CN1379111A - 制备非蛋白原l－氨基酸的方法 - Google Patents

制备非蛋白原l－氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

通过酶促生物转化制备非蛋白原L－氨基酸的方法,在该方法中,用O－乙酰－L－丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂,使O－乙酰－L－丝氨酸与亲核化合物反应,生成非蛋白原L－氨基酸,其中该方法在pH为5.0至7.4的范围内进行。

Description

制备非蛋白原L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及通过酶促生物转化制备非蛋白原L-氨基酸的方法。
背景技术
非蛋白原氨基酸是自然界不用作蛋白质生物合成的结构单元的氨基酸，所以它们清楚地区别于20种蛋白原氨基酸。就本发明的含义而言，实际上不存在于蛋白质中的非常稀有的氨基酸L-硒代半胱氨酸归类于非蛋白原氨基酸。
非蛋白原氨基酸构成令人感兴趣的化合物，例如用于制药的化合物和农业活性化合物。作为活性化合物或活性化合物的一部分，它们能够以分子模拟类型模仿天然氨基酸的结构，从而调节天然反应，例如在受体相互作用的情况中。再者，作为手性化合物，它们通常能够用作“手性库”中的合成结构单元。
目前用以制备对映体纯形式的非蛋白原氨基酸的方法大部分基于精细合成，另外，该合成通常仅容许得到一种特定的化合物。仅有少数方法能够通过简单替换起始化合物而制备不同的化合物。在大多数情况下，合成是化学合成，它们本身通常用手性结构单元进行。其他方法结合外消旋体的化学合成和通常在酶促条件下进行的外消旋体拆分。
此外，也有描述一些酶促方法，其利用前手性化合物，且能够以立体选择方式合成非蛋白原氨基酸。因此，可能采用转氨酶，使用L-谷氨酸作为氨基供体，由α-酮酸制备各种非蛋白原氨基酸(Taylor等，1998，TIBTECH 16：412-418)。另一实例是用亮氨酸脱氢酶合成L-tert-亮氨酸(Drauz，1997，chimia 51：310-314)。
专利申请DE 10046934(由同一申请人于2000年9月21日申请)描述了通过微生物的直接发酵制备非蛋白原氨基酸的特别简单的方法。该方法所用微生物的半胱氨酸代谢是去调节的，所以其提供高水平的O-乙酰-L-丝氨酸。在半胱氨酸代谢中，该化合物作为L-半胱氨酸的生物合成前体。L-半胱氨酸通过用硫醇基取代β位的乙酸酯基而形成。该反应称为β取代，其由O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶族[EC 4.2.99.8]的酶催化。在发酵过程中，当引入属于特定化合物族的亲核物质(硫醇类、唑系和/或异噁唑啉酮类)时，这些化合物进入β取代，从而实现非蛋白原L-氨基酸的制备。因此所制备的氨基酸的各基团的结构由所提供的亲核化合物定。
该方法的问题是所引入的亲核化合物不应以太高的速率计量加入，否则，化合物本身或所得到的氨基酸可能对微生物的代谢产生毒性作用。尤其，许多硫醇化合物如此，因为它们作为氧化还原活性物质，在较高浓度下具有毒性。再者，在发酵方法中使用硫醇化合物很有问题，因为当发酵罐密集充气时，它们倾向于氧化，没有机械防备(provision)，将导致相当程度的不良异味。已知当使用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶时，叠氮化物或氰化物进入β取代(Flint等，1996，J.Biol.Chem.271：16053-16067)，但因其毒性高，亦不可能引入。
发明内容
本发明的目的是提供制备非蛋白原L-氨基酸的方法，所述方法可能利用亲核化合物，尤其是毒性化合物，这些化合物以高速计量加入。
通过酶促生物转化方法实现该目的，在该方法中，使用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，生成非蛋白原L-氨基酸，所述方法在pH为5.0至7.4的范围内进行。
本方法可能以工业规模合成大量非蛋白原对映体纯的L-氨基酸，它们中的一些是新的。
O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶是已知的。迄今，已经从多种植物和微生物中分离了它们。最广泛研究的是从鼠伤寒沙门氏菌分离的相应的细菌酶。在这种微生物中，有两种O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶类酶，它们分别被命名为OASS-A和OASS-B。相关的基因同样已知且分别被称为cysK和cysM。虽然两种酶具有极为相似的反应机理，但就氨基酸序列而言两者仅显示45％相同。
与OASS-A(CysK)不同，已报导OASS-B(CysM)能够催化O-乙酰-L-丝氨酸与硫代硫酸盐的反应，生成S-硫代半胱氨酸。当硫代硫酸盐是唯一的硫源时，该反应在细菌生长中起重要作用。
再者，对来自各种微生物的O-乙酰-L-丝氨酸基因序列的比较显示，存在两种系统发育类(phylogenetic group)(Kitabatake等，2000，J.Bacteriol.182：143-145)。鼠伤寒沙门氏菌cysK和大肠杆菌CysK和来自其他真细菌、来自产甲烷古细菌(Archaea)和来自植物的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶形成庞大的类(group)。相反，鼠伤寒沙门氏菌CysM和大肠杆菌CysM仅和来自嗜高热(hyperthermophilic)古细菌(例如火球菌、硫化叶菌和热原体)的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶位于极小的族(family)内。
在本发明的含义内，O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶因它们能够催化从O-乙酰-L-丝氨酸和硫化物合成L-半胱氨酸而重要。所以在本发明的含义内，与CysM相关的酶和与Cysk相关的酶均是O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。
