MXPA02003402A - Procedimiento para la preparacion de l-aminoacidos no proteinogenos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparacion de un L-amino-acido no proteinogeno mediante una biotransformacion enzimatica, en el que se hace reaccionar O-acetil-L-serina con un compuesto nucleofilo mediando catalisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina para formar un L-aminoacido no proteinogeno, estando caracterizado este procedimiento porque se lleva a cabo a un valor del pH situado en el intervalo entre pH 5,0 y 7,4.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE L-AMINOACIDOS NO PROTEINOGENOS El invento se refiere a un procedimiento para la preparación de 5 L-aminoácidos no proteinógenos mediante biotransformación enzimática. Los aminoácidos no proteinógenos son aminoácidos que no se utilizan en la naturaleza como eslabones componentes para la biosíntesis de ' proteínas, y en ello se pueden diferenciar claramente de los 20 aminoácidos proteinógenos. En el sentido del presente invento se cuenta entre los 10 aminoácidos no proteinógenos al aminoácido muy raro, L-seleno-cisteína, que se presenta bastante en proteínas. Los aminoácidos no proteinógenos constituyen compuestos interesantes p.ej. para la preparación de sustancias activas farmacéuticas y agrícolas. Estos, como sustancia activa o como parte de una sustancia activa, 15 pueden imitar en una especie de mimetismo molecular a la estructura de * aminoácidos naturales y con ello pueden producir una modulación de la f reacción natural, por ejemplo en el caso de interacciones con receptores.

Además, pueden servir como eslabones componentes de síntesis de modo enteramente general como compuestos quirales dentro del marco del "charco 20 quiral". Los procedimientos de preparación hasta ahora conocidos para aminoácidos no proteinógenos en forma pura en cuanto a los enantiómeros, se basan en la mayor parte de los casos en síntesis costosas, que además de ello solamente permiten el acceso a un compuesto determinado. Solamente unos pocos procedimientos hacen posible, mediante el simple intercambio de un educto (es decir un producto de partida), la preparación de diferentes compuestos. En la mayor parte de los casos, se trata de síntesis químicas, que a su vez parten ya de eslabones componentes quirales. Otros procedimientos combinan la síntesis química de racematos con un desdoblamiento de racematos, que con frecuencia se lleva a cabo por vía enzimática. Junto a esto, se describen también algunos procedimientos enzimáticos que parten de compuestos proquirales y que hacen posible la síntesis estereoselectiva de aminoácidos no proteinógenos. Así, con ayuda de transaminasas se pueden preparar a partir de cc-ceto-ácidos, con ácido L-glutámico como donante de grupos amino, diferentes aminoácidos no proteinógenos (Taylor y colaboradores 1998, TIBTECH 16: 412-418). Otro ejemplo es la síntesis de L-terc.-leucina con ayuda de la deshidrogenasa de leucina (Drauz 1997, Chimia 51 : 310 - 314). Un procedimiento especialmente sencillo para la preparación de aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de microorganismos se describe en el documento de solicitud de patente alemana DE-10046934 (presentada el 21 .09.2000 por el mismo solicitante). En este caso pasan a emplearse organismos que presentan un metabolismo desarreglado de cisteína y por lo tanto ponen a disposición un alto nivel de O-acetil-L-serina. Este compuesto sirve en el metabolismo de la cisteína como compuesto precursor biosiníético de L-c¡steína. Esta última se forma por sustitución del grupo acetato en la posición ß por un radical de tiol. Esta reacción, designada como sustitución en ß, es catalizada por enzimas de la clase de las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina [EC 4.2.99.8]. Por alimentación de sustancias nucleófilas de determinadas clases de compuestos (tioles, azoles e isoxazolinonas) durante la fermentación, éstas toman parte en la sustitución en posición ß y se consigue la producción de L-aminoácidos no proteinógenos. Las estructuras de los respectivos radicales de los aminoácidos preparados son dictadas por consiguiente por el compuesto nucleófilo aportado. Un problema que se plantea en el caso de este procedimiento consiste en que los compuestos nucleófilos alimentados no se deben dosificar en cantidades demasiado altas, puesto que en caso contrario se pueden provocar, por el propio compuesto o por el aminoácido resultante, efectos tóxicos sobre el metabolismo de los microorganismos. Esto es cierto en particular para muchos compuestos tioles, puesto que éstos, como sustancias activas en redox, poseen toxicidad en concentraciones elevadas. Además, el empleo de compuestos tioles en procedimientos de fermentación plantea muchos problemas, puesto que éstos en el caso de una aireación intensa en el fermentador tienen tendencia a la oxidación y, sin tomar precauciones técnicas, provocan una importante molestia por olor. Tampoco es posible por causa de su alta toxicidad una alimentación de un aziduro o cianuro, de los que es conocido que toman parte en la sustitución en posición ß con sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina (Flint y colaboradores, 1996, J. Biol. Chem. 271 : 16053-16067). Fue misión del presente invento poner a disposición un procedimiento para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos, que haga posible un posible un empleo con dosificación elevada de compuestos nucleófilos - en particular, también de compuestos tóxicos -. El problema planteado por esta misión se resuelve mediante un procedimiento de biotransformación enzimática, en el que se hace reaccionar O-acetil-L-serina con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno, estando caracterizado este procedimiento porque se lleva a cabo a un valor del pH en el intervalo comprendido entre pH 5,0 y 7,4. Mediante este procedimiento se hace posible la síntesis de un gran número de L-aminoácidos no proteinógenos, puros en cuanto a los enantiómeros, y en parte de nuevo tipo, a la escala industrial. Se conocen sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina. Éstas se han aislado hasta ahora a partir de las plantas y los microorganismos más diferentes. Las que han sido mejor investigadas son las correspondientes enzimas bacterianas de Salmonella typhimurium. En este organismo existen dos enzimas sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina, que se denominan por OASS-A y OASS-B respectivamente. Los correspondientes genes son asimismo conocidos y llevan las denominaciones de cysK y cysM respectivamente. Aún cuando ambas enzimas poseen un mecanismo muy similar de reacción, la identidad sobre la base de la secuencia de aminoácidos es solamente de un 45 %. Acerca de la OASS-B (CysM) se describió que ésta, al contrario que la OASS-A (CysK), está en situación de catalizar una reacción de O-acetil-L-serina con un tiosulfato para formar S-sulfo-cisteína. Esta reacción desempeña un cometido importante en el caso del crecimiento de las bacterias con un tiosulfato como única fuente de azufre. Las comparaciones entre las secuencias de genes de O-acetil-L-serina procedentes de diferentes organismos muestran, además de ello, que hay dos grupos filogenéticos (Kitabatake y colaