CN114644581A - 含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用。本发明基于大肠杆菌利用生物合成将几十种廉价易得的芳香或者脂肪巯基的前体小分子合成多种含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，并利用基因密码子扩展技术将上述氨基酸定点插入到具有潜在应用的蛋白中，获得含有特定位点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白。其中插入生物正交反应结构的上述氨基酸的蛋白可以偶联荧光分子，药物以及PEG，具有成像，治疗以及延长半衰期的潜在应用。

Description

含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物 合成方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及非天然氨基酸、重组蛋白及其制备方法及应用，具体涉及含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用。
背景技术
蛋白质不仅是细胞的组成成分之一，而且是细胞功能的主要执行者。自然界中蛋白质由20种天然氨基酸组成，这些天然氨基酸不同的理化性质赋予蛋白质结构和功能多样性。但是天然氨基酸因其结构类型的局限，限制了新型蛋白的开发。于是科学家在这20种天然氨基酸的基础上创造出能够编码蛋白质的新型非天然氨基酸(ncAAs)结构，极大丰富了蛋白质的结构与功能并且在化学生物学研究领域发挥着重要的作用。
基因密码子扩展技术便是其中之一，其能实现在生物体内任意目标蛋白的特定位点引入ncAAs。这一技术是利用与宿主细胞生物正交的氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，aaRS)/tRNA对，在蛋白中突变的终止密码子(UAG/UGA/UAA)位点插入ncAAs，得到定点编码非天然氨基酸的蛋白质，该技术可在蛋白的任意位点定点引入非天然氨基酸。
蛋白质药物如工程化抗体，重组蛋白等在治疗棘手的重大疾病和慢性疾病方面有重要应用，如肿瘤和免疫系统等疾病。蛋白质化学修饰技术，在蛋白上修饰效应分子，赋予蛋白质新功能，可成为更强大的诊断工具或者治疗武器。例如，在蛋白质的特定氨基酸上化学标记荧光基团来追踪蛋白质在细胞内的定位和动态变化；通过在识别肿瘤的抗体上偶联药物分子，将药物靶向性和杀伤性有效的结合；在治疗性药物蛋白上偶联PEG，提高药物的半衰期等。蛋白质定点修饰可生产质量可控的蛋白修饰药物，而蛋白质定点修饰需要特定的生物技术来实现。基因密码子扩展技术可以将具有生物正交基团的非天然氨基酸定点编码到蛋白质的任意位置，是目前蛋白定点修饰的关键且成熟的技术。在蛋白质修饰上具有得天独厚的优势。
相对简单的ncAAs如酪氨酸或苯丙氨酸衍生物可以购买但是非常昂贵。而且大多数具有生物化学意义的ncAAs没有商业渠道购买，需通过多步合成来制备，有些ncAAs还需要进行手性拆分，产率较低，而且表达蛋白过程中对非天然氨基酸的需求量较大。这些因素限制了蛋白的大规模工业化生产制备。因此目前已有许多研究利用生物体(细菌，植物和动物)本身生物合成途径生产ncAAs或者通过引入市售廉价的前体分子生物合成ncAAs，并且运用上述基因密码子拓展技术插入到目的蛋白产品中。
当前非天然氨基酸的生物合成已经取得了较好的应用成果，而且这些生物合成的非天然氨基酸也能通过基因密码子拓展技术或者营养缺陷手段也能同时插入到蛋白质中。但是该技术却仍存在一些问题，比如：a.虽然找到了合成一些非天然氨基酸的生物途径但是大多数非天然氨基酸没有什么商业或者生物化学研究的价值；b.改造生成非天然氨基酸的生物途径较为复杂，而且生成氨基酸的产量较低，无法实现量产的目的；c.尽管体外加入了一些合成非天然氨基酸的前体分子，但是一些前体分子仍然需要化学合成，有些前体分子原料昂贵且合成产率低；d.一些生物途径的底物范围较为单一，不能生物合成一系列的非天然氨基酸类似物；e.尽管通过生物本身的合成途径生物合成出非天然氨基酸，但是插入到蛋白上的产量较低，无利用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，该氨基酸通过改造大肠杆菌的生物代谢途径进行表达，从而生物合成出一系列全新的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸。
本发明的另一个目的在于提供一种带有上述含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的残基的重组蛋白。
本发明的第三个目的在于提供一种偶联物。
本发明的第四目的在于提供上述含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法，该方法改造了大肠杆菌的生物代谢途径，通过添加芳香巯/硒基前体分子，表达出含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸。
本发明的第五个目的在于提供一种制备定点插入生物合成的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的方法。
本发明的第六个目的在于提供上述偶联物的应用。
本发明的第五个目的在于提供使用上述重组蛋白与偶联剂偶联的偶联物。
为了实现上述目的，本发明提供一种含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，具有如下式(1)所示通式：
Figure BDA0002882587720000031
或其盐或其前药，其中，A为S或者Se，m和n相同或不同，m和n为0-3之间的整数；U为(C0-C4)直链或者支链烷基；
G取自叠氮基，乙酰基，四嗪基，2-氧代丙酰胺基团，硼酸基，醛基，氰基，羧基，三氟甲基或巯基；
含G官能团的键可以仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者可同时存在于任意两个相同或不同位置；G1，G2和G3中的一个可以是-N-，或者-C-，且G1，G2和G3中的其余者独立的是-CH-。
其中，当G分别取自叠氮基，醛基，氰基，羧基时，U为C0烷基；
当G分别取自硼酸基，巯基时，m为0，同时U为C0烷基。
优选地，所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其中G为叠氮基，具有如下式(2)所示通式：
Figure BDA0002882587720000032
其中，m为0-3之间的整数；
叠氮基的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置。
优选地，所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其中G为乙酰基，具有如下式(3)所示通式：
Figure BDA0002882587720000041
其中，m为0-3之间的整数；
乙酰基的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置。
优选地，所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其中G为四嗪基，具有如下式(4)所示通式：
Figure BDA0002882587720000042
其中，m为0-3之间的整数；
四嗪基的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置。
具体地，所述含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸优选为如下式S-1至S-70或Se-1至Se-69中的任一式的化合物：
Figure BDA0002882587720000051
Figure BDA0002882587720000061
Figure BDA0002882587720000071
Figure BDA0002882587720000081
Figure BDA0002882587720000091
Figure BDA0002882587720000101
Figure BDA0002882587720000111
Figure BDA0002882587720000121
本发明还提供一种重组蛋白，所述重组蛋白包含如上述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的一个或多个残基。
本发明还提供一种偶联物，包含连接于偶联剂的如上述的重组蛋白，且所述偶联物任选地包含所述抗体和所述偶联剂之间的连接部分。
优选地，所述偶联剂为药物分子、荧光分子或PEG，连接部分为羟胺衍生物、DBCO衍生物、降冰片烯衍生物、BCN衍生物、环丙烯基团或反式环辛烯基团。
本发明还提供上述含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法，包括如下步骤：
1)构建带有半胱氨酸合成酶CysM基因和O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因或AtSat3基因的辅助质粒
a.使用带有持续性表达启动子Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物从大肠杆菌基因组中扩增得到半胱氨酸合成酶CysM基因，使得该半胱氨酸合成酶CysM基因的前面融合Trc1启动子；将该半胱氨酸合成酶CysM基因通过Gibson组装方法克隆到含有p15a复制起点的大肠杆菌pBK表达载体中，该载体含有卡那霉素抗性基因，得到pBK-CysM质粒；
b.合成带有O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因的质粒或带有O-乙酰丝氨酸转移酶AtSat3基因的质粒，使用带有持续性表达启动子IPP序列的NtSat4基因的引物或带有持续性表达启动子IPP序列的AtSat3基因的引物从带有NtSat4或AtSat3基因的质粒中扩增得到带有持续性表达启动子IPP的NtSat4或AtSat3基因的片段；将该NtSat4基因或AtSat3基因的片段通过Gibson组装方式克隆到pBK-CysM载体中，得到辅助质粒pBK-CysM-NtSat4或pBK-CysM-AtSat3；
2)制备表达含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的菌株
将质粒pBK-CysM-NtSat4或质粒pBK-CysM-AtSat3转化入BL21(DE3)中，得到合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4和BL-pBK-CysM-AtSat3；
3)含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的合成
将菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3接种在5mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，过夜培养，次日按照接种量为1:100体积比转接于20mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，培养至对数生长初期，添加1mM芳香巯/硒基前体分子，在37℃，220转速的摇床中培养12小时；吸取1mL菌液，12000转速离心2分钟，吸取培养基上清，用0.22μm滤膜过滤，纯化。
优选地，步骤1)所述的带有持续性表达启动子Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物由上游引物CysM-Trc1-F1、CysM-Trc1-F2、CysM-Trc1-F3和下游引物CysM-R组成；
其中，CysM-Trc1-F1的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；CysM-Trc1-F2的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；CysM-Trc1-F3的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；CysM-R的核苷酸序列如Seq ID No.4所示；
含有p15a复制起点的大肠杆菌pBK表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.5；