虽然少数文献指出，来自CysK类的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶显示相对宽的底物谱(Ikegami和Murakoshi，1994，Phytochemishtry 35：1089-1104：Flint等，1996，J.Biol.Chem.271：16053-16067)，但工业使用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶制备非蛋白原氨基酸的可能性以前未曾有考虑。
以前，妨碍使用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶实施工业酶促制备非蛋白原氨基酸的重要原因是，在对应于O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶活性范围的pH范围内，O-乙酰-L-丝氨酸恰好不稳定。
O-乙酰-L-丝氨酸异构化为N-乙酰-L-丝氨酸取决于pH。例如，在pH为7.6时，该反应不可逆且极为快速，反应速率为1％min-1。反应速率随pH降低而下降，例如，在pH为4.0时该化合物稳定。该反应的机理基于去质子的氨基对酰基的羰基碳的分子内亲核攻击(Tai等，1995，Biochemistry 34：12311-12322)。
相反，O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的pH最优值在pH 8.0的区域(Ikegami和Murakoshi，1994，Phytochemistry 35：1089-1104；Tai等，1995，Biochemistry 34：12311-12322)，就O-乙酰-L-丝氨酸的异构化而言，该最优值通常在非常不利的区域。
因为该原因，Ikegami和Murakoshi提出用O-乙酰-L-丝氨酸、亲核化合物、吡哆醛磷酸和金属离子(优选为Ga2+)进行非蛋白原氨基酸的仿生合成。该反应可以在pH 3.5至5.5的范围内进行，因此确保O-乙酰-L-丝氨酸的稳定性。但是，其最大收率＜45％，该方法的效率不甚高。与酶促合成相比，其主要缺点是缺乏对映体选择性。
因此，本发明的方法实现的另一目的是提供制备对映体纯的非蛋白原氨基酸的酶促方法，尽管O-乙酰-L-丝氨酸稳定性与酶活性最优值之间不相容，但该方法确保有效的酶促转换(＞＞45％)和低水平的异构化。
该目的通过本发明的方法实现，因为该方法优选具有以下特点：-反应在低于O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶pH最优值的范围内进行，及-酶的用量足够高。
在本发明的含义内，制备非蛋白原氨基酸的优选pH范围是pH5.0至7.4。
该pH范围特别优选为pH 6.0至7.1。
该pH范围尤其优选为pH 6.0至6.99。
为了对抗乙酸的化学计量形成，优选将pH活性调节保持恒定。pH的活性调节优选通过测量和控制装置完成，当pH偏离所需值时，所述装置通过计量加入碱或酸而将其重置。
与本发明所采用的方法相反，文献中以前描述的用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶合成非蛋白原氨基酸的反应在O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的pH最优值区域进行，不对pH进行任何活性调节，且仅是分析规模的。再者，它们无例外地使用CysK酶所属的系统发育类。
因此，本发明还涉及制备非蛋白原L-氨基酸的方法，在该方法中，使用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，生成非蛋白原L-氨基酸，所述方法包括将CysM用作O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。
即使在酶反应pH最优值以外，酶的适当高剂量仍确保发生足够的转换。当混合物中O-乙酰-L-氨酸硫化氢解酶的体积活性ACys是至少2单位/毫升时，对于该方法优选实现这样的酶浓度。该活性优选为2-200单位/毫升。用实施例3所述试验测定活性。
在本发明的进程中，可能观察到来自CysM酶所属的系统发育类的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶也是极好的用以制备非蛋白原氨基酸的酶。令人惊奇的是，适于用作底物的亲核化合物的谱甚至比CysK酶的更宽。
在本发明的特别优选的实施方案中，酶反应以连续方式进行。在这种情况中，将O-乙酰-L-丝氨酸、O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶和亲核化合物恒定计量加入，同时，将含有非蛋白原L-氨基酸的溶液(产物溶液)自混合物移出。移出产物溶液的方式优选使反应混合物的体积保持不变。该过程的特别的优点是稳态得以设置，使混合物中恒定具有低浓度的O-乙酰-L-丝氨酸，因而异构化得以降低。优选地，将混合物中O-乙酰-L-丝氨酸的浓度调节至＜1.0克/升。该值可以通过改变溶液在混合物中的平均驻留时间加以控制。连续反应的O-乙酰-L-丝氨酸储液优选保持在酸性pH，优选在pH 4-5，以确保足够的稳定性。
以前O-乙酰-L-丝氨酸仅能通过L-丝氨酸的酰化自化学合成获得，且因为L-丝氨酸售价高以致成本昂贵。属于同一申请人，于2001年2月15日申请的专利申请DE 10107002描述了用于制备O-乙酰-L-丝氨酸的发酵方法。虽然该申请提供了成本低廉的生产系统，但由于O-乙酰-L-丝氨酸的不稳定性，因此将产物自发酵罐肉汤分离有困难。
本发明的优点是，含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤，例如从依照DE 10107002中所述进行的发酵得到的含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤，可以直接用作本发明的方法中的O-乙酰-L-丝氨酸源。该方法特别经济，且避免了不稳定化合物的分离。
优选用本领域技术人员熟悉的常规重组DNA技术制备用以合成非蛋白原氨基酸的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。
为此目的，将编码O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的基因克隆入适当的载体，随后转化适当的宿主菌株。任何可以接受重组DNA技术的、适于以发酵方式制备重组蛋白的微生物均适于用作宿主菌株。
