮＡ複製に関与し、したがってＡＡＶライフサイクルの主要制御として機能する（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．他（２００７）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＴｙｐｅ２ｐ５Ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ａＲｅｐ－ＲｅｇｕｌａｔｅｄＤＮＡＳｗｉｔｃｈＥｌｅｍｅｎｔＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇｉｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄＳｉｔｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１（８）：３７２１－３７３０）。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８タンパク質の発現は、Ｒｅｐ４０およびＲｅｐ５２タンパク質の転写に関与するＰ１９プロモーターを活性化する（Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．他（２００２）“ＳｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｐ１９ＰｒｏｍｏｔｅｒｂｙＲｅｐＰｒｏｔｅｉｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１６）：８２２５－８２３５；Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｙ．他（１９９８）“ＴｈｅＵｓｅｏｆＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＰｒｏｍｏｔｅｒｓｆｏｒＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＡＡＶＶｅｃｔｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２（３）：１７７－１８５）。
ＡＡＶゲノムの３’ハーフは、ＶＰ１，ＶＰ２，ＶＰ３の３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ）をコードするＡＡＶキャプシド遺伝子（ｃａｐ）を含む。３つのキャプシドタンパク質は、単一のプロモーター（ＡＡＶ２の場合はＰ４０）によって制御される単一のｍＲＮＡ転写産物から翻訳される。ＡＡＶゲノムの３’ハーフは、また、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするＡＡＰ遺伝子を含む。６０個のＶＰモノマー（約５コピーのＶＰ１、５コピーのＶＰ２、および５０コピーのＶＰ３を含む）がＡＡＶゲノムの周囲で自己集合し、成熟ウイルス粒子の正二十面体のタンパク質の殻（キャプシド）を形成する（Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“ＣａｐｓｉｄＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；ＶａｎＶｌｉｅｔＫ．Ｍ．他（２００８）ＴｈｅＲｏｌｅｏｆｔｈｅＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＣａｐｓｉｄｉｎＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ：ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｉｎ，Ｋ．Ｋ．（編集），Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４３７：５１－９１）．ＡＡＶＡＡＰタンパク質は、新たに産生されたＶＰタンパク質を安定化し、細胞質から細胞核へ輸送するために必要であると考えられている。ＡＡＶゲノムの３’ハーフは、また、ゲノム複製をサポートするタンパク質をコードすると考えられているＡＡＶＸ遺伝子を含む（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｓｓｕｅｓｉｎＡＡＶ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｎＶｉｖｏＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“ＣａｐｓｉｄＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｃａｏ，Ｍ．他（２０１４）“ＴｈｅＸＧｅｎｅＯｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ２（ＡＡＶ２）ＩｓＩｎｖｏｌｖｅｄＩｎＶｉｒａｌＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＬｏＳＯＮＥ９，ｅ１０４５９６：１－１０）。

上述のＡＡＶ遺伝子コード配列は、１４５ヌクレオチドの二つのＡＡＶ特異的回文逆末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．他（２０１４）“ＢａｓｉｃＢｉｏｌｏｇｙｏｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＶｅｃｔｏｒｓＵｓｅｄｉｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１４（２）：８６－１００；Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｓｓｕｅｓｉｎＡＡＶ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｎＶｉｖｏＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４）。

ＡＡＶは本質的に欠陥のあるウイルスであり、少なくとも２つの重要な機能を果たす能力を欠いている：すなわち、ウイルス特異的産物の合成を開始する能力と、そのような産物を集めて成熟した感染性ウイルス粒子の正二十面体のタンパク質の殻（キャプシド）を形成する能力である。したがって、ＡＡＶゲノムの遺伝子によってコードされていないウイルス随伴（ＶＡ）ＲＮＡを提供するために、アデノウイルス（Ａｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルスまたはヒトパピローマウイルスのような、同時感染する「ヘルパー」ウイルスを必要とする。このようなＶＡＲＮＡは翻訳されないが、他のウイルス遺伝子の翻訳を調節する役割を果たす。同様に、ＡＡＶゲノムはウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、およびＥ４をコードする遺伝子を含まない；したがって、これらのタンパク質は、また、同時に感染する「ヘルパー」ウイルスによって供給されなければならない。Ｅ１ａタンパク質は増殖性感染中のウイルス遺伝子転写を大きく刺激する。Ｅ１ｂタンパク質はアデノウイルス感染細胞のアポトーシスを阻止し、増殖性感染を進行させる。Ｅ２ａタンパク質は、鋳型をほどいて転写開始を促進することにより、ウイルス鎖置換複製の伸長の段階において役割を果たす。Ｅ４タンパク質は、導入遺伝子の持続性、ベクター毒性、および免疫原性に影響を及ぼすことが示されている（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．他（１９９２）“ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥ１ＡＴａｒｇｅｔｓＫｅｙＲｅｇｕｌａｔｏｒｓＯｆＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃ．Ｓｕｒｖ．１２：１６１－１９５；ＪｏｎｅｓＮ．Ｃ．（１９９０）“ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＢｙＴｈｅＨｕｍａｎＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，”Ｓｅｍｉｎ．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌ．１（６）：４２５－４３５；Ｂｅｎ－Ｉｓｒａｅｌ，Ｈ．他（２００２）“ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｎｄＣｅｌｌＣｙｃｌｅＣｏｎｔｒｏｌ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１３６９－ｄ１３９５；Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．他（２０１３）“ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：ａ０１３００３（１－１１ページ）；Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．（２０１３）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：ＴｈｅＶｉｒｕｓｅｓＡｎｄＴｈｅｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ：ＦＩＥＬＤＳＶＩＲＯＬＯＧＹ，６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．他編集．），Ｖｏｌ．２．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７０４－１７３１ページ；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００５）“ＦｕｎｃｔｉｏｎｓＯｆＴｈｅＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥ４ＰｒｏｔｅｉｎｓＡｎｄＴｈｅｉｒＩｍｐａｃｔＯｎＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：１１０６－１１１７参照のこと）。

ＡＡＶウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、環状エピソーム分子として存続するか、または特定の染色体座（アデノ随伴ウイルス組込み部位またはＡＡＶＳ）において宿主細胞のＤＮＡに組み込まれる。（Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１６）“ＳｙｓｔｅｍｉｃＤｅｌｉｖｅｒｙＯｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：１６－２５；Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４）。ＡＡＶの複製と成熟に必要な機能を果たすヘルパーウイルスが存在しない限り、ＡＡＶは感染細胞内に潜伏したままである。
ＩＩ．遺伝子治療におけるｒＡＡＶとその利用

ＡＡＶの特性に照らして、組換え改変されたバージョンのＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療用ベクターとして実質的な有用性を見出している（Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．他（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ａｓａＶｅｃｔｏｒｆｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＤｒｕｇｓ３１：３１７－３３４；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．他（２０１７）“ＡＡＶ：ＡｎＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆＵｎａｎｓｗｅｒｅｄＱｕｅｓｔｉｏｎｓ，”ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．２８（４）：３０８－３１３；Ｂｅｒｒｙ，Ｇ．Ｅ．他（２０１６）“ＣｅｌｌｕｌａｒＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍｓＯｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：５４－６０；Ｂｌｅｓｓｉｎｇ，Ｄ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＡｎｄＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＲｅｆｉｎｅｄＴｏｏｌｋｉｔＦｏｒＴｈｅＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍ，”２１：６１－６６；Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚ，Ｊ．Ｌ．（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＶｅｃｔｏｒｓｉｎＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ２４０：２８７－３０１；Ｓａｌｇａｎｉｋ，Ｍ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＡｓＡＭａｍｍａｌｉａｎＤＮＡＶｅｃｔｏｒ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒ．３（４）：１－３２；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ－ＢａｓｅｄＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣＮＳＤｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｙｋｋｅｎ，Ｅ．Ａ．他（２０１８）“ＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇｒｅｓｓＡｎｄＣｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓＦｏｒＡＡＶＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｉｅｓＴａｒｇｅｔｉｎｇＴｈｅＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐ．Ｄｉｓ．１０：１６：１－１０；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“ＣａｐｓｉｄＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．他（１９９８）“ＩｎＶｉｖｏＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＨｕｍａｎＧｅｎｅｓＦｏｒＤｏｐａｍｉｎｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＩｎＴｈｅＣａｕｄａｔｅｓＯｆＭＰＴＰ－ＴｒｅａｔｅｄＭｏｎｋｅｙｓＵｓｉｎｇＡｎＡＡＶＶｅｃｔｏｒ，”ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：８２０－８２７；Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．他（２０１４）“ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｅｓＦｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５（７）：４４５－４５１；Ｋｗｏｎ，Ｉ．他（２００７）“ＤｅｓｉｇｎｅｒＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙＶｅｃｔｏｒｓ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＥｎｈａｎｃｅｄＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５（３）：４８９－４９９；米国特許第１０，２６６，８４５号；１０，０８１，６５９号；米国特許第９，８９０，３９６号；米国特許第９，８４０，７１９号；米国特許第９，８３９，６９６号；米国特許第９，８３４，７８９号；米国特許第９，８０３，２１８号；米国特許第９，７８３，８２５号；米国特許第９，７７７，２９１号；米国特許第９，５４０，６５９号；米国特許第９，５２７，９０４号；米国特許第８，２３６，５５７号；米国特許第７，９７２，５９３号および米国特許第７，９４３，３７４号参照のこと）。

ｒＡＡＶは、典型的には環状プラスミド（「ｒＡＡＶプラスミドベクター」）を用いて産生される。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、典型的には、そのような構築物から欠失され、プロモーター、βグロビンイントロン、選択された治療用遺伝子（導入遺伝子）が挿入されたクローニング部位、およびポリアデニル化（「ｐｏｌｙＡ」）部位で置換される。しかし、ｒＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は保持されるので、ｒＡＡＶプラスミドベクターの導入遺伝子発現カセットはＡＡＶＩＴＲ配列によって挟まれる（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｓｓｕｅｓｉｎＡＡＶ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｎＶｉｖｏＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“ＣａｐｓｉｄＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５）。したがって、５’から３’方向に、ｒＡＡＶは、５’ＩＴＲ、ｒＡＡＶの導入遺伝子発現カセット、および３’ＩＴＲを含む。

ｒＡＡＶは、多数の遺伝性疾患（例えば、遺伝性リポ蛋白リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素欠損症（ＡＡＤＣ）、脈絡膜血症、血友病）のいずれかに罹患している患者に導入遺伝子を送達するために使用されており、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）療法およびＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９などの遺伝子改変戦略などの新しい臨床的方法において有用である（米国特許第８，６９７，３５９号，米国特許第１０，０００，７７２号，米国特許第１０，１１３，１６７号，米国特許第１０，２２７，６１１号；Ｌｉｎｏ，Ｃ．Ａ．他（２０１８）“ＤｅｌｉｖｅｒｉｎｇＣＲＩＳＰＲ：ＡＲｅｖｉｅｗＯｆＴｈｅＣｈａｌｌｅｎｇｅｓＡｎｄＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ，”ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．２５（１）：１２３４－１２３７；Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｖ．他（２０１４）“ＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅｓＴｏＡＡＶ－Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＴｈｅＧｌｙｂｅｒａＥｘａｍｐｌｅＦｒｏｍＢｅｎｃｈＴｏＢｅｄｓｉｄｅ”Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（８２）：１－１５），Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“ＣａｐｓｉｄＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｒａｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｐ．Ｗ．（２０１７）“ＣｕｒｒｅｎｔａｎｄＦｕｔｕｒｅＴｒｅａｔｍｅｎｔｓｆｏｒＬｙｓｏｓｏｍａｌＳｔｏｒａｇｅＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，”Ｃｕｒｒ．ＴｒｅａｔＯｐｔｉｏｎｓＮｅｕｒｏｌ．１９（１２）：４５；Ｋａｙ，Ｍ．他（２０１７）“ＦｕｔｕｒｅＯｆｒＡＡＶＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ：ＰｌａｔｆｏｒｍＦｏｒＲＮＡｉ，ＧｅｎｅＥｄｉｔｉｎｇＡｎｄＢｅｙｏｎｄ，”ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．２８：３６１－３７２）；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．他（２０１７）“ＡＡＶ：ＡｎＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆＵｎａｎｓｗｅｒｅｄＱｕｅｓｔｉｏｎｓ，”ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．２８（４）：３０８－３１３）。ｒＡＡＶに関与する１５０以上の臨床試験が開始されている（Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“ＣａｐｓｉｄＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｄＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅＥｆｆｉｃａｃｙｏｆＡＡＶＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．他（２０１６）“ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＯｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１６００２：１－７）。このような組換え改変ＡＡＶに最も一般的に使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ２であり、中枢神経系、腎臓、網膜色素上皮および光受容体細胞の細胞に感染することができる。ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、筋細胞に感染し、また広く使用される（Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１６）“ＳｙｓｔｅｍｉｃＤｅｌｉｖｅｒｙＯｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：１６－２５）。ＡＡＶ血清型は以下に記載される：米国特許第１０，３０１，６５０号；米国特許第１０，２６６，８４６号；米国特許第１０，２６５，４１７号；米国特許第１０，２１４，７８５号；米国特許第１０，２１４，５６６号；米国特許第１０，２０２，６５７号；米国特許第１０，０４６，０１６号；米国特許第９，８８４，０７１号；米国特許第９，８５６，５３９号；米国特許第９，７３７，６１８号；米国特許第９，６７７，０８９号；米国特許第９，４５８，５１７号；米国特許第９，４５７，１０３号；米国特許第９，４４１，２４４号；米国特許第９，１９３，９５６号；米国特許第８，８４６，３８９号；米国特許第８，５０７，２６７号；米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，４７９，５５４号；米国特許第７，１８６，５５２号；米国特許第７，１０５，３４５号；米国特許第６，９８４，５１７号；米国特許第６，９６２，８１５号；および，米国特許７３３，７５７号。
ＩＩＩ．ｒＡＡＶ製造の方法

