ES2210391T3 - Sistema auxiliar de alta eficacia para la produccion de vectores aav. - Google Patents

Sistema auxiliar de alta eficacia para la produccion de vectores aav.

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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE PRESENTAN REGIONES CODIFICADORAS DE VIRUS ADENO UE SON CAPACES DE EXPRESAR LAS FUNCIONES DE AAV NECESARIAS PARA FORMAR UN VECTOR DE AAV EN LA PRODUCCION DE VIRIONES DE AAV RECOMBINANTES (RAAV). LAS MOLECULAS INCLUYEN UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE ES SUSTANCIALMENTE HOMOLOGA CON UNA REGION PROMOTORA P5 DE AAV, ESTANDO LA REGION PROMOTORA P5 SITUADA EN LAS MOLECULAS EN UN SITIO QUE ES DISTINTO DE SU POSICION NATURAL EN RELACION CON LA REGION CODIFICADORA REP DE AAV EN EL GENOMA DE AAV DE TIPO SALVAJE. TAMBIEN SE DESCRIBEN CONSTRUCTOS DE FUNCION COADYUVANTE DE AAV, QUE INCLUYEN LAS PRESENTES MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO INCLUIDAS EN UN REPLICON QUE ES CAPAZ DE SER TRANSCRITO Y TRADUCIDO PARA EXPRESAR FUNCIONES COADYUVANTES DE AAV COMPLEMENTARIAS EN UNA CELULA HUESPED ADECUADA. SE DESCRIBEN NUEVAS CELULAS DE INCLUSION DE AAV Y CELULAS PRODUCTORAS DE AAV, QUE CONTIENEN LOS CONSTRUCTOS COADYUVANTES DE AAV DE LA INVENCION, Y PROCEDIMIENTOS PARAPRODUCIR UNOS NIVELES AUMENTADOS DE VIRIONES DE RAAV UTILIZANDO LOS CONSTRUCTOS COADYUVANTES DE AAV DE LA INVENCION. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR VIRIONES DE RAAV SIN LA PRODUCCION CONCOMITANTE DE UNOS NIVELES SIGNIFICATIVOS DE AAV DE TIPO SALVAJE.

Description

Sistema auxiliar de alta eficacia para la producción de vectores AAV.
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a sistemas de función auxiliar de uso en la producción de vector de virus adeno-asociado (AAV). Más específicamente, la invención se refiere a construcciones de función auxiliar de AAV que proporcionan la expresión de funciones rep y cap de AAV esenciales necesarias para la producción de viriones de AAV.
Fundamento de la invención
La entrega de genes es un método prometedor para el tratamiento de enfermedades adquiridas y hereditarias. Se ha descrito un cierto número de sistemas de base vírica con fines de transferencia de genes, tales como sistemas retrovíricos, que son actualmente los sistemas de vectores víricos usados más ampliamente con este propósito. Véanse, por ejemplo, descripciones de diversos sistemas retrovíricos en, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
Se han usado también sistemas de virus adeno-asociados (AAV) para entrega de genes. El AAV es un parvovirus de ADN dependiente de auxiliar que pertenece al género Dependovirus. El AAV requiere la coinfección con un virus auxiliar no relacionado, un adenovirus, un herpesvirus o viruela vacuna, para que tenga lugar una infección productiva. En ausencia de tal coinfección, el AAV establece un estado latente por inserción de su genoma en un cromosoma de célula hospedante. La infección subsiguiente por un virus auxiliar rescata la copia integrada que puede replicarse después para producir progenie vírica infecciosa. El AAV tiene un amplio intervalo de hospedantes y es capaz de replicarse en células de cualquier especie en tanto haya también una coinfección con éxito de tales células con un virus auxiliar adecuado. Así, por ejemplo, el AAV humano se replica en células de canes coinfectadas con un adenovirus de canes. El AAV no se ha asociado con ninguna enfermedad de seres humanos o animales y no parece alterar las propiedades biológicas de la célula hospedante por integración. Para un examen de AAV, véase, por ejemplo, Berns y Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307.
El genoma de AAV está compuesto por una molécula de ADN de cadena sencilla lineal que contiene 4.681 bases (Berns y Bohenzky, supra). El genoma incluye repeticiones terminales invertidas (ITRs) en cada extremo que funcionan en cis como orígenes de replicación de ADN y como señales de empaquetado para el virus. Las ITRs tienen una longitud de aproximadamente 145 pares de bases. La porción no repetida interna del genoma incluye dos grandes estructuras de lectura abiertas, conocidas como regiones rep y cap de AAV, respectivamente. Estas regiones codifican las proteínas víricas implicadas en la replicación y empaquetado del virión. En particular, se sintetiza una familia de al menos cuatro proteínas víricas a partir de la región rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, nombradas según su peso molecular aparente. La región cap de AAV codifica al menos tres proteínas, VP1, VP2 y VP3. Para una descripción detallada del genoma de AAV, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158: 97-129.
Se ha descrito la construcción de viriones de AAV recombinante. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nº 5.173.414 y 5.139.941; los Números de Publicación Internacional WO 92/01070 (publicada el 23 de Enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de Marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158:97-129; y Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801.
Se producen generalmente viriones de AAV recombinante (AAVr) en una célula hospedante adecuada que se ha transfectado con dos construcciones que incluyen un plásmido vector de AAV y un plásmido auxiliar, por lo que la célula hospedante es capaz así de expresar las proteínas de AAV necesarias para la replicación y empaquetado de AAV (funciones auxiliares de AAV). La célula hospedante se coinfecta después con un virus auxiliar apropiado para proporcionar funciones auxiliares víricas necesarias. Las funciones auxiliares de AAV pueden proporcionarse transfectando la célula hospedante con un plásmido auxiliar de AAV que incluye las regiones de codificación de AAV rep y/o cap pero que carece de las ITRs de AAV. Por consiguiente, el plásmido auxiliar no puede replicar ni empaquetar por sí mismo. Se conoce un cierto número de vectores que contienen la región de codificación rep, incluyendo los vectores descritos en la Patente de los EE.UU. Nº 5.139.941, que tienen números de admisión ATCC 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226. De manera similar, se describen métodos para obtener vectores que contienen el homólogo de HHV-6 de rep de AAV en Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311. También se ha descrito un cierto número de vectores que contienen la región de codificación cap, incluyendo los vectores descritos en la Patente de los EE.UU. Nº 5.139.941. Se han descrito linajes celulares de empaquetado derivados de células 293 humanas que se han transfectado con un vector que tiene el gen de rep de AAV enlazado operativamente a un promotor de transcripción heterólogo en las Publicaciones Internacionales Nº WO 95/13392, publicada el 18 de Mayo de 1995, y WO 95/13365, publicada el 18 de Mayo de 1995.
En la producción de viriones de AAVr, los plásmidos vectores de AAV pueden diseñarse para contener una secuencia de nucleótidos relevante funcionalmente (por ejemplo, un gen seleccionado, una molécula de ácido nucleico antisentido, una ribozima o similar) de interés que esté flanqueada por ITRs de AAV que proporcionen funciones de replicación y empaquetado de AAV. Los plásmidos auxiliares de AAV y el plásmido vector de AAV que lleva la secuencia de nucleótidos se introducen en células receptoras por transfección transitoria. Las células transfectadas se infectan después con adenovirus que transactiva los promotores de AAV presentes en el plásmido auxiliar que dirigen la transcripción y traducción de regiones rep y cap de AAV. Se forman viriones de AAVr que albergan la secuencia de nucleótidos de interés y pueden purificarse a partir de la preparación.
Una célula hospedante que se ha transfectado con un plásmido auxiliar que codifica funciones auxiliares de AAV comprende una célula de empaquetado que, en virtud de la transfección, es capaz de expresar productos de gen de AAV para complementar funciones necesarias suprimidas de un plásmido vector de AAV seleccionado. Se ha hecho un cierto número de intentos para establecer sistemas de células de empaquetado. Particularmente, Mendelson et al. (1988) Virology 166:154-165 informaban de un linaje celular capaz de expresión de bajo nivel de una de las formas cortas de Rep usando transfección estable de HeLa o células 293 con plásmidos que contienen el gen de rep. Se han descrito también linajes celulares que contienen genes de rep y cap de AAV integrados expresados a partir de los promotores de AAV normales. Vincent et al. (1990) Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 353-359.
Se han intentado otros métodos para establecer sistemas de linajes celulares de empaquetado que contengan vectores de AAV, integrados establemente en el genoma de la célula hospedante o mantenidos como un plásmido episómico. Los linajes celulares se transfectan después con funciones de AAV que complementan trans tales como con construcciones que contienen los genes de rep, o rep y cap de AAV. Véanse, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5.173.414 de Lebkowski, y las Publicaciones Internacionales Nº WO 95/13365, publicada el 18 de Mayo de 1955, y WO 95/13392, publicada el 18 de Mayo de 1955.
Sin embargo, se ha tropezado con un cierto número de problemas en los sistemas de células de empaquetado antedichos que han limitado en gran medida su utilidad. Particularmente, tales sistemas no han sido capaces de generar niveles significativos de viriones de AAV recombinante. Sin unirse a ninguna teoría particular, tales problemas pueden ser debidos en parte a varios efectos inhibidores atribuidos a productos de gen de rep expresados en estos sistemas celulares. Véanse, por ejemplo, Labow et al (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1320-1325 y Tratschin et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2884-2894. Otro problema ha sido la producción de niveles significativos de partículas de AAV de tipo natural contaminantes (por ejemplo, partículas de AAV competentes en la replicación) en tales sistemas celulares de empaquetado debido a los sucesos de recombinación entre vector de AAV y secuencias de plásmidos auxiliares. Senapathy et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:4661-4666.
Por consiguiente, permanece la necesidad de proporcionar construcciones de funciones auxiliares de AAV mejoradas que sean capaces de expresarse en una célula hospedante en niveles eficaces. Además, permanece la necesidad de proporcionar sistemas de células de empaquetado de AAV capaces de producir niveles significativos comercialmente de partículas de AAV recombinante sin generar también niveles significativos de partículas de AAV de tipo natural recombinado contaminantes.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevas moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos que son sustancialmente homólogas a regiones de promotor p5 de AAV y regiones de codificación de AAV (por ejemplo, regiones de codificación rep y cap de AAV). La región de promotor p5 puede estar situada en las moléculas de ácido nucleico en un lugar distinto de su posición normal con relación a la región de codificación rep de AAV en el genoma de AAV de tipo natural. Las moléculas sujeto, que tienen una región de promotor p5 que se ha movido eficazmente de su posición normal aguas arriba (con relación a la región de codificación rep en el genoma de AAV de tipo natural (tn)), presentan varios aspectos nuevos. Primero, la reubicación de la región de promotor p5 puede producir la atenuación de la producción de al menos los productos de Rep de forma larga cuando se expresa la región de codificación rep. Además, están presentes las funciones que actúan cis necesarias para la expresión de los promotores p19 y p40 de AAV, de manera que aparecen expresarse normalmente rep52/40 y cap. También, en moléculas particulares puede reducirse o eliminarse la generación indeseada de partículas de AAV de tipo natural contaminantes durante la producción de AAVr.
También se proporcionan aquí moléculas de ácido nucleico que tienen regiones de codificación de AAV (por ejemplo, regiones de codificación rep y cap de AAV) y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV, en las que la secuencia de nucleótidos está dispuesta en la molécula de tal modo que el promotor p5 está situado en un lugar distinto de su posición normal aguas arriba con relación a la región de codificación rep de AAV en el genoma de AAV tn.
Las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden incluir adicionalmente una o una pluralidad de secuencias de nucleótidos adicionales, en las que la secuencia de nucleótidos adicional simple está dispuesta 5' con las regiones de codificación de AAV y la región de promotor p5, o la pluralidad de secuencias de nucleótidos adicionales está dispuesta para flanquear las regiones de codificación de AAV y la región de promotor p5. Estas secuencias de nucleótidos adicionales son sustancialmente homólogas a sustratos de recombinasa de FLP de levadura (por ejemplo, lugares de objetivo de recombinación "flip" (FRT)). La provisión de lugares de FRT flanqueantes 5' y 3' permite la excisión de la molécula de ácido nucleico a partir de una construcción de vector por acción de la enzima recombinasa de FLP.