大肠杆菌是优选用于制备O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的微生物。
原则上，可能将重组O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶基因整合入染色体或将其用在自我复制的质粒载体上。
在克隆时，优选使用已经含有遗传因子(例如可调节的启动子、终止子)的载体，所述载体使O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶基因以受控和强烈可诱导的方式被表达。特别优选是以高拷贝数存在的质粒载体，如大肠杆菌载体pUC18、pBR322、pACYC184和它们的衍生物。适当的强烈可诱导的启动子的实例是lac、tac、trc、λPL(lambda PL)、ara和tet启动子。
例如，通过用发酵手段培养重组微生物菌株而制备O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。在这方面，利用本领域技术人员已知的繁殖方法，且使方法参数适应给定的微生物菌株。完全培养基和基本培养基均可以用作营养培养基。可以使用分批方法或补料分批方法。当使用可诱导的启动子系统时，通过添加适当的诱导物，使O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶基因的表达在适当的点及时开始。在适当的生产期后，通过已知方法(例如离心)收集含有O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的细胞。
可以通过蛋白质纯化的常规方法分离如此制备的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。在这方面，可以使用经典方法(例如沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、等电聚焦)和采用“亲和标记物”的现代亲和色谱。当克隆基因时，可以将编码这些亲和标记物的序列融合至编码区，从而给出含有相应的亲和标记物的融合蛋白。随后在一步纯化中分离这些蛋白。亲和标记物与亲和纯化的适当组合的实例是Strep-Tag和链霉抗生物素亲和色谱，该组合可以自德国Gottingen的IBA公司购得。
在本发明的方法中可能使用纯化形式的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。但是，除了在溶液内的反应外，还可能将酶固定化在载体上。适当的方法属于本领域的技术。
但是，对于制备非蛋白原氨基酸而言，分离O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶并非绝对必要。在本发明的方法中也可以直接采用具有O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶活性的微生物细胞。这种微生物菌株的实例是大肠杆菌菌株DH5α/pFL145和BLR21(DE3)/pLE4。它们在实施例1和2中有描述，且分别以保藏号DSM 14088和14089于2001年2月26日保藏于德国，不伦瑞克的德意志微生物保藏中心(DSMZ)。
在本发明的变体中，用静息细胞将O-乙酰-L-丝氨酸生物转化成非蛋白原L-氨基酸。在这方面，细胞如确保反应产物，即非蛋白原L-氨基酸的释放一样，确保O-乙酰-L-丝氨酸和亲核化合物穿入细胞。
如果需要，通过用可以使细胞透化的物质处理细胞，可以增加细胞内部与反应培养基间的物质转移。所述可以使细胞透化的物质例如氯仿或甲苯，及其用途是本领域技术人员公知的。
于该方法的优选实施方案中，使用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，形成非蛋白原氨基酸，其中O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶存在于微生物的细胞内。
特别优选是用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使发酵获得的未经纯化的O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，制备非蛋白原氨基酸，其中O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶存在于微生物的细胞内。
本发明的方法中，用于由O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶催化的β取代的亲核化合物优选是含有以下基团的化合物H-S-，H-Se-，-N-N+＝N-，-C≡N， 特别优选向反应混合物中添加选自以下化合物的亲核化合物-硫代硫酸盐-通式(1)的硫醇
H-S-R1             (1)其中R1是单价、取代或未取代的、具有1至15个碳原子的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基；-硒化物-通式(2)的硒醇
H-Se-R1            (2)其中R1代表的意义与通式(1)中的相同；-叠氮化物-氰化物-通式(3)或(4)的唑系其中X和Y相同或不同，且是CR4或N，或R1，R4是-H、-COOH、-OH、-NH2、-NO2 -、-SH、-SO3 -、-F、-Cl、-Br、-I、C1-C5-烷基羰基-和它们的酯、酰胺或盐，且R1代表的意义与通式(1)中的相同，且其中R2和R3相同或不同，其是R4或者其中通式(4)中的C1和C2通过桥[-CR5R6-]a连接，代替取代基R2和R3，形成环，其中a是1、2、3或4，R5和R6相同或不同，且是R4，且一个或多个非相邻的基团[-CR5R6-]可以被氧、硫或亚胺基代替，该亚胺基任选地被C1-C5烷基取代，且两个相邻的基团[-CR5R6-]可以被基团[-CR5＝CR6-]或被基团[-CR5＝N-]代替；-通式(5)或(6)的异噁唑啉酮(isoxazolinone)
Figure A0210545300161
其中X、R1、R2和R3代表的意义与已经给出的相同，且通式(6)中的C1和C2可以通过通式(4)中定义的桥连接，代替取代基R2和R3，形成环。
硫代硫酸盐的实例是硫代硫酸钠、硫代硫酸钾和硫代疏酸铵。
硫醇的实例是选自以下的化合物：2-巯基乙醇、3-巯基丙醇、3-巯基丙酸、3-巯基-1-丙磺酸、巯基乙磺酸、2-巯基乙胺、巯基乙酸、硫羟乳酸、硫代乙酸、巯基琥珀酸、巯基丙酮酸、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、1-硫甘油、苯硫酚、4-氟苯硫酚、4-氯苯硫酚、4-巯基苯酚、对甲苯硫酚、5-硫代-2-硝基苯甲酸、2-巯基噻唑、2-巯基噻唑啉、2-巯基咪唑、3-巯基-1，2，4-三唑、2-噻吩硫醇、2-巯基吡啶、2-巯基嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-巯基烟酸、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基苯并噻唑、2-巯基苯并噁唑、6-巯基嘌呤、。
硒醇的实例是选自甲硒醇、乙硒醇、丙硒醇和硒酚(phenylselenol)的化合物。
叠氮化物的实例是叠氮化钠、叠氮化钾和叠氮化铵。
氰化物的实例是氰化钾、氰化钠和氰化铵。
唑系的实例是选自以下的化合物：1，2-吡唑、3-甲基吡唑、4-甲基吡唑、3，5-二甲基吡唑、3-氨基吡唑、4-氨基吡唑、吡唑-4-羧酸、吡唑-3，5-二羧酸、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、3-氨基-1，2，4-三唑、1，2，3，4-四唑、吲唑、吲唑-3-羧酸、吲唑-5-羧酸、5-氨基吲唑、苯并三唑、苯并三唑-5-羧酸、5-氨基苯并三唑、氨基吡唑并嘧啶(aminopyrazolopyrimidine)、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤。
异噁唑啉酮的实例是选自以下的化合物：异噁唑啉-5-酮、3-甲基异噁唑啉-5-酮、4-甲基异噁唑啉-5-酮、4，5-二甲基异噁唑啉-2-酮和1，2，4-噁唑啉-3，5-二酮。
优选选择混合物中亲核化合物的浓度以使该化合物以与O-乙酰-L-丝氨酸等摩尔的浓度存在。
优选选择反应温度为5℃至70℃。该温度范围特别优选为20℃至40℃。
优选将水用作该反应的溶剂。
所形成的产物优选为L构形的通式(7)的L-氨基酸
Figure A0210545300171
其中Z是选自通式(8)至(19)的单价基团
-S-SO3 -     (8)，     -S-R1    (9)，
-Se-H       (10)，    -Se-R1   (11)，
-N＝N+＝N- (12)，    -C≡N    (13)，
Figure A0210545300172
Figure A0210545300181
及它们的酯、醚或盐，且R1、R2、R3、R4、X和Y代表的意义与通式(1)至(6)中给出的相同。
优选地，在本发明的方法终止后，且优选在用已知方法将水溶液分成生物质和培养物上清液后，从培养物上清液分离可溶性非蛋白原L-氨基酸。同样，这种分离氨基酸的方法是本领域技术人员公知的。其包括，例如，过滤、离心、萃取、吸附、离子交换色谱、沉淀和结晶。在难溶性非蛋白原氨基酸的情况下，优选进行分级离心，如本领域技术人员公知的，生物质尽可能留在离心上清液中。分离出的产物优选用标准方法加以溶解并再沉淀。
具体实施方式
下列实施例用以阐明本发明。实施例1：克隆作为含有StrepTag序列的融合基因的大肠杆菌cysK和cysM
为了克隆大肠杆菌cysk和cysM基因，首先，使用以下硫代磷酸保护的寡核苷酸引物对，并采用Pwo DNA聚合酶进行聚合酶链反应。
Figure A0210545300191
在这方面，通过引物序列将限制性内切核酸酶BsaI(下划线的核苷酸)的切割位点引入。来自大肠杆菌w3110(ATTC 27325)的染色体DNA作为模板。所得扩增物经限制酶BsaI消化并随后克隆入Eco31I-处理的载体pASK-IBA3(Institut furBioanalytik，Gottinger，德国)。该载体可以使基因作为基因融合被克隆，所述基因融合在3’端具有编码亲和肽(WSHPQFEKSEQ.ID.NO.5)的序列，所述亲和肽被命名为StrepTagII。用tet启动子表达基因融合形成具有C-末端StrepTagII标记的蛋白。后者可用以分离该蛋白，因为StrepTaqI介导结合链霉抗生物素柱。实施例2：纯化cysK和cysM蛋白
用cysM-StrepTag结构(pFL145)，可能在大肠杆菌菌株DH5α(Clonetech，Heidelberg，德国)中获得极好的基因表达。依照德国Gottingen的Institut fur Bioanalytik公司所提供的说明书进行繁殖和表达。菌株DH5α/pFL145依照布达佩斯条约，以保藏号DSMZ 14088保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)。相反，在cysK-StrepTag结构(pLE1)的情况中，表达非常弱。但是，在本例(PLE4)中，通过将基因融合作为XbaI/HindIII片段再克隆入含有T7启动子(pRSET5a)(Stratagene，Heidelberg，德国)的载体并在菌株BLR21(DE3)(Novagen，Darmstadt，德国)中表达其。菌株BLR21(DE3)/pLE4依照布达佩斯条约，以保藏号DSMZ 14089保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)。通过亲和色谱于链霉抗生物素柱上分离cysK和cysM蛋白，原则上该程序依照德国Gottingen的Institut fur Bioanalytik公司提供的制造商说明书进行。当使用250毫升培养物时，收率分别为3毫克纯化的cysK蛋白或4.5毫克纯化的CysM蛋白。由于吡哆醛磷酸辅因子，两种蛋白均显现显著的黄色，且具有420纳米的最大吸收波长。
实施例3：测定酶活性
通过检测“天然”反应产物L-半胱氨酸(Cys)，或者在CysM的情况中，还检测反应产物S-硫代-L-半胱氨酸(S-Cys)，而测定O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的活性。两种产物均可以用Gaitonde所述的试验(1967，Biochem.J.104：627-633)特异性且极灵敏地检测。由于与硫代半胱氨酸的有色复合物强度较低，所以必须对两个化合物的独立标准曲线加以校正。