所望の導入遺伝子発現カセットを含むｒＡＡＶは、典型的には、懸濁で増殖させたヒト細胞（ＨＥＫ２９３など）によって産生される。上述したように、ｒＡＡＶは欠陥ウイルスであるため、ｒＡＡＶを複製してパッケージングするためには、さらなる機能が提供されなければならない。

ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶプラスミドベクターおよび第２のプラスミドベクターで細胞を一過性にトランスフェクトすることによって産生され得る。第２のプラスミドベクターはＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む。ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ベクター転写制御および複製に、そしてウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要なＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８遺伝子（Ｒｅｐ４０およびＲｅｐ６８やｒＡＡＶの産生には必要とされない）、ならびにｒＡＡＶを産生するためにＡＡＶから削除されたｃａｐ遺伝子を提供する。第２のプラスミドベクターは、さらに、ＡＡＶ増殖に必要なウイルス転写因子および翻訳因子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）をコードする非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含むことができ、それにより、ｒＡＡＶと協調して、ダブルプラスミドトランスフェクションシステムを含み得る（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．他（１９９８）“ＮｏｖｅｌＴｏｏｌｓＦｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＡｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＯｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：２７４５－２７６０；Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．他（２０１８）“ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：１６６－１８０）。

しかし、（必要とされるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供する）ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを「ＡＡＶヘルパープラスミド」にクローニングし、（ウイルスの転写因子と翻訳因子をコードする遺伝子を提供する）非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを異なるプラスミド（すなわち、「Ａｄヘルパープラスミド」）上にクローニングすることは、ますます一般的になってきており、そのようなプラスミドは、ｒＡＡＶプラスミドベクターと協働して、トリプルプラスミドトランスフェクションシステムを含む（図２）。トリプルプラスミドトランスフェクションシステムの使用は、１つのｃａｐ遺伝子を別のｃａｐ遺伝子に容易に切り替えることができ、それによってｒＡＡＶの血清型の変化を容易にするという利点を有する。ヘルパーウイルスではなくヘルパープラスミドを用いることにより、ヘルパーウイルスの粒子をさらに産生することなく、ｒＡＡＶを産生することができる（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“ＡｃｃｕｒａｔｅＴｉｔｒａｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡＡＶＰａｒｔｉｃｌｅｓＲｅｑｕｉｒｅｓＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＶｅｃｔｏｒＧｅｎｏｍｅｓａｎｄＳｕｉｔａｂｌｅＣｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．他（１９９８）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓＣａｎＢｅＥｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙＰｒｏｄｕｃｅｄＷｉｔｈｏｕｔＨｅｌｐｅｒＶｉｒｕｓ，”ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：９３８－９４５）。

ｒＡＡＶプラスミドベクター、ＡＡＶヘルパー機能ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供するプラスミドベクター、ならびに非ＡＡＶヘルパー機能を提供するプラスミドベクターを含むプラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム共沈によるＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションは、研究室でｒＡＡＶを産生するための標準的な方法となっている（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．他（１９９８）“ＮｏｖｅｌＴｏｏｌｓＦｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＡｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＯｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：２７４５－２７６０）。しかし、このようなリン酸カルシウムを介したトランスフェクション過程を懸濁培養されたトランスフェクトされた哺乳動物細胞で使用するには、培地交換が必要であり、したがって、治療用量のｒＡＡＶを産生するために必要とされる大規模なｒＡＡＶ産生には理想的ではないと考えられる（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄＶｅｒｓａｔｉｌｅＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓａｔＳｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。この理由ため、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が使用され、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて得られたものと類似のウイルスの収率を提供することが見出されている（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．他（２００７）“ＳｃａｌａｂｌｅＳｅｒｕｍ－ＦｒｅｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＯｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＴｙｐｅ２ＢｙＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＯｆ２９３ＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎＣｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４４：３２－４０）。

あるいは、バキュロウイルスベクター（例えば、米国特許第９，８７９，２８２号；米国特許第９，８７９，２７９号；米国特許第８，９４５，９１８号；米国特許第８，１６３，５４３号；米国特許第７，２７１，００２号；米国特許第６，７２３，５５１号を参照のこと）を用いて昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）、または、ＨＳＶ感染ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えばＢＨＫ２１）でｒＡＡＶを産生することができる（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“ＡｃｃｕｒａｔｅＴｉｔｒａｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡＡＶＰａｒｔｉｃｌｅｓＲｅｑｕｉｒｅｓＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＶｅｃｔｏｒＧｅｎｏｍｅｓａｎｄＳｕｉｔａｂｌｅＣｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）。ｒＡＡＶの産生の方法はＧｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４，ａｎｄｉｎＰｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．他（２０１８）“ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：１６６－１８０でレビューされる。
ＩＶ．ｒＡＡＶの精製および回収方法

産生後、ｒＡＡＶは、典型的には、１回以上、オーバーナイトのＣｓＣｌ勾配遠心分離によって収集および精製され（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．他（１９９９）“ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＮｏｖｅｌＭｅｔｈｏｄｓＩｍｐｒｏｖｅｓＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＴｉｔｅｒＡｎｄＹｉｅｌｄ，”ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：９７３－９８５）、次いで脱塩によって精製されたｒＡＡＶ産生ストックを形成する。１０^１２～１０^１３の感染性ｒＡＡＶキャプシド／ｍＬの力価が得られる。

ｒＡＡＶ感染は細胞変性効果を引き起こさないためｒＡＡＶ製剤の感染力価を測定するために、プラークアッセイは使用できない。したがって、感染力価は典型的には組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）として測定される。この方法では、ＨｅＬａ由来ＡＡＶ２ｒｅｐおよびｃａｐ発現細胞株を９６ウェルプレート中で増殖させ、血清型５のアデノウイルスの存在下で、ｒＡＡＶ調製物の複製１０倍連続希釈液で感染させる。感染後、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によりベクターゲノム複製を決定する（Ｚｅｎ，Ｚ．他（２００４）“ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＴｉｔｅｒＡｓｓａｙＦｏｒＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓＷｉｔｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｆｆｉｃｉｅｎｔＴｏＤｅｔｅｃｔＳｉｎｇｌｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＥｖｅｎｔｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１５：７０９－７１５）。あるいは、調製ｒＡＡＶの感染力価は、感染中枢アッセイ（ＩＣＡ）を用いて測定することができる。このアッセイは、ＨｅＬａｒｅｐ－ｃａｐ細胞およびＡｄを使用するが、インキュベーション後、細胞を膜に移すことを含む。使用される導入遺伝子の一部に相補的な標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーションを介して（個々の感染細胞を表す）感染中心を検出する。より広く使用されるが、ＴＣＩＤ５０アッセイは、ＩＣＡよりも高いバックグラウンドを導き、ＩＣＡと比較してベクター感染性を過大評価することが報告されている（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“ＡｃｃｕｒａｔｅＴｉｔｒａｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡＡＶＰａｒｔｉｃｌｅｓＲｅｑｕｉｒｅｓＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＶｅｃｔｏｒＧｅｎｏｍｅｓａｎｄＳｕｉｔａｂｌｅＣｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）。ｒＡＡＶを産生および精製する方法は、特に米国特許第１０，２９４，４５２号；米国特許第１０，１６１，０１１号；米国特許第１０，０１７，７４６号；米国特許第９，５９８，７０３号；米国特許第７，６２５，５７０号；米国特許第７，４３９，０６５号；米国特許第７，４１９，８１７号；米国特許第７，２０８，３１５号；米国特許第６，９９５，００６号；米国特許第６，９８９，２６４号；米国特許第６，８４６，６６５号；および米国特許第６，８４１，３５７に記載される。

しかし、このような以前のすべての成功にもかかわらず、遺伝子治療へのｒＡＡＶの適用性を現在制限している問題に取り組むことができる方法を開発する必要が残っている（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．他（２０１４）“ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｅｓＦｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５（７）：４４５－４５１；Ｋｗｏｎ，Ｉ．他（２００７）“ＤｅｓｉｇｎｅｒＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙＶｅｃｔｏｒｓ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＥｎｈａｎｃｅｄＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５（３）：４８９－４９９；Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．他（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ａｓａＶｅｃｔｏｒｆｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＤｒｕｇｓ３１：３１７－３３４）。

本発明は、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現の調節を介してＡＡＶおよびｒＡＡＶパッケージングの効率を増加させるための改善された方法に関する。

本発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージング効率を高めることができる組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、およびそのようなｒＡＡＶのパッケージング効率を改善するためのそれらの使用に関する。本発明は、特に、そのようなｒＡＡＶによってコードされるＲｅｐタンパク質と天然に会合するＰ５および／またはＰ４０プロモーター配列を、異なる血清型のｒＡＡＶのＲｅｐタンパク質と会合するＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターと置換（または増強）するようにさらに改変された組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターに関する。このような代替または追加のプロモーター配列の使用は、組換え修飾アデノ随伴ウイルスの産生増加を引き起こす。

詳細には、本発明は、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド、特にプラスミドベクターであるＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターを提供し、ここで該ポリヌクレオチドは、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列を含む。

本発明は、特に、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターの実施形態を含み、ここで、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドベクターは、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター配列および／または非天然ＡＡＶ血清型Ｐ４０プロモーター配列を含む。

本発明はまた、特に、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターの実施形態を含み、ここで、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列が天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を置換する。

本発明はまた、特に、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターの態様を含み、該ベクターは、さらに非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む。

本発明はさらに、導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法を提供し、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）ｒＡＡＶ；
（２）上述の、さらに非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター；
培養は、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、前記ｒＡＡＶの産生を引き起こす。

本発明はさらに、導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法を提供し、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）ｒＡＡＶ；
（２）上述の、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターのいずれか；および
（３）さらなるベクター、特に、非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチを含む、プラスミドベクター；
培養は、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、前記ｒＡＡＶの産生を引き起こす。

本発明は特に、そのような方法の実施形態を含み、前記導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である。

本発明はまた、特に、そのような方法の実施形態を含み、
（Ａ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ１Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｂ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ２Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｃ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ３Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｄ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ４Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｅ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ５Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｆ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ６Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｇ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ７Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；または
（Ｈ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ７、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である。

本発明はまた、特に、そのような方法の実施形態を含み、細胞がヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞またはｓｆ９昆虫細胞である。

本発明はさらに、上述の方法のいずれかによって産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、および、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