带有持续性表达启动子IPP序列的NtSat4基因的引物由上游引物NtSat4-F1、NtSat4-F2和下游引物NtSat4-R组成；
其中，NtSat4-F1的核苷酸序列如Seq ID No.11所示；NtSat4-F2的核苷酸序列如Seq ID No.12所示；NtSat4-R的核苷酸序列如Seq ID No.13所示；
带有持续性表达启动子IPP序列的AtSat3基因的引物由上游引物AtSat3-F1、AtSat3-F2和下游引物AtSat3-R组成；
其中，AtSat3-F1的核苷酸序列如Seq ID No.18所示；AtSat3-F2的核苷酸序列如Seq ID No.19所示；AtSat3-R的核苷酸序列如Seq ID No.20所示；
带有O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因的质粒的核苷酸序列如Seq ID No.10所示；NtSat4基因的核苷酸序列如Seq ID No.9所示；AtSat3基因的核苷酸序列如Seq ID No.17所示。
本发明还提供制备定点插入生物合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的方法，包括如下步骤：
1)构建含有可插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的包含氨酰tRNA合成酶基因和tRNA基因的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA
合成包含突变位点Y32W，L65H，H70G，F108N，Q109S，D158S和L162E的氨酰tRNA合成酶PhSeRS基因的质粒，将PhSeRS基因替换pUltra-CNF质粒中的CNF片段，其中pUltra-CNF质粒已包含tRNA基因序列，得到带有可插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA；
2)构建含有终止密码子突变的表达目标蛋白的质粒
将C端带有6xHis标签的目标蛋白的基因序列用Gibson组装方法克隆到pET22b载体中，利用Quikchange定点突变的方法将特定位点的密码子突变为终止密码子TAG，得到带有TAG的目标蛋白的质粒；
3)表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株
将前述制备的辅助质粒pBK-CysM-NtSat4或pBK-CysM-AtSat3、步骤1)制备的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA、步骤2)制备的带有TAG的目标蛋白的质粒共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株；
或，将步骤1)制备的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA、步骤2)制备的带有TAG的目标蛋白的质粒共转化到前述制备的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3中，得到表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株；
上述两种方法均可得到得到表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)中同时带有质粒pBK-CysM-NtSat4(或pBK-CysM-AtSat3)、pUltra-PhSeRS/tRNA、带有TAG的目标蛋白的质粒。
4)将所述大肠杆菌工程菌株培养至对数生长初期，添加1mM芳香巯/硒基前体分子，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达12-20小时，得到含有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白，然后用Ni-NTA Agarose进行纯化。
优选地，所述包含突变位点Y32W，L65H，H70G，F108N，Q109S，D158S和L162E的PhSeRS基因的质粒的核苷酸序列如Seq ID No.21所示。
优选地，所述大肠杆菌工程菌株培养的培养条件为：含有50μg/ml壮观霉素，100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的2-YT培养基在37℃条件下220rpm进行培养；对数生长初期为OD＝0.3。
优选地，所述芳香巯/硒基前体分子为具有如式(5)的化学结构的通式化合物；
Figure BDA0002882587720000151
其中，A为SH或者SeH，m和n相同或不同，m和n为0-3之间的整数；U为(C0-C4)直链或者支链烷基；
G取自叠氮基，乙酰基，四嗪基，2-氧代丙酰胺基团，硼酸基，醛基，氰基，羧基，三氟甲基，巯基，硝基，羧甲基，胺乙酰基，卤素，氨基，甲氧基，羟基或卤素；
含G官能团的键可以仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者可同时存在于任意两个相同或不同位置；G1，G2和G3中的一个可以是-N-，或者-C-，且G1，G2和G3中的其余者独立的是-CH-。
其中，当G分别取自叠氮基，醛基，氰基，羧基时，U为C0烷基；
当G分别取自硼酸基，巯基时，m为0，同时U为C0烷基。
优选地，所述卤素为-F、-Cl或-Br。
本发明还提供上述的重组蛋白与偶联物偶联后可作为荧光成像剂、治疗性药物以及延长半衰期药物应用。
本发明提供的重组蛋白由于将其中的天然氨基酸替换为非天然氨基酸(含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸)，而非天然氨基酸可人工设计为带有叠氮基团，乙酰基团，四嗪基团，二酮基团，硼酸基团，醛基团，苯胺基团等基团的非天然氨基酸，而这些基团为生物正交官能团，可以与连接有药物分子、荧光分子或PEG的偶联剂进行偶联，使得重组蛋白可以作为荧光成像剂、治疗性药物或延长半衰期药物使用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白、含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法以及定点突变重组蛋白的制备方法，所使用的原料为可购买或者一步简单合成大量廉价易得的芳香以及脂肪巯基底物前体分子，而无需使用昂贵的非天然氨基酸；该方法不需要过度修改该生物合成的途径；可一次性生物合成以及定点插入许多具有生物化学意义的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸到蛋白中；生成的具有新型结构的蛋白产量可以达到与未突变的野生型蛋白的产量的水平。
附图说明
图1为半胱氨酸衍生的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成途径。
图2为半胱氨酸合成酶CysM基因上游融合Trc1启动子后的序列，以及引物位置关系图。
图3为本发明实施例所制备的pBK-CysM质粒的质粒图谱。
图4为本发明实施例所制备的pBK-CysM-NtSat4质粒的质粒图谱。
图5A至图5D为本发明实施例所制备的经修饰的氨基酸的LC-MS分析图谱。
图6为本发明实施例所制备的pUltra-PhSeRS质粒的质粒图谱。
图7为本发明实施例所制备的pET22b-sfGFP-Y151TAG质粒的质粒图谱。
图8A至图8N为本发明实施例所制备的BL-pET22b-sfGFP-Y151TAG菌株表达的插入生物合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的sfGFP的质谱验证。
图9为本发明实施例所制备的pET22b-Herceptin-Fab质粒的质粒图谱。
图10为本发明实施例所制备插入经修饰的氨基酸的Herceptin-Fab蛋白的质谱验证。
图11为定点插入生物合成的经修饰的氨基酸的Herceptin-Fab蛋白可以与荧光物质、药物、PEG进行偶联的结构图。
图12为定点插入生物合成的经修饰的氨基酸的Herceptin-Fab蛋白的偶联PEG或荧光基团的原理示意图。
图13插入苯基叠氮半胱氨酸的Herceptin-Fab与DBCO-PEG20K偶联反应后的SDS-PAGE电泳结果图。
图14插入苯基叠氮半胱氨酸的Herceptin-Fab与DBCO-Cy5偶联反应后用于HER2阳性肿瘤细胞的成像图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
在本发明中，采用的基因密码子扩展技术可以参见Peter Schultz于2001年提出的在蛋白质中插入人工合成的非天然氨基酸的技术(Science 2001,Vol 292,498-500。自然界中所有的蛋白都是由61个密码子编码20种氨基酸组成，其中TAG、TAA和TGA三个终止密码子执行蛋白翻译的终止。该技术的关键则是改变TGA及TAG的生物功能，将TGA及TAG变成编码非天然氨基酸的密码子。将人工合成的具有特殊物理和化学特性的“人造氨基酸”插入到任何选定蛋白的任何选定位点。借住这些人造氨基酸可以将功能各异、具有特殊化学、物理或者生物活性官能团定点引入到蛋白质之中，例如，羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团能够有效地且选择性地形成共价键，更加有利于蛋白质的定点特异性修饰，从而改善蛋白的性质或者增加蛋白质的功能。到目前为止，该技术已经成功的将几十种非天然氨基酸定点表达在活细胞蛋白质中，赋予了这些蛋白质新的物理、化学、生理性质。这种定点修饰既不同于随机修饰的无质控标准，也不同于上述三种定点修饰，需要在被修饰蛋白上添加特定氨基酸序列。
关于“生物正交反应”的概念参考：Hang,H.C.,Yu,C.,Kato,D.L.,and Bertozzi,C.R.(2003).A metabolic labeling approach toward proteomic analysis of mucin-type O-linked glycosylation.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 100,14846-14851。该反应是指能在生物系统中发生而且不干扰内源性生物化学过程的化学反应。相对于传统的标记方式，如荧光蛋白标记，以化学小分子作为标记物好处在于他们更容易进入细胞，且具备高选择性。生物正交反应使得对生物体内的生物分子(如糖类、蛋白质和脂类)的实时研究成为可能。经过十多年的努力，一系列生物正交反应被广泛应用于细胞标记、抗体修饰、高通量测序、蛋白质组学等领域。目前已发展了大量满足生物正交性的化学偶联策略，如叠氮化合物与环炔烃的1,3-偶极环加成反应(又称无铜点击化学)(Baskin,J.M.,Prescher,J.A.,Laughlin,S.T.,Agard,N.J.,Chang,P.V.,Miller,I.A.,Lo,A.,Codelli,J.A.,and Bertozzi,C.R.(2007).Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.Proceedings oftheNational Academy of Sciences 104,16793-16797.)、硝酮与环炔烃的反应(Ning,X.,Temming,R.P.,Dommerholt,J.,Guo,J.,Ania,D.B.,Debets,M.F.,Wolfert,M.A.,Boons,G.-J.,and van Delft,F.L.(2010).Protein Modification by Strain-PromotedAlkyne-Nitrone Cycloaddition.Angewandte Chemie International Edition 49,3065-3068.)、醛或酮形成肟或腙的反应、四嗪与环状烯烃或环状炔烃的狄尔斯-阿尔德反应(Blackman,M.L.,Royzen,M.,and Fox,J.M.(2008).Tetrazine Ligation:FastBioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-AlderReactivity.Journal of the American Chemical Society 130,13518-13519.)、基于异氰化物的点击反应(
Figure BDA0002882587720000182