通常的试验混合物含有10mM O-乙酰-L-丝氨酸(自在500mM琥珀酸钠缓冲液，pH5.5中的200mM储备液加入)，10mM硫化钠或硫代硫酸钠，100mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，和5微克纯化的酶/毫升，并在37℃下保温。比活A以单位/毫克蛋白，即微摩尔产物/分钟/毫克蛋白给出。ACYS指用硫化物形成半胱氨酸的比活。AS-CYS指用硫代硫酸钠形成S-硫代半胱氨酸的比活。实施例2分离的蛋白的比活是：
CysK：ACYS 140单位/毫克
CysM：ACYS 199单位/毫克
CysM：AS-CYS 145单位/毫克
当于静息细胞中测定O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶的活性时，首先将细胞悬浮液的光密度调节至20.0(于600纳米处测量)。随后通过添加氯仿至浓度为10％(体积)而将细胞透化处理。在室温下将混合物保温5分钟。为了酶试验，之后将光密度调节至1.0，然后用上述细胞进行与O-乙酰-L-丝氨酸和硫化物或硫代硫酸盐的反应。在这方面，细胞的比活A以微摩尔/分钟/(毫升于600纳米处光密度为1.0的细胞悬浮液)给出；其简式为：单位/ml OD。实施例4：O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶CysK和CysM催化可能性的研究
为了用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶制备非蛋白原氨基酸，在反应中用其他亲核化合物代替硫化物或硫代硫酸盐。为了检测它们，用邻苯二甲醛进行氨基酸的前柱衍生化。用此方法，可能广泛筛选适当的亲核底物。
混合物含有4mM O-乙酰-L-丝氨酸(自在500mM琥珀酸钠缓冲液，pH5.5中的200mM储备液加入)、20mM亲核化合物、100mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，和5微克纯化的酶/毫升。反应用1/100体积的乙酸(96％(体积/体积))中止，并用HP氨基定量柱(200毫米×2.1毫米)及依照德国Waldbronn的HewlettPackard提供的制造商说明书通过HPLC分析。
为了表征所形成的产物，用HPLC-MS确定分子量。将Luna C18柱(Phenomenex，Aschaffenburg，德国)用于此目的，并以甲酸(0.1％(体积/体积))作为流动相。离子化以正电喷雾模式进行。
下表所示是CysK和CysM两种酶对各种亲核化合物的反应性和在HPLC-MS分析中测定的质量(MH+)。
亲核化合物(或盐) CysK* CysM* 产物 MH+
巯基乙醇 +++ +++ S-羟乙基-L-半胱氨酸 166
二硫苏糖醇 +++ +++ S-巯基-二羟基丁基-L-半胱氨酸 242
苯硫酚 ++ +++ S-苯基-L-半胱氨酸 198
2-巯基噻唑 ++ +++ 噻唑-2-基-L-半胱氨酸 205
3-巯基-1，2，4-三唑 + +++ 1，2，4-三唑-3-基-L-半胱氨酸 189
硒化钠 +++ +++ L-硒代半胱氨酸 170
硒酚 ++ +++ 苯基-L-硒代-半胱氨酸 246
叠氮化钠 +++ +++ 叠氮-L-丙氨酸 131
氰化钾 +++ +++ 氰基-L-丙氨酸 115
1，2-吡唑 ++ ++ 1，2-吡唑基-L-丙氨酸 156
1，2，4-三唑 +++ ++ 1，2，4-三唑基-1-L-丙氨酸 157
1，2，3，4-四唑 +++ ++ 1，2，3，4-四唑-2-基-L-丙氨酸 158
1，2，3-苯并三唑 ++ + 1，2，3-苯并三唑-2-基-丙氨酸 207
5-羧基-1，2，3-苯并三唑 ++ + 5-羧基-1，2，3-苯并三唑-2-基-丙氨酸 242
8-氮鸟嘌呤 - + 氮鸟嘌呤-8-基-L-丙氨酸 240
1，2，4-噁唑林-3，5-二酮 - + 1，2，4-噁唑啉-二酮基-L-丙氨酸 190
* +++ 30分钟后转化大于70％，++  30分钟后转化大于40％，+   30分钟后转化大于10％，-   30分钟后转化小于5％。实施例5：通过发酵制备O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶CysM
作为发酵的预培养物，将20毫升LB培养基(10克胰蛋白胨/升，5克酵母提取物/升，10克Nacl/升)，其中另外含有100毫克氨苄青霉素/升，用菌株DH5α/pFL145(见上)接种，并于摇床内，在30℃和150转/分钟下培养过夜。随后，将整个混合物移入100毫升SM1培养基(12克K2HPO4/升；3克KH2PO4/升；5克(NH4)2SO4/升；0.3克MgSO4×7H2O/升：0.015克CaCl2×2H2O/升；0.002克FeSO4×7H2O/升；1克柠檬酸三钠×2H2O/升；0.1克Nacl，1毫升微量元素溶液/升，该溶液由以下成分组成：0.15克Na2MoO4×2H2O/升；2.5克Na3BO3/升；0.7克CoCl2×6H2O/升；0.25克CuSO4×5H2O/升；1.6克MnCl2×4H2O/升；0.3克ZnSO4×7H2O/升)，其中补充以5克葡萄糖/升；0.5毫克维生素B1/升；和100毫克氨苄青霉素/升。在30℃和150转/分钟下，将预培养物另外培养8小时。
所用的发酵罐是Braun Biotech(Melsungen，德国)出品的Biostat M装置，且其最大培养物容积为2升。将含有900毫升发酵培养基(15克葡萄糖/升；10克胰蛋白胨/升；5克酵母提取物/升；5克(NH4)2SO4/升；1.5克KH2PO4升；0.5克Nacl/升；0.3克MgSO4×7H2O/升；0.015克CaCl2×2H2O/升；0.075克FeSO4×7H2O/升；1克柠檬酸三钠×2H2O/升；和1毫升微量元素溶液/升(见上)；5毫克维生素B1/升；和100毫克氨苄青霉素/升，用25％氨水将pH调至7.0)的发酵罐用上述预培养物(于600纳米处的光密度约为2)接种。在发酵过程中，将温度设定在32℃，且通过计量加入25％(体积/体积)氨水将pH保持在7.0恒定。用无菌压缩空气，以1.5体积/体积/分钟将培养物通气并以200转/分钟的旋转搅拌器速率搅拌。氧饱和度降至50％后，将转速升高至1200转/分钟，通过监控装置保持50％氧饱和度(用于900转/分钟下，校正至100％饱和的氧分压探针测定)。当发酵罐内葡萄糖浓度自初始值15克/升降至约5至10克/升时，立即将56％(w/v)葡萄糖溶液计量加入。进料流速为3至6毫升/小时，发酵罐内葡萄糖的浓度保持在0.5至10克/升。葡萄糖用YSI(yellow Springs，俄亥俄州，美国)提供的葡萄糖分析仪测定。当光密度达到30时，通过添加3毫克四环素/升诱导酶的产生。诱导历时7小时。此后，将试样取出，并通过离心将细胞自培养物培养基分离并加以清洗。依照实施例3所述分析所得细胞悬浮液。用硫代硫酸盐测定的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶活性AS-CYS是12单位/ml OD。