図１は野生型（Ｗｔ）ＡＡＶゲノムの概略的な遺伝子の地図を提供する。図２は、野生型ＡＡＶ２ゲノム（１）、組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（２）、補足する「ＡＡＶヘルパープラスミド」（３）、およびアデノウイルスヘルパープラスミド（「Ａｄヘルパープラスミド」）（４）の構造ドメインの概略図を提供する。野生型（Ｗｔ）ＡＡＶ２（１）は、ＡＡＶ特異的回文逆末端反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子を含む５’ハーフ、およびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含む３’ハーフからなる。ｒＡＡＶ（２）は、野生型（Ｗｔ）ＡＡＶ２（１）のＲｅｐおよびＣａｐをコードする遺伝子を、プロモーター（Ｐｒｏ）、目的の外来性導入遺伝子、およびポリアデニル化部位（ｐＡ）を含む導入遺伝子カセットで置換することによって形成される。ｒＡＡＶ（２）を産生するために、補足する「ＡＡＶヘルパー」プラスミドベクター（３）およびアデノウイルスヘルパープラスミドベクター（Ａｄヘルパープラスミド）（４）が提供される。補足するＡＡＶヘルパープラスミド（３）は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供する。Ａｄヘルパープラスミド（４）は、アデノウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４を提供する。図３はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ１（配列番号１）の遺伝子の地図を示す。図４はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２（配列番号２）の遺伝子の地図を示す。図５はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ５（配列番号３）の遺伝子の地図を示す。図６はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ６（配列番号４）の遺伝子の地図を示す。図７はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ７（配列番号５）の遺伝子の地図を示す。図８はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎ（配列番号６）の遺伝子の地図を示す。図９はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（配列番号７）の遺伝子の地図を示す。図１０はＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰ（配列番号８）の遺伝子の地図を示す。図１１は、本明細書に記載される例示的なＡＡＶヘルパー構築物の開発のために従った全体的な構造およびアプローチを示す。親構築物（ｐＡＡＶ－ＲＣ２；Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ）は、Ｒｅｐタンパク質をコードする天然のＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子（白く囲まれた遺伝子）の発現を指示するＰ５およびＰ１９プロモーターのＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた囲み）、ならびにＣａｐタンパク質をコードする天然のＡＡＶ２ｃａｐ遺伝子（灰色で囲まれた遺伝子）の発現を指示するＰ４０プロモーターのＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた囲み）を含む。Ｐ５－ＲＣ構築物は、天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター（黒で塗られた囲み）の代わりに非天然Ｐ５プロモーター（すなわち、ベクターのＡＡＶｒｅｐ遺伝子内に本来存在しないＡＡＶＰ５プロモーター（下向きの縞模様の囲み））を用いてＡＡＶｒｅｐ遺伝子を直接発現するように改変された親プラスミドＡＡＶＲＣの誘導体である；Ｐ５－ＲＣ構築物は、親ベクターの天然ＡＡＶ血清型Ｐ１９およびＰ４０プロモーター配列（黒で塗られた囲み）を用いて、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現を指示する。Ｐ４０－ＲＣ構築物は、天然ＡＡＶ血清型Ｐ４０プロモーター（黒で塗られた囲み）の代わりにベクターの非天然Ｐ４０プロモーター（すなわち、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子内に本来存在しないＡＡＶＰ４０プロモーター（上向きの縞模様の囲み））を用いてＡＡＶｃａｐ遺伝子の発現を指示するように改変された親プラスミドＡＡＶＲＣの誘導体である；Ｐ４０－ＲＣ構築物は、親ベクターの天然ＡＡＶ血清型Ｐ５およびＰ１９プロモーター配列（黒で塗られた囲み）を用いて、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子の発現を指示する。Ｐ５／Ｐ４０－ＲＣ構築物は、天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター（黒で塗られた囲み）の代わりに非天然Ｐ５プロモーター（すなわち、ベクターのＡＡＶｒｅｐ遺伝子内に本来存在しないＡＡＶＰ５プロモーター（下向きの縞模様の囲み））を用いてＡＡＶｒｅｐ遺伝子の発現を指示するように改変された親プラスミドＡＡＶＲＣの誘導体である。Ｐ５／Ｐ４０－ＲＣ構築物は、さらに、天然ＡＡＶ血清型Ｐ４０プロモーター（黒で塗られた囲み）の代わりにベクターの非天然Ｐ４０プロモーター（すなわち、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子内に本来存在しないＡＡＶＰ４０プロモーター（上向きの縞模様の囲み））を用いてＡＡＶｃａｐ遺伝子を直接発現するように改変された。Ｐ４０－ＲＣ構築物は、親ベクターの天然ＡＡＶ血清型Ｐ１９プロモーター配列（黒で塗られた囲み）を用いてＡＡＶｒｅｐ遺伝子の発現を指示する。プロモーター領域の配列は表１に示される。図１２Ａは、親ＲＣ２ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１２Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。図１２Ｂは、親ＲＣ２ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１２Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。図１２Ｂは、このようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２、Ｐ５（２）－ＲＣ２、Ｐ５（１）－ＲＣ２、Ｐ５（３）－ＲＣ２、Ｐ５（４）－ＲＣ２、Ｐ５（５）－ＲＣ２、Ｐ５（７）－ＲＣ２、およびＰ５（８）－ＲＣ２。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた。図１３Ａは、親ベクターのＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーターの代わりに非天然Ｐ４０プロモーター配列（図１１；図１３Ａ；上向きの縞模様の長方形）を含むように親ＲＣ２ベクターを改変することによって得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ５およびＰ１９プロモーターは、両方、天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。図１３Ｂは、親ベクターのＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーターの代わりに非天然Ｐ４０プロモーター配列（図１１；図１３Ａ；上向きの縞模様の長方形）を含むように親ＲＣ２ベクターを改変することによって得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ５およびＰ１９プロモーターは、両方、天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。図１３Ｂは、このようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２、Ｐ４０（１）－ＲＣ２、Ｐ４０（３）－ＲＣ２、Ｐ４０（４）－ＲＣ２、Ｐ４０（５）－ＲＣ２、Ｐ４０（６）－ＲＣ２、Ｐ４０（７）－ＲＣ２、およびＰ４０（８）－ＲＣ２。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた。図１４Ａは、親ベクターのＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列および／または非天然Ｐ４０プロモーター配列（図１１；図１４Ａ；Ｐ５、下向き縞模様長方形；Ｐ４０、上向き縞模様長方形）を含むように親ＲＣ２ベクターを改変することによって得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９プロモーターは、天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２、Ｐ５（２）－ＲＣ２、Ｐ５（３）－ＲＣ２、Ｐ５（５）－ＲＣ２、Ｐ４０（１）－ＲＣ２、Ｐ５（２）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２、Ｐ５（３）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２、およびＰ５（５）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２。プロモーター領域の配列を表１に示す。図１４Ｂは、親ベクターのＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列および／または非天然Ｐ４０プロモーター配列（図１１；図１４Ａ；Ｐ５、下向き縞模様長方形；Ｐ４０、上向き縞模様長方形）を含むように親ＲＣ２ベクターを改変することによって得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９プロモーターは、天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２、Ｐ５（２）－ＲＣ２、Ｐ５（３）－ＲＣ２、Ｐ５（５）－ＲＣ２、Ｐ４０（１）－ＲＣ２、Ｐ５（２）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２、Ｐ５（３）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２、およびＰ５（５）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２。プロモーター領域の配列を表１に示す。図１４Ｂは、このようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた。図１５Ａは、親ＲＣ６ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１５Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ６、Ｐ５（１）－ＲＣ６、Ｐ５（２）－ＲＣ６、Ｐ５（３）－ＲＣ６、Ｐ５（７）－ＲＣ６およびＰ５（８）－ＲＣ６。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。図１５Ｂは、親ＲＣ６ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１５Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ６、Ｐ５（１）－ＲＣ６、Ｐ５（２）－ＲＣ６、Ｐ５（３）－ＲＣ６、Ｐ５（７）－ＲＣ６およびＰ５（８）－ＲＣ６。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。図１５Ｃは、親ＲＣ６ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１５Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ６、Ｐ５（１）－ＲＣ６、Ｐ５（２）－ＲＣ６、Ｐ５（３）－ＲＣ６、Ｐ５（７）－ＲＣ６およびＰ５（８）－ＲＣ６。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。図１６Ａは、親ＲＣ１、ＲＣ５、またはＲＣ７ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１６Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ１、Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ５、Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ７、Ｐ５（２）－ＲＣ１、Ｐ５（７）－ＲＣ１、Ｐ５（８）－ＲＣ１、Ｐ５（７）－ＲＣ５、Ｐ５（２）－ＲＣ７、Ｐ５（７）－ＲＣ７およびＰ５（８）－ＲＣ７。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた（図１６Ｂ）。図１６Ｂは、親ＲＣ１、ＲＣ５、またはＲＣ７ベクターを改変して、そのようなベクターのｒｅｐ遺伝子と天然に会合するＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーターの代わりに、非天然Ｐ５プロモーター配列（図１１；図１６Ａ；下向きの縞模様の長方形）を含むようにして得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。Ｐ１９およびＰ４０プロモーターは、いずれも天然のＡＡＶ２血清型プロモーター配列（黒で塗られた長方形）である。以下の構築物が用いられた：Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ１、Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ５、Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ７、Ｐ５（２）－ＲＣ１、Ｐ５（７）－ＲＣ１、Ｐ５（８）－ＲＣ１、Ｐ５（７）－ＲＣ５、Ｐ５（２）－ＲＣ７、Ｐ５（７）－ＲＣ７およびＰ５（８）－ＲＣ７。プロモーター領域の配列を表１に示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた（図１６Ｂ）。

Ｉ．本発明の方法
本発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージング効率を高めることができる組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、およびそのようなｒＡＡＶのパッケージング効率を改善するためのそれらの使用に関する。本発明は、特に、そのようなｒＡＡＶによってコードされるＲｅｐタンパク質と天然に会合するＰ５および／またはＰ４０プロモーター配列を、異なる血清型のｒＡＡＶのＲｅｐタンパク質と会合するＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターと置換（または増強）するようにさらに改変された組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターに関する。このような代替または追加のプロモーター配列の使用は、組換え修飾アデノ随伴ウイルスの産生増加を引き起こす。

本発明は、部分的に、高レベルのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質が、産生されるｒＡＡＶゲノム粒子の量を増加させ、その結果、ｒＡＡＶパッケージングの効率を増加させ、その結果、ｒＡＡＶストックの高い産生力価をもたらすという認識に基づいている。タンパク質の発現を指令するＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターを、異なるＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターで置換することによって、または最初に存在するプロモーターに加えてそのような異なるＡＡＶＰ５および／またはＰ４０プロモーターを添加することによって、所望の高レベルのｒＡＡＶを達成することが予想外に判明した。ＣａｐＡＡＶＲｅｐタンパク質は米国特許第１０，２１４，７３０号；米国特許第７，１２２，３４８号；米国特許第６，８２１，５１１；米国特許第６，７５３，４１９号；米国特許第９，４４１，２０６号；および米国特許第７，１１５，３９１号に記載される。

上述のように、ＡＡＶとｒＡＡＶは、キャプシドタンパク質によって決定される血清型に基づいて特徴づけられる（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｓｓｕｅｓｉｎＡＡＶ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｎＶｉｖｏＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ－ＢａｓｅｄＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣＮＳＤｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＳｅｒｏｔｙｐｅｓＦｏｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”２４：５９－６７；米国特許第１０，３０１，６５０号；米国特許第１０，２６６，８４６号；米国特許第１０，２６５，４１７号；米国特許第１０，２１４，７８５号；米国特許第１０，２１４，５６６号；米国特許第１０，２０２，６５７号；米国特許第１０，０４６，０１６号；米国特許第９，８８４，０７１号；米国特許第９，８５６，５３９号；米国特許第９，７３７，６１８号；米国特許第９，６７７，０８９号；米国特許第９，４５８，５１７号；米国特許第９，４５７，１０３号；米国特許第９，４４１，２４４号；米国特許第９，１９３，９５６号；米国特許第８，８４６，３８９号；米国特許第８，５０７，２６７号；米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，４７９，５５４号；米国特許第７，１８６，５５２号；米国特許第７，１０５，３４５号；米国特許第６，９８４，５１７号；米国特許第６，９６２，８１５号；および米国特許第６，７３３，７５７号）。異なる血清型の２つ以上のキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドの存在下でＡＡＶおよびｒＡＡＶを形成することによって、「ハイブリッド」血清型を有するＡＡＶおよびｒＡＡＶを産生することができる。このようなＡＡＶおよびｒＡＡＶは、このようなキャプシドタンパク質のそれぞれを有するＡＡＶおよびｒＡＡＶの組合せのトロフィズム（ｔｒｏｐｈｉｓｍ）を示す。

異なるＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質は異なる、しかし、このようなタンパク質は構造タンパク質ではないので、この違いはＡＡＶの観察される血清型に寄与しない。

本明細書での使用において、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスを示すことを意図し、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、全ての亜型および自然発生型と組換え型の両方を含む。本明細書での使用において、用語「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶ起源でないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種性のポリヌクレオチド）を含む、ＡＡＶの組換え改変型を示すことを意図する。ｒＡＡＶは一本鎖または二本鎖であり得、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成され得る。上記で議論されたように、ｒＡＡＶは、典型的には、特定のＡＡＶ遺伝子を欠失しており、したがって、ダブルプラスミドトランスフェクションシステムが、あるいは、より好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター、非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター、およびｒＡＡＶプラスミドベクターを含むトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて産生される（図２）。１つの実施形態において、このようなダブルまたはトリプルトランスフェクションの系のＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ハイブリッド血清型を有するｒＡＡＶを形成することができるように、２つ以上のｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含み得る。別の実施形態では、ハイブリッド血清型を有するｒＡＡＶの形成を可能にするために、第２のまたは追加的なＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを（例えば、第２のまたは追加的なプラスミドベクター上に）提供することができる。
Ａ．例示的なＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド

本明細書での使用において、「ＡＡＶヘルパー機能」は、ｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要なＡＡＶタンパク質（例えば、ＲｅｐとＣａｐ）および／またはＡＡＶのポリヌクレオチドを示す。このようなＡＡＶヘルパー機能は、「ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド」によって提供され、この用語は、本明細書での使用において、ＡＡＶヘルパー機能を提供する、ウイルス、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、または細胞染色体に組み込まれたポリヌクレオチドである。ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶヘルパープラスミドは、ｐＡＡＶ－ＲＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ａｄｄｇｅｎｅ；ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）、ｐＡＡＶ－ＲＣ１、ｐＡＡＶ－ＲＣ２、ｐＡＡＶ－ＲＣ５、ｐＡＡＶ－ＲＣ６、およびｐＡＡＶ－ＲＣ７を含む。
１．プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ１

プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ１（配列番号１；図３）は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶ１血清型キャプシドタンパク質を発現するＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＡＡＶ‐ＲＣ１のＰ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターはＡＡＶ２血清型プロモーターである（それぞれ配列番号１０および配列番号１８）。
プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ１のコード鎖（配列番号１）：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc 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cagctcaaag cgggtgacaa tccgtacctg cggtataacc acgccgacgc cgagtttcag gagcgtctgc aagaagatac gtcttttggg ggcaacctcg ggcgagcagt cttccaggcc aagaagcggg ttctcgaacc tctcggtctg gttgaggaag gcgctaagac ggctcctgga aagaaacgtc cggtagagca gtcgccacaa gagccagact cctcctcggg catcggcaag acaggccagc agcccgctaa aaagagactc aattttggtc agactggcga ctcagagtca gtccccgatc cacaacctct cggagaacct ccagcaaccc ccgctgctgt gggacctact acaatggctt caggcggtgg cgcaccaatg gcagacaata acgaaggcgc cgacggagtg ggtaatgcct caggaaattg gcattgcgat tccacatggc tgggcgacag agtcatcacc accagcaccc gcacctgggc cttgcccacc tacaataacc acctctacaa gcaaatctcc agtgcttcaa cgggggccag caacgacaac cactacttcg gctacagcac cccctggggg tattttgatt tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca gcgactcatc aacaacaatt ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca aactcttcaa catccaagtc aaggaggtca cgacgaatga tggcgtcaca accatcgcta ataaccttac cagcacggtt caagtcttct cggactcgga gtaccagctt ccgtacgtcc tcggctctgc gcaccagggc tgcctccctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattccgc aatacggcta cctgacgctc aacaatggca 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cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 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ccctgaccgt ggccgagaag ctgcagcgcg actttctgac ggaatggcgc cgtgtgagta aggccccgga ggctcttttc tttgtgcaat ttgagaaggg agagagctac ttccacatgc acgtgctcgt ggaaaccacc ggggtgaaat c

配列番号１において、ｐＡＡＶ－ＲＣ１の１－１５６１残基はＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（９５－２２１残基はＡＡＶ２Ｐ１９プロモーターに相当し、１０７５－１２５４残基はＡＡＶ２Ｐ４０プロモータ（配列番号１８）に相当する）；１５７８－３７８８残基はＡＡＶ１ＶＰ１キャプシドタンパク質をコードし；７１２７－７４３１残基はＲｅｐ６８タンパク質をコードし；３９８４－４１１４残基はＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列に相当し（配列番号１０）；４２３７－４２５３残基はＭ１３Ｒｅｖ配列であり；４２６１－４２７７残基はＬａｃオペレーター配列であり；４２８５－４３１５はＬａｃプロモーター配列であり；４５７８－５３０２残基はｐＭＢｏｒｉ配列に相当し；５３９８－６２５８残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；そして、６２５９－６３５７残基はｂｌａプロモーター配列である（図３）。
２．プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ２

プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ２（配列番号２；図４）は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶ２血清型キャプシドタンパク質を発現するＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＡＡＶ‐ＲＣ２のＰ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターはＡＡＶ２血清型プロモーターである（それぞれ、配列番号１０および配列番号１８）。
プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ２のコード鎖（配列番号２）：
ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ggggagctcg cagggtctcc attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccatgccg gggttttacg agattgtgat taaggtcccc agcgaccttg acgagcatct gcccggcatt tctgacagct ttgtgaactg ggtggccgag aaggaatggg agttgccgcc agattctgac atggatctga atctgattga gcaggcaccc ctgaccgtgg ccgagaagct gcagcgcgac tttctgacgg aatggcgccg tgtgagtaag gccccggagg ctcttttctt tgtgcaattt gagaagggag agagctactt ccacatgcac gtgctcgtgg aaaccaccgg ggtgaaatcc atggttttgg gacgtttcct gagtcagatt cgcgaaaaac tgattcagag aatttaccgc gggatcgagc cgactttgcc aaactggttc gcggtcacaa agaccagaaa tggcgccgga ggcgggaaca aggtggtgga tgagtgctac atccccaatt acttgctccc caaaacccag cctgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaacagtatt taagcgcctg tttgaatctc acggagcgta aacggttggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag aacaaagaga atcagaatcc caattctgat gcgccggtga tcagatcaaa aacttcagcc aggtacatgg agctggtcgg gtggctcgtg gacaagggga ttacctcgga gaagcagtgg atccaggagg accaggcctc atacatctcc ttcaatgcgg cctccaactc gcggtcccaa atcaaggctg ccttggacaa tgcgggaaag attatgagcc tgactaaaac cgcccccgac tacctggtgg gccagcagcc cgtggaggac atttccagca atcggattta taaaattttg gaactaaacg ggtacgatcc ccaatatgcg gcttccgtct ttctgggatg ggccacgaaa aagttcggca agaggaacac catctggctg tttgggcctg caactaccgg gaagaccaac atcgcggagg ccatagccca cactgtgccc ttctacgggt gcgtaaactg gaccaatgag aactttccct tcaacgactg tgtcgacaag atggtgatct ggtgggagga ggggaagatg accgccaagg tcgtggagtc ggccaaagcc attctcggag gaagcaaggt gcgcgtggac cagaaatgca agtcctcggc ccagatagac ccgactcccg tgatcgtcac ctccaacacc aacatgtgcg ccgtgattga cgggaactca acgaccttcg aacaccagca gccgttgcaa gaccggatgt tcaaatttga actcacccgc cgtctggatc atgactttgg gaaggtcacc aagcaggaag tcaaagactt tttccggtgg gcaaaggatc acgtggttga ggtggagcat gaattctacg tcaaaaaggg tggagccaag aaaagacccg cccccagtga cgcagatata agtgagccca aacgggtgcg cgagtcagtt gcgcagccat cgacgtcaga cgcggaagct tcgatcaact acgcagacag gtaccaaaac aaatgttctc gtcacgtggg catgaatctg atgctgtttc cctgcagaca atgcgagaga atgaatcaga attcaaatat ctgcttcact cacggacaga aagactgttt agagtgcttt cccgtgtcag aatctcaacc 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tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggta

配列番号２において、ｐＡＡＶ－ＲＣ２の８５－１９５０残基は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（４８４－６６３残基はＡＡＶ２Ｐ１９プロモーターに相当し、１４６４－１６４３残基はＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター（配列番号１８）に相当し、１６６８－１６７６残基はドナー部位である）；１９６７－４１７４残基はＡＡＶ２ＶＰ１キャプシドタンパク質をコードし；１９９２－２０１６残基はＲｅｐ６８タンパク質の部分をコードし；４１７５－４２５６残基はポリＡ配列をコードし；４３５７－４４８７残基は、配列番号１０のＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列に相当し；４６１０－４６２６残基はＭ１３Ｒｅｖ配列であり；４６３４－４６５０残基はＬａｃオペレーター配列であり；４６５８－４６８８はＬａｃプロモーター配列であり；４９５１－５６７５残基はｐＭＢｏｒｉ配列に相当し、５７７１－６６３１残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；６６３２－６７３０残基はｂｌａプロモーター配列である（図４）。
３．プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ５

プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ５（配列番号３；図５）は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶ５血清型キャプシドタンパク質を発現するＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＡＡＶ‐ＲＣ５のＰ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターはＡＡＶ２血清型プロモーターである（それぞれ、配列番号１０および配列番号１８）。
プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ５のコード鎖（配列番号３）：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc 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cttgaggcgg gagacaaccc ctacctcaag tacaaccacg cggacgccga gtttcaggag aagctcgccg acgacacatc cttcggggga aacctcggaa aggcagtctt tcaggccaag aaaagggttc tcgaaccttt tggcctggtt gaagagggtg ctaagacggc ccctaccgga aagcggatag acgaccactt tccaaaaaga aagaaggctc ggaccgaaga ggactccaag ccttccacct cgtcagacgc cgaagctgga cccagcggat cccagcagct gcaaatccca gcccaaccag cctcaagttt gggagctgat acaatgtctg cgggaggtgg cggcccattg ggcgacaata accaaggtgc cgatggagtg ggcaatgcct cgggagattg gcattgcgat tccacgtgga tgggggacag agtcgtcacc aagtccaccc gaacctgggt gctgcccagc tacaacaacc accagtaccg agagatcaaa agcggctccg tcgacggaag caacgccaac gcctactttg gatacagcac cccctggggg tactttgact ttaaccgctt ccacagccac tggagccccc gagactggca aagactcatc aacaactact ggggcttcag accccggtcc ctcagagtca aaatcttcaa cattcaagtc aaagaggtca cggtgcagga ctccaccacc accatcgcca acaacctcac ctccaccgtc caagtgttta cggacgacga ctaccagctg ccctacgtcg tcggcaacgg gaccgaggga tgcctgccgg ccttccctcc gcaggtcttt acgctgccgc agtacggtta cgcgacgctg aaccgcgaca acacagaaaa tcccaccgag aggagcagct 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tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggctct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg aaatc

配列番号３において、ｐＡＡＶ－ＲＣ５の１－１５６１残基は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（９１－２２１残基はＡＡＶ２Ｐ１９プロモーターに相当し、１０７５－１２５４残基はＰ４０プロモーター（配列番号１８）に相当する）；１５７８－３７４９残基はＡＡＶ５ＶＰ１キャプシドタンパク質をコードし；７０９１－７３９５残基はＲｅｐ６８タンパク質の部分をコードし；３９４８－４０７８残基は、配列番号１０のＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列に相当し；４２０１－４２１７残基はＭ１３Ｒｅｖ配列であり；４２２５－４２４１残基はＬａｃオペレーター配列であり；４２４９－４２７９はＬａｃプロモーター配列であり；４５４２－５２６６残基はｐＭＢｏｒｉ配列に相当し；５３６２－６２２２残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；６２２３－６３２１残基はｂｌａプロモーター配列である（図５）。
４．プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ６

プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ６（配列番号４；図６）、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶ６血清型キャプシドタンパク質を発現するＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＡＡＶ‐ＲＣ６のＰ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターはＡＡＶ２血清型プロモーターである（それぞれ、配列番号１０および配列番号１８）。
プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ６のコード鎖（配列番号４）：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc gtgatcgtca cctccaacac caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc aacgaccttc gaacaccagc agccgttgca agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg ccgtctggat catgactttg ggaaggtcac caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg ggcaaaggat cacgtggttg aggtggagca tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagaccc gcccccagtg acgcagatat aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca tcgacgtcag acgcggaagc ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatct gatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag aatgaatcag aattcaaata tctgcttcac tcacggacag aaagactgtt tagagtgctt tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt cgtcaaaaag gcgtatcaga aactgtgcta cattcatcat atcatgggaa aggtgccaga cgcttgcact gcctgcgatc tggtcaatgt ggatttggat gactgcatct ttgaacaata aatgatttaa atcaggtatg gctgccgatg gttatcttcc agattggctc gaggacaacc tctctgaggg cattcgcgag tggtgggact tgaaacctgg agccccgaaa cccaaagcca accagcaaaa gcaggacgac ggccggggtc tggtgcttcc tggctacaag tacctcggac ccttcaacgg actcgacaag ggggagcccg tcaacgcggc ggatgcagcg gccctcgagc acgacaaggc ctacgaccag cagctcaaag cgggtgacaa tccgtacctg cggtataacc acgccgacgc cgagtttcag gagcgtctgc aagaagatac gtcttttggg ggcaacctcg ggcgagcagt cttccaggcc aagaagaggg ttctcgaacc ttttggtctg gttgaggaag gtgctaagac ggctcctgga aagaaacgtc cggtagagca gtcgccacaa gagccagact cctcctcggg cattggcaag acaggccagc agcccgctaa aaagagactc aattttggtc agactggcga ctcagagtca gtccccgacc cacaacctct cggagaacct ccagcaaccc ccgctgctgt gggacctact acaatggctt caggcggtgg cgcaccaatg gcagacaata acgaaggcgc cgacggagtg ggtaatgcct caggaaattg gcattgcgat tccacatggc tgggcgacag agtcatcacc accagcaccc gaacatgggc cttgcccacc tataacaacc acctctacaa gcaaatctcc agtgcttcaa cgggggccag caacgacaac cactacttcg gctacagcac cccctggggg tattttgatt tcaacagatt ccactgccat ttctcaccac gtgactggca gcgactcatc aacaacaatt ggggattccg gcccaagaga ctcaacttca agctcttcaa catccaagtc aaggaggtca cgacgaatga tggcgtcacg accatcgcta ataaccttac cagcacggtt caagtcttct cggactcgga gtaccagttg ccgtacgtcc tcggctctgc gcaccagggc tgcctccctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattccgc agtacggcta cctaacgctc aacaatggca gccaggcagt gggacggtca tccttttact gcctggaata tttcccatcg cagatgctga gaacgggcaa taactttacc ttcagctaca ccttcgagga cgtgcctttc cacagcagct acgcgcacag ccagagcctg gaccggctga tgaatcctct catcgaccag tacctgtatt acctgaacag aactcagaat cagtccggaa gtgcccaaaa caaggacttg ctgtttagcc gggggtctcc agctggcatg tctgttcagc ccaaaaactg gctacctgga ccctgttacc ggcagcagcg cgtttctaaa acaaaaacag acaacaacaa cagcaacttt acctggactg gtgcttcaaa atataacctt aatgggcgtg aatctataat caaccctggc actgctatgg cctcacacaa agacgacaaa gacaagttct ttcccatgag cggtgtcatg atttttggaa aggagagcgc cggagcttca aacactgcat tggacaatgt catgatcaca gacgaagagg aaatcaaagc cactaacccc gtggccaccg aaagatttgg gactgtggca gtcaatctcc agagcagcag cacagaccct gcgaccggag atgtgcatgt tatgggagcc ttacctggaa tggtgtggca agacagagac gtatacctgc agggtcctat ttgggccaaa attcctcaca cggatggaca ctttcacccg tctcctctca tgggcggctt tggacttaag cacccgcctc ctcagatcct catcaaaaac acgcctgttc ctgcgaatcc tccggcagag ttttcggcta caaagtttgc ttcattcatc acccagtatt ccacaggaca agtgagcgtg gagattgaat gggagctgca gaaagaaaac agcaaacgct ggaatcccga agtgcagtat acatctaact atgcaaaatc tgccaacgtt gatttcactg tggacaacaa tggactttat actgagcctc gccccattgg cacccgttac ctcacccgtc ccctgtaagg cgcgccaccg gttgcttgtt aatcaataaa ccgtttaatt cgtttcagtt gaactttggt ctctgcgtat ttctttctta tctagtttcc atgctctagg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg aattcggctt tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct agaggtcctg tattagaggt cacgtgagtg ttttgcgaca ttttgcgaca ccatgtggtc acgctgggta tttaagcccg agtgagcacg cagggtctcc attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccaagccg aattctgcag atatccaaac actggcggcc gctcgactag agcggccgcc accgcggtgg agctccagct tttgttccct ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 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配列番号４において、ｐＡＡＶ－ＲＣ６の１－１５６１残基は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（９１－２２１残基はＡＡＶ２Ｐ１９プロモーターに相当し、１０７５－１２５４残基はＰ４０プロモーター（配列番号１８）に相当する）；１５７８－３７８８残基はＡＡＶ６ＶＰ１キャプシドタンパク質をコードし；７３６－１２８１残基は、Ｒｅｐ６８タンパク質の部分をコードし；３９８４－４１１４残基は、ＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）に相当し；４２３７－４２５３残基はＭ１３Ｒｅｖ配列であり；４２６１－４２７７残基はＬａｃオペレーター配列であり；４２８５－４３１５はＬａｃプロモーター配列であり；４５７８－５３０２残基はｐＭＢｏｒｉ配列に相当し；５３９８－６２５８残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；６２５９－６３５７残基はｂｌａプロモーター配列である（図６）。
５．ｐＡＡＶ－ＲＣ７プラスミド

プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ７（配列番号５；図７）は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶ６血清型キャプシドタンパク質を発現するＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＡＡＶ‐ＲＣ７のＰ５プロモーターおよびＰ４０プロモーターはＡＡＶ２血清型プロモーターである（それぞれ、配列番号１０および配列番号１８）。
プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ７のコード鎖（配列番号５）：
catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc 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cagctcaaag cgggtgacaa tccgtacctg cggtataacc acgccgacgc cgagtttcag gagcgtctgc aagaagatac gtcatttggg ggcaacctcg ggcgagcagt cttccaggcc aagaagcggg ttctcgaacc tctcggtctg gttgaggaag gcgctaagac ggctcctgca aagaagagac cggtagagcc gtcacctcag cgttcccccg actcctccac gggcatcggc aagaaaggcc agcagcccgc cagaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgactcagag tcagtccccg accctcaacc tctcggagaa cctccagcag cgccctctag tgtgggatct ggtacagtgg ctgcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg tgccgacgga gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatt accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caagcaaatc tccagtgaaa ctgcaggtag taccaacgac aacacctact tcggctacag caccccctgg gggtattttg actttaacag attccactgc cacttctcac cacgtgactg gcagcgactc atcaacaaca actggggatt ccggcccaag aagctgcggt tcaagctctt caacatccag gtcaaggagg tcacgacgaa tgacggcgtt acgaccatcg ctaataacct taccagcacg attcaggtat tctcggactc ggaataccag ctgccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag ggctgcctgc ctccgttccc ggcggacgtc ttcatgattc ctcagtacgg ctacctgact ctcaacaatg 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agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggtaccggg ccccccctcg aggtcgacgg tatcggggga gctcgcaggg tctccatttt gaagcgggag gtttgaacgc gcagccgcca tgccggggtt ttacgagatt gtgattaagg tccccagcga ccttgacgag catctgcccg gcatttctga cagctttgtg aactgggtgg ccgagaagga atgggagttg ccgccagatt ctgacatgga tctgaatctg attgagcagg cacccctgac cgtggccgag aagctgcagc gcgactttct gacggaatgg cgccgtgtga gtaaggcccc ggaggctctt ttctttgtgc aatttgagaa gggagagagc tacttccaca tgcacgtgct cgtggaaacc accggggtga aatc

配列番号５において、ｐＡＡＶ－ＲＣ７の１－１５６１残基は、Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（９１－２２１残基はＡＡＶ２Ｐ１９プロモーターに相当し；１０７５－１２５４残基はＰ４０プロモーター（配列番号１８）に相当し；１５７８－３７９１残基はＡＡＶ７ＶＰ１キャプシドタンパク質をコードし；７３６－１２８１残基は、Ｒｅｐ６８タンパク質の部分をコードし；残基３９８７－４１１７は、配列番号１０のＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列に相当する）；４２４０－４２５６残基はＭ１３Ｒｅｖ配列であり；４２６４－４２８０残基はＬａｃオペレーター配列であり；４２８８－４３１８はＬａｃプロモーター配列であり；４５８１－５３０５残基はｐＭＢｏｒｉ配列に相当し；５４０１－６２６１残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；６２６２－６３６０残基はｂｌａプロモーター配列である（図７）。
Ｂ．例示的な非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド

本明細書での使用において、「非ＡＡＶヘルパー機能」との用語は、ｒＡＶＶの複製およびパッケージングに必要なＡｄ、ＣＭＶ、ＨＳＶまたは他の非ＡＡＤウイルス（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）のタンパク質、および／またはＡｄ、ＣＭＶ、ＨＳＶまたは他の非ＡＡＤウイルスのポリヌクレオチドを意味する。このような非ＡＡＶヘルパー機能は「非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド」によって提供され、この用語は、本明細書での使用において、非ＡＡＶヘルパー機能を提供する、ウイルス、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、または細胞染色体に組み込まれたポリヌクレオチドである。ベクター、ｐＨｅｌｐｅｒおよびそれらの誘導体（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅおよび他から商業的に利用可能であるもののように）は、適切な非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドである（例えばＭａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．他（１９９８）“Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓＣａｎＢｅＥｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙＰｒｏｄｕｃｅｄＷｉｔｈｏｕｔＨｅｌｐｅｒＶｉｒｕｓ，”ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：９３８－９４５；Ｓｈａｒｍａ，Ａ．他（２０１０）“ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙＯｆＡＡＶ２／６，２／８Ａｎｄ２／９ＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＤｅｌｉｖｅｒｉｎｇＧｅｎｅｓＩｎＨｕｍａｎＣｏｒｎｅａｌＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｂｕｌｌ．８１（２－３）：２７３－２７８を参照のこと）。

ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎプラスミド（配列番号６；図８）は非ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得る非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドである。
プラスミドｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎのコード鎖（配列番号６）

配列番号６において、ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎの１－５３４３残基はアデノウイルスに由来しＥ２Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド（２５８－１８４７残基）を含み；５３４４－８５３５残基はアデノウイルスに由来し、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み；９４２３－１００１１残基はｏｒｉ配列に相当し；１０１８２－１０９７６残基はｂｌａプロモーター配列によって発現されるカナマイシン耐性決定因子（１０９７７－１１０８１残基）をコードし；１１１０７－１１５６１残基はｆ１ｏｒｉ配列に相当する（図４）。
Ｃ．例示的なｒＡＡＶプラスミドベクター

上記で議論されたように、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドと非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは典型的にはｒＡＡＶプラスミドベクターと協働して使用され、トリプルトランスフェクションシステムを含む。複数の商業的に利用可能なｒＡＡＶプラスミドベクター（例えばｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ，ｐＧＯＩなど（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎａｎｄＳｔｒａｔａｇｅｎｅ））は、本発明に従って使用され得る。本発明に従って使用され得る例示的なｒＡＡＶプラスミドベクターは、５’ＩＴＲ，Ｕ６プロモーター，ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター配列、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド（Ｇａｍｂｏｔｔｏ，Ａ．他（２０００）“ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙＯｆＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）ＩｎＢＡＬＢ／ＣＭｉｃｅ：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＯｆＡｎＨ２－Ｋｄ－ＲｅｓｔｒｉｃｔｅｄＣＴＬＥｐｉｔｏｐｅ，”ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７（２３）：２０３６－２０４０；Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）“ＴｈｅＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９－５４４；Ｃｉｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．他（２０００）“ＴｈｅＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＡｓＡＴｏｏｌＦｏｒＴｈｅＡｎａｌｙｓｉｓＯｆＰｒｏｔｅｉｎＤｙｎａｍｉｃｓＡｎｄＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ：ＬｏｃａｌＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｔｕｄｙＡｔＴｈｅＳｉｎｇｌｅ－ＭｏｌｅｃｕｌｅＬｅｖｅｌ，”Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７１（６）：７７１－７７６；ＣｈｏｐｒａＡ．（２００８）“ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＷｉｔｈＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，”Ｉｎ：ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＩＭＡＧＩＮＧＡＮＤＣＯＮＴＲＡＳＴＡＧＥＮＴＤＡＴＡＢＡＳＥ（ＭＩＣＡＤ），ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ），発現タンパク質の回収および局在を容易化するＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ部位，ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位および３’ＩＴＲを含むｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（配列番号７；図９）である。
プラスミドｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰのコード鎖（配列番号７）：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg ccctccagtg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccgcacgc gtctagttat taatagtaat cgaattcgtg ttactcataa ctagtaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga cgcgggatcc actggaccag gcagcagcgt cagaagactt ttttggaaaa gcttgactag taatactgta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagagatc cggtaccgag gagatctgcc gccgcgatcg ccggcgcgcc agatctcacg cttaactagc tagcggaccg acgcgtacgc ggccgctcga gatggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta agtcgaggat tataaggatg acgacgataa attcgtcgag caccaccacc accaccacta ataaggttta tccgatccac cggatctaga taagatatcc gatccaccgg atctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacctgccag cgccttagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt

配列番号７において、ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの１－１２８残基は５’ＩＴＲに相当し；２０１－４４１残基はＵ６プロモーター配列であり、５６２－８６５残基はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー配列、８６６－１０６８残基はＣＭＶ前初期プロモーター配列を含み；１１９２－１９１１残基はＥＧＦＰをコードする哺乳動物コドン最適化ポリヌクレオチドを含み；１９１８－１９４１残基はＦＬＡＧタグをコードし；１９５１－１９６８残基は６×Ｈｉｓタグをコードし、２１３９－２２６０残基はＳＶ４０ポリ（Ａ）配列をコードし、２２９３－２４３３残基は３’ＩＴＲに相当し；２５０８－２２９６３残基はＦ１ｏｒｉ配列に相当し；３３５０－４２１０残基はｂｌａプロモーター配列（３２４５－３３４９残基）によって発現されるアンピシリン耐性決定因子とそのシグナル配列（３３５０－３４１８残基）をコードし；４３８１－４９６９残基はｏｒｉ配列に相当する（図９）。