H.,Neves,A.A.,Stairs,S.,Brindle,K.M.,and Leeper,F.J.(2011).Exploring isonitrile-based click chemistry for ligationwithbiomolecules.Organic&biomolecular chemistry 9.)，以及四环烷偶联反应(Sletten,E.M.,and Bertozzi,C.R.(2011).A Bioorthogonal QuadricyclaneLigation.Journal of the American Chemical Society 133,17570-17573.)。
本发明所提供的方法只需要购买一些廉价易得的商业化产品，或者一些仅需要在实验室通过简单的一两步合成即可得到的芳香巯/硒基前体分子，并将这些前体小分子在工程大肠杆菌内生成非天然氨基酸，并且通过基因密码子拓展技术将非天然氨基酸插入到目的蛋白上。本发明提供的大肠杆菌工程菌株及重组蛋白的制备方法大大的降低了生产成本，极具工业应用潜力。
本发明得到的含有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白，所包含的非天然氨基酸残基结构如式(6)所示：
Figure BDA0002882587720000181
其中，所述Q为具有如式(7)所述通式结构；
Figure BDA0002882587720000191
其中，A为S或者Se，m和n相同或不同，m和n为0-3之间的整数；U为(C0-C4)直链或者支链烷基；
G取自叠氮基，乙酰基，四嗪基，2-氧代丙酰胺基团，硼酸基，醛基，氰基，羧基，三氟甲基，巯基，硝基，羧甲基，胺乙酰基，卤素，氨基，甲氧基，羟基或卤素；
含G官能团的键可以仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者可同时存在于任意两个相同或不同位置；G1，G2和G3中的一个可以是-N-，或者-C-，且G1，G2和G3中的其余者独立的是-CH-。
其中，当G分别取自叠氮基，醛基，氰基，羧基时，U为C0烷基；
当G分别取自硼酸基，巯基时，m为0，同时U为C0烷基。
所述卤素为-F、-Cl或-Br。
在本发明下述具体实施例中非天然氨基酸特指含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，在部分表述中也简化为经修饰的氨基酸。
本发明的重组蛋白与已有的蛋白(如治疗蛋白、诊断蛋白、工业用酶，或其片段等)至少有60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或更高的相同性，其中包含一个或多个非天然氨基酸。可被修饰使其包含一个或多个非天然氨基酸的治疗蛋白、诊断蛋白以及其它蛋白包括但不限于α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、C-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、C-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MIP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、去角质毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人体生长激素(hGH)、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、IGFI、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经生长因子(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效生长因子(pleiotropin)、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B和致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小的生物合成的蛋白质、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SECT、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕激素受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体、和皮质酮等。在相关的或进一步的实施方案中，所述经修饰的氨基酸多肽也可以与生长激素超基因家族的任何多肽成员是同源的。
如图1所示为生物合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸(以半胱氨酸类似物为例)的反应原理示意图，其中，整条路线是基于大肠杆菌中半胱氨酸的生物合成途径，在生成半胱氨酸的最后一步是由半胱氨酸合成酶(简称：CysM酶)以乙酰基丝氨酸和硫氢根离子为底物，催化生成半胱氨酸。CysM酶除了识别硫氢根离子以外，还可以识别不同结构的带有巯基或硒基的有机小分子。本发明利用CysM酶的这种底物识别广泛的特点，人为添加芳香或者脂肪巯基/硒基小分子，最终生成结构类似于半胱氨酸的非天然氨基酸。为了进一步优化生物合成途径，提高非天然氨基酸产量，通过表达不受半胱氨酸反馈抑制的上游关键酶O-乙酰丝氨酸转移酶基因AtSat3或NtSat4，进一步提高非天然氨基酸产量。
所述芳香或者脂肪巯基/硒氢基小分子为具有如式(5)；
Figure BDA0002882587720000211
其中，A为SH或者SeH，m和n相同或不同，m和n为0-3之间的整数；U为(C0-C4)直链或者支链烷基；
G取自叠氮基，乙酰基，四嗪基，2-氧代丙酰胺基团，硼酸基，醛基，氰基，羧基，三氟甲基，巯基，硝基，羧甲基，胺乙酰基，卤素，氨基，甲氧基，羟基或卤素；
含G官能团的键可以仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者可同时存在于任意两个相同或不同位置；G1，G2和G3中的一个可以是-N-，或者-C-，且G1，G2和G3中的其余者独立的是-CH-。
其中，当G分别取自叠氮基，醛基，氰基，羧基时，U为C0烷基；
当G分别取自硼酸基，巯基时，m为0，同时U为C0烷基。
优选地，所述卤素为-F、-Cl或-Br。
优选符合上述式(2)的具体的芳香或者脂肪巯基/硒基小分子，用于下述具体实施例。
Figure BDA0002882587720000221
其中化合物1为化合物2通过生物合成的非天然氨基酸的形式，化合物2至化合物56为优选的芳香或者脂肪巯基/硒基小分子，在大肠杆菌工程菌株内通过生物合成非天然氨基酸，并通过基因密码子扩展技术定点的插入到目标蛋白质中。
所用的的O-乙酰丝氨酸转移酶编码自烟草的NtSat4基因或拟南芥的AtSat3基因，均对半胱氨酸不敏感。其中，AtSat3基因编码的O-乙酰丝氨酸转移酶为线粒体酶，N端线粒体信号肽已删除。上述两个基因采用基因合成的方法，在持续性表达IPP启动子下和CysM的共表达。
试剂：
KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO)，DpnI(New England Biolabs,NEB)，壮观霉素(Sigma)，卡那霉素(Sigma)，氨苄霉素(Sigma)，1×PBS(Macgene)，Ni亲和柱(GEhealthcare)，IPTG(INALC)，2-YT培养基(16g tryptone，12g yeast extract，5g NaCl，OXOID)，pUltra-CNF表达载体(Addgene Plasmid No.48215)，Gibson组装预混液(NEB)，质粒提取试剂盒(天根质粒小提试剂盒)，LB平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，15g/L琼脂)。
基因序列合成、引物合成、基因测序均由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。
大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10B均为常规商业菌株。
需要说明的是，本发明中未详述的实验操作均为分子生物学常规操作。
实施例1：芳香巯基/硒基前体分子的获得
本发明所提供的芳香巯基/硒基前体分子属于廉价易得的，可直接进行购买的小分子，或者一些仅需要在实验室通过简单的一两步合成即可得到。这里以具体的含有叠氮以及苯乙酮基团的芳香巯基前体分子，为例展示的一步合成法。
苯乙酮基化合物以对巯基苯乙酮(化合物7)为例，叠氮基化合物以对巯基叠氮(化合物22)为例进行一步法合成。
A.对巯基苯乙酮(1-(4-mercaptophenyl)ethan-1-one，化合物7)的合成
对碘苯乙酮购买自毕得医药，产品编号BD11067。
CuSO4·5H2O购买自毕得医药，产品编号BD122189。
Cs2CO3购买自毕得医药，产品编号BD120462。
DMSO购买自海之园，产品编号124-10。
1,2-乙二硫醇购买自萨恩，产品编号A040973*。
乙酸乙酯购买自北京市通广精细化工公司。
无水硫酸钠购买自北京市通广精细化工公司。
硅胶购买自赛谱锐思(北京)科技有限公司，产品编号GJF200。
将原料对碘苯乙酮(1mmol)，CuSO4·5H2O(12.5mg，0.05mmol)，Cs2CO3(1.62g,5mmol)，DMSO(2mL)。氩气保护下,加入1,2-乙二硫醇(0.18毫升，2mmol)。将混合物在110℃预热的油浴中搅拌20小时后冷却至室温,反应完毕加入20ml稀盐酸(5％)，乙酸乙酯萃取两次(2×10ml)，无水硫酸钠干燥过夜，真空浓缩，硅胶(200-300目)柱分离,得到灰色固体。负离子质谱验证m/z＝151，证明合成产物确实为对巯基苯乙酮。A.对巯基苯乙酮(1-(4-mercaptophenyl)ethan-1-one，化合物7)的合成
Figure BDA0002882587720000241
对碘苯乙酮购买自毕得医药，产品编号BD11067。
CuSO4·5 H2O购买自毕得医药，产品编号BD122189。
Cs2CO3购买自毕得医药，产品编号BD120462。
DMSO购买自海之园，产品编号124-10。
1,2-乙二硫醇购买自萨恩，产品编号A040973*。
乙酸乙酯购买自北京市通广精细化工公司。
无水硫酸钠购买自北京市通广精细化工公司。
硅胶购买自赛谱锐思(北京)科技有限公司，产品编号GJF200。
将原料对碘苯乙酮(1mmol)，CuSO4·5 H2O(12.5mg，0.05mmol)，Cs2CO3(1.62g,5mmol)，DMSO(2mL)。氩气保护下,加入1,2-乙二硫醇(0.18毫升，2mmol)。将混合物在110℃预热的油浴中搅拌20小时后冷却至室温,反应完毕加入20ml稀盐酸(5％)，乙酸乙酯萃取两次(2×10ml)，无水硫酸钠干燥过夜，真空浓缩，硅胶(200-300目)柱分离,得到灰色固体。负离子质谱验证m/z＝151，证明合成产物确实为对巯基苯乙酮。
B.对巯基叠氮(4-azidobenzenethiol，化合物22)的合成
Figure BDA0002882587720000242
对氨基苯硫酚购买自北京偶合科技有限公司，货号01001091-5g。
叔丁基亚硝酸酯购买自杭州贝洛生物科技有限公司，货号IN-A17327-100ml。
叠氮基三甲基硅烷(TMSN3)购买自萨恩化学技术(上海)有限公司，产品编号W320011*。
硅胶购买自赛谱锐思(北京)科技有限公司，产品编号GJF200。
将原料对氨基苯硫酚(2g，15.97mmol)溶于乙腈(CH3CN)中，冰盐浴冷却至0℃，搅拌过程中滴加叔丁基亚硝酸酯(2.84ml，23.9mmol)，继续搅拌10分钟，然后加入叠氮基三甲基硅烷(2.53ml，19.17mmol)，氩气保护下室温反应1h，反应完毕，浓缩溶剂，硅胶(200-300目)柱分离(EP:EA＝8:2)得到最终产品(收率80％)。负离子质谱验证m/z＝150，证明合成产物确实为对巯基叠氮。
实施例2：构建带有半胱氨酸合成酶CysM基因和O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因或AtSat3基因的辅助质粒
由于烟草的NtSat4基因或拟南芥的AtSat3基因均可以应用于本发明，在本实施例中以烟草的NtSat4基因为例来构建辅助质粒。