通过离心收集细胞，急冻于液氮内，并在-20℃储存。实施例6：通过发酵制备O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶CysK
大体上，制备Cysk的过程与实施例5所述相同。但是，在本例中使用菌株BLR21(DE3)/pLE4。在初始引入的15克葡萄糖/升消耗后，开始给入60％(体积/体积)甘油溶液。流速为9.5毫升/小时。同时，通过添加0.4mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱发酶的产生。诱发21小时后，将试样取出，并通过离心将细胞自培养物培养基分离并加以清洗。依照实施例3所述分析所得细胞悬浮液。用硫化物测定的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶比活ACYS为2单位/ml OD。
通过离心收集细胞，急冻于液氮内，并在-20℃下储存。实施例7：用静息细胞进行的S-苯基-L-半胱氨酸的酶促制备
在装有pH探头和pH控制器的控温容器内，首先将盐酸O-乙酰-L-丝氨酸(Sigma，Deisenhofen，德国)溶解在100毫升水中，使O-乙酰-L-丝氨酸的终浓度达到200mM(29.4克/升)。之后，在搅拌下添加200mM苯硫酚。随后，用5M NaOH滴定，迅速使混合物的pH达到6.7，并将产CysM菌株DH5α/pFL145的细胞悬浮液立即混入。细胞悬浮液的比活AS-CYS为12单位/ml OD。混合物内细胞的光密度(在600纳米处测量)为2.0，因此O-乙酰-L-丝氨酸活性的AS-CYS值为24单位/毫升。在反应过程中，通过pH控制系统，计量加入5M NaOH以保持pH恒定。
在反应过程中观察到白色沉淀形成。30分种后，将试样取出并用1％(体积/体积)乙酸处理。通过离心分离沉淀，并将其溶解于等体积的21％(体积/体积)磷酸，并用HPLC分析。离心上清液也进行色谱分析。分析通过反相HPLC于LUMA 5μC18(2)柱(Phenomenex，Aschaffenburg，德国)进行。所用洗脱液是流速为0.5毫升/分钟的稀磷酸(0.1毫升浓磷酸/升)。上清液中S-苯基-L-半胱氨酸的含量为1.6克/升，沉淀中其含量为24.8克/升。基于O-乙酰-L-丝氨酸，这相应于总收率为67％。该制备还分别在所用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶减至12和2单位/毫升下进行。但是，这导致酶反应减缓，且由于O-乙酰-L-丝氨酸的异构化，而导致收率分别减至52％和15％。实施例8：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的S-苯基-L-半胱氨酸的的酶促制备
本试验在含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤中进行，以代替使用纯O-乙酰基丝氨酸。该肉汤依照专利申请DE 10107002所述通过发酵获得。发酵终止时，为了稳定O-乙酰-L-丝氨酸，用21％(体积/体积)磷酸将pH调至4.0。通过离心分离细胞，并通过蒸发使发酵罐肉汤的浓度达到30克O-乙酰-L-丝氨酸/升。随后，将200mM苯硫酚、滴至pH6.7后的产CysM菌株DH5α/pFL145细胞与100毫升肉汤混合。AS-CYS活性为24单位/毫升。之后，其他过程与实施例7所述相同。基于O-乙酰-L-丝氨酸，收率为65％。实施例9：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的S-苯基-L-半胱氨酸的连续酶促制备
进行本反应的目的是实现基于昂贵且不稳定的起始化合物O-乙酰-L-丝氨酸的尽可能高的转化。为确保实现该目的，研发出连续方法。在该方法中，程序最初与实施例8所述相同，惟不同的是，所用的CysM活性AS-CYS增加至49单位/毫升。反应进行20分钟后，通过计量装置，将含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤(30克/升)、苯硫酚和产CysM菌株DH5α/pFL145的细胞悬浮液(在600纳米处的光密度为240，于磷酸钾缓冲液内，pH7.0)加入。流速分别为150、2.5和3毫升/小时。同时，以155.5毫升/小时的流速，开始将产物溶液自反应容器连续取出。选择该流速以使反应器内的反应体积保持恒定，且反应器内的平均驻留时间为30分钟。用此过程，在混合物内建立了O-乙酰-L-丝氨酸浓度为1.0克/升恒定的稳态。因酶的Km值甚至更低，因此在该浓度下，酶仍具有很好的活性，由于此低浓度，可能成功地减少N-乙酰-L-丝氨酸的异构化。基于O-乙酰-L-丝氨酸，反应收率为85％。实施例10：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的叠氮-L-丙氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM叠氮化钠代替苯硫酚。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为45％。实施例11：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的氰基-L-丙氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM氰化钾代替苯硫酚。仅在将混合物的pH调节至6.7后添加氰化物。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为65％。实施例12：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的S-硫代-L-半胱氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM硫代硫酸钠代替苯硫酚。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为16单位/毫升的细胞，测得的转化为91％。实施例13：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的S-噻唑-2-基-L-半胱氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM 2-巯基噻唑代替苯硫酚。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为62％。实施例14：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的S-1，2，4-三唑-3-基-L-半胱氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM 3-巯基-1，2，4-三唑代替苯硫酚。反应进行30分钟之后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为74％。实施例15：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的硒-L-半胱氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM硒化钠代替苯硫酚。硒化钠通过用硼氢化钠还原亚硒酸钠而制备。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为75％。实施例16：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的苯基-硒代-L-半胱氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM硒酚代替苯硫酚。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为62％。实施例17：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的1，2，4-三唑-1-基-L-丙氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM 1，2，4-三唑代替苯硫酚。为了进行该反应，通过用10％(体积/体积)氯仿处理细胞而使其透化。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为48％。实施例18：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的5-羧基-1，2，3-苯并三唑-2-基-L-丙氨酸的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM 5-羧基-1，2，3-苯并三唑代替苯硫酚。为了进行该反应，通过用10％氯仿处理细胞而使其透化。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为54％。实施例19：用含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤和静息细胞进行的1，2，4-噁唑啉-3，5-二酮基-L-丙氨酸(＝使君子氨酸)的酶促制备
大体上，本实施例的过程与实施例8所述的使用含有CysM的细胞的过程相同。用200mM 1，2，4-噁唑啉-2，5-二酮代替苯硫酚。为了进行该反应，通过用10％氯仿处理细胞而使其透化。反应进行30分钟后，使用相当于在混合物中活性为72单位/毫升的细胞，测得的转化为11％。
                              序列表<110>电化学工业有限公司(国际)<120>制备非蛋白原L-氨基酸的方法<130>DEWAC0187<140><141><160>5<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1gatcgaggtc tcgaatgagt aagatttttg aaga                                       34<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2gatcgaggtc tcggcgctct gttgcaattc tttctcag                                   38<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>3gatcgaggtc tcgaatgagt acattagaac aaac                                       34<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4gatcgaggtc tcggcgctaa tccccgcccc ctggctaa                                   38<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>用于蛋白质纯化的StrepTagII亲和肽<400>5Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1               5

Claims (18)

1.通过酶促生物转化制备非蛋白原L-氨基酸的方法，在该方法中，用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，生成非蛋白原L-氨基酸，所述方法在pH为5.0至7.4的范围内进行。
2.如权利要求1所述的方法，其在pH为6.0至7.1的范围内进行。
3.如权利要求1所述的方法，其在pH为6.0至6.99的范围内进行。
4.制备非蛋白原L-氨基酸的方法，在该方法中，用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，生成非蛋白原L-氨基酸，其中将CysM用作O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。
5.如权利要求1至4之一所述的方法，其中O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶在混合物中的体积活性ACYS至少为2单位/毫升。
6.制备非蛋白原L-氨基酸的方法，在该方法中，用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，生成非蛋白原L-氨基酸，其中将O-乙酰-L-丝氨酸、O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶和亲核化合物恒定地计量加入，同时，将含有非蛋白原L-氨基酸的溶液移出。
7.如权利要求1至6之一所述的方法，其中使用纯化形式的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。
8.如权利要求1至4之一所述的方法，其中将O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶固定化在载体上之后使用之。
9.制备非蛋白原L-氨基酸的方法，在该方法中，用O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶作为催化剂，使O-乙酰-L-丝氨酸与亲核化合物反应，生成非蛋白原L-氨基酸，其中将含有O-乙酰-L-丝氨酸的发酵罐肉汤用作O-乙酰-L-丝氨酸。
10.如权利要求1至6之一或9所述的方法，其中使用具有O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶活性的静息微生物细胞形式的O-乙酰-L-丝氨酸硫化氢解酶。
11.如权利要求1至10之一所述的方法，其中亲核化合物含有选自以下的基团H-S-，H-Se-，-N＝N+＝N-，-C≡N，
Figure A0210545300031
12.如权利要求11所述的方法，其中亲核化合物选自以下化合物：
硫代硫酸盐，通式(1)的硫醇
H-S-R1            (1)其中R1是单价、取代或未取代的、具有1至15个碳原子的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基；
硒化物，通式(2)的硒醇
H-Se-R1           (2)
其中R1代表的意义与通式(1)中的相同；
叠氮化物，氰化物，通式(3)或(4)的唑系其中X和Y相同或不同，且是CR4或N，或R1，R4是-H、-COOH、-OH、-NH2、-NO2 -、-SH、-SO3 -、-F、-Cl、-Br、-I、C1-C5烷基羰基-和它们的酯、酰胺或盐，且R1代表的意义与通式(1)中的相同，且其中R2和R3相同或不同，且是R4或者其中通式(4)中的C1和C2通过桥[-CR5R6-]a连接，代替取代基R2和R3，形成环，其中a是1、2、3或4，其中R5和R6相同或不同，且是R4，且一个或多个非相邻的基团[-CR5R6-]可以被氧、硫或亚胺基代替，该亚胺基任选地被C1-C5烷基取代，且两个相邻的基团[-CR5R6-]可以被基团[-CR5＝CR6-]或被基团[-CR5＝N-]代替；
通式(5)或(6)的异噁唑啉酮其中X、R1、R2和R3代表的意义与已经给出的相同，且其中通式(6)中的C1和C2可以通过通式(4)中定义的桥连接，代替取代基R2和R3，形成环。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中亲核化合物选自2-巯基乙醇、3-巯基丙醇、3-巯基丙酸、3-巯基-1-丙磺酸、巯基乙磺酸、2-巯基乙胺、巯基乙酸、硫羟乳酸、硫代乙酸、巯基琥珀酸、巯基丙酮酸、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、1-硫甘油、苯硫酚、4-氟苯硫酚、4-氯苯硫酚、4-巯基苯酚、对甲苯硫酚、5-硫代-2-硝基苯甲酸、2-巯基噻唑、2-巯基噻唑啉、2-巯基咪唑、3-巯基-1，2，4-三唑、2-噻吩硫醇、2-巯基吡啶、2-巯基嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-巯基烟酸、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基苯并噻唑、2-巯基苯并噁唑、6-巯基嘌呤、硫代硫酸钠、硫代硫酸钾、硫代硫酸铵、叠氮化钠、叠氮化钾、叠氮化铵、氰化钾、氰化钠、氰化铵、甲硒醇、乙硒醇、丙硒醇、硒酚、1，2-吡唑、3-甲基吡唑、4-甲基吡唑、3，5-二甲基吡唑、3-氨基吡唑、4-氨基吡唑、吡唑-4-羧酸、吡唑-3，5-二羧酸、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、3-氨基-1，2，4-三唑、1，2，3，4-四唑、吲唑、吲唑-3-羧酸、吲唑-5-羧酸、5-氨基吲唑、苯并三唑、苯并三唑-5-羧酸、5-氨基苯并三唑、氨基吡唑并嘧啶、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、异噁唑啉-5-酮、3-甲基异噁唑啉-5-酮、4-甲基异噁唑啉-5-酮、4，5-二甲基异噁唑啉-2-酮和1，2，4-噁唑啉-3，5-二酮。
14.如权利要求1至13之一所述的方法，其中选择亲核化合物的浓度以使该化合物以与O-乙酰-L-丝氨酸等摩尔的浓度存在。
15.如权利要求1至14之一所述的方法，其在5℃至70℃的温度下进行。
16.如权利要求1至15之一所述的方法，其中非天然L-氨基酸选自呈L-构形的通式(7)的氨基酸
Figure A0210545300051
其中Z是与通式(8)至(19)相对应的单价基团
-S-SO3 -     (8)，     -S-R1    (9)，
-Se-H       (10)，    -Se-R1   (11)，
-N＝N+＝N- (12)，    -C≡N    (13)，
Figure A0210545300052
Figure A0210545300061
及它们的酯、醚或盐，且R1、R2、R3、R4、X和Y代表的意义与通式(1)至(6)中给出的相同。
17.如权利要求1至16之一个或多个所述的方法，其中在所述方法终止后，用已知方法分离非蛋白原L-氨基酸。
18.如权利要求17所述的方法，其中分离通过过滤、离心、萃取、吸附、离子交换色谱、沉淀或结晶进行。
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