本発明に従って使用され得る第二の例示的なプラスミドベクターは５’ＩＴＲ、甲状腺ホルモン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド、発現タンパク質の回収および局在を容易化するＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ部位、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位および３’ＩＴＲを含むｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰ（配列番号８；図１０）である。
ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰプラスミドのコード鎖（配列番号８）：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct gcggccggtc gcgtctagta ctagtaggtt aatttttaaa aagcagtcaa aagtccaagt ggcccttggc agcatttact ctctctgttt gctctggtta ataatctcag gagcacaaac attccagatc caggttaatt tttaaaaagc agtcaaaagt ccaagtggcc cttggcagca tttactctct ctgtttgctc tggttaataa tctcaggagc acaaacattc cagatccggc gcgccagggc tggaagctac ctttgacatc atttcctctg cgaatgcatg tataatttct acagaaccta ttagaaagga tcacccagcc tctgcttttg tacaactttc ccttaaaaaa ctgccaattc cactgctgtt tggcccaata gtgagaactt tttcctgctg cctcttggtg cttttgccta tggcccctat tctgcctgct gaagacactc ttgccagcat ggacttaaac ccctccagct ctgacaatcc tctttctctt ttgttttaca tgaagggtct ggcagccaaa gcaatcactc aaagttcaaa ccttatcatt ttttgctttg ttcctcttgg ccttggtttt gtacatcagc tttgaaaata ccatcccagg gttaatgctg gggttaattt ataactaaga gtgctctagt tttgcaatac aggacatgct ataaaaatgg aaagatgttg ctttctgaga gacaggtacc gaggagatct gccgccgcga tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacttacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtagac gcgtacgcgg ccgctcgagg attataagga tgacgacgat aaattcgtcg agcaccacca ccaccaccac taataaggtt tatccgatcc accggatcta gataagatat ccgatccacc ggatctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taacgcggta accacgtgcg gacccaacgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcacat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacctgcc agcgccttag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ctctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg tctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gt

配列番号８において、ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの１－１３０残基は５’ＩＴＲに相当し；１５０－８５４残基は、ＴＢＧを含む４１５－８２４残基と共にＴＢＧプロモーター配列であり；８８６－１６０８残基はＥＧＦＰをコードし；１６３０－１６５３残基はＦＬＡＧタグをコードし；１６６３－１６８０残基は６×Ｈｉｓタグをコードし；１８５１－１９７２残基はポリ（Ａ）配列をコードし；２００５－２１４５残基は３’ＩＴＲに相当し；２２２０－２６７５残基はＦ１ｏｒｉ配列に相当し；３０６２－３９２２残基はｂｌａプロモーター配列（２９５７－３０６１残基）によって発現されるアンピシリン耐性決定因子とそのシグナル配列（３０６２－３１３０残基）をコードし；４０９３－４６８１残基はｏｒｉ配列に相当する（図１０）。

本明細書中で使用する場合、用語「天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列」は、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子の転写を天然に制御するか、またはそのようなｒｅｐ遺伝子内に天然に存在するプロモーター配列を意味することを意図する。例えば：
・ＡＡＶ１Ｐ５プロモーター配列は天然にＡＡＶ１のｒｅｐ遺伝子の転写を制御し、ＡＡＶ１Ｐ４０プロモーター配列は天然にＡＡＶ１のｒｅｐ遺伝子の中に見いだされる。したがって、ＡＡＶ１Ｐ５プロモーター配列およびＡＡＶ１Ｐ４０プロモーター配列はＡＡＶ１ｒｅｐ遺伝子の天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列である；
・ＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列は天然にＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子の転写を制御し、ＡＡＶ２Ｐ４０ロモーター配列は天然にＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子の中に見いだされる。したがって、ＡＡＶ２Ｐ５プロモーター配列およびＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列はＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子の天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列である；
・ＡＡＶ５Ｐ５プロモーター配列は天然にＡＡＶ５のｒｅｐ遺伝子を制御し、ＡＡＶ５Ｐ４０プロモーター配列は天然にＡＡＶ５のｒｅｐ遺伝子の中に見いだされる。したがって、ＡＡＶ５Ｐ５プロモーター配列およびＡＡＶ５Ｐ４０プロモーター配列はＡＡＶ５のｒｅｐ遺伝子の天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列である；
・ＡＡＶ６Ｐ５プロモーター配列は天然にＡＡＶ６のｒｅｐ遺伝子を制御し、ＡＡＶ６Ｐ４０プロモーター配列は天然にＡＡＶ６のｒｅｐ遺伝子の中に見いだされる。したがって、ＡＡＶ６Ｐ５プロモーター配列およびＡＡＶ６Ｐ４０プロモーター配列はＡＡＶ６遺伝子の天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列である；そして、
・ＡＡＶ７Ｐ５プロモーター配列は天然にＡＡＶのｒｅｐ遺伝子を制御し、ＡＡＶ７Ｐ４０配列は天然にＡＡＶ７のｒｅｐ遺伝子の中に見いだされる。したがって、ＡＡＶ７Ｐ５プロモーター配列およびＡＡＶ７Ｐ４０プロモーター配列はＡＡＶ７の天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列である。

ＡＡＶ血清型１から８の天然ＡＡＶＰ５およびＰ４０プロモーター配列を表１に示す。転写を媒介することができるそのような配列またはそのサブ配列は、本発明の方法に従って使用することができる。

対して、「非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列」という用語は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子を天然に制御せず、そのようなｒｅｐ遺伝子内に天然に見出されないプロモーター配列を意味することを意図する。非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列の例示的な、非限定的な例は：ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ１Ｐ５プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ２Ｐ５プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ５Ｐ５プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ６Ｐ５プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ７Ｐ５プロモーター；ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ１Ｐ４０プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ５Ｐ４０プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ７ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ６Ｐ４０プロモーター；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６ｒｅｐ遺伝子の発現を指示するために使用される場合のＡＡＶ７Ｐ４０プロモーターなどを含む。

一実施形態において、このようなＡＡＶ血清型プロモーター配列の１つ以上を、このようなプラスミドの既存のＰ５またはＰ４０プロモーターを置換または増大させるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するように設計された組換えＡＡＶヘルパープラスミドに遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）することができる。このような改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術の周知の方法を用いて達成される。

プロモーター配列の血清型のアイデンティティーは、本明細書中において、関与するプロモーター（たとえば、Ｐ５、Ｐ４０など）、それが天然に会合するｒｅｐ遺伝子の血清型、およびベクターの名前を示すことによって示される。すなわち、例えば、ＡＡＶ２と天然に会合するＰ５プロモーター配列を含むｐＡＡＶ－ＲＣ２プラスミドは、Ｐ５（２）－ＲＣ２として示され；ＡＡＶ３と天然に会合するＰ５プロモーター配列を含むｐＡＡＶ－ＲＣ２プラスミドは、Ｐ５（３）－ＲＣ２として示され；ＡＡＶ７と天然に会合するＰ４０プロモーター配列を含むｐＡＡＶ－ＲＣ５プラスミドは、Ｐ４０（７）－ＲＣ５として示され；ＡＡＶ３と天然に会合するＰ５プロモーターとＡＡＶ８と天然に会合するＰ４０プロモーター配列を含むｐＡＡＶ－ＲＣ２プラスミドは、Ｐ５（３）／Ｐ４０（８）－ＲＣ２として示される、など。

一実施形態において、導入されたＡＡＶ血清型プロモーター配列は、最初に存在するＡＡＶ血清型プロモーター配列を置換する。他の実施形態では、導入されたＡＡＶ血清型プロモーター配列は、そのような最初に存在するＡＡＶ血清型プロモーター配列に加えて存在し、そのような最初に存在するＡＡＶ血清型プロモーター配列に対して５’または３’の位置にある。導入されるヌクレオチド配列は、そのような最初に存在するＡＡＶ血清型プロモーター配列に隣接して、または離れて配置され得る。

本発明のこのようなＡＡＶ血清型プロモーター配列の１つ以上の置換または付加は、ｒＡＡＶ産生力価を増加させる。本明細書での使用において、用語「産生力価」は調製物中の感染性ｒＡＡＶの濃度の量を示すことを意図する。このような量または濃度は、好ましくは、このような調製物中のＡＡＶまたはｒＡＡＶを力価化（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）することによって決定される。本発明のｒＡＡＶ調製物の産生力価は、好ましくは、産生細胞（例えば、ｒＡＡＶプラスミドベクター、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するＡＡＶヘルパーベクター、および必要なアデノウイルス転写および翻訳因子を提供するＡｄヘルパーベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３）を３回凍結／解凍した後、超音波処理してｒＡＡＶ粒子の放出に供した後、力価化される。次いで、調製物は遠心分離される。使用されるＡＡＶベクターは上清に局在する。調製物のアリコートはプロテイナーゼＫで処理され、ＡＡＶゲノムの数が決定される。調製物のアリコートを（ＡＡＶ２ＲｅｐおよびＣａｐを発現する）ＨｅＬａ－３２Ｃ２細胞に感染させ、感染力価は感染中心アッセイ（ＩＣＡ）（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“ＡｃｃｕｒａｔｅＴｉｔｒａｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡＡＶＰａｒｔｉｃｌｅｓＲｅｑｕｉｒｅｓＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＶｅｃｔｏｒＧｅｎｏｍｅｓａｎｄＳｕｉｔａｂｌｅＣｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）を用いて、またはより好ましくは、組織培養感染用量の中央値（ＴＣＩＤ５０）として測定される（Ｚｅｎ，Ｚ．他（２００４）“ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＴｉｔｅｒＡｓｓａｙＦｏｒＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓＷｉｔｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｆｆｉｃｉｅｎｔＴｏＤｅｔｅｃｔＳｉｎｇｌｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＥｖｅｎｔｓ，”Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１５：７０９－７１５）。

本明細書中において、もし、本発明の方法の使用から得られた産生力価が、追加的に提供されたイオンが提供されなかった同様に実施された産生から得られた力価より、少なくとも１０％大きい、より好ましくは少なくとも２０％大きい、さらに好ましくは少なくとも３０％大きい、より好ましくは少なくとも４０％大きい、より好ましくは少なくとも５０％大きい、より好ましくは少なくとも６０％大きい、より好ましくは少なくとも７０％大きい、より好ましくは少なくとも８０％大きい、より好ましくは少なくとも９０％大きい、より好ましくは少なくとも２倍大きい、より好ましくは少なくとも１１０％大きい、より好ましくは少なくとも１２０％大きい、より好ましくは少なくとも１３０％大きい、より好ましくは少なくとも１４０％大きい、より好ましくは少なくとも２．５倍大きい、より好ましくは少なくとも１６０％大きい、より好ましくは少なくとも１７０％大きい、より好ましくは少なくとも１８０％大きい、より好ましくは少なくとも１９０％大きい、より好ましくは少なくとも３倍大きければ、ｒＡＡＶ産生力価が、本発明の方法によって「増加した」と言われる。

本発明の方法を用いて産生力価を増加させることができるｒＡＡＶは、ｒＡＡＶがＡＡＶキャプシド粒子内にカプセル化され得るｒＡＡＶプラスミドベクターにパッケージングされることを可能にする任意の導入遺伝子カセットを含むことができる。限定されるものではないが、このような導入遺伝子カセットは、ヒト、霊長類（チンパンジー、テナガザル、ゴリラ、オランウータンなどを含む）、セルコピテクシン（ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ）（ヒヒ、カニクイザル、ビロードサルなどを含む）、イヌ、グリリン（ｇｌｉｒｉｎｅ）（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなどを含む）、ネコ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ起源であってもよい。

好ましい実施形態において、そのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドなど）をコードするか、または遺伝的もしくは遺伝的疾患もしくは状態に関連する転写された核酸を含み、その結果、そのような疾患もしくは状態を治療するための遺伝子治療において使用され得る。

本発明の方法は、さらに、以下でトランスフェクトされた細胞においてｒＡＡＶおよびｒＡＡＶプラスミドベクターの産生力価を増加させるために使用することができる。
（１）非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を有し、そのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターによって天然に提供されないが、それらの産生に必要なタンパク質またはＲＮＡ分子を発現することができるＡＡＤヘルパーベクター。上述のように、このようなタンパク質またはＲＮＡ分子には、ベクター転写制御および複製、ならびにウイルスゲノムのウイルス被膜へのパッケージングに必要なＲｅＰ５２およびＲｅｐ７８タンパク質をコードする遺伝子、ならびに感染性粒子の形成に必要なＶＰキャプシドタンパク質をコードするキャップ遺伝子が含まれる；および
（２）そのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターによって提供されないが、それらの産生に必要な、非ＡＡＶヘルパータンパク質（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡ、Ｅ４）またはＲＮＡを提供することができるＡｄヘルパーベクター。

本発明のｒＡＡＶを製造するための一実施形態において、このような遺伝子およびＲＮＡ分子の全ては、ｒＡＡＶと協働して、ダブルプラスミドトランスフェクションシステムを含むように、同じヘルパーウイルス（またはより好ましくは、ヘルパーベクター）上に提供される。しかし、より好ましくは、本発明のｒＡＡＶを製造するためには、必要なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供するＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド、ならびにそのような非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含むベクターから分離されたベクター上に提供され、そのようなベクターまたはプラスミドは、ｒＡＡＶと協働して、トリプルプラスミドトランスフェクションシステムを含む。

したがって、本発明は、一部は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現を天然プロモーター配列ではないプロモーター配列によって誘導することによって、ｒＡＡＶの産生を増加させることができるという認識に由来する。したがって、特定のｒＡＡＶを改変して、その天然のＰ５および／またはＰ４０ＡＡＶ血清型プロモーター配列を非天然Ｐ５および／またはＰ４０ＡＡＶ血清型プロモーター配列で置換することによって（または非天然Ｐ５または／およびＰ４０ＡＡＶ血清型プロモーター配列を取り込むことによって）、本発明の方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０血清型を含み、ハイブリッド血清型（例えば、ＡＡＶ２／５およびｒＡＡＶ２／５、ＡＡＶ血清型２および５のハイブリッドであり、そのような血清型の両方の栄養性を有する）を含む任意の血清型に属するｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用される。

本発明の方法は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルスまたはパピローマウイルスによって提供される「ヘルパー」ＲＮＡまたはタンパク質を用いて産生されるｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用することができる。

本発明の方法は、接着単層培養または懸濁培養において細胞によって産生されるｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用することができ、ｒＡＡＶを産生することができる任意の方法とともに使用することができる。しかしながら、ｒＡＡＶは、好ましくは、組織培養で成長させたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、またはより好ましくは、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を上述されたプラスミドベクターでトランスフェクトすることによって産生される。内因性レトロウイルスを欠くＢＨＫ細胞株ＢＨＫ－２１（ＡＴＣＣＣＣＬ－１０）は、好ましいＢＨＫ細胞株である。ＨＥＫ細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ－１５７３）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣＣＲＬ－３２１６：ＳＶ４０Ｔ抗原に対する温度感受性遺伝子が挿入されたＨＥＫ２９３細胞株の高度にトランスフェクト可能な誘導体）またはＨＥＫ２９３Ｔ／１７（トランスフェクションの容易さのために選択されたＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１１２６８）のような、その誘導体が特に好ましい。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＳＦ細胞株（ＡＴＣＣＡＣＳ－４５００）は、無血清培地および懸濁液に適合した２９３Ｔ／１７細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ－１１２６８）の誘導体であり、希望によって用いることができる。

このような細胞を培養するための本発明の好ましい基本培地は、イーグル最小必須培地（ＡＴＣＣカタログＮｏ．３０－２００３）またはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。ウシ胎児血清（例えばＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳｏｕｔｈＬｏｇａｎ，ＵＴ）を１０％の最終濃度まで添加して完全増殖培地が作製される。イーグル最小必須培地およびダルベッコの改変イーグル培地は、様々な無機塩に加えて、アミノ酸、ビタミン、および必要に応じてグルコースを含有する複合培地である。ダルベッコの改変イーグル培地は、オリジナルのイーグル最小必須培地の約４倍のビタミンとアミノ酸を含み、２～４倍のグルコースを含むという点で培地は異なる。追加的に、それはｐＨ表示用に硫酸第二鉄の形態の鉄とフェノールレッドを含有する（Ｙａｏ，Ｔ他（２０１７）“Ａｎｉｍａｌ－ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉａ：Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ＡｎｄＣｕｒｒｅｎｔＩｓｓｕｅｓ，”Ｒｅｐｒｏｄｕｃ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：９９－１１７）。

このようなトランスフェクションに使用される細胞は、好ましくは、指数増殖期に維持するために週２回継代される。小規模トランスフェクションについては、例えば、マルチウェルプレート上のウェル当たり１×１０^６ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞、または１５ｃｍディッシュ当たり１．５×１０^７ＨＥＫ２９３細胞のアリコートを使用することができる。大規模産生のために、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞は、複数のコンフルエントな１５ｃｍプレートから収集され、１リットルの完全な培養培地を含有する２つの１０層細胞スタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に分割され得る。一実施形態において、そのような細胞は、トランスフェクション前にそのような培地中で４日間増殖される。トランスフェクションの前日に、２つの細胞スタックをトリプシン処理し、細胞（例えば、約６×１０^８細胞）を２００ｍｌの培地中に再懸濁させてもよい。好ましくは、細胞をトランスフェクション前に２４時間付着させる。細胞スタックの集密性は、顕微鏡ステージ上に細胞スタックを収容するために、位相コントラストハードウェアが除去された、ダイアポット（Ｄｉａｐｈｏｔ）倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてモニターすることができる。

特に、本発明はさらに、導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法を提供すし、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）ｒＡＡＶ；
（２）ＡＡＶヘルパー機能を提供するポリヌクレオチドを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ヘルパーベクターであって、そのようなポリヌクレオチドは、天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列の置換またはそれに加えて、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列を含む、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ヘルパーベクター；および
（３）さらなるベクター、特に、非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチを含む、プラスミドベクター；
培養は、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、前記ｒＡＡＶの産生を引き起こす。

本発明はさらに、導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法を提供し、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）ｒＡＡＶ；および
（２）以下を含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ヘルパーベクター：
（ａ）ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドであって、そのようなポリヌクレオチドは、天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列の置換またはそれに加えて、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列を含む、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド；および
（ｂ）非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド；
培養は、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、前記ｒＡＡＶの産生を引き起こす。

好ましい態様において、そのようなｒＡＡＶの導入遺伝子カセットは、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である。
ＩＩ．本発明の薬学的組成物

本発明は、さらに、本発明の方法に従って製造されたｒＡＡＶの薬学的に許容される調製物、および薬学的に受容可能な担体を含む薬学的組成物を含む。そのような薬学的組成物のｒＡＡＶは、タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを含むか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的であり、そのような薬学的組成物中に有効な量（「有効量」）で存在する。

用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関あるいは米国薬局方（ＵＳＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）または他の一般に認められた薬局方にリストされた規制機関によって、動物、特にヒトにおける使用が承認されたことを意味する。用語「担体」は、それと共に治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント）、賦形剤、または賦形剤を指す。そのような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油のような滅菌液体であり得る。薬学的組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、所望すれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。適切な薬学的形剤は、米国特許第８，８５２，６０７号；米国特許第８，１９２，９７５号；米国特許第６，７６４，８４５；米国特許第６，７５９，０５０号および米国特許第７，５９８，０７０号に記載される。

一般に、本発明の組成物の成分は、例えば、乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、または活性剤の量を示すバイアル、アンプルまたはサシェットのような密封容器中の水溶液として、単位投与形態で別々に、または一緒に混合されて供給される。この組成物を注入によって投与する場合には、無菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて投与することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射または生理食塩水のための滅菌水のアンプル、または他の希釈剤を提供して、成分を投与前に混合することができる。

本発明はまた、このような薬学的組成物の１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、適宜、薬品または生物由来製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定める様式による通知を関連付けることができる。その通知とは、人の投与のための、製造、使用または販売の機関による承認を反映するものである。

このような薬学的組成物のｒＡＡＶは、好ましくは、バイアル、アンプルまたはサシェットのような密封容器内に包装され、分子の量を示し、任意に使用指示書を含む。一実施形態では、このようなキットのｒＡＡＶは、乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密閉容器内に供給され、対象への投与のための適切な濃度まで、例えば、水、生理食塩水または他の希釈剤で再構成することができる。凍結乾燥物は、元の容器で２～８°Ｃで保存され、再構成された後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または溶解後１時間以内に投与される。別の実施形態では、このようなキットのｒＡＡＶは、密閉容器内の水溶液として供給され、例えば、水、生理食塩水、または他の希釈剤で、被験体への投与のための適切な濃度に希釈され得る。キットは、１つ以上の容器中に、疾患または状態の治療に有用な１つ以上の他の予防および／または治療剤をさらに含むことができる；および／またはキットは、癌に関連する１以上の癌抗原に結合する１以上の細胞傷害性抗体をさらに含むことができる。ある態様において、他の予防または治療剤は化学療法剤である。他の態様において、予防剤または治療剤は、生物学的またはホルモン治療剤である。
ＩＩＩ．本発明の使用

本発明の方法は、ｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、特に、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドなど）をコードする導入遺伝子カセットを含むｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態を治療する、ｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、そのような疾患または状態を治療するための遺伝子治療において使用することができる。そのような疾患および状態の例には、色盲（ＡＣＨＭ）、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症；アルツハイマー病；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）欠損症；脈絡膜血症（ＣＨＭ）；癌；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；ジスフェルリン欠損症；ホリスタチン遺伝子欠損症（ＢＭＤＳＩＢＭ）；血友病Ａ；血友病Ｂ；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ハンチントン病；特発性パーキンソン病；乳児後期神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ、バッテン病の乳児型）；レーベル先天性黒内障（ＬＣＡ）；レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ（ＬＧＭＤ１Ｂ）；肢帯型筋ジストロフィー１Ｃ（ＬＧＭＤ１Ｃ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ａ（ＬＧＭＤ２Ａ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ（ＬＧＭＤ２Ｉ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）；リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）欠損症；異染性白質ジストロフィー；神経学的障害；神経運動障害；神経骨格障害；パーキンソン病；関節リウマチ；サンフィリッポＡ症候群；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）；αサルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｄ）；βサルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｅ）；γ－サルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｃ）およびδ－サルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｆ）。
ＩＶ．本発明の実施形態

本発明は、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、その使用および組成物に関する。それは特に以下の実施形態Ｅ１からＥ１６に関する。
Ｅ１．ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターであって、ポリヌクレオチドが非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列を含む、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
Ｅ２．ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドベクターが非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター配列を含む、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
Ｅ３．ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドベクターが非天然ＡＡＶ血清型Ｐ４０プロモーター配列を含む、Ｅ１またはＥ２のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
Ｅ４．ベクターがプラスミドベクターであるＥ１からＥ３のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
Ｅ５．非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列が天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を置換する、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
Ｅ６．ベクターが、非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドをさらに含む、Ｅ１からＥ６のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
Ｅ７．導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）ｒＡＡＶ；および
（２）Ｅ６の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、
培養は、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、ｒＡＡＶの産生を引き起こす、方法。
Ｅ８．導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）ｒＡＡＶ；
（２）Ｅ１からＥ６のいずれか組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター；および
（３）非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチを含む、さらなるベクター、特にプラスミドベクター、
培養は、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、ｒＡＡＶの産生を引き起こす、方法。
Ｅ９．Ｅ７またはＥ８の方法であって、
（Ａ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ１Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｂ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ２Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｃ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ３Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｄ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ４Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｅ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ５Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｆ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ６Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｇ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ７Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；または
（Ｈ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ７、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である、
方法。
Ｅ１０．細胞がヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞またはｓｆ９昆虫細胞であるＥ７からＥ９の方法。
Ｅ１１．細胞がＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞であるＥ１０の方法。
Ｅ１２．細胞がＢＨＫ２１ベビーハムスター腎細胞であるＥ１１の方法。
Ｅ１３．導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、Ｅ７からＥ１２のいずれか方法。
Ｅ１４．Ｅ１３の方法によって産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物。
Ｅ１５．Ｅ１３の方法によって産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、および、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
Ｅ１６．遺伝性の疾患または状態を治療に使用するための、Ｅ１４の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物またはＥ１５の薬学的組成物。

本発明を一般的に説明した後、以下の実施例を参照することにより、同じことがより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供され、特定されない限り、本発明を限定することを意図しない。
実施例１
非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター配列を有するＡＡＶＲＣ２ヘルパープラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列がｒＡＡＶの産生力価に影響を及ぼす能力を示すために、そのようなプラスミドの天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター（図１２Ａ；下向きの縞模様の長方形）の代わりに非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ２（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ２血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体を構築した（図１１）。構築物のＰ１９およびＰ４０プロモーターは変化せず、したがって両方、天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列であった（図１２Ａ；黒で塗られた長方形）。

以下の構築物を使用した；プロモーター領域の配列を表１に示す：
（１）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子および完全なＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）の一部の部分、およびＡＡＶ２ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ２（配列番号２）；
（２）Ｐ５（１）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型１のＰ５プロモーター配列（配列番号９）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（３）Ｐ５（２）－ＲＣ２
Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２の部分的ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型２の完全長Ｐ５プロモーター（配列番号１０）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（４）Ｐ５（３）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型３のＰ５プロモーター配列（配列番号１１）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（５）Ｐ５（４）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型４のＰ５プロモーター配列（配列番号１２）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（６）Ｐ５（５）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型５のＰ５プロモーター配列（配列番号１３）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣの誘導体；
（７）Ｐ５（６）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型６のＰ５プロモーター配列（配列番号１４）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣの誘導体；
（８）Ｐ５（７）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型７のＰ５プロモーター配列（配列番号１５）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣの誘導体；および
（９）Ｐ５（８）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型８のＰ５プロモーター配列（配列番号１６）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣの誘導体。