1.使用带有Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物从大肠杆菌BL21基因组中扩增得到半胱氨酸合成酶CysM基因，使得该半胱氨酸合成酶CysM基因的前面融合有持续性表达启动子Trc1；
其中，带有Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物由上游引物CysM-Trc1-F1、CysM-Trc1-F2、CysM-Trc1-F3和下游引物CysM-R组成。
CysM-Trc1-F1的核苷酸序列如Seq ID No.1所示：GTCAGCGGTTAACAATTTCACACAGGAAACAGACCAAGGAGCCCATATGAGTACATTAGAACAAACAATAGGCAATACGC。
CysM-Trc1-F2的核苷酸序列如Seq ID No.2所示：TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTCAGCGGTTAACAATTTCACAC。
CysM-Trc1-F3的核苷酸序列如Seq ID No.3所示：CGGGTTGTCAGCCTGTCCCGCTTATAAGATTGTTGACAATTAATCATCCGGCTC。
CysM-R的核苷酸序列如Seq ID No.4所示：CAATTTAGCGTTTGAAACTGCAGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAATCCCCGCCCCCTGGCTAAAA。
如图2所示为上游引物中融合有Trc1启动子序列Ptrc1的位置关系，通过菌落PCR反应将Ptrc1融合到CysM基因前面。在下游引物CysM-R上还设计有用于纯化蛋白的flag标签。
菌落PCR反应体系如表1所示：
表1菌落PCR反应体系
Figure BDA0002882587720000251
Figure BDA0002882587720000261
PCR反应条件为：95℃10min；98℃10s，54℃5s，68℃20s 30个循环；4℃保存。PCR产物经电泳，纯化，回收得到CysM基因片段。
2.将该半胱氨酸合成酶CysM基因通过Gibson组装方式(参考NatMethods.2009May；6(5):343-345)克隆到经改造的含有p15a复制起点的大肠杆菌pBK载体中得到pBK-CysM质粒。pBK载体序列如SeqID No.5所示。pBK载体在进行Gibson组装前进行PCR线性化。
pBK载体进行PCR线性化的具体过程为：利用pBK-F和pBK-R引物，以pBK载体为模板扩增。其中，pBK-F引物序列如Seq ID No.6所示：CTGCAGTTTCAAACGCTAAATTGC；pBK-R引物序列如Seq ID No.7所示：ATCTTATAAGCGGGACAGGCTG。PCR反应体系如表2所示。
表2 pBK载体线性化的PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
pBK-F(10μM) 2μL
pBK-R(10μM) 2μL
pBK载体(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃30s，30个循环；4℃保存。PCR产物经电泳，纯化，回收得到线性化的pBK载体。
Gibson反应体系为：CysM基因片段(25ng/μL)：1.5μL，线性化的pBK载体(50ng/μL)：1μL，Gibson反应液：2.5μL，总体系为5μL。
Gibson反应条件为：50℃1小时。
Gibson反应液转化大肠杆菌DH10B，涂布于50μg/ml卡那霉素的LB平板，次日挑单菌落于5mL 2YT液体培养基，培养基中添加浓度为50μg/ml的卡那霉素，置于37℃，220转速摇床培养12小时，提质粒(按照试剂盒说明书操作)，质粒经测序确认为pBK-CysM质粒。
如图3所示，为pBK-CysM质粒的质粒图谱，从图3可以看出pBK-CysM质粒以p15a为复制起点，具有卡那霉素抗性，以trc1为启动子表达CysM基因，在CysM基因末端还具有用于纯化蛋白的flag标签。pBK-CysM载体的序列如Seq ID No.8所示。
3.从文献Amino Acids 2003,24,195-203中得到NtSat4基因序列如Seq ID No.9所示，委托公司合成到质粒载体中，得到NtSat4基因合成质粒，序列如Seq ID No.10所示。
使用带有IPP序列的NtSat4基因的引物从NtSat4基因合成质粒中扩增得到O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因，使得该O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因的前面融合有持续性表达启动子IPP；
带有IPP序列的NtSat4基因的引物由上游引物NtSat4-F1、NtSat4-F2和下游引物NtSat4-R组成，其中，NtSat4-F1的核苷酸序列如Seq ID No.11所示：AAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTACTCAAGGAGGATGGCTGCGGCGACCCCG；NtSat4-F2的核苷酸序列如Seq ID No.12所示：TAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATAC；NtSat4-R的核苷酸序列如Seq ID No.13所示：AAGCGGGACAGGCTGACAACCCGAGGATCCAAAACGCCGCTGAACGCGGCGTTTTTTAAATAACATAATCGCTCCACTCGT。PCR反应体系如表3所示。
表3 PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 18μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
NtSat4-F1(10μM) 2μL
NtSat4-F2(10μM) 2μL
NtSat4-R(10μM) 2μL
NtSat4基因合成质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：95℃10min；98℃10s 54℃5s 68℃20s 30个循环；4℃保存。PCR产物经电泳，纯化，回收得到带有IPP启动子的NtSat4基因片段。
4.将该O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因通过Gibson组装方式克隆到pBK-CysM载体中，得到辅助质粒pBK-CysM-NtSat4。pBK-CysM质粒在进行Gibson组装前进行PCR线性化。
pBK-CysM质粒进行PCR线性化的具体过程为：利用pBK-CysM-F和pBK-CysM-R引物，以pBK-CysM质粒(Seq ID No.8)为模板扩增，pBK-CysM质粒线性化的PCR反应体系如表4所示。
其中，pBK-CysM-F引物的序列Seq ID No.14如所示：GGATCCTCGGGTTGTCAGC；pBK-CysM-R引物的序列Seq ID No.15如所示：GATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCG。
表4 pBK-CysM质粒线性化的PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
pBK-CysM-F(10μM) 2μL
pBK-CysM-R(10μM) 2μL
pBK-CysM载体(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃40s，30个循环；4℃保存，经纯化得到线性化的pBK-CysM质粒。
Gibson反应体系为：NtSat4基因片段(20ng/μL)：1.5μL，线性化的pBK-CysM(50ng/μL)：1μL，Gibson反应液：2.5μL，总体系为5μL。
Gibson反应条件为：50℃1小时。
Gibson反应液转化大肠杆菌DH10B，涂布于50μg/ml卡那霉素的LB平板，次日挑单菌落于5mL 2YT液体培养基，培养基中添加浓度为50μg/ml的卡那霉素，置于37℃，220转速摇床培养12小时，提质粒(按照试剂盒说明书操作)，质粒经测序确定为pBK-CysM-NtSat4质粒。
如图4所示为pBK-CysM-NtSat4质粒的质粒图谱，从图4可以看出，pBK-CysM-NtSat4质粒在卡那霉素抗性基因和CysM基因之间插入了NtSat4基因。pBK-CysM-NtSat4质粒的序列如Seq ID No.16所示。pBK-CysM-NtSat4质粒在大肠杆菌中可以表达O-乙酰丝氨酸转移酶(NtSat4)和半胱氨酸合成酶(CysM)，O-乙酰丝氨酸转移酶可将丝氨酸转化生成乙酰基丝氨酸，半胱氨酸合成酶可将乙酰基丝氨酸转化生成半胱氨酸类似物的非天然氨基酸。
当将辅助质粒中的NtSat4基因更换为Atsat3时，将从参考文献J Biol Chem1998,273,32739-32745中得到的如Seq ID No.17所示的Atsat3基因序列替代NtSat4基因，相应将上游引物NtSat4-F1、NtSat4-F2和下游引物NtSat4-R替换为AtSat3-F1、AtSat3-F2和AtSat3-R，可以制备得到pBK-CysM-Atsat3质粒；其中，AtSat3-F1的核苷酸序列如Seq IDNo.18所示：TCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTACTCAAGGAGGATGGCGGCGTGCATTGAC；AtSat3-F2的核苷酸序列如Seq ID No.19所示：TAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATAC；AtSat3-R的核苷酸序列如Seq ID No.20所示：AAGCGGGACAGGCTGACAACCCGAGGATCCAAAACGCCGCTGAACGCGGCGTTTTTTAGATCACGTAATCGCTCCATTC。
实施例3生物合成非天然氨基酸的工程菌株的制备
将质粒pBK-CysM-NtSat4或质粒pBK-CysM-AtSat3转化到BL21(DE3)感受态细胞中，转化按照《分子克隆实验指南(第四版)》的步骤进行，然后涂布于添加了50μg/ml卡那霉素的LB平板，次日挑取单菌落，在添加50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中37℃，220rpm扩增培养12-16小时，后保种，得到合成非天然氨基酸的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3。
实施例4非天然氨基酸的合成与鉴定
将菌株BL-pBK-CysM-NtSat4接种在5mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，过夜培养，次日按照接种量为1:100体积比例转接于20mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，培养至对数生长初期，添加1mM化合物7或化合物55，在37℃，220转速的摇床中培养12小时。吸取1mL菌液，12000转速离心2分钟，吸取培养基上清，用0.22μm滤膜过滤，纯化(纯化过程参考Nat Biotechnol.2003Apr；21(4):422-7)。纯化产物进行LC-MS分析检测，结果如图5A至图5D所示。其中，图5A代表化合物7生成对应氨基酸的出峰时间，图5B表示化合物7出峰的物质的mass图。图5C代表化合物55生成对应氨基酸的出峰时间，图5D表示化合物55出峰的物质的mass图。
从图5A至图5D可以看出，本发明制备的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3确实可以生物合成非天然氨基酸，当根据需要添加不同的芳香或者脂肪巯基/硒基小分子可以得到具有相应结构的非天然氨基酸的产品。此外，也可以对菌株进行继续改造，使得非天然氨基酸在大肠杆菌体内直接合成目标重组蛋白。
实施例5辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA的制备
根据参考文献：Angew Chem Int Ed Engl 2007,46,6849-6851得到突变位点为Y32W，L65H，H70G，F108N，Q109S，D158S和L162E的氨酰tRNA合成酶PhSeRS基因，并由公司合成带有突变位点的PhSeRS基因的质粒，序列如Seq ID No.21所示。将PhSeRS基因替换pUltra-CNF表达载体中的CNF片段，得到辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA。