La presente invención proporciona también construcciones auxiliares de AAV que son capaces de expresarse para proporcionar polipéptidos de Rep y Cap de AAV. Tales construcciones auxiliares pueden formarse enlazando operativamente las moléculas de ácido nucleico de la invención a elementos de control adecuados que sean capaces de dirigir la transcripción y traducción de las regiones de codificación de AAV contenidas en las construcciones. Las construcciones auxiliares de AAV proporcionadas aquí pueden comprender plásmidos o cualquier otro vector adecuado, y pueden construirse adicionalmente para incluir marcadores genéticos seleccionables tales como genes de resistencia a antibióticos o similares. En una realización particular, la construcción auxiliar de AAV comprende el plásmido pGN1909 (Número de Admisión ATCC 69871). En otras realizaciones particulares, la construcción auxiliar de AAV comprende el plásmido pW1909-1 o el plásmido pH8.
La invención proporciona además células de empaquetado de AAV que son capaces de convertirse en células productoras de AAV cuando está presente en ellas un vector de AAV, y la célula de empaquetado es capaz de expresar funciones auxiliares víricas. Las células de empaquetado de AAV sujeto se producen introduciendo las construcciones auxiliares de AAV de la presente invención en una célula hospedante adecuada. Más particularmente, las construcciones auxiliares pueden transfectarse transitoria o establemente en células hospedantes adecuadas usando técnicas conocidas.
También se proporcionan aquí células productoras de AAV que son capaces de producir viriones de AAVr cuando se expresan en ellas funciones auxiliares víricas. Las células productoras sujeto se forman por transfección de las células de empaquetado de AAV de la presente invención con un vector de AAV adecuado. Según la invención, el vector de AAV comprende generalmente una secuencia de nucleótidos heteróloga que está flanqueada por ITRs de AAV funcionales. La producción de viriones de AAVr que contienen la secuencia de nucleótidos heteróloga (para transducción subsiguiente) puede conseguirse introduciendo funciones auxiliares víricas en las células productoras para transactivar las funciones auxiliares de AAV presentes en las construcciones auxiliares de AAV.
La invención proporciona además métodos para producir viriones de AAVr que incluyen las etapas de: introducir un vector de AAV en una célula hospedante adecuada; introducir en la célula hospedante una construcción auxiliar de AAV seleccionada entre las proporcionadas aquí para expresar funciones auxiliares de AAV esenciales; expresar funciones auxiliares víricas en la célula hospedante; y cultivar la célula para producir viriones de AAVr. El vector de AAV y las construcciones auxiliares de AAV pueden transfectarse a la célula hospedante, secuencial o simultáneamente, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. La expresión de funciones auxiliares víricas puede proporcionarse infectando la célula hospedante con un virus auxiliar adecuado seleccionado del grupo de adenovirus, herpesvirus y virus de viruela vacuna. Las funciones auxiliares víricas transactivan promotores de AAV presentes en la construcción auxiliar de AAV que dirigen la transcripción y traducción de regiones rep y cap de AAV. Así, se forman viriones de AAVr que albergan una secuencia de nucleótidos heteróloga seleccionada y pueden purificarse de la preparación usando métodos conocidos.
Estas y otras realizaciones de la invención sujeto se encontrarán fácilmente para los de experiencia ordinaria en la técnica a la vista de la presente descripción.
Descripción breve de las figuras
La Figura 1 representa la construcción de la construcción de plásmido pGN1909.
La Figura 2 es una representación de plásmido pGN1909.
La Figura 3 muestra las secuencias de nucleótidos de un lugar de FRT de 76 pb [SEC ID NO: 3] y un lugar de FRT "mínimo" de 59 pb [SEC ID NO: 2] que son útiles en la construcción de las construcciones auxiliares de AAV de la presente invención.
La Figura 4 representa una secuencia de polinucleótidos consistente en los pares de bases 145 a 494 [SEC ID NO: 4] del genoma de serotipo 2 de AAV de tipo natural.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención emplea, salvo indicación en contrario, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular y métodos de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican extensamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edición Actual); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, red.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, red., Edición Actual); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, reds., Edición Actual); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, reds., Edición Actual); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijessen, red.); Fundamental Virology, 2ª Edición, vol. I & II (B.N. Fields y D.M. Knipe, reds.).
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí, tanto antes como después, se incorporan por referencia en su integridad.
Según se usan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" y "el" incluyen referencias plurales salvo que el contenido indique claramente lo contrario.
A. Definiciones
Al describir la presente invención, se emplearán las siguientes expresiones, y se pretenden estar definidas como se indica a continuación.
"Transferencia de genes" o "entrega de genes" se refiere a métodos o sistemas para insertar con seguridad ADN extraño en células hospedantes. Tales métodos pueden producir expresión transitoria de ADN transferido no integrado, replicación extracromosómica y expresión de replicones transferidos (por ejemplo, episomas), o integración de material genético transferido en el ADN genómico de células hospedantes. La transferencia de genes proporciona un método único para el tratamiento de enfermedades adquiridas y heredadas. Se ha desarrollado un cierto número de sistemas para la transferencia de genes a células de mamíferos. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5.399.346.
Por "vector" se entiende cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de replicación cuando se asocia con los elementos de control apropiados y que puede transferir secuencias de genes entre células. Así, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos.
Por "repeticiones terminales invertidas de virus adeno-asociado" o "ITRs de AAV" se entiende las regiones palindrómicas reconocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma de AAV, que funcionan juntas en cis como orígenes de replicación de ADN y como señales de empaquetado para el virus. Las ITRs de AAV, junto con la región de codificación rep de AAV, proporcionan la excisión y rescate eficaces, y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ITRs flanqueantes en un genoma de célula de mamífero.
Las secuencias de nucleótidos de regiones de ITR de AAV son conocidas. Véase, por ejemplo, Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" en Fundamental Virology, 2ª Edición, (B.N. Fields y D.M. Knipe, reds.) para la secuencia de AAV-2. Según se usa aquí, una "ITR de AAV" no necesita ser la secuencia de nucleótidos de tipo natural representada, sino que puede estar alterada, por ejemplo, por inserción, supresión o sustitución de nucleótidos. Adicionalmente, la ITR de AAV puede derivarse de cualquiera entre varios serotipos de AAV, incluyendo sin limitación AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Además, Las ITRs 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de AAV no necesitan necesariamente ser idénticas o derivarse del mismo serotipo o aislado de AAV, en tanto funcionen como se pretende, es decir, para permitir la excisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de célula hospedante, y para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando el gen de rep está presente en la célula (en el mismo o en un vector diferente).
Por un "vector de AAV" se entiende un vector derivado de un serotipo de virus adeno-asociado, incluyendo sin limitación AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes de tipo natural de AAV suprimidos en todo o en parte, preferiblemente los genes de rep y/o cap, pero mantienen secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para el rescate, replicación y empaquetado del virión de AAV. Así, un vector de AAV se define aquí incluyendo al menos las secuencias requeridas en cis para replicación y empaquetado (por ejemplo, ITRs funcionales) del virus. Las ITRs no necesitan ser las secuencias de nucleótidos de tipo natural, y pueden estar alteradas, por ejemplo, por inserción, supresión o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias proporcionen el rescate, la replicación y el empaquetado funcionales.
Pueden construirse vectores de AAV usando métodos recombinantes que son conocidos en la técnica para incluir una o más secuencias de nucleótidos heterólogas flanqueadas en ambos extremos (5' y 3') con ITRs de AAV funcionales. En la práctica de la invención, un vector de AAV puede incluir al menos una ITR de AAV y una secuencia de promotor adecuada situada aguas arriba de la secuencia de nucleótidos heteróloga y al menos una ITR de AAV situada aguas abajo de la secuencia heteróloga. Las ITRs 5' y 3' no necesitan necesariamente ser idénticas o derivarse del mismo aislado de AAV, en tanto funcionen como se pretende.
La secuencia de nucleótidos heteróloga seleccionada incluida en el vector de AAV puede comprender cualquier gen deseado que codifique una proteína que tenga en defecto o carezca de un genoma de célula receptora o que codifique una proteína no nativa que tenga un efecto biológico o tereapéutico deseado (por ejemplo, una función antivírica), o la secuencia puede corresponder a una molécula que tenga una función antisentido o ribozima. Los genes adecuados incluyen los usados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, crónicas e infecciosas, incluyendo trastornos tales como SIDA, cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedad cardiovascular, hipercolestemia; diversos trastornos de la sangre incluyendo diversas anemias, talasemias y hemofilia; defectos genéticos tales como fibrosis cística, enfermedad de Gaucher, deficiencia en deaminasa de adenosina (ADA), enfisema, etc. Se ha descrito en la técnica un cierto número de oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, oligonucleótidos cortos complementarios de secuencias alrededor del lugar de iniciación traduccional (codón AUG) de un ARNm) que son útiles en terapia antisentido para cáncer y para enfermedades víricas. Véase, por ejemplo, Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317; Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90:543-584; Helene et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049:99-125; Agarwal et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083; y Heikkila et al. (1987) Nature 328:445-449. Para una discusión de ribozimas adecuados, véase, por ejemplo, Cech et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17479-17482 y Patente de los EE.UU. Nº 5.225.347 de Goldberg et al.
Los vectores de AAV pueden incluir también secuencias de control, tales como lugares de promotor y poliadenilación, así como marcadores seleccionables o genes informadores, secuencias mejoradoras, y otros elementos de control que permiten la inducción de la transcripción. Tales elementos de control se describen más extensamente después. Tales vectores de AAV pueden construirse usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5.173.414; los Números de Publicación Internacional WO 92/01070 (publicada el 23 de Enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de Marxo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immnuol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165- 169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.
"Funciones auxiliates de AAV" se refiere a secuencias de codificación derivadas de AAV que pueden expresarse para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, pueden funcionar en trans para la replicación productiva de AAV. Así, las funciones axiliares de AAV incluyen uno o ambos de los principales marcos de lectura abiertos (ORFs) de AAV-rep y cap. Se ha demostrado que los productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, incluyendo reconocimiento, unión y corte del origen de AAV de replicación de ADN; actividad de helicasa de ADN; y modulación de la transcripción a partir de promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Cap suministran funciones de empaquetado necesarias. Las funciones auxiliares de AAV se usan aquí para complementar las funciones de AAV en trans ausentes de vectores de AAV.
La expresión "funciones auxiliares víricas" se refiere a la provisión de factores que son necesarios durante diversos aspectos del ciclo de vida de AAV. El AAV requiere tales funciones auxiliares de un virus auxiliar no relacionado (por ejemplo, un adenovirus, un herpesvirus o un virus de viruela vacuna), para que tenga lugar una infección productiva de AAV. Particularmente, se ha demostrado que el adenovirus suministra factores requeridos para la expresión del promotor de AAV, la estabilidad del ARN mensajero de AAV y la traducción de AAV. Véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics. Microbiol. and Immun. 158:97-129. En ausencia de tales funciones, el AAV establece un estado latente por inserción de su genoma en un cromosoma de célula hospedante. La producción de funciones auxiliares víricas rescata la copia integrada que puede replicarse después para producir progenie vírica infecciosa. Las funciones auxiliares víricas pueden proporcionarse por infección de una célula con un virus auxiliar adecuado.
La expresión "construcción auxiliar de AAV" se refiere en general a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones de AAV suprimidas de un vector de AAV que ha de usarse para producir un vector de transducción para la entrega de una secuencia de nucleótidos de interés. Se usan comúnmente construcciones auxiliares de AAV para proporcionar expresión transitoria de genes de rep y/o cap de AAV para completar las funciones de AAV ausentes que son necesarias para la replicación lítica de AAV; sin embargo, las construcciones auxiliares carecen de ITRs de AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí mismas. Las construcciones auxiliares de AAV pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se ha descrito un cierto número de construcciones auxiliares de AAV, tal como los plásmidos usados comúnmente pAAV/Ad y pIM29+45, que codifican productos de expresión de Rep y Cap. Véase, por ejemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Se ha descrito un cierto número de otros vectores que codifican productos de expresión de Rep y/o Cap. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5.139.941.
Por "virus recombinante" se entiende un virus que se ha alterado genéticamente, por ejemplo, por adición o inserción en la partícula de una construcción de ácido nucleico heteróloga.
Por "virión de AAV" se entiende una partícula de virus completa, tal como una partícula de virus de AAV de tipo natural (tn) (que comprende un genoma de ácido nucleico de AAV de cadena sencilla, lineal, asociado con un revestimiento de proteína cápsida de AAV), o una partícula de virus de AAV recombinante como se describe después. A este respecto, pueden empaquetarse en un virión cualquiera de AAV moléculas de cualquier sentido complementario, por ejemplo, cadenas "sentido" o "antisentido", y ambas cadenas son igualmente infecciosas.
Un "virión de AAV recombinante", o "virión de AAVr", se define aquí como un virus infeccioso carente de replicación infeccioso compuesto por una envoltura de proteína de AAV, que encapsida una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que está flanqueada en ambos lados por ITRs de AAV.
La expresión "región de promotor" se usa aquí en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a polimerasa de ARN e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación aguas abajo (dirección 3'). Ciertas secuencias consenso dentro de la región de promotor se creen particularmente importantes en la unión de polimerasa de ARN, y se hace referencia generalmente a ellas como cajas CAT y TATA. Las regiones de promotor se extienden desde aproximadamente 40 nucleótidos hasta aproximadamente 5 nucleótidos aguas arriba del inicio de la región de codificación del gen, estando situadas las cajas CAT y TATA dentro de la región de promotor como extensiones cortas de secuencias de nucleótidos. La caja TATA incluye el lugar de unión de factores de transcripción, pero no la enzima polimerasa de ARN.
Una "región de promotor p5 de AAV" abarca ambas secuencias de promotor con identidad hasta una región de promotor p5 aislada de un serotipo de AAV, incluyendo sin limitación AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc., así como los que son sustancialmente homólogos y equivalentes funcionalmente a ellos (como se define después). El promotor p5 de AAV dirige la expresión de las formas largas de Rep, y se ha descrito y caracterizado. Véase, por ejemplo, Lusby et al. (1982) J. Virol. 41:518-526; Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5567-5571; Green et al. (1980a) J. Virol. 36:79-92; Green et al. (1980b) Cell 1:231-242. Con el fin de definir la presente invención, en el genoma de AAV tn, la región de promotor p5 de AAV está "en su posición natural" cuando se une en el término 5' del lugar de inicio transcripcional de la secuencia de codificación rep y el lugar de inicio transcripcional rep está aproximadamente 25 pb aguas abajo (dirección 3') de la caja TATA de p5, de tal modo que el ATG rep está aproximadamente 6 pb aguas abajo (dirección 3') de la caja TATA de p5. El promotor p5 de AAV tn se extiende aguas arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de las formas largas de Rep en niveles detectables por encima del de fondo.
Una región de promotor p5 de AAV está situada "distinta de en su posición natural" cuando el promotor p5 de AAV se ha movido de su posición natural con relación a la secuencia de codificación rep en la molécula de ácido nucleico particular descrita. Por ejemplo, una región de promotor p5 de AAV "está situada distinta de en su posición natural" cuando esa región está situada en una molécula de ácido nucleico tal que la caja TATA de promotor p5 de AAV no está 25 pb aguas arriba (dirección 5') del lugar de inicio transcripcional rep en esa misma molécula.
Por "región de codificación rep de AAV" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación del virus que se requieren colectivamente para replicar el genoma vírico, u homólogos funcionales de los mismos, tales como el gen rep de herpesvirus humano 6 (HHV-6) del que también se sabe que media en la replicación de ADN de AAV-2 (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311). Así, la región de codificación rep incluye al menos los genes que codifican Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40 de AAV, u homólogos funcionales de ellos. Según se usa aquí, la región de codificación rep no incluye la región de promotor p5 de AAV. Para una descripción adicional de la región de codificación rep de AAV, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158:97- 129; y Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. La región de codificación rep puede derivarse de cualquier serotipo, tal como los serotipos de AAV descritos antes. La región no necesita incluir todos los genes de tipo natural, sino que puede estar alterada, por ejemplo, por inserción, supresión o sustitución de nucleótidos, siempre que los genes de rep presentes proporcionen suficientes funciones de replicación cuando están presentes en una célula hospedante junto con un vector de AAV.
La expresión "formas cortas de Rep" se refiere a los productos génicos de Rep 52 y Rep 40 de la región de codificación rep de AAV, incluyendo homólogos funcionales de los mismos. Las formas cortas de Rep se expresan bajo la dirección del promotor p19 de AAV, que se ha descrito y caracterizado. Véase, por ejemplo, Lusby et al., Laughlin et al., Green et al. (1980a) y Green et al. (1980b), supra.
La expresión "formas largas de Rep" se refiere a los productos génicos de Rep 78 y Rep 68 de la región de codificación rep de AAV, incluyendo homólogos funcionales de los mismos. Las formas largas de Rep se expresan normalmente bajo la dirección del promotor p5 de AAV, que se ha descrito y caracterizado. Véase Lusby et al., Laughlin et al., Green et al. (1980a) y Green et al. (1980b), supra.
Por "región de codificación cap de AAV" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de revestimiento del virus que se requieren colectivamente para empaquetar el genoma vírico. Así, la región de codificación cap incluye al menos los genes que codifican las proteínas de revestimiento VP1, VP2 y VP3. Para una descripción adicional de la región de codificación cap, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158:97-129; y Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. La región de codificación cap de AAV, según se usa aquí, puede derivarse de cualquier serotipo de AAV, como se ha descrito antes. La región no necesita incluir todos los genes de cap de tipo natural, sino que puede estar alterada, por ejemplo, por inserción, supresión o sustitución de nucleótidos, siempre que los genes proporcionen suficientes funciones de empaquetado cuando están presentes en una célula hospedante junto con un vector de AAV.
Por una "región de codificación de AAV" se entiende una molécula de ácido nucleico que incluye los dos principales marcos de lectura abiertos de AAV correspondientes a las regiones de codificación rep y cap de AAV (por ejemplo, una melécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a los pares de bases 310 a 4.440 del genoma de AAV de tipo natural). Véase, por ejemplo, Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45:555-564; Hermonat et al. (1984) J. Virol. 51:329-339; y Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619. Así, para los fines de la presente invención, una "región de codificación de AAV" no incluye las secuencias correspondientes a la región de promotor p5 de AAV, y no incluye las ITRs de AAV.
Un "lugar de objetivo de recombinación "flip"" (FRT) se refiere a una secuencia de nucleótidos que sirve como sustrato en el sistema de recombinasa "flip" de levadura específico para el lugar. Se ha cartografiado la región de recombinación de FRT hasta un segmento de aproximadamente 65 pares de bases (pb) dentro de las repeticiones invertidas de 599 pb de longitud del círculo de 2 \mum (un plásmido que tiene lugar comúnmente en Saccharomyces cerevisiae). La enzima responsable de la recombinación (FLP) se codifica por el círculo de 2 \mum, y se ha expresado en altos niveles en células humanas. La FLP cataliza la recombinación dentro de las repeticiones invertidas de la molécula para ocasionar inversión intramolecular. La FLP también puede promover una recombinación eficaz entre plásmidos que contienen la repetición de círculo de 2 \mum con muy alta eficacia y especificidad. Véase, por ejemplo, Jayaram (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5875-5879; y O'Gorman (1991) Science 251:1351-1355. Se ha descrito en la técnica un "lugar de FRT mínimo" (por ejemplo, un sustrato de FLP mínimo) y se define aquí como una simetría diada de 13 pb más un núcleo de 8 pb situados dentro de la región de FRT de 65 pb. Jayarama et al., supra. Ambos lugares de FRT y plásmidos de expresión de FLP están disponibles comercialmente de Stratagene (San Diego, CA).
"Transfección" se refiere a la absorción de ADN extraño por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana célular. De esta manera, el ADN exógeno puede o no resultar integrado (enlazado covalentemente) con el ADN cromosómico completando el genoma de la célula. Se conoce en la técnica un cierto número de técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al. (1981) Gene 13:197. Puede usarse cualquiera de estas técnicas para introducir uno o más restos de ADN exógeno, tales como construcciones auxiliares de AAV, plásmidos vectores de AAV y otras construcciones de vectores, en células hospedantes adecuadas. Generalmente, el ADN exógeno debe atravesar la membrana de plasma de la célula receptora con el fin de exponerse a la transcripción de la célula y a la maquinaria de replicación. La célula resultante puede transfectarse transitoriamente con la molécula de ácido nucleico exógena o transfectarse establemente, en donde la molécula de ácido nucleico se enlaza covalentemente con el genoma de la célula hospedante o se mantiene y replica como una unidad episómica que puede hacerse pasar a las células progenitoras (por ejemplo, capaz de replicación extracromosómica en una proporción suficiente). Tales métodos de transfección se han descrito en la técnica, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico (Graham et al. (1973) Virol. 52:456-467), microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, M.R. (1980) Cell 22:479-488), electroporación (Shigekawa et al. (1988) BioTechniques 6:742-751), transferencia de genes mediada por liposoma (Mannino et al. (1988) BioTechniques 6:682-690), transfección mediada por lipidos (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), y entrega de ácidos nucleicos usando microproyectiles de alta velocidad (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73).
"Transfección transitoria" se refiere a casos en los que ADN exógeno no se integra en el genoma de una célula transfectada, por ejemplo, cuando ADN episómico se transcribe en ARNm y se traduce en proteína.
Una célula se ha "transfectado establemente" con una construcción de ácido nucleico que comprende regiones de codificación de AAV cuando la construcción de ácido nucleico se ha introducido dentro de la membrana celular y las regiones de codificación de AAV son capaces de ser heredadas por células hijas.
La expresión "célula hospedante" indica, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos, que pueden ser, o han sido, usadas como receptores de una construcción auxiliar de AAV, un plásmido vector de AAV u otro ADN de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Así, una "célula hospedante" según se usa aquí se refiere en general a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógeno usando métodos como se ha descrito antes. Se entiende que la progenie de una célula madre simple puede no ser completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total a la madre original, debido a mutación natural, accidental o deliberada.
Según se usa aquí, la expresión "linaje celular" se refiere a una población de células capaz de crecimiento continuo o prolongado y división in vitro. A menudo, los linajes celulares son poblaciones clónicas derivadas de una célula progenitora simple. Se sabe además en la técnica que pueden tener lugar cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de tales poblaciones clónicas. Por tanto, las células derivadas del linaje celular al que se hace referencia pueden no ser idénticas con precisión a las células o cultivos ancestrales, y el linaje celular al que se hace referencia incluye tales variantes.
Una "célula de empaquetado" se refiere a una célula hospedante que, mediante una transfección estable o transitoria con secuencias de nucleótidos heterólogas, alberga una molécula de ácido nucleico que comprende una construcción auxiliar de AAV, en la que la construcción es capaz de proporcionar expresión transitoria de funciones auxiliares de AAV que pueden proporcionarse en trans para replicación de AAV productiva. La expresión de las funciones auxiliares de AAV puede ser constitutiva o inducible, tal como cuando las funciones auxiliares están bajo el control de un promotor inducible.
Una "célula productora" se refiere a una célula de empaquetado que se ha transfectado estable o transitoriamente con un vector de AAV, antes, después de o al mismo tiempo de la transfección de la célula con las funciones auxiliares de AAV. De esta manera, una célula productora contiene secuencias de AAV que se proporcionan en cis para replicación y empaquetado (por ejemplo, secuencias de ITR funcionales), y secuencias de AAV que codifican funciones auxiliares que carecen del vector de AAV y proporcionadas en trans para replicación y empaquetado. En presencia de funciones auxiliares víricas necesarias, la célula productora es capaz así de codificar polipéptidos de AAV que se requieren para empaquetar ADN vírico transfectado (por ejemplo, vectores víricos de AAV que contienen una secuencia de nucleótidos recombinante de interés) en partículas víricas infecciosas para la entrega de genes subsiguiente.
Las funciones auxiliares víricas, como se han definido antes, pueden introducirse en una célula productora por infección o superinfección de la misma con uno o más restos de virus auxiliares tales como un adenovirus, herpesvirus o virus de viruela vacuna.
El término "heteróloga" en lo referente a secuencias de ácidos nucleicos tales como secuencias de codificación y secuencias de control, indica secuencias que no están normalmente unidas entre sí y/o no están asociadas normalmente con una célula particular. Así, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico es un segmento de ácido nucleico dentro o incorporado a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción podría incluir una secuencia de codificación flanqueada por secuencias que no se encuentran en asociación con la secuencia de codificación en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). De manera similar, una célula hospedante transformada con una construcción que no está presente normalmente en la célula se consideraría heteróloga para los fines de esta invención. La variación alélica o los acontecimientos mutacionales que tienen lugar naturalmente no dan lugar a ADN heterólogo, según se usa aquí.
Una "secuencia de codificación" o una secuencia que "codifica" un polipéptido particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación están determinados por un codón de iniciación en el término 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el término 3' (carboxi). Una secuencia de codificación puede incluir, aunque no está limitada a ello, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción estará situada usualmente 3' con la secuencia de codificación.
La expresión "secuencias de control" de ADN se refiere colectivamente a secuencias de promotor, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, lugares de entrada de ribosomas internos ("IRES"), mejoradores y similares, que proporcionan colectivamente la replicación, transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan estar presentes siempre en tanto el gen seleccionado sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula receptora apropiada.
"Enlazado operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes descritos así están configurados para realizar su función usual. Así, las secuencias de control enlazadas operativamente a una secuencia de codificación son capaces de efectuar la expresión de la secuencia de codificación. Las secuencias de control no necesitan ser contiguas con la secuencia de codificación, en tanto funcionen para dirigir la expresión de ella. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias no traducidas aunque transcritas intermedias entre una secuencia de promotor y la secuencia de codificación, y la secuencia de promotor puede aún considerarse "enlazada operativamente" con la secuencia de codificación.
Por "aislada" cuando se hace referencia a una secuencia de nucleótidos se entiende que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Así, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido sujeto; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente a las características básicas de la composición.
Con el fin de describir la posición relativa de secuencias de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico particular en toda la presente solicitud, tal como cuando se describe que una secuencia de nucleótidos particular está situada "aguas arriba", "aguas abajo", "3'" o "5'" con relación a otra secuencia, ha de entenderse que es la posición de las secuencias en la cadena de "sentido" o "codificación" de una molécula de ADN a la que se hace referencia como es convencional en la técnica.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre restos de dos polinucleótidos o dos polipéptidos. La correspondencia entre la secuencia de un resto y otra puede determinarse por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse la homología por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas de polipéptidos alineando la información de secuencia y usando programas de ordenador fácilmente disponibles. Alternativamente, la homología puede determinarse por hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguida por digestión con nucleasa(s) específicas para cadenas sencillas, y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos ADN, o dos secuencias de polipéptidos, son "sustancialmente homólogos" entre sí cuando al menos alrededor del 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos alrededor del 95% de los nucleótidos o aminoácidos se corresponden sobre una longitud definida de las moléculas, determinado usando los métodos anteriores.
Un "homólogo funcional" o un "equivalente funcional" de un polipéptido dado incluye moléculas derivadas de la secuencia de polipéptido nativa, así como polipéptidos producidos recombinantemente o sintetizados químicamente que funcionan de manera similar a la molécula de referencia para conseguir un resultado deseado. Así, un homólogo funcional de Rep 52 o Rep 40 de AAV abarca derivados y análogos de estos polipéptidos, incluyendo cualesquiera adiciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácidos simples o múltiples, que tengan lugar internamente o en los términos amino o carboxi de los mismos, mientras permanezca la actividad de replicación.
Un "homólogo funcional" o un "equivalente funcional" de una región de promotor de AAV dada incluye promotores derivados de un serotipo de AAV, así como polinucleótidos producidos recombinantemente o sintetizados químicamente que funcionan de manera similar a la región de promotor de referencia para conseguir un resultado deseado. Así, un homólogo funcional de una región de promotor p5 de AAV abarca derivados y análogos de tales secuencias de control, incluyendo cualesquiera adiciones, sustituciones y/o supresiones de bases de nucleótidos simples o múltiples que tengan lugar dentro de la región de promotor, en tanto en cuanto el homólogo del promotor conserve el número mínimo de bases o elementos suficiente para iniciar la transcripción de las formas largas de Rep en niveles detectables por encima del de fondo.
B. Métodos generales
Un objeto principal de la invención es proporcionar sistemas auxiliares de AAV mejorados útiles en la producción de viriones de AAV recombinante (AAVr) que pueden usarse a continuación en métodos de transferencia de genes. Particularmente, un objeto de la invención es desarrollar construcciones auxiliares de AAV que pueden introducirse en células de empaquetado adecuadas para proporcionar la producción mejorada de niveles útiles comercialmente de viriones de AAV recombinante.
En una realización particular, se proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una región de codificación rep y cap de AAV y una región de promotor p5 de AAV que está situada en la molécula sujeto en un lugar distinto de su posición normal con relación a la región de codificación rep de AAV en un genoma de AAV de tipo natural (tn). Las regiones de codificación rep y cap pueden disponerse en la molécula como dos marcos de lectura abiertos principales contiguos, dispuestos respectivamente en el orden dado en la dirección 5' a 3' tal como la disposición normal de esas regiones de codificación en el genoma de AAV tn. Véase, por ejemplo, Berns y Bohenzky (1987) Alvances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; y Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45:555-564.
Alternativamente, las regiones de codificación rep y cap pueden disponerse en la molécula de ácido nucleico como dos regiones no contiguas separadas por nucleótidos intermedios y dispuestas en cualquier orden, siempre que la región de codificación rep incluya al menos un promotor capaz de dirigir la expresión de rep52/40 (tal como una secuencia de nucleótidos que sea sustancialmente homóloga a la región de promotor p19 de AAV), y la región de codificación cap incluya al menos un promotor capaz de dirigir la expresión de los productos de expresión de Cap (tal como una secuencia de nucleótidos que sea sustancialmente homóloga a una región de promotor p40 de AAV).
Las presentes moléculas pueden construirse enlazando secuencias de nucleótidos correspondientes a regiones de codificación rep y cap de AAV (Srivastava et al., supra) con una secuencia de nucleótidos que sea sustancialmente homóloga a una región de promotor p5 de AAV, o que corresponda a los pb 145-309 del genoma de AAV tn (Figura 4, [SEC ID NO:4]), en la que la región de promotor p5 está dispuesta en la molécula en cualquier posición distinta de su posición normal con relación a la región de codificación rep. En una molécula particular, la secuencia de nucleótidos que comprende la región de promotor p5 de AAV es sustancialmente homóloga a los pb 145-494 del genoma de AAV tn (Figura 4, [SEC ID NO: 4]). En otra molécula, la secuencia de nucleótidos que es homóloga a la región de promotor p5 de AAV está situada aguas abajo de ambas regiones de codificación rep y cap, sustancialmente adyacente al término 3' de la región de codificación cap. Por sustancialmente adyacente al término 3' se entiende que la secuencia de nucleótidos sujeto está dentro de aproximadamente 0 a 500 nucleótidos, más preferiblemente dentro de alrededor de 0 a 200 nucleótidos, y aún más preferiblemente dentro de aproximadamente 0 a 50 nucleótidos del término 3' de la región de codificación cap.
En otra realización todavía, la región de promotor p5 de AAV está situada aguas debajo de ambas regiones de codificación rep y cap y separada de ellas por una secuencia de nucleótidos intermedia (X) que tiene una longitud mínima (l), por lo que el fragmento rep-cap-X-p5 de AAV resultante se dimensiona de tal modo que los sucesos de recombinación (durante la producción de viriones de AAV recombinante) entre dicho fragmento y un vector de AAV (que produce una adquisición de ITRs) produzcan una molécula recombinada que sea demasiado grande para empaquetar como un virión de AAV. Se admite generalmente que un fragmento de aproximadamente 5.100 pb representa el límite superior de material genético que puede empaquetarse en tales partículas (véase, por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº 5.173.414 de Lebkowski et al.). De esta manera, se reduce o elimina la producción potencial de partículas de AAV de tipo natural contaminantes. En una molécula particular, la secuencia de nucleótidos intermedia (X) comprende al menos 500 pares de bases.
Las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden aislarse y clonarse en un vector adecuado tal como un plásmido o partícula de virus para proporcionar una construcción auxiliar de AAV, en los que el vector puede incluir adicionalmente elementos de control adecuados para replicación y expresión de las secuencias de codificación de AAV y facilita la transferencia de la molécula de ácido nucleico entre células.
En realizaciones adicionales de la invención, las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden incluir una o más secuencias de nucleótidos que sean sustancialmente homólogas a sustratos de recombinasa de FLP de levadura (por ejemplo, lugares de objetivo de recombinación "flip" (FRT)). Jayaram (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5875-579; y O'Gorman (1991) Science 251:1351-1355. Así, las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden incluir una segunda secuencia de nucleótidos que sea homóloga a un lugar de FRT (o al menos un lugar de FRT mínimo), en las que la segunda secuencia de nucleótidos está dispuesta en la molécula de tal modo que el lugar de FRT está situado aguas arriba de las regiones de codificación de AAV y la región de promotor p5 de AAV. En realizaciones preferidas, se proporcionan moléculas que comprenden, en la dirección 5' a 3', un lugar de FRT (Jayaram y O'Gorman, supra), una región de codificación rep de AAV, una región de codificación cap de AAV y una región de promotor p5 de AAV. En una realización adicional todavía, se proporciona una molécula en la que la secuencia de nucleótidos que contiene la región de promotor p5 de AAV es sustancialmente homóloga a los pb 145-494 del genoma de AAV tn (Figura 4 [SEC ID NO: 4]). La primera secuencia de nucleótidos tiene también un polinucleótido insertado que comprende un lugar de FRT. Más particularmente, se ha puesto un inserto de polinucleótido (que comprende un lugar de FRT) entre los pb 310 y 311 de la primera secuencia, de manera que el lugar de FRT insertado está situado inmediatamente adyacente al término 3' de la región de promotor p5 de AAV (que se extiende de los pb 145 a 310). La construcción resultante se coloca después en la molécula de ácido nucleico para situar la región de promotor p5 de AAV en cualquier posición distinta de su posición normal con relación a la región de codificación rep, como se ha descrito antes. Todas las moléculas antedichas pueden construirse usando métodos recombinantes conocidos en la técnica.
En realizaciones relacionadas, las moléculas de ácido nucleico descritas antes se construyen de manera que incluyan una pluralidad de polinucleótidos que sean homólogos a un lugar de FRT. Más particularmente, pueden disponerse en las moléculas dos lugares de FRT de modo que proporcionen regiones flanqueantes 5' y 3' que limiten con las regiones de codificación de AAV y la región de promotor p5 de AAV. De esta manera, la molécula de ácido nucleico comprende un casette (que tiene una región de codificación rep de AAV, una región de codificación cap de AAV y una región de promotor p5 de AAV) que está flanqueado por lugares de FRT. En realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico están dispuestas de manera que comprendan, en el orden dado en la dirección 5' a 3', un lugar de FRT, rep de AAV, cap de AAV, una región de promotor p5 de AAV y un lugar de FRT. Las moléculas anteriores pueden montarse, aislarse y clonarse en un vector adecuado usando técnicas conocidas. El casette FRT-rep-cap-p5-FRT puede insertarse fácilmente o excindirse de un vector por acción de la enzima recombinasa de FLP de levadura, si así se desea.
En una realización relacionada adicional todavía, se proporciona una molécula que tiene regiones de codificación rep y cap de AAV, una secuencia de nucleótidos que contiene una región de promotor p5 de AAV y una pluralidad de lugares de FRT. En esta molécula particular, la secuencia de nucleótidos que contiene la región de promotor p5 de AAV es sustancialmente homóloga a los pb 145-494 del genoma de AAV tn (Figura 4 [SEC ID NO: 4]). Dentro de esta primera secuencia de nucleótidos, se ha insertado un polinucleótido que comprende un lugar de FRT. Más particularmente, se ha puesto un inserto de polinucleótido (que comprende un lugar de FRT) entre los pb 310 y 311 de la primera secuencia, de manera que el lugar de FRT insertado está situado inmediatamente adyacente al término 3' de la región de promotor p5 de AAV (que se extiende de los pb 145 a 310). Se dispone después la molécula de ácido nucleico de modo que comprenda, en el orden dado en la dirección 5' a 3', un lugar de FRT, rep de AAV, cap de AAV y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV y que tiene un lugar de FRT situado inmediatamente 3' de la región de promotor p5 de AAV.
Además, se introducen fácilmente vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas antes en un hospedante adecuado y se expresan en él para complementar funciones de AAV faltantes en vectores de AAV que carecen de regiones de codificación rep y/o cap que funcionen. Las regiones rep y cap en un vector de AAV pueden inhabilitarse por supresiones de material genético, inserciones de material genético que ocasionan errores del marco de lectura y mutaciones puntuales que desorganizan las funciones de replicación y encapsidación suministradas por esos genes. Puede protegerse un sistema de vector de AAV para una región de codificación rep que funciona transfectando el vector en un hospedante adecuado, tal como una célula infectada de adenovirus, y ensayando en los extractos de células, por ejemplo, 48 horas después, la presencia de genomas de vector replicante. Si la región de codificación rep es funcional, puede revelarse por análisis de manchas de Southern el ADN que se replica usando métodos conocidos en la técnica. Los sistemas de vectores de AAV pueden protegerse para una región de codificación cap que funciona ensayando la producción de partículas de AAV usando métodos de manchas de Western que son conocidos en la técnica (Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828).
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden construirse usando técnicas recombinantes convencionales. A este respecto, pueden construirse fácilmente moléculas de ácido nucleico que contienen regiones de codificación rep y cap de AAV con una región de promotor p5 de AAV desplazada insertando una secuencia de nucleótidos que incluye una región de promotor p5 de AAV en una construcción que tiene una región de codificación de AAV (que contiene regiones de codificación rep y cap) ligando un fragmento de restricción que contiene la región de promotor sujeto a un lugar adecuado con relación a la región de codificación rep de AAV. La molécula de ácido nucleico recién formada puede excindirse después de la construcción usando enzimas de restricción si así se desea. Estas y otras moléculas de la invención pueden proporcionarse así aquí usando métodos muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nº 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales Nº WO 92/01070 (publicada el 23 de Enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de Marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129: Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.
Más particularmente, pueden excindirse regiones de codificación de AAV seleccionadas que comprenden los genes rep y cap, y secuencias de nucleótidos seleccionadas tales como las que contienen una región de promotor p5 de AAV, del genoma vírico o de un vector de AAV que contiene las mismas y enlazarse de tal modo que la región de promotor p5 esté 3' de las regiones de codificación rep y/o cap, usando técnicas de ligación estándares tales como las descritas en Sambrook et al., supra. Las moléculas pueden construirse adicionalmente para tener secuencias de FRT flanqueantes dispuestas en sus extremos 5', o 5' y 3'. Las ligaciones pueden conseguirse en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, 33 \mug/ml de BSA, NaCl 10 mM-50 mM y bien ATP 40 \muM, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de ligasa de ADN T4 a 0ºC (para ligación de "extremo cohesivo") o bien ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de ligasa de ADN T4 a 14ºC (para ligación de "extremo romo"). Se realizan habitualmente ligaciones de "extremo cohesivo" intermolecular a concentraciones de ADN total de 30-100 \mug/ml (concentración final total 5-100 nM).
Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden derivarse sintéticamente, usando una combinación de química de síntesis de oligonucleótidos directa en fase sólida y métodos de ligación enzimática que son convencionales en la técnica. Pueden construirse secuencias sintéticas que tienen aspectos tales como lugares de enzimas de restricción y pueden prepararse en dispositivos de síntesis de oligonucleótidos disponibles comercialmente tales como los dispositivos disponibles de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) usando el método de fosfaramidita. Véase, por ejemplo, Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862. Las secuencias de nucleótidos de las secuencias de codificación rep y cap de AAV, las regiones de promotor p5, p19 y p40 de AAV y los lugares de FRT se conocen y se han descrito previamente (véase, por ejemplo, Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45:555-564; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" en Fundamental Virology, 2ª Edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, reds.) para secuencias de AAV; y véase, por ejemplo, Jayaram et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5875-5879 y O'Gorman (1991) Science 251:1351-1355 para secuencias de FRT. También pueden sintetizarse codones preferidos para la expresión de la molécula sintética en células de mamíferos. Se montan después moléculas de ácido nucleico completas a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados por los métodos anteriores. Véase, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al. Science (1984) 223:1299; Jay et al. J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
Un objeto adicional de la invención es proporcionar construcciones auxiliares de AAV que comprenden generalmente replicones que incluyen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Las construcciones son así capaces de codificar funciones auxiliares de AAV. Un replicón se define aquí como cualquier longitud de ADN que sirve como unidad de replicación durante la síntesis de ADN. En una realización, se proporciona una construcción auxiliar de AAV en forma de un episoma que es capaz de replicación autónoma independientemente de un genoma hospedante, y que puede ser capaz además de integración en un cromosoma hospedante. En una realización particularmente preferida, la construcción es un plásmido. En otras realizaciones diversas, las funciones auxiliares de AAV (por ejemplo, las regiones de codificación rep y cap) están enlazadas operativamente a secuencias de control que dirigen la transcripción y traducción de las mismas.
En un aspecto particular de la invención, se montan construcciones auxiliares de AAV para proporcionar casettes de expresión que pueden mantenerse como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un episoma o plásmido) que es capaz de mantenimiento estable en una célula hospedante. La construcción tendrá un sistema de replicación adecuado que le permita mantenerse de manera sustancialmente estable en un hospedante replicante.
Las construcciones auxiliares de AAV que incluyen las regiones de codificación rep y cap de AAV con una región de promotor p5 de AAV, dispuesto en la construcción sujeto para estar situado en un lugar distinto de su posición normal con relación a la región de codificación rep en el genoma de AAV tn, secuencias de control y secuencias de multiplicación opcionales, pueden incluir también marcadores seleccionables. Los marcadores adecuados incluyen genes que confieren resistencia o sensibilidad a antibióticos, o imparten color, o cambian las características antígenas cuando se desarrollan células que se han transfectado con las construcciones de ácido nucleico en un medio selectivo apropiado. Los genes marcadores seleccionables particulares útiles en la práctica de la invención incluyen el gen de resistencia a la higromicina B (que codifica aminoglicósido fosfotransferasa (APH)) que permite la selección en células de mamíferos confiriendo resistencia a G418 (disponible de Sigma, St. Louis, MO.). Se conocen otros marcadores adecuados por los expertos en la técnica.
Es un objeto adicional todavía de la invención proporcionar células de empaquetado de AAV que son capaces de producir viriones de AAVr cuando un vector de AAV está presente en la célula y la célula de empaquetado es capaz de expresar funciones auxiliares víricas. En una realización particular, pueden derivarse células de empaquetado de AAV de células de mamíferos que son capaces de sostener la infección por un virus auxiliar (para la provisión de funciones auxiliares víricas). A este respecto, casi cualquier célula de mamífero puede sostener AAV y producir viriones de AAV siempre que esté presente un virus auxiliar que sea compatible con la célula. Por tanto, serán objeto de elección células de empaquetado usadas para producir viriones de AAVr, dictada en gran medida por conveniencia, tal como disponibilidad, características de crecimiento o similares. Las células de empaquetado adecuadas incluyen, sin limitación, células derivadas de seres humanos y especies de primates no humanos, células de roedor, bovino, ovino, porcino, equino, felino y canino, entre otras. Sin embargo, por razones de conveniencia, se prefieren linajes celulares humanos tales como células 293, HeLa, KB y JW-2 humanas. Estas células están disponibles fácilmente a través de la American Type Culture Collection (ATCC) (por ejemplo, células 293 humanas están disponibles con el número de admisión ATCC CRL1573).
En una realización particular, se forma una célula de empaquetado de AAV a partir de una célula hospedante adecuada (por ejemplo, una célula 293 humana) transfectando la célula con una construcción auxiliar de AAV capaz de expresar funciones auxiliares de AAV. La construcción auxiliar de AAV sujeto comprende una molécula de ácido nucleico que tiene regiones de codificación rep y cap de AAV y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV, en la que las secuencias de nucleótidos están dispuestas en la molécula de manera que se sitúe la región de promotor p5 en un lugar distinto de su posición normal con relación a la región de codificación rep en el genoma de AAV tn como se ha descrito antes. La construcción auxiliar es capaz de transcribirse y traducirse eficazmente en la célula hospedante para complementar funciones de AAV ausentes en un vector de AAV asociado.
En otra realización particular, se forma una célula de empaquetado de AAV a partir de una célula hospedante adecuada (por ejemplo, una célula 293 humana) por transfección con una construcción auxiliar de AAV capaz de expresar polipéptidos de Rep y Cap de AAV. La construcción auxiliar de AAV transfectada comprende una molécula de ácido nucleico que tiene una región de codificación de AAV y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV, dispuestas respectivamente dicha región de codificación de AAV y dicha región de promotor p5 en la molécula 5' a 3', y separadas entre sí por una secuencia de nucleótidos intermedia. La construcción sujeto es capaz de transcribirse y traducirse eficazmente en la célula hospedante para complementar funciones de AAV ausentes en un vector de AAV asociado. Además, la secuencia de nucleótidos intermedia puede seleccionarse para que tenga una longitud suficiente que haga al fragmento de AAV rep-cap...p5 resultante demasiado grande para empaquetar como una partícula de virión de AAV en caso de recombinación durante la producción de virión de AAVr. De esta manera, se evita la producción de niveles significativos de partículas de AAV tn contaminantes en el sistema de célula de empaquetado. En una realización relacionada, la construcción auxiliar de AAV comprende un plásmido.
Cada una de las construcciones auxiliares de AAV de la invención pueden mantenerse establemente en la célula de empaquetado como un elemento episómico o pueden integrarse en el genoma de la célula de empaquetado, creando así un linaje celular de empaquetado que puede mantenerse indefinidamente. Alternativamente, las construcciones auxiliares de AAV pueden transfectarse en la célula de empaquetado justo antes, o después, o al tiempo, de la introducción de funciones auxiliares víricas adecuadas.
También es un objeto de la presente invención proporcionar células productoras de AAV que sean capaces de producir viriones de AAVr cuando se expresan en ellas funciones auxiliares víricas. En una realización particular, se forman células productoras transfectando transitoria o establemente una de las células de empaquetado de AAV antedichas con un vector de AAV (tal como un plásmido) que albergue una secuencia de nucleótidos heteróloga que esté interpuesta entre ITRs de AAV funcionales.
Es aún un objeto adicional incluso de la invención proporcionar métodos para la producción de viriones de AAVr, en la que los métodos implican generalmente las etapas de (1) introducir un vector de AAV que albergue una secuencia de nucleótidos heteróloga a transducir que esté interpuesta entre ITRs de AAV funcionales en una célula hospedante; (2) introducir en la célula hospedante una construcción auxiliar de AAV que se ha montado como se ha descrito antes, en la que la construcción es capaz de expresar funciones auxiliares de AAV carentes del vector de AAV; (3) expresar funciones auxiliares víricas en la célula hospedante; y (4) cultivar la célula para producir viriones de AAVr.
En una realización, se proporciona un método para producir viriones de AAVr en el que una célula de empaquetado de AAV que se ha construido como se ha descrito antes se transfecta con un vector de AAV que contiene una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que está interpuesta entre ITRs de AAV. La célula de empaquetado de AAV puede transfectarse transitoria o establemente con el vector de AAV sujeto (para proporcionar una célula productora como se ha descrito antes).
En una realización preferida, la célula de empaquetado de AAV usada en el método anterior se produce transfectando una célula hospedante adecuada con una construcción auxiliar de AAV capaz de expresarse para proporcionar polipéptidos de Rep y Cap de AAV. La construcción auxiliar de AAV sujeto comprende una molécula de ácido nucleico que tiene regiones de codificación rep y cap de AAV y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV, en la que los elementos de la molécula están dispuestos para situar la región de promotor p5 en un lugar distinto de su posición normal con relación a la región de codificación rep en el genoma de AAV tn como se ha descrito antes. La construcción auxiliar de AAV puede co-transfectarse en la célula hospedante con un vector de AAV apropiado usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En realizaciones relacionadas adicionalmente, la construcción auxiliar de AAV puede incluir uno o más lugares de FRT flanqueantes como se ha descrito supra.
En otra realización preferida, se produce una célula de empaquetado de AAV transfectando una célula hospedante adecuada con una construcción auxiliar de AAV diseñada para reducir o eliminar la producción de niveles significativos de AAV de tipo natural durante la producción de vector de AAVr. La construcción auxiliar incluye una molécula de ácido nucleico que tiene regiones de codificación rep y cap de AAV, una secuencia de nucleótidos intermedia y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV. Los elementos de la molécula están dispuestos de tal manera que la región de promotor p5 de AAV está situada aguas abajo de las regiones de codificación rep y cap y separada de ellas por la secuencia de nucleótidos intermedia (X). La secuencia de nucleótidos (X) se selecciona para que tenga una longitud mínima tal que el fragmento rep-cap-X-p5 de AAV resultante tenga un tamaño total que sea eficaz para asegurar que los sucesos de recombinación (durante la producción de viriones de AAV recombinante) entre dicho fragmento y un vector de AAV (dando como resultado una adquisición de ITRs) produzcan una molécula recombinada que sea demasiado grande para empaquetar como un virión de AAV. De esta maanera, se reduce o elimina la producción potencial de partículas de AAV tn.
En la práctica de la invención, pueden obtenerse títulos mejorados de viriones de AAVr usando métodos que emplean las células de empaquetado descritas antes. No ciñéndose a ninguna teoría particular, se cree que la producción mejorada de viriones en tales células es debida en parte a la atenuación de la toxicidad de Rep en esas células. A este respecto, la situación de la región de promotor p5 en un lugar distinto de su posición normal con relación a la región de codificación rep puede servir para atenuar la producción de Rep 78 y Rep 68 (los productos de expresión de Rep de forma larga transcritos normalmente desde el promotor p5) cuando se expresa la región de codificación rep. A la vista del hecho de que algunos productos de Rep de forma larga se expresan desde las presentes construcciones auxiliares de AAV, la región de promotor p5 de AAV resituada puede servir una función determinante en virtud de su nueva posición.
En cada uno de los métodos descritos antes, pueden expresarse funciones auxiliares víricas en las células hospedantes usando métodos que son conocidos por los expertos en la técnica. Particularmente, se proporcionan funciones auxiliares víricas por infección de las células hospedantes con un virus auxiliar no relacionado. Los virus auxiliares que encuentran uso con los presentes sistemas incluyen los adenovirus; los herpesvirus tales como el virus de herpes simplex tipos 1 y 2; y los virus de viruela vacuna. También encuentran uso aquí auxiliares no víricos, tales como sincronización de células, usando cualquiera entre diversos agentes conocidos. Véase, por ejemplo, Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241-247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117. Como consecuencia de la infección de la célula hospedante, las funciones auxiliares víricas son capaces de expresarse para transactivar una construcción auxiliar de AAV para producir proteínas de Rep y Cap de AAV. De esta manera, las proteínas de Rep sirven para excindir el ADN recombinante (que contiene la secuencia de nucleótidos heteróloga) del vector de AAV recombinante (o del genoma de la célula hospedante si se ha integrado el vector de AAV). Las proteínas de Rep sirven también para duplicar el genoma de AAV. Las proteínas de Cap expresadas se montan en cápsidas, y el genoma de AAV recombinante se empaqueta en las cápsidas. Así, sobreviene replicación de AAV lítica, y la secuencia de nucleótidos heteróloga se empaqueta en vectores de transducción viables.
Tras la expresión de las funciones auxiliares víricas en la célula hospedante y la replicación de AAV, pueden purificarse viriones de AAVr de la célula hospedante usando una variedad de métodos de purificación convencionales, tales como gradientes de CsCl. Además, si se emplea infección para expresar las funciones auxiliares víricas, puede inactivarse cualquier virus auxiliar residual, usando métodos conocidos. Por ejemplo, puede inactivarse adenovirus calentando a temperaturas de aproximadamente 60ºC durante, por ejemplo, 20 minutos o más, porque el AAV es extremadamente estable al calor y el adenovirus es termolábil.
Los viriones de AAVr resultantes que contienen la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés pueden usarse después para entrega de genes, tal como en aplicaciones de terapia génica, para la producción de animales transgénicos, en vacunación, terapia de ribozimas y antisentido, así como para la entrega de genes in vitro, a una variedad de tipos de células.
B. Experimental
Seguidamente hay ejemplos de realizaciones específicas para efectuar la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo con fines ilustrativos, y no se pretende que limiten en modo alguno el alcance de la presente invención.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se debe tener en cuenta, por supuesto, algún error y desviación experimentales.
Ejemplo 1 Construcción de plásmido pAAVlacZ
Se construyó como sigue un vector de AAV que llevaba el gen lacZ (pAAV-lacZ). La región de codificación de AAV de pSub201 (Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101), entre los lugares de XbaI, se sustituyó con enlazadores de EcoRI, produciendo el plásmido pAS203. El fragmento de EcoRI a HindIII de pCMV\beta (CLONETECH) se hizo de extremos romos y se clonó en el lugar de EcoRI tratada con Klenow de pAS203 para producir pAAVlacZ.
Ejemplo 2 Construcción del plásmido auxiliar pGN1909
La construcción auxiliar de AAV pGN1909 que es capaz de expresar los productos polipéptidos de Rep y Cap de AAV incluye una extensión de nucleótidos de aproximadamente 4,8 kb que comprende una región de codificación rep y cap de AAV y un promotor p5 de AAV aguas abajo que están interpuestos entre dos lugares de FRT. El plásmido pGN1909 puede construirse como sigue. Con relación a la Figura 1, se introduce un lugar BglII 12 bases 5' del ATG de rep78/68 en la construcción de pAAV/Ad descrita previamente (Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828) produciendo un plásmido denominado pAAV/Ad-Bgl. Un lugar de FRT mínimo de 50 pb (Jayaram (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5875-5879; y O'Gorman (1991) Science 251:1351-1355) se inserta después en el lugar de BglII de pAAV/Ad-Bgl y el fragmento de FRT-rep-cap resultante que carece del promotor p5 se clona en el polienlazador de pBSII k/s- (Stratagene, San Diego, CA) para producir un plásmido denominado pFRTRepCap.
En una etapa separada, un fragmento definido por los lugares de SpeI y PstI del plásmido pIM29+45 descrito previamente (McCarty et al.. (1991) J. Virol. 65:2936-2945) que incluye un promotor p5 de AAV y una porción del extremo 5' del gen de rep se subclona en el polienlazador de pBSII k/s- entre los lugares de SpeI y PstI. Se introduce después un lugar de FRT 12 pb 5' del ATG de rep78/68, produciendo un plásmido denominado pGN1901. El fragmento de SpeI-PstI de pGN1901 se inserta en el lugar de XbaI del plásmido pFRTRepCap produciendo la construcción de plásmido pGN1909. En la Figura 2 se representa un mapa del plásmido pGN1909.
Puede construirse como sigue una construcción similar. Los siguientes cinco fragmentos de nucleótidos, dispuestos en el orden dado en la dirección 5' a 3' se ligan en el polienlazador de pBSII k/s- entre los lugares de NotI y PstI: (1) un primer fragmento de nucleótido que comprende el lugar de FRT "mínimo" de 59 pb (Jayaram y O'Gorman, supra) representado en la Figura 3 [SEC ID NO:2]; (2) un segundo fragmento de nucleótido que comprende una región de codificación rep y cap de AAV (correspondiente a los pb 310 a 4484 del genoma de AAV tn, Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45:555-564); (3) un tercer fragmento de nucleótido que comprende una región de promotor p5 de AAV correspondiente a los pb 145 a 310 del genoma de AAV tn (representado en la Figura 4 [SEC ID NO:4]); (4) un cuarto fragmento de nucleótido que comprende el lugar de FRT de 76 pb (Jayaram y O'Gorman, supra) representado en la Figura 3 [SEC ID NO:3]; y (5) un quinto fragmento de nucleótido que comprende un segmento de 184 pb del extremo 5' de la región de codificación rep correspondiente a los pb 310 a 494 del genoma de AAV tn (representado en la Figura 4 [SEC ID NO:4]).
Las cinco secuencias de nucleótidos se enlazan entre sí para formar una molécula de ácido nucleico contigua simple que tiene una unión sintética interpuesta entre los fragmentos 2 y 3 para facilitar el enlace de esos dos restos. La secuencia de nucleótidos de la unión sintética es como sigue: 5'-CTCTAGTGGATCT-3' [SEC ID NO:1]. Tales uniones pueden ser cualquier resto enlazador conocido en la técnica y se usan simplemente aquí para facilitar el montaje de la construcción auxiliar de AAV sujeto.
Ejemplo 3 Construcción del plásmido auxiliar pW1909
El plásmido auxiliar de AAV pW1909, que es capaz de proporcionar polipéptidos de Rep y Cap de AAV esenciales para producción de viriones de AAV recombinante, comprende generalmente una secuencia auxiliar de AAV 1909 (regiones de codificación rep y cap de AAV que tienen un promotor p5 de AAV dispuesto aguas abajo de ellas). El plásmido pW1909 se construyó a partir de un plásmido pW1909adhLacZ (descrito después) dividiendo el plásmido con Sse8387, aislando el fragmento de Sse8387I-Sse8387I de 6506 pb y recircularizando el fragmento por ligación intramolecular.
El plásmido pW1909adhLacZ se construyó como sigue. El plásmido pUC119 (Nombre de referencia GeneBank: U07649, Número de admisión GeneBank: U07649) se digirió parcialmente con AflIII y BspHI, se modificó a extremos romos con la enzima de Klenow, y se ligó después para formar un plásmido circular de 1732 pb que contenía el origen bacteriano y el gen de amp sólo (se separó el polienlazador y el origen de F1). La unión de AflIII y BspHI hecha roma y ligada forma un lugar de NspI único. El plásmido de 1732 pb se cortó con NspI, se modificó a extremos romos con polimerasa T4, y un fragmento de HinDIII-HinCII de 20 pb (modificado a extremos romos con la enzima de Klenow) obtenido del polienlazador pUC119 se ligó en el lugar de NspI hecho romo del plásmido. Se regeneró el lugar de HinDIII del polienlazador hecho romo, y se situó después adyacente al origen bacteriano de replicación. Se cortó después el plásmido resultante en el lugar de PstI/Sse8387I único, y se ligó un oligonucleótido Sse8387I-PvuII-Sse8387I (5'-GGCAGCTGCCTGCA-3' [SEC ID NO:5]). Se cortó el lugar de BspHI único restante, se modificó a extremos romos con enzima de Klenow, y se ligó un oligonucleótido que contenía un enlazador de AscI (5'-GAAGGCGCGCCTTC-3' [SEC ID NO:6]), eliminando el lugar de BspHI. El plásmido resultante se denominó pWee.
Se insertó un casette de expresión CMVlacZ en el lugar de PvuII único de pWee usando etapas múltiples de tal modo que el promotor CMV estaba dispuesto próximo al gen de amp bacteriano de pWee. El casette CMVlacZ contiene una secuencia de nucleótidos flanqueada 5' y 3' por ITRs de AAV. La secuencia de nucleótidos tiene los siguientes elementos: un promotor CMV; el primer intrón de hGH; un fragmento adhlacZ; y un lugar de poliadenilación temprana de SV40.
El plásmido psub201 (Samulski et al. (1987) J. Virol. 61:3096-3101) se cortó con XbaI, se modificó a extremos romos, y se ligaron a los extremos enlazadores de NotI (5'-TTGCGGCCGCAA-3') [SEC ID NO:7] para proporcionar un fragmento de vector que contenía el origen bacteriano de replicación y un gen de amp, en el que el fragmento de vector está flanqueado en ambos lados por lugares de NotI. Después de cortarse con NotI, el primer casette de expresión de CMV se clonó en el fragmento de vector psub201 para crear psub201CMV. El caette de expresión unido a ITR de este plásmido se aisló cortando con PvuII, y se ligó a pWee después de cortar el plásmido con PvuII para crear pWCMV. Se cortó después pWCMV con BssHII (parcial), y un fragmento de 3246 pb que contenía el gen de adhlacZ (un fragmento de nucleótido de SmaI-DraI obtenido del plásmido pCMV-\beta, que tiene enlazadores de AscI (5'-GAAGGCGCGCCTTC-3') [SEC ID NO:6] ligados a los extremos para proporcionar un fragmento de 3246 pb) se ligó en el lugar de BssHII de pWCMV para obtener la construcción pWadhlacZ.