図１２Ｂは、そのようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、ｒＡＡＶ（ｐＧＯＩ；ＢＢａ＿Ｋ４０４１１９）と、必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）でのトリプルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた。プラスミドｐＧＯＩは、５’から３’方向に、５’ＩＴＲ、ＣＭＶプロモーター、β－グロビンイントロン、黄色蛍光タンパク質ｍＶｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ，Ｔ．他（２００２）“ＡＶａｒｉａｎｔＯｆＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＷｉｔｈＦａｓｔＡｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＭａｔｕｒａｔｉｏｎＦｏｒＣｅｌｌ－ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：８７－９０）をコードするポリヌクレオチド、ヒト成長ホルモンのポリＡドメイン、および３’ＩＴＲを含むｒＡＡＶプラスミドベクターである。
図１２Ｂは、Ｐ５プロモーターの血清型がｒＡＡＶ産生力価に影響を及ぼすことを明らかにし、プラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の天然のＡＡＶ２Ｐ５プロモーターをＡＡＶ５血清型Ｐ５プロモーターへ置換することは、ｒＡＡＶ産生力価を大きく減少したこと、一方、プラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の天然のＡＡＶ２Ｐ５プロモーターのＡＡＶ血清型１、３、５、７または８のＰ５プロモーターでの置換は、ｒＡＡＶ産生力価を大きく増加したことを示す。
実施例２
非天然ＡＡＶ血清型Ｐ４０プロモーター配列を有するＡＡＶＲＣ２ヘルパープラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列がｒＡＡＶの産生力価に影響を及ぼす能力をさらに示すために、そのようなプラスミドの天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター（図１３Ａ；上向きの縞模様の長方形）の代わりに非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ２（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ２血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体を構築した（図１１）。構築物のＰ５およびＰ１９プロモーターは変化せず、したがって両方、天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列であった（図１３Ａ；黒で塗られた長方形）。

以下の構築物を使用した；プロモーター領域の配列を表１に示す：
（１）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子および完全なＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）の一部の部分、およびＡＡＶ２ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ２（配列番号２）；
（２）Ｐ４０（１）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型１のＰ４０プロモーター配列（配列番号１７）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（３）Ｐ４０（２）－ＲＣ２
Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２のＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型２のＰ４０プロモーター配列（配列番号１８）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（４）Ｐ４０（３）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型３のＰ４０プロモーター配列（配列番号１９）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（５）Ｐ４０（４）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型４のＰ４０プロモーター配列（配列番号２０）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（６）Ｐ４０（５）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型５のＰ４０プロモーター配列（配列番号２１）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（７）Ｐ４０（６）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型６のＰ４０プロモーター配列（配列番号２２）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（８）Ｐ４０（７）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型７のＰ４０プロモーター配列（配列番号２３）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；および
（９）Ｐ４０（８）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ血清型８のＰ４０プロモーター配列（配列番号２４）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体。

図１３Ｂは、そのようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、本質的に実施例１に記載したように得られた。調査の結果は、Ｐ４０プロモーターの血清型もｒＡＡＶ産生力価に影響を及ぼすことを明らかにし、プラスミドベクターｐＡＡＶ‐ＲＣ２の天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーターのＡＡＶ５血清型Ｐ４０プロモーターへの置換はｒＡＡＶ産生力価を大きく減少したこと、一方、プラスミドベクターｐＡＡＶＲＣ２の天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーターのＡＡＶ１血清型Ｐ４０プロモーターまたはＡＡＶ８血清型Ｐ４０プロモーターへの置換はｒＡＡＶ産生力価を大きく増加したことを示す。
実施例３
非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーター配列を有するＡＡＶＲＣ２ヘルパープラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列がｒＡＡＶの産生力価に影響を及ぼす能力をさらに示すために、そのようなプラスミドの天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５（図１４Ａ；下向き縞模様の長方形）およびｐ４０（図１４Ａ；上向き縞模様の長方形）プロモーターの代わりに非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ２（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ２血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体を構築した（図１１）。構築物のＡＡＶ２Ｐ５およびＰ１９プロモーターは変化せず、したがって天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列であった（図１４Ａ；黒で塗られた長方形）。

以下の構築物を使用した；プロモーター領域の配列を表１に示す：
（１）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ２
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子および完全なＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）の一部の部分、およびＡＡＶ２ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ２（配列番号２）；
（２）Ｐ５（２）－ＲＣ２
該一部のＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型２のＰ５プロモーター配列（配列番号１０）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（３）Ｐ５（３）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ血清型３のＰ５プロモーター配列（配列番号１１）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（４）Ｐ５（５）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ５血清型のＰ５プロモーター配列（配列番号１３）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（５）Ｐ４０（１）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ１血清型のＰ４０プロモーター配列（配列番号１７）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（６）Ｐ５（２）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ２のＰ５プロモーター配列（配列番号１０）で置換し、天然Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ１のＰ４０プロモーター配列（配列番号１７）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；
（７）Ｐ５（３）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ３のＰ５プロモーター配列（配列番号１１）で置換し、天然Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ１のＰ４０プロモーター配列（配列番号１７）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体；および
（８）Ｐ５（５）／Ｐ４０（１）－ＲＣ２
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ５のＰ５プロモーター配列（配列番号１３）で置換し、天然Ｐ４０プロモーター配列をＡＡＶ１のＰ４０プロモーター配列（配列番号１７）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の誘導体。

ｒＡＡＶの産生力価は、本質的に実施例１に記載したように得られた。図１４Ｂは、そのようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。図１４Ｂに示されるように、ｐＡＡＶ－ＲＣ２の天然Ｐ５およびＰ４０プロモーターのＡＡＶ３またはＡＡＶ５のｐ５プロモーター配列およびＡＡ１のＰ４０プロモーター配列への置換は相乗的にｒＡＡＶ産生力価を増加した。
実施例４
非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーター配列を有するＡＡＶＲＣ６ヘルパープラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列がｒＡＡＶの産生力価に影響を及ぼす能力をさらに示すために、そのようなプラスミドの天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５（図１５Ａ；下向き縞模様の長方形）およびｐ４０（図１５Ａ；下向き縞模様の長方形）プロモーターの代わりに非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ６（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ６血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体を構築した（図１１）。構築物のＡＡＶ２Ｐ５プロモーターは変化せず、したがって天然ＡＡＶ２血清型プロモーター配列であった（図１５Ａ；黒で塗られた長方形）。

以下の構築物を使用した；プロモーター領域の配列を表１に示す：
（１）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ６
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とその天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）およびＡＡＶ６ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ６（配列番号４）；
（２）Ｐ５（１）－ＲＣ６
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ１血清型のＰ５プロモーター配列（配列番号９）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ６の誘導体；
（３）Ｐ５（２）－ＲＣ６
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ２血清型のＰ５プロモーター配列（配列番号１０）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ６の誘導体；
（４）Ｐ５（３）－ＲＣ６
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ３血清型のＰ５プロモーター配列（配列番号１１）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ６の誘導体；
（５）Ｐ５（７）－ＲＣ６
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ７血清型のＰ５プロモーター配列（配列番号１５）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ６の誘導体；および
（６）Ｐ５（８）－ＲＣ６
天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列をＡＡＶ８血清型のＰ５プロモーター配列（配列番号１６）で置換したプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ６の誘導体。

図１５Ｂは、そのようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、本質的に実施例１に記載したように得られた。

調査の結果は図１５Ｂおよび１５Ｃに示され、そのようなＡＡＶヘルパープラスミドベクターを用いて得られる産生力価を明らかにする。そのような図に示されるように、ｐＡＡＶ－ＲＣ６の天然Ｐ５およびＰ４０プロモーターのＡＡＶ血清型１、２、３、７または８のｐ５プロモーター配列での置換はｒＡＡＶ産生力価を増加した。
実施例５
非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーター配列を有するＡＡＶＲＣ１、ＡＡＶＲＣ５またはＡＡＶＲＣ７ヘルパープラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列がｒＡＡＶの産生力価に影響を及ぼす能力をさらに示すために、そのようなプラスミドの天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５（図１６Ａ；下向き縞模様の長方形）および／またはｐ４０（図１６Ａ；上向き縞模様の長方形））プロモーターの代わりにＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ１（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ１血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体、ＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ５（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ５血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体、およびＡＡＶヘルパープラスミドＡＡＶＲＣ７（ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ７血清型のＣａｐタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を有する）の誘導体を、非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を有するように構築した（図１１）。

以下の構築物を使用した；プロモーター領域の配列を表１に示す：
（１）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ１
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とその天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）、およびＡＡＶ１ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ１（配列番号１）；
（２）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ５
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とその天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）、およびＡＡＶ５ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ５（配列番号３）；
（３）Ｐａｒｅｎｔ－ＲＣ７
ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とその天然ＡＡＶ２血清型Ｐ５プロモーター配列（配列番号１０）、およびＡＡＶ７ｃａｐ遺伝子を含み、その発現が天然ＡＡＶ２Ｐ４０プロモーター配列（配列番号１８）によって制御されるｐＡＡＶ－ＲＣ７（配列番号５）；
（４）Ｐ５（２）－ＲＣ１
天然ＡＡＶ１血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ２のＰ５プロモーター配列（配列番号１０）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ１の誘導体；
（５）Ｐ５（７）－ＲＣ１
天然ＡＡＶ１血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ７のＰ５プロモーター配列（配列番号１５）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ１の誘導体；
（６）Ｐ５（８）－ＲＣ１
天然ＡＡＶ１血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ８のＰ５プロモーター配列（配列番号１６）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ１の誘導体；
（７）Ｐ５（７）－ＲＣ５
天然ＡＡＶ５血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ７のＰ５プロモーター配列（配列番号１５）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ５の誘導体；
（８）Ｐ５（２）－ＲＣ７
天然ＡＡＶ７血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ２のＰ５プロモーター配列（配列番号１０）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ７の誘導体；
（９）Ｐ５（７）－ＲＣ７
天然ＡＡＶ７血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ７のＰ５プロモーター配列（配列番号１５）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ７の誘導体；および
（１０）Ｐ５（８）－ＲＣ７
天然ＡＡＶ７血清型Ｐ５プロモーター配列がＡＡＶ８のＰ５プロモーター配列（配列番号１６）で置換されたプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ７の誘導体。

ＡＡＶの産生力価は、本質的に実施例１に記載したように得られた。調査の結果は図１６Ｂに示され、ｐＡＡＶ－ＲＣ１、ｐＡＡＶ－ＲＣ５、およびｐＡＡＶ－ＲＣ７の天然Ｐ５プロモーター配列のＡＡＶ血清型２、７または８のＰ５プロモーター配列での置換はｒＡＡＶ産生力価を増加したことを明らかにする。

本明細書に記載されているすべての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、その全体が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、本発明はさらに修正することが可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従った、本発明が関係する技術分野の既知のまたは慣習的な実施の範囲内で得られる本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または適応をカバーすることが意図されていることが理解されるであろう。

Claims

ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクターであって、前記ポリヌクレオチドが非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列を含む、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドベクターが非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５プロモーター配列を含む、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドベクターが非天然ＡＡＶ血清型Ｐ４０プロモーター配列を含む、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
前記ベクターがプラスミドベクターである請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
前記非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列が天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列を置換する、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
前記ベクターが、非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター。
導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）前記ｒＡＡＶ；および
（２）請求項６に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、
前記培養は、前記ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、前記非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、前記細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、前記ｒＡＡＶの産生を引き起こす、方法。
前記導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、請求項７に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
請求項７に記載の方法であって：
（Ａ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ１Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｂ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ２Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｃ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ３Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｄ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ４Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｅ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ５Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｆ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ６Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｇ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ７Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；または
（Ｈ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ７、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドであるＡＡＶのプロモーター配列である、
方法。
前記細胞がヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞またはｓｆ９昆虫細胞である請求項７に記載の方法。
前記細胞がＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞である請求項１０に記載の方法。
前記細胞がＢＨＫ２１ベビーハムスター腎細胞である請求項１０に記載の方法。
導入遺伝子カセットを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法は、以下でトランスフェクトされた細胞を培養することを含み：
（１）前記ｒＡＡＶ；
（２）請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター；および
（３）非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチを含む、さらなるベクター、特にプラスミドベクター；
前記培養は、前記ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、培地中で行われ、前記非天然ＡＡＶ血清型Ｐ５またはＰ４０プロモーター配列の存在は、前記細胞が、前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドが天然血清型Ｐ５およびＰ４０プロモーターを含有する場合に達成されるものと比較して、増加した産生力価で、前記ｒＡＡＶの産生を引き起こす、方法。
前記導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、請求項１３に記載の方法。
請求項１３に記載の方法であって、
（Ａ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ１Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｂ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ２Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｃ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ３Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｄ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ４Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｅ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ５Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｆ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ６Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；
（Ｇ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ７Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である；または
（Ｈ）前記ベクターの前記ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８Ｃａｐタンパク質をコードし、前記非天然ＡＡＶ血清型プロモーター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６またはＡＡＶ７、または前記血清型の１つ以上のハイブリッドのＡＡＶのプロモーター配列である、
方法。
前記細胞がヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞またはｓｆ９昆虫細胞である請求項１３に記載の方法。
前記細胞がＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞である請求項１６に記載の方法。
前記細胞がＢＨＫ２１ベビーハムスター腎細胞である請求項１６に記載の方法。
請求項６に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、および、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
請求項１３に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、および、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。