具体过程为：
1.利用PhSeRS-F，PhSeRS-R引物从带有PhSeRS基因的质粒中PCR扩增PhSeRS基因片段，其中，PhSeRS-F引物的序列如Seq ID No.22所示：CAAAGGAGGTGCGGCCGCATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACAC；PhSeRS-R引物的序列如Seq ID No.23所示：ACCGTTTAAACGCGGCCGCTTATAATCTCTTTCTAATTGGCTCTAAAATCTTTATAAGTT。PCR反应体系如表5所示。
表5 PCR反应体系：
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
PhSeRS-F(10μM) 2μL
PhSeRS-R(10μM) 2μL
带有PhSeRS基因的质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃20s，30个循环；4℃保存。PCR产物经电泳，纯化，回收得到PhSeRS基因片段。
2.然后将pUltra-CNF载体通过PCR方式线性化，通过Gibson组装方式克隆得到pUltra-PhSeRS/tRNA质粒。
pUltra-CNF载体进行PCR线性化的具体方法：利用pUltra-F和pUltra-R引物，以pUltra-CNF载体为模板扩增，pUltra-CNF载体线性化的PCR反应体系如表6所示。
其中，pUltra-F引物的序列如Seq ID No.24所示：GCGGCCGCGTTTAAACGG；pUltra-R引物的序列如Seq ID No.25所示：GCGGCCGCACCTCCTTTG。
表6 pUltra-CNF载体线性化的PCR反应体系
Figure BDA0002882587720000301
Figure BDA0002882587720000311
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃60s，30个循环；4℃保存，PCR产物经电泳，纯化，回收得到线性化的pUltra-CNF。
Gibson反应体系为：PhSeRS基因片段(20ng/μL)：1.5μL，线性化的pUltra-CNF(50ng/μL)：1μL，Gibson反应液：2.5μL，总体系为5μL。
Gibson反应条件为：50℃1小时。
Gibson反应液转化大肠杆菌DH10B，涂布于50μg/ml壮观霉素的LB平板，次日挑单菌落于5mL 2YT液体培养基，培养基中添加浓度为50μg/ml的壮观霉素，置于37℃，220转速摇床培养12小时，提质粒(按照试剂盒说明书操作)，质粒经测序确认为pUltra-PhSeRS质粒。
如图6所示为pUltra-PhSeRS/tRNA质粒的质粒图谱，从图6可以看出，pUltra-PhSeRS/tRNA质粒具有壮观霉素抗性。pUltra-PhSeRS质粒序列如Seq ID No.26所示。
实施例6制备含突变sfGFP的质粒
通过基因合成获得序列如Seq ID No.27所示的带有sfGFP基因的质粒，将序列如Seq ID No.28所示的pET22b载体进行PCR线性化，sfGFP基因用Gibson组装方式克隆到pET22b载体中，得到pET22b-sfGFP质粒，利用quikchange定点突变的方式将sfGFP的151位Y突变为TAG，从而获得pET22b-sfGFP-Y151TAG质粒。
具体过程为：利用sfGFP-F，sfGFP-R引物从带有sfGFP基因的质粒中扩增sfGFP基因片段，其中，sfGFP-F引物的序列如Seq ID No.29所示：CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTACATATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACT；sfGFP-R引物的序列如Seq ID No.30所示：GTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGATC，划线部分为6xHis标签。扩增sfGFP基因片段的PCR反应体系如表7所示。
表7扩增sfGFP基因片段的PCR反应体系
Figure BDA0002882587720000312
Figure BDA0002882587720000321
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃15s，30个循环；4℃保存，PCR产物经电泳，纯化，回收得到sfGFP基因片段。
将pET22b质粒通过PCR方式线性化，具体过程为：利用pET22b-sfGFP-F和pET22b-sfGFP-R引物，以pET22b质粒为模板扩增，pET22b质粒PCR反应体系如表8所示。
其中，pET22b-sfGFP-F引物序列如Seq ID No.31所示：AAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGAC；pET22b-sfGFP-R引物序列如Seq ID No.32所示：ATGTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTGTGTG。
表8 pET22b质粒PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
pET22b-sfGFP-F(10μM) 2μL
pET22b-sfGFP-R(10μM) 2μL
pET22b质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃60s，30个循环；4℃保存。PCR产物经电泳，纯化，回收得到线性化的pET22b质粒。
Gibson反应体系为：sfGFP基因片段(20ng/μL)：1.5μL，线性化的pET22b质粒(50ng/μL)：1μL，Gibson反应液：2.5μL，总体系为5μL。
Gibson反应条件为：50℃1小时。
Gibson反应液转化大肠杆菌DH10B，涂布于50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，次日挑单菌落于5mL 2YT液体培养基，培养基中添加浓度为50μg/ml的氨苄青霉素，置于37℃，220转速摇床培养12小时，提质粒(按照试剂盒说明书操作)，质粒经测序确认为pET22b-sfGFP质粒。测序得pET22b-sfGFP质粒序列如Seq ID No.33所示。
quikchange定点突变的步骤为：利用sfGFP-151-F，sfGFP-151-R引物,以pET22b-sfGFP质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物利用DpnI内切酶酶切，酶切后的产物转化大肠杆菌，挑单克隆提质粒，测序验证得到pET22b-sfGFP-Y151TAG质粒。
其中，sfGFP-151-F引物的序列如Seq ID No.34所示：TTTAACTCACACAATGTATAGATCACGGCAGACAAACAAAAGAATG；sfGFP-151-R引物的序列如Seq ID No.35所示：GTTTGTCTGCCGTGATCTATACATTGTGTGAGTTAAAGTTGTACTCGAG；PCR反应体系如表9所示。
画横线的部分即为突变位点，将原编码酪氨酸(Y)的密码子TAC突变为终止密码子TAG。
表9PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
sfGFP-151-F(10μM) 2μL
sfGFP-151-R(10μM) 2μL
pET22b-sfGFP质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃80s，15个循环；4℃保存。
DpnI内切酶酶切反应体系为：50μL PCR反应液，1μL DpnI内切酶。
DpnI内切酶酶切反应条件为：37℃2小时。
大肠杆菌转化步骤为：将5μL DpnI酶切产物加入大肠杆菌DH10B化转感受态中，冰浴30min，42℃热激45秒，冰浴3分钟，加入2YT培养基37℃孵育1小时，涂板，挑单克隆，提取质粒，测序验证。
如图7所示为pET22b-sfGFP-Y151TAG质粒的质粒图谱，该pET22b-sfGFP-Y151TAG质粒具有氨苄青霉素抗性，测序确定该pET22b-sfGFP-Y151TAG质粒仅在Y151TAG位点与pET22b-sfGFP质粒有差别(TAC突变为TAG)。
实施例7.定点突变的sfGFP表达菌株的制备
将实施例2制备的辅助质粒pBK-CysM-NtSat4(卡那霉素抗性)、实施例5制备的pUltra-PhSeRS/tRNA质粒(壮观霉素抗性)和实施例6所获得的表达质粒pET22b-sfGFP-Y151TAG(氨苄霉素抗性)三个质粒共转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中，经三抗性平板(卡那霉素，壮观霉素和氨苄霉素抗性)筛选出同时转化了三种质粒的阳性菌株，命名为表达菌株BL21-pET22b-sfGFP-Y151TAG。
实施例8.定点插入非天然氨基酸的sfGFP的表达表达纯化和质谱验证
将实施例7中的BL21-pET22b-sfGFP-Y151TAG挑单菌落与5mL含有卡那霉素，壮观霉素和氨苄霉素的2YT培养基中过夜培养，次日按照1:100体积比例转接到新鲜的50mL含有卡那霉素，壮观霉素和氨苄霉素的2YT培养基中，待培养到指数生长初期，在培养基中添加1mM的前体小分子以及0.5mM的IPTG，诱导表达12-16小时后收集菌体。
将上述收集的表达菌体用高盐缓冲buffer(20mM Tris-HCl，300mM氯化钠pH8.0)重悬，在0-4℃超声破碎1-2min。将破碎产物进行高速离心(12000rpm，30分钟4℃)，吸取上清。将上清样品与Ni亲和柱在4℃孵育30分钟，然后分别用25mM咪唑冲洗5-10个柱体积，40mM咪唑冲洗3个柱体积，250mM咪唑洗脱并浓缩，浓缩后通过SDS-PAGE蛋白电泳确定纯化蛋白质量。
将纯化的含有非天然氨基酸的绿色荧光蛋白用质谱(Electrospray IonizationMass Spectroscopy)验证非天然氨基酸的定点插入，进而通过蛋白质谱确定非天然氨基酸的合成。检测的芳香巯/硒基前体分子顺序为化合物7、31、37、25、38、21、5、35、10、22、3、4、52、36。
如图8A至图8N所示依次为上述芳香巯/硒基前体分子生物合成非天然氨基酸的插入sfGFP效率的质谱表征，质谱结果表明非天然氨基酸确实插入到了sfGFP蛋白中。采用本发明提供的方法制备的大肠杆菌工程菌株确实可以表达带有非天然氨基酸的重组蛋白。
实施例9制备含Herceptin-Fab的质粒
1.从药物库(DRUGBANK)搜索Herceptin-Fab的重链和轻链的蛋白质序列，并添加胞间质转移的StII信号肽分别在重链和轻链的前面并由公司合成带有StII信号肽的Herceptin-Fab质粒(Herceptin-Fab基因3’端带有用于纯化蛋白的6xHis tag序列)，然后将Herceptin-Fab的重链和轻链采用Gibson组装连接克隆至提前通过PCR线性化的pET22b载体，得到pET22b-Herceptin-Fab质粒。
StII信号肽可将在胞内表达出来的蛋白转移到胞间质通过二硫键组装，由于胞内属于还原环境，二硫键不会稳定存在，而胞间质可以稳定存在二硫键，进而可纯化得到正确折叠组装的fab。
pET22b-Herceptin-Fab质粒构建的具体步骤为：利用Fab-F，Fab-R引物从带有StII信号肽的Herceptin-Fab质粒中扩增Herceptin-Fab基因片段，将pET22b载体通过PCR方式线性化。
其中，Fab-F引物的序列如Seq ID No.36所示：GGGTATCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCTAG；Fab-R引物的序列如Seq ID No.37所示：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT，划线部分为6xHis标签；带有StII信号肽的Herceptin-Fab质粒的序列如Seq ID No.38所示。PCR反应体系如表10所示。
表10 PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
Fab-F(10μM) 2μL
Fab-R(10μM) 2μL
带有StII信号肽的Herceptin-Fab的质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃20s，30个循环；4℃保存。PCR产物经电泳，纯化，回收得到带有StII信号肽的Herceptin-Fab片段。
pET22b质粒进行PCR线性化的具体过程为：利用pET22-Fab-F和pET22-Fab-R引物，以pET22b载体为模板进行PCR扩增。其中，pET22-Fab-F引物序列如Seq ID No.39所示：GATCCGGCTGCTAACAAAGC；pET22-Fab-R引物序列如Seq ID No.40所示：AAAATCACCTCAACCTCTAGATACCC。PCR反应体系如表11所示。
表11 pET22b载体进行PCR线性化的PCR反应体系：
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
pET22-Fab-F(10μM) 2μL
pET22-Fab-R(10μM) 2μL
pET22b质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃60s，30个循环；4℃保存PCR产物经电泳，纯化，回收得到线性化的pET22b质粒。
Gibson反应体系为：Herceptin-Fab基因片段(20ng/μL)：1.5μL，线性化的pET22b(50ng/μL)：1μL，Gibson反应液：2.5μL，总体系为5μL。
Gibson反应条件为：50℃1小时。
Gibson反应液转化大肠杆菌DH10B，涂布于50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，次日挑单菌落于5mL 2YT液体培养基，培养基中添加浓度为50μg/ml的氨苄青霉素，置于37℃，220转速摇床培养12小时，提质粒(按照试剂盒说明书操作)，质粒经限制性酶切验证和测序确认为pET22b-Herceptin-Fab质粒。pET22b-Herceptin-Fab质粒图谱如图9所示，序列如SeqID No.41所示。
2.位点选择参照文献(Proc Natl Acad Sci,U S A.2012Oct 2；109(40):16101-6.)对Herceptin-Fab蛋白选择了重链恒定区的121位点，轻链恒定区的169位点或202位点，可分别作为定点突变的靶氨基酸。
通过QuikChange定点突变方法分别将A121位点、K169位点或S202位点密码子突变为终止密码子-TAG。具体过程如下：
Herceptin-Fab的A121位，K169位及S202位设计能够使编码所述氨基酸的相应密码子突变为TAG的引物，具体引物如下表12所示。
表12：突变引物列表
Figure BDA0002882587720000361
以pET22b-Herceptin-Fab质粒为模板，分别使用表12中121位点、169位点、202位点的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表13、表14及表15所示所示。
表13 121位点的PCR反应体系
Figure BDA0002882587720000371
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃80s，15个循环；4℃保存。
表14 169位点的PCR反应体系
Figure BDA0002882587720000372
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃80s，15个循环；4℃保存。
表15 202位点的PCR反应体系
ddH<sub>2</sub>O 20μL
KOD One<sup>TM</sup> PCR Master Mix 25μL
Fab-202-F(10μM) 2μL
Fab-202-R(10μM) 2μL
pET22b-Herceptin-Fab质粒(50ng/μL) 1μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：98℃10s，54℃5s，68℃80s，15个循环；4℃保存。
分别将上面121位点、169位点、202位点的PCR产物进行DpnI消化，DpnI内切酶酶切反应体系为：50μL PCR反应液，1μL DpnI内切酶；反应条件为：37℃2小时。
消化后的片段分别直接转化DH5α菌株：具体转化步骤为：将5μL DpnI酶切产物加入大肠杆菌DH10B化转感受态中，冰浴30min，42℃热激45秒，冰浴3分钟，加入2YT培养基37℃孵育1小时后，分别涂在氨苄霉素抗性的平板上，次日挑取单克隆测序，以得到突变质粒pET22b-Herceptin-Fab-A121TAG，pET22b-Herceptin-Fab-K169TAG及pET22b-Herceptin-Fab-S202TAG的质粒。上述突变质粒分别与pET22b-Herceptin-Fab质粒仅有121位点、169位点、202位点密码子分别突变为TAG的差别。
实施例10.定点突变的Herceptin-Fab表达菌株的制备
将实施例2制备的pULTRA-PhSeRS质粒(壮观霉素抗性)和实施例8所制备的具有氨苄霉素抗性的表达质粒pET22-Herceptin-Fab-A121TAG或pET22-Herceptin-Fab-K169TAG或pET22-Herceptin-Fab-S202TAG同时转化到实施例3制备的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4(卡那霉素抗性)中，经三抗性平板(卡那霉素，壮观霉素和氨苄霉素抗性)筛选出同时转化了三种表达质粒的阳性菌株，分别命名为表达菌株BL21-pET22-Herceptin-Fab-A121TAG，BL21-pET22-Herceptin-Fab-K169TAG，BL21-pET22-Herceptin-Fab-S202TAG。
同样的，采用上述方法将未突变的质粒pET22-Herceptin-Fab与PBK-CysM-NtSat4质粒和pULTRA-PhSeRS质粒共转化后得到未突变的野生型BL21-pET22-Herceptin-Fab表达菌株。
实施例11.Herceptin-Fab蛋白定点插入生物合成的非天然氨基酸的重组蛋白的表达和纯化
1.定点插入生物合成的非天然氨基酸的重组蛋白的表达
将实施例8中制备的BL21-pET22-Herceptin-Fab-A121TAG表达菌株在2YT培养基(含有50μg/ml壮观霉素，100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素)中37℃过夜培养。次日按照1：50接种到新鲜2YT中至OD值为0.3时，加入1mM实施例5制备的对巯基叠氮(化合物22)继续培养，待OD值为0.6-1.0时，加入0.5mM IPTG，于25℃诱导表达16-18小时后收集菌体。此表达实验采用的阳性对照为在实施例8中构建的野生型的pET22-Herceptin-Fab表达菌株，除接种菌不同外，其余培养条件均与突变菌相同。BL21-pET22-Herceptin-Fab-K169TAG、BL21-pET22-Herceptin-Fab-S202TAG均按照以上培养条件进行表达。
2.定点插入生物合成的非天然氨基酸的重组蛋白的表达
1)将上述收集的BL21-pET22-Herceptin-Fab-A121TAG菌体用高盐缓冲液(20mMTris-HCl，300mM氯化钠pH8.0)重悬，加入溶菌酶(1mg/ml)室温孵育2h，利用超声破碎1-2min。
2)将步骤1)破碎产物进行高速离心(12000rpm，30分钟4℃)，吸取上清。
3)将步骤2)的上清样品与Ni亲和柱在4℃孵育30分钟，然后分别用25mM咪唑冲洗5-10个柱体积，40mM咪唑冲洗3个柱体积，250mM咪唑洗脱并浓缩，浓缩后进行SDS-PAGE蛋白电泳确定纯化蛋白质量。
将纯化的含有非天然氨基酸的Herceptin-Fab蛋白用质谱(ElectrosprayIonization Mass Spectroscopy)验证非天然氨基酸的定点插入，进而通过蛋白质谱确定非天然氨基酸的合成，结果如图10所示。从图10可以看出，该Herceptin-Fab蛋白中确实插入了含对巯基叠氮的非天然氨基酸。
实施例12.定点插入生物合成的非天然氨基酸的Herceptin-Fab蛋白的偶联反应
如图11所示为定点插入生物合成的非天然氨基酸的Herceptin-Fab蛋白可以与荧光物质、药物、PEG进行偶联的结构图。如图12所示为实施例11制备的定点插入生物合成的非天然氨基酸的Herceptin-Fab蛋白的偶联原理示意图，为了简便表示，图12中将聚乙二醇(PEG)偶联和荧光偶联放在一起，实际偶联仅仅为一种偶联剂与突变蛋白作用。
1.聚乙二醇(PEG)偶联
将实施例11制备的含叠氮官能团的A121TAG突变的Herceptin-Fab蛋白(与DBCO-mPEG20K(购买自西安瑞禧生物科技有限公司)按摩尔比1:300混合，在pH为7.4的PBS缓冲液中室温反应过夜。
PEG通过与DBCO连接，而DBCO与突变蛋白上的叠氮基进行反应，得到PEG修饰的Herceptin-Fab蛋白，将偶联PEG的蛋白进行SDS-PAGE电泳结果如图13所示。Herceptin-Fab蛋白经过PEG修饰后可以提高此抗体的半衰期，促进靶向HER2阳性癌细胞的治疗或诊疗成像的效果。
2.荧光偶联
将含叠氮官能团的A121TAG突变的Herceptin-Fab蛋白与DBCO-Cy5(购买自西安瑞禧生物科技有限公司)按摩尔比1:3(Herceptin-Fab:DBCO-Cy5)混合，在pH为7.4的PBS缓冲液中室温反应过夜。用偶联荧光基团Cy5的Fab来标记HER2阳性细胞SK BR-3，共聚焦显微镜观察插入叠氮基团的Herceptin抗体片段对her2高表达细胞SK-BR-3的结合，结果如图14所示(左图：利用核染料Hoechst33342对细胞核进行染色，进而实现镜下的细胞定位；中图：通过Herceptin Fab上的叠氮基团，与DBCO-cy5反应后得到了荧光标记蛋白，将该荧光蛋白与细胞共孵育，镜下观察到细胞膜表面高表达的her2受体被染色；右图：Hoechst33342与cy5染色图叠加，显示细胞核与细胞膜的共定位)。从图14可以看出，将Herceptin-Fab蛋白与荧光基团偶联确实可用于肿瘤细胞成像。
采用上述方法可以将其他位点的突变体蛋白与DBCO修饰的PEG，药物或者荧光偶联，得到近似产率的偶联产物。
除DBCO基团外，非天然氨基酸定点突变蛋白还可以与羟胺衍生物、DBCO衍生物、降冰片烯衍生物、BCN衍生物、TCO衍生物、环丙烯基团或反式环辛烯基团反应。
所述非天然氨基酸定点突变蛋白的位点为不影响结构稳定、活性并且为非天然氨基酸插入效率较高的位点，可以根据现有研究报道进行选择。如前面所制备的突变后的sfGPF产量能够达到45-70mg/L，胞间质表达的突变后的抗体Fab能够得到1.5mg/L的产量。这都与相应突变前野生型蛋白的产量相当，说明本方法通过生物合成非天然氨基酸并定点插入蛋白质中，生产的蛋白效率与野生蛋白的生产效率相当，具有工业应用潜力。
采用本发明所提供的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸定点插入的重组蛋白，通过含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的特定基团与荧光、药物、PEG等实现偶联，当重组蛋白为抗体时，该抗体和荧光偶联可以实现肿瘤成像；该抗体和药物偶联时，可以实现对肿瘤的定点杀伤；该抗体或者一些治疗蛋白和PEG修饰剂偶联时，可增加抗体或者治疗蛋白的半衰期，可提高药物的效率。
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸、重组蛋白及其生物合成方法及应用
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ccggagcact gcgggtggca aaagctaacc ctgacgcggt ggtggtggcg atcatctgcg 960
atcgtggcga tcgctacctt tctaccgggg tgtttgggga agagcatttt agccaggggg 1020
cggggattga ctacaaggac gacgatgaca agtgactgca gtttcaaacg ctaaattgcc 1080
tgatgcgcta cgcttatcag gcctacatga tctctgcaat atattgagtt tgcgtgcttt 1140
tgtaggccgg ataaggcgtt cacgccgcat ccggcaagaa acagcaaaca atccaaaacg 1200
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agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg tttgagatcg ttttggtctg cgcgtaatct 1320
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ccaactcttt gaaccgaggt aactggcttg gaggagcgca gtcaccaaaa cttgtccttt 1440
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<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gttctgattg gtgcgggcac ctgcatcctg ggtaacatca ccattggtga aggcgcgaaa 840
attggtgcgg gcagcgtggt tctgaaagat gtgccgccgc gtaccaccgc ggttggtaac 900
ccggcgcgtc tgctgggtgg caaggataac ccgaaaaccc acgacaagat cccgggcctg 960
accatggacc aaaccagcca cattagcgaa tggagcgatt acgtgatcta a 1011
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
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tgtaatac 68
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aagcgggaca ggctgacaac ccgaggatcc aaaacgccgc tgaacgcggc gttttttaga 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
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gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 1800
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ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 2160
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aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 2280
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 2340
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 2400
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atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 3540
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<210> 22
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
accgtttaaa cgcggccgct tataatctct ttctaattgg ctctaaaatc tttataagtt 60
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<212> DNA
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<400> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
accaccctga attgactctc ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc 60
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cactgaatgt ctatagattg gctttaaaaa ctaccttaaa aagagcaaga aggagtatgg 600
aacttatagc aagagaggat gaaaatccaa aggttgctga agttatctat ccaataatgc 660
aggttaatag tattcattat gagggcgttg atgttgcagt tggagggatg gagcagagaa 720
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gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac 4020
agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt 4080
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acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg 4320
ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc 4380
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cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata 4500
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cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc 4680
atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt 4740
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<400> 43
accgatgggc ccttggtgga ctatgaggag acggtgacca ggg 43
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gtgtcacaga gcaggacagc taggacagca cctacagcct cagc 44
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gctgaggctg taggtgctgt cctagctgtc ctgctctgtg acac 44
<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gcgaagtcac ccatcagggc ctgtcctcgc ccgtcacaaa gagc 44
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gctctttgtg acgggcgagg acaggccctg atgggtgact tcgc 44

Claims (17)

1.含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，具有如下式(1)所示通式：
Figure FDA0002882587710000011
或其盐或其前药，其中，A为S或者Se，m和n相同或不同，m和n为0-3之间的整数；U为(C0-C4)直链或者支链烷基；
G为叠氮基，乙酰基，四嗪基，2-氧代丙酰胺基团，硼酸基，醛基，氰基，羧基，三氟甲基或巯基；
含G官能团的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置；G1，G2和G3中的一个可以是-N-，或者-C-，且G1，G2和G3中的其余者独立的为-CH-。
其中，当G分别取自叠氮基，醛基，氰基，羧基时，U为C0烷基；
当G分别取自硼酸基，巯基时，m为0，同时U为C0烷基。
2.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，A为S。
3.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，A为Se。
4.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，G为叠氮基，具有如下式(2)所示通式：
Figure FDA0002882587710000012
其中，m为0-3之间的整数；
叠氮基的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置。
5.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，G为乙酰基，具有如下式(3)所示通式：
Figure FDA0002882587710000021
其中，m为0-3之间的整数；
乙酰基的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置。
6.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，G为四嗪基，具有如下式(4)所示通式：
Figure FDA0002882587710000022
其中，m为0-3之间的整数；
四嗪基的键仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者同时存在于任意两个相同或不同位置。
7.如权利要求1所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸，其特征在于，所述含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸具体为如下式S-1至S-70或Se-1至Se-69中的任一式的化合物：
Figure FDA0002882587710000031
Figure FDA0002882587710000041
Figure FDA0002882587710000051
Figure FDA0002882587710000061
Figure FDA0002882587710000071
Figure FDA0002882587710000081
Figure FDA0002882587710000091
Figure FDA0002882587710000101
8.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包含如权利要求1-5中任一项所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的一个或多个残基。
9.一种偶联物，其特征在于，包含连接于偶联剂的如权利要求6所述的重组蛋白，且所述偶联物任选地包含所述抗体和所述偶联剂之间的连接部分。
10.如权利要求9所述的偶联物，其特征在于，所述偶联剂为药物分子、荧光分子或PEG，连接部分为羟胺衍生物、DBCO衍生物、降冰片烯衍生物、BCN衍生物、环丙烯基团或反式环辛烯基团。
11.一种含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建带有半胱氨酸合成酶CysM基因和O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因或AtSat3基因的辅助质粒
a.使用带有持续性表达启动子Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物从大肠杆菌基因组中扩增得到半胱氨酸合成酶CysM基因，使得该半胱氨酸合成酶CysM基因的前面融合Trc1启动子；将该半胱氨酸合成酶CysM基因通过Gibson组装方法克隆到含有p15a复制起点的大肠杆菌pBK表达载体中，该载体含有卡那霉素抗性基因，得到pBK-CysM质粒；
b.合成带有O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因的质粒或带有O-乙酰丝氨酸转移酶AtSat3基因的质粒，使用带有持续性表达启动子IPP序列的NtSat4基因的引物或带有持续性表达启动子IPP序列的AtSat3基因的引物从带有NtSat4或AtSat3基因的质粒中扩增得到带有持续性表达启动子IPP的NtSat4或AtSat3基因的片段；将该NtSat4基因或AtSat3基因的片段通过Gibson组装方式克隆到pBK-CysM载体中，得到辅助质粒pBK-CysM-NtSat4或pBK-CysM-AtSat3；
2)制备表达含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的菌株
将质粒pBK-CysM-NtSat4或质粒pBK-CysM-AtSat3转化到BL21(DE3)中，得到合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3；
3)含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的合成
将菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3接种在5mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，过夜培养，次日按照接种量为1:100体积比转接于20mL含有50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，培养至对数生长初期，添加1mM芳香巯/硒基前体分子，在37℃，220转速的摇床中培养12小时；吸取1mL菌液，12000转速离心2分钟，吸取培养基上清，用0.22μm滤膜过滤，分离纯化氨基酸，这种分离氨基酸的方法是本领域技术人员公知的，其中包括过滤，离心，萃取，吸附，离子交换色谱，沉淀和结晶。
12.如权利要求11所述的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的生物合成方法，其特征在于，步骤1)所述的带有持续性表达启动子Trc1序列的半胱氨酸合成酶CysM基因的引物由上游引物CysM-Trc1-F1、CysM-Trc1-F2、CysM-Trc1-F3和下游引物CysM-R组成；
其中，CysM-Trc1-F1的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；CysM-Trc1-F2的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；CysM-Trc1-F3的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；CysM-R的核苷酸序列如Seq ID No.4所示；
含有p15a复制起点的大肠杆菌pBK表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.5；
带有持续性表达启动子IPP序列的NtSat4基因的引物由上游引物NtSat4-F1、NtSat4-F2和下游引物NtSat4-R组成；
其中，NtSat4-F1的核苷酸序列如Seq ID No.11所示；NtSat4-F2的核苷酸序列如SeqID No.12所示；NtSat4-R的核苷酸序列如Seq ID No.13所示；
带有持续性表达启动子IPP序列的AtSat3基因的引物由上游引物AtSat3-F1、AtSat3-F2和下游引物AtSat3-R组成；
其中，AtSat3-F1的核苷酸序列如Seq ID No.18所示；AtSat3-F2的核苷酸序列如SeqID No.19所示；AtSat3-R的核苷酸序列如Seq ID No.20所示；
带有O-乙酰丝氨酸转移酶NtSat4基因的质粒的核苷酸序列如Seq ID No.10所示；NtSat4基因的核苷酸序列如Seq ID No.9所示；AtSat3基因的核苷酸序列如Seq ID No.17所示。
13.制备定点插入生物合成的含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建含有可插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的包含氨酰tRNA合成酶基因和tRNA基因的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA
合成包含突变位点Y32W，L65H，H70G，F108N，Q109S，D158S和L162E的氨酰tRNA合成酶PhSeRS基因的质粒，将PhSeRS基因替换pUltra-CNF质粒中的CNF片段，其中pUltra-CNF质粒已包含tRNA基因序列，得到带有可插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA；
2)构建含有终止密码子突变的表达目标蛋白的质粒
将C端带有6xHis标签的目标蛋白的基因序列用Gibson组装方法克隆到pET22b载体中，利用Quikchange定点突变的方法将特定位点的密码子突变为终止密码子TAG，得到带有TAG的目标蛋白的质粒；
3)表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株
将权利要求9制备的辅助质粒pBK-CysM-NtSat4或pBK-CysM-AtSat3、步骤1)制备的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA、步骤2)制备的带有TAG的目标蛋白的质粒共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株；
或，将步骤1)制备的辅助质粒pUltra-PhSeRS/tRNA、步骤2)制备的带有TAG的目标蛋白的质粒共转化到权利要求9制备的菌株BL-pBK-CysM-NtSat4或BL-pBK-CysM-AtSat3中，得到表达具有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的大肠杆菌工程菌株；
4)将所述大肠杆菌工程菌株培养至对数生长初期，添加1mM芳香巯/硒基前体分子，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达12-20小时，得到含有定点插入含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白，然后用Ni-NTA Agarose进行纯化。
14.如权利要求13所述的制备定点插入生物合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的方法，其特征在于，所述包含突变位点Y32W，L65H，H70G，F108N，Q109S，D158S和L162E的PhSeRS基因的质粒的核苷酸序列如Seq ID No.21所示。
15.如权利要求13所述的制备定点插入生物合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株培养的培养条件为：含有50μg/ml壮观霉素，100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的2-YT培养基在37℃条件下220rpm进行培养；对数生长初期为OD＝0.3。
16.如权利要求13所述的制备定点插入生物合成含芳基硫酚或芳基硒酚经修饰的氨基酸的重组蛋白的方法，其特征在于，所述芳香巯/硒基前体分子为具有如式(5)的化学结构的通式化合物；
Figure FDA0002882587710000131
其中，A为SH或者SeH，m和n相同或不同，m和n为0-3之间的整数；U为(C0-C4)直链或者支链烷基；
G取自叠氮基，乙酰基，四嗪基，2-氧代丙酰胺基团，硼酸基，醛基，氰基，羧基，三氟甲基，巯基，硝基，羧甲基，胺乙酰基，卤素，氨基，甲氧基，羟基或卤素；
含G官能团的键可以仅在苯环的邻位，间位或者对位，或者可同时存在于任意两个相同或不同位置；G1，G2和G3中的一个可以是-N-，或者-C-，且G1，G2和G3中的其余者独立的是-CH-。
其中，当G分别取自叠氮基，醛基，氰基，羧基时，U为C0烷基；
当G分别取自硼酸基，巯基时，m为0，同时U为C0烷基；
其中，所述卤素为-F、-Cl或-Br。
17.如权利要求9或10所述的偶联物在作为荧光成像剂、治疗性药物以及延长半衰期药物中的应用。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1379111A (zh) * 2001-04-04 2002-11-13 电化学工业有限公司（国际） 制备非蛋白原l－氨基酸的方法
CN101405401A (zh) * 2006-03-16 2009-04-08 斯克利普斯研究院 含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白质的遗传编程表达
US20100254943A1 (en) * 2006-05-02 2010-10-07 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2014020345A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Isis Innovation Limited Themis protein
CN104099360A (zh) * 2013-04-12 2014-10-15 北京大学 非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽的制备
US20180022822A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-25 Mabimmune Diagnostics Ag Novel anti-fibroblast activation protein (fap) binding agents and uses thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1379111A (zh) * 2001-04-04 2002-11-13 电化学工业有限公司（国际） 制备非蛋白原l－氨基酸的方法
CN101405401A (zh) * 2006-03-16 2009-04-08 斯克利普斯研究院 含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白质的遗传编程表达
US20100254943A1 (en) * 2006-05-02 2010-10-07 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2014020345A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Isis Innovation Limited Themis protein
CN104099360A (zh) * 2013-04-12 2014-10-15 北京大学 非天然氨基酸标记的目的蛋白或肽的制备
US20180022822A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-25 Mabimmune Diagnostics Ag Novel anti-fibroblast activation protein (fap) binding agents and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VAHIDI, AKBAR K.等: "Facile Synthesis of S-Substituted L-Cysteines with Nano-sized Immobilized O-Acetylserine Sulfhydrylase", CHEMCATCHEM, vol. 10, no. 17, pages 3671 *

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