El plásmido pW1909adhlacZ se obtuvo combinando elementos de pGN1909 con la construcción pWadhlacZ. En particular, se obtuvo del plásmido pGN1909 un fragmento de SpeI-EcoRV de 4723 pb que contenía la región de codificación rep y cap de AAV. El fragmento de 4723 pb se modificó a extremos romos, y se ligaron enlazadores de AscI a los extremos hechos romos. Se ligó después el fragmento resultante al lugar de AscI único de pWadhlacZ y se orientó de tal manera que las secuencias de codificación de AAV estaban dispuestas próximas al origen bacteriano de replicación en la construcción.
Ejemplo 4 Producción de viriones de AAV recombinante
Se desarrollan células 293 humanas (Graham et al. (1967) J. Gen. Virol. 36:59-72, disponibles de la ATCC con el Número de admisión CRL1573) en medio de cultivo DME/F12 estéril (sin tampón HEPES) que se ha suplementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS), 1% de pen/estrep y 1% de glutamina (Sigma, St. Louis, MO) a 37ºC en 5% de CO_{2}. Una vez que las células son sanas y dividiendo, se tripsinizan y ponen en placa a razón de 1 x 10^{6} a 5 x 10^{6} células por placa de cultivo de células de 10 cm. Se consigue una confluencia monocapa del 50 al 75% cuando las células se adhieren inicialmente a la superficie de la placa. El volumen de medio en cada placa es 10 ml. Es esencial evitar toda agregación de las células y una distribución uniforme en la célula con el fin de conseguir una densidad de células uniforme sobre todas las zonas de la placa de cultivo de tejidos (que es importante para un rendimiento de partículas de AAVr alto). Se desarrollan después las células a 37ºC en 5% de CO_{2} para alcanzar 90% de confluencia durante un período de 24 a 48 horas antes de la transfección.
Entre 1 y 4 horas antes de la transfección, el medio en las placas de cultivo de tejidos se sustituye con medio de cultivo DME/F12 reciente que contiene 10% de FCS, 1% de pen/estrep y 1% de glutamina. Se añaden 10 \mug de cada uno del vector pAAVlacZ y la construcción auxiliar pGN1909 (u otra construcción auxiliar adecuada) a 1 ml de CaCl_{2} 300 mM estéril, lo que se añade después a 1 ml de solución de HBS 2X estéril (formada mezclando NaCl 280 mM, tampón HEPES 50 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM y ajustando el pH en 7,1 con NaOH 10 M) y se mezcla inmediatamente por inversión suave. La mezcla resultante se pipetea después inmediatamente en las placas de 10 cm de células 293 confluentes 90% (en 10 ml del medio de cultivo descrito antes) y se arremolina para producir una solución homogénea.
Las placas se transfieren a un incubador del 5% de CO_{2} y se cultivan a 37ºC durante 6 a 8 horas sin perturbación. Después de la transfección, se separa el medio de las placas, y se lava una vez la monocapa de células con solución salina tamponada co fosfato (PBS) estéril.
La materia prima de trabajo de adenovirus se prepara diluyendo una materia prima principal de adenovirus (serotipo 2) hasta una concentración de 10^{6} ufp/ml en DME/F12 más 10% de FCS, 1% de pen/estrep, 1% de glutamina y tampón HEPES estéril 25 mM (pH 7,4). Se añaden 10 ml de la materia prima de trabajo de adenovirus resultante a cada placa de 10 cm y se incuban las células durante aproximadamente 72 horas. Cuando todas las células muestran efecto citopático (CPE), y están flotando el 30% aproximadamente de las células, se cosechan las células pipeteando suavemente las células para despegarlas de la superficie de la placa. La suspensión de células se recoge y centrifuga a 300 x g durante 2 minutos. Se aspira el sobrenadante y se resuspenden las células en 1 ml de solución salina tamponada con Tris estéril (TBS, preparada mezclando 100 ml de Tris HCl, NaCl 150 mM y ajustada a pH 8,0). El material resultante puede congelarse a -80ºC, o usarse inmediatamente para hacer un lisado para congelar/descongelar.
El lisado para congelar/descongelar se prepara congelando y descongelando la suspensión de TBS:células 3 veces alternando entre un baño de hielo seco/etanol (hasta que las células están completamente congeladas) y un baño de agua a 37ºC (hasta estar completamente descongeladas). Se separa el residuo de tejidos por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se recoge y transfiere a un crio-vial estéril. El adenovirus se inactiva por calor incubando el lisado para congelar/descongelar a 56ºC durante 1 hora por sumersión en un baño de agua. Cualquier precipitado que se forma durante la inactivación por calor se separa centrifugando la muestra a 10.000 x g durante 10 minutos. Se cosecha después el sobrenadante que contiene viriones de AAV recombinante. Los viriones pueden guardarse congelados a -70ºC.
Pueden determinarse los títulos de vector de transducción infectando células 293 con una serie de diluciones de los viriones de AAVr preparados antes. Después de 24 horas, se fijan las células y se colorean con X-Gal (Sanes et al. (1986) EMBO 5:3133-3142). Se calcula el título cuantificando el número de células azules.
Ejemplo 5 Comparación de eficacia de plásmidos auxiliares de AAV
Se comparó la eficacia de funciones auxiliares proporcionadas por la construcción pGN1909 frente a los plásmidos auxiliares de AAV pAAV/Ad y pIM29+45 descritos previamente (Samulski et al. y McCarty et al., supra). Se prepararon viriones AAVrlacZ por co-transfección de células 293 humanas con pAAVlacZ (preparado como se ha descrito antes en el Ejemplo 1) y uno de los tres siguientes plásmidos auxiliares: pGN1909, pAAV/Ad y pIM29+45. Se determinaron los títulos de preparaciones recombinantes de las tres preparaciones (como se ha descrito antes en el Ejemplo 4). Los resultados se representan en la Tabla 1.
TABLA 1
Construcción auxiliar de AAV Títulos de AAVrlacZ
PGN1909 2,7 x 10^{8}/ml
PAAV/Ad 3,8 x 10^{7}/ml
PIM29+45 1,9 x 10^{7}/ml
Como puede verse por los resultados anteriores, los títulos de preparaciones recombinantes producidas usando la construcción pGN1909 como construcción auxiliar de AAV son de 5 a 10 veces mayores que las preparaciones usando alguno de los dos plásmidos auxiliares descritos previamente.
Ejemplo 6 Preparación de secuencias auxiliares de AAV 1909 prolongadas
Se ha demostrado que, durante la producción de viriones de AAV recombinante, pueden tener lugar sucesos de recombinación indeseados entre vector de AAV y ADNs auxiliares de AAV que dan como resultado la producción de la replicación de virus de tipo natural de AAV competentes (en los que los fragmentos auxiliares de AAV han adquirido ITRs de AAV). Con el fin de reducir o eliminar la generación de virus de AAV de tipo natural, se insertó una secuencia de nucleótidos intermedia (X) en la construcción auxiliar pW1909 entre la región de codificación cap de AAV y la secuencia de nucleótidos que contiene el promotor p5 de AAV. La secuencia intermedia (X) se seleccionó para tener una longitud (l) que hace a los recombinantes de tipo natural demasiado grandes para ser encapsidados como viriones de AAV.
En particular, se derivó de pW1909 un conjunto de cuatro plásmidos auxiliares insertando cuatro secuencias de nucleótidos intermedias progresivamente más largas (X1-X4) en la secuencia auxiliar de AAV entre el lugar de poliadenilación (3' de la región de codificación cap de AAV en la construcción) y la secuencia de promotor p5 de AAV. El plásmido pW1909 se digirió parcialmente con Ecl136II en posición 5060. La secuencia de nucleótidos X1 (un fragmento de 603 pb obtenido de phi X174,2) se ligó en el lugar de Ecl136II de pW1909 para obtener pW1909-0.6. Con la adición del fragmento de X1 de 603 pb, la construcción pW1909-0.6 contiene una secuencia auxiliar de AAV de 5349 pb. La secuencia de nucleótidos X2 (un fragmento de 1078 pb obtenido de phi X174,3) se ligó en el lugar de Ecl136II de pW1909 para obtener pW1909-1. Con la adición del fragmento de X2 de 1078 pb, la construcción pW1909-1 contiene una secuencia auxiliar de AAV de 5824 pb. La secuencia de nucleótidos X3 (un fragmento de 2027 pb obtenido de fago lambda) se ligó en el lugar de Ecl136II de pW1909 para obtener pW1909-2. Con la adición del fragmento de X3 de 2027 pb, la construcción pW1909-2 contiene una secuencia auxiliar de AAV de 6773 pb. La secuencia de nucleótidos X4 (un fragmento de 4361 pb obtenido de fago lambda) se ligó en el lugar de Ecl136II de pW1909 para obtener pW1909-4. Con la adición del fragmento de X4 de 4361 pb, la construcción pW1909-4 contiene una secuencia auxiliar de AAV de 9107 pb.
La adición de dos secuencias de ITR de AAV mínimas (145 pb) a cualquiera de las secuencias auxiliares de AAV prolongadas de pW1909-0.6, pW1909-1, pW1909-2 o pW1909-4 produciría longitudes de secuencias de AAV de 5639 pb, 5824 pb, 6773 pb y 9107 pb, respectivamente. De esta manera, el tamaño de recombinantes de tipo natural generados a partir de cualquiera de estas construcciones auxiliares de AAV supera el límite de empaquetado de AAV de aproximadamente 5100 pb.
Se valoró en las construcciones pW1909-0.6, pW1909-1, pW1909-2 y pW1909-4 su capacidad para proporcionar actividad auxiliar de AAV mejorada en producción de viriones de AAVr. Se usaron como testigos la construcción auxiliar pW1909 y el plásmido auxiliar pAAV/Ad.
La actividad auxiliar de AAV se valoró como sigue. Se prepararon viriones AAVrlacZ por co-transfección de células 293 humanas (5 x 10^{6} células por placa de 10 cm) con pAAVlacZ (preparado como se ha descrito antes en el Ejemplo 1) y uno de los siguientes plásmidos auxiliares: pAAV/Ad o pW1909 (como testigos); pW1909-0.6; pW1909-1; pW1909-2; o pW1909-4. La producción de viriones de AAVr se realizó como se ha descrito antes en el Ejemplo 4, con la excepción de que se proporcionaron en forma de un plásmido funciones auxiliares víricas (proporcionadas normalmente por infección adenovírica). Más particularmente, los cultivos de células 293 se co-transfectaron con 5 \mug de cada uno de los siguientes vectores: el vector pAAVlacZ; un plásmido auxiliar de AAV seleccionado; y un tercer plásmido que contenía genes o regiones de genes adenovíricos seleccionados (ARN de E2a, E4 y VA) que suministraron las funciones auxiliares adenovíricas. Las células se incubaron durante aproximadamente 72 horas. La preparación de lisados para congelar/descongelar y la determinación de los títulos de AAVrlacZ a partir de las preparaciones se realizaron después como se ha descrito en el Ejemplo 4. Los resultados se representan en la Tabla 2.
TABLA 2
Construcción Longitud de secuencia Título de AAVrlacZ % de pW1909
auxiliar de AAV auxiliar de AAV (pb)
PAAV/Ad 4391 7 x 10^{8} 24
PW1909 4746 3 x 10^{9} 100
PW1909-0.6 5349 1 x 10^{9} 37
PW1909-1 5824 2 x 10^{9} 60
PW1909-2 6773 1 x 10^{9} 32
PW1909-4 9107 8 x 10^{8} 25
Como puede verse, los títulos de preparaciones recombinantes producidas usando la construcción auxiliar pW1909 son cuatro veces mayores que las preparaciones obtenidas usando el plásmido auxiliar pAAV/Ad "convencional" descrito previamente. Las construcciones 1909 que tienen secuencias auxiliares de AAV prolongadas (pW1909-0.6, pW1909-1, pW1909-2 y pW1909-4) proporcionaron cantidades variables de viriones, en las que pW1909-1 presentaba una actividad auxiliar que era sustancialmente 60% tan eficiente como pW1909.
Ejemplo 7 Preparación de versiones modificadas del plásmido auxiliar pW1909
Se proporcionaron como sigue dos versiones modificadas del plásmido auxiliar pW1909, pH4 y pH8. Inicialmente, se montó un plásmido auxiliar de AAV, pUC4391, insertando una secuencia de nucleótidos que contenía los pares de bases 146-4530 del genoma de serotipo 2 de AAV (Srivastava et al. (1983) J. Virol. 45:555-564) en el lugar de SmaI de pUC119. Se dispuso el plásmido de tal modo que lugares de SmaI flanquean un fragmento de nucleótidos de 4391 pb que contiene todas las secuencias de genoma de serotipo 2 de AAV excepto las dos secuencias de ITR de 145 pares de bases. En particular, el fragmento de SmaI de 4567 pb obtenido de pSM620 (Samulski et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2077-2081) se subclonó en el lugar de SmaI de pUC119 (Nombre de referencia GeneBank: U07649, Número de admisión GeneBank: U07649) para proporcionar pUC4567. Se usó después mutagénesis basada en M13 para eliminar todas las secuencias de ITR de AAV y proporcionar por ello pUC4391. Se usaron los siguientes oligonucleótidos mutagénicos en la mutagénesis de M13: 5'- AGCTCGGTACCCGGGCGGAGGGGTGGAGTCG-3'; y 5'-TAATCATTAACTACAGCCCGGGGATCCTCTA-3'.
El polienlazador de pBSII k/s- (Stratagene, San Diego) se separó cortando con BssHII y se sustituyó con el siguiente polienlazador síntético: 5'-GCGCGCCGATATCGTTAACGCCCGGGCGTTTAAACAGCGCTGGCGCGC-3' [SEC ID NO:8]. El polienlazador sintético contiene los siguientes lugares de restricción: BssHII; EcoRV; HpaI; SrfI; PmeI; Eco47III; y BssHII. La construcción resultante se denominó "guión romo".
El fragmento de SmaI de 4399 pb de pUC4391 se clonó en el lugar de SrfI del guión romo de tal modo que el extremo 5' de la región de codificación rep de la secuencia auxiliar de AAV estaba próximo al lugar de HpaI del polienlazador sintético. El plásmido resultante se denominó pH1. La región de promotor p5 de AAV y la secuencia no traducida rep 5' de AAV de pH1 se sustituyó con una secuencia no traducida 5' sin promotor obtenida del plásmido auxiliar pW1909. En particular, el fragmento de BssHII(hecho romo)-SrfI de 323 pb de pW1909 se clonó en un fragmento de SrfI-SmaI(parcial) de 7163 pb obtenido de pH1 para obtener pH2. La construcción pH2 se usó para proporcionar los dos plásmidos auxiliares de AAV, pH4 y pH8, que contienen dos versiones diferentes de una región de promotor p5 de AAV dispuesta en el extremo 3' de la secuencia auxiliar de AAV.
En particular, el plásmido auxiliar pH4 se construyó clonando el fragmento de BglI-PstI(hecho romo) de 727 pb de pW1909 en el lugar de Eco47III de pH2. La secuencia de 727 pb de pW1909 contiene una región de promotor p5 de AAV, un lugar de FRT y una porción de la secuencia de codificación rep N-terminal. La dirección de transcripción de la región de promotor p5 de AAV 3' es la misma que la dirección de transcripción de las regiones de promotores p19 de AAV y p40 de AAV.
El plásmido auxiliar pH8 se construyó insertando un fragmento de ácido nucleico de 172 pb que contenía la región de promotor p5 de AAV en el lugar de Eco47III de pH2. Así, el plásmido auxiliar pH8 no tiene un lugar de recombinación de FRT o secuencias de nucleótidos de AAV adicionales asociadas con la región de promotor p5 de AAV 3'. Además, la región de promotor p5 de AAV 3' transcribe en la misma dirección que las regiones de promotores p19 de AAV y p40 de AAV.
La eficacia de funciones auxiliares proporcionadas por los plásmidos auxiliares pH4 y pH8 en la producción de viriones AAVrlacZ se comparó frente al plásmido pW1909. La producción de viriones de AAVr se realizó como se ha descrito antes en el Ejemplo 4, con la excepción de que las funciones auxiliares víricas (proporcionadas normalmente por infección adenovírica) se proporcionaron en forma de un plásmido. Más particularmente, los cultivos de células 293 se co-transfectaron con 5 \mug de cada uno de los siguientes vectores: el vector pAAVlacZ; un plásmido auxiliar de AAV seleccionado; y un tercer plásmido que contenía genes o regiones de genes adenovíricos seleccionados (ARN de E2a, E4 y VA) que suministraron las funciones auxiliares adenovíricas. Las células se incubaron durante aproximadamente 72 horas. La preparación de lisados para congelar/descongelar y la determinación de los títulos de AAVrlacZ a partir de las preparaciones se realizaron después como se ha descrito en el Ejemplo 4. Los resultados se representan en la Tabla 3.
TABLA 3
Construcción Situación del lugar Promotor p5 de Título de AAVrlacZ
auxiliar de AAV de FRT AAV 3'
PW1909 5' y 3' 1909 1 x 10^{8}
PH4 5' y 3' 1909 2 x 10^{8}
PH8 5' sólo mínimo 2 x 10^{8}
Como puede verse, pH4 y pH8 tienen aproximadamente la misma actividad que el plásmido auxiliar pW1909, lo que indica que la supresión de las secuencias del lugar de FRT 3' y rep de AAV 3' no afectaron adversamente a la función del plásmido auxiliar pH8, derivado de pW1909.
Depósitos de cepas útiles en la práctica de la invención
Se hizo un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest. El número de admisión indicado se asignó después de ensayos de viabilidad con éxito, y se pagaron los derechos precisos. El acceso a dichos cultivos estará disponible durante la pendencia de la solicitud de patente a alguien que esté autorizado para ello por el Comisario bajo 37 CFR 1.14 y 35 USC 122. Toda restricción sobre la disponibilidad de dichos cultivos para el público será eliminada irrevocablemente sobre la concesión de una patente basada en la solicitud. Además, los depósitos designados se mantendrán durante un período de treinta (30) años desde la fecha de depósito, o durante cinco (5) años después de la última petición de depósito; o durante la vida obligatoria de la patente de los EE.UU., cualquiera que sea más largo. Si un cultivo resultara no viable o se destruyera por descuido, o, en caso de cepas que contienen plásmidos, perdieran su plásmido, se sustituirá por un(os) cultivo(s) viable(s) de la misma descripción taxonómica.
Estos depósitos se proporcionan simplemente como algo conveniente para los expertos en la técnica, y no son un reconocimiento de que se requiera un depósito. Las secuencias de ácidos nucleicos de estos plásmidos, así como las secuencias amino de los polipéptidos codificados por ellos, son predominantes en caso de cualquier conflicto con la presente descripción. Puede requerirse un permiso para fabricar, usar o vender los materiales depositados, y no se garantiza por ello tal permiso.
Cepa Fecha de depósito ATCC Nº
PGN1909 20 de Julio de 1995 69871

Claims (18)

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV, comprendiendo dicha molécula:
una región de codificación rep de AAV y una región de codificación cap de AAV, dichas regiones de codificación rep y cap de AAV enlazadas operativamente a secuencias de control que dirigen la expresión de las mismas; y una primera secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV que está situada 3' con relación a la región de codificación rep.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1ª, en la que la primera secuencia de nucleótidos es sustancialmente homóloga a los pares de bases 145 a 309 del genoma de serotipo 2 de AAV de tipo natural, representado como las bases 1-164 en la Figura 4 [SEC ID NO:4], por lo que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente homólogas entre sí cuando al menos el 80% aproximadamente, preferiblemente al menos alrededor del 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos o aminoácidos son iguales sobre una longitud definida de las moléculas.
3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1ª, en la que la primera secuencia de nucleótidos es sustancialmente homóloga a los pares de bases 145 a 494 del genoma de serotipo 2 de AAV de tipo natural, representado como las bases 1-349 en la Figura 4 [SEC ID NO:4], por lo que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente homólogas entre sí cuando al menos el 80% aproximadamente, preferiblemente al menos alrededor del 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos o aminoácidos son iguales sobre una longitud definida de las moléculas.
4. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, que comprende además una segunda secuencia de nucleótidos que es homóloga a un lugar de objetivo de recombinación "flip" (FRT).
5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, que comprende además una secuencia de nucleótidos flanqueante 5' y una 3', en la que cada una de dichas secuencias flanqueantes es sustancialmente homóloga a un lugar de FRT, por lo que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente homólogas entre sí cuando al menos el 80% aproximadamente, preferiblemente al menos alrededor del 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos o aminoácidos son iguales sobre una longitud definida de las moléculas, y en la que además la región de codificación rep de AAV, la región de codificación cap de AAV y la secuencia de nucleótidos que comprende la región de promotor p5 de AAV están interpuestas entre dichas secuencias de nucleótidos flanqueantes.
6. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 5ª, que comprende además una secuencia de nucleótidos intermedia, en la que la molécula comprende, en el orden dado en la dirección 5' a 3', una región de codificación rep de AAV, una región de codificación cap de AAV, la secuencia de nucleótidos intermedia y una secuencia de nucleótidos que comprende una región de promotor p5 de AAV.
7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6ª, en la que la secuencia de nucleótidos intermedia tiene una longitud suficiente para impedir el empaquetado en un virión de AAV de una molécula producida por una recombinación de dicha molécula de ácido nucleico con ITRs de AAV durante la producción de viriones de AAV recombinante.
8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7ª, en la que la secuencia de nucleótidos intermedia comprende al menos 500 pares de bases.
9. Una construcción auxiliar de AAV que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 8ª.
10. La construcción de la reivindicación 9ª, que comprende además un marcador genético seleccionable.
11. La construcción de la reivindicación 10ª, en la que el marcador genético seleccionable comprende un gen de resistencia a antibióticos.
12. La construcción auxiliar de AAV de las reivindicaciones 9ª, 10ª o 11ª, en la que dicha construcción comprende un plásmido.
13. La construcción auxiliar de AAV de la reivindicación 12ª, en la que dicha construcción comprende el plásmido pGN1909 (Número de admisión ATCC 69871).
14. Una célula de empaquetado de AAV preparada por transfección de una célula hospedante adecuada con la construcción auxiliar de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9ª a 11ª.
15. Una célula productora de AAV capaz de producir viriones de AAV recombinante cuando se expresan en ella funciones auxiliares víricas, comprendiendo dicha célula productora la célula de empaquetado de la reivindicación 14ª que se ha transfectado con un vector de AAV.
16. Un método para producir viriones de AAV recombinante, que comprende las etapas de:
(a)
introducir un vector de AAV en una célula hospedante;
(b)
introducir la construcción auxiliar de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9ª a 11ª en la célula hospedante de tal modo que la construcción proporcione polipéptidos de Rep y Cap esenciales;
(c)
expresar funciones auxiliares víricas en la célula hospedante; y
(d)
cultivar la célula para producir viriones de AAV recombinante.
17. El método de la reivindicación 16ª, en el que la expresión de funciones auxiliares víricas se proporciona infectando la célula hospedante con un virus seleccionado del grupo constituido por adenovirus, herpesvirus y virus de viruela vacuna.
18. El uso de una molécula de ácido nucleico según alguna de las reivindicaciones 1ª-8ª en la producción de viriones de AAV recombinante para reducir o eliminar la generación indeseada de partículas de AAV de tipo natural contaminantes durante la producción de AAVr.
ES96932925T 1995-08-03 1996-08-01 Sistema auxiliar de alta eficacia para la produccion de vectores aav. Expired - Lifetime ES2210391T3 (es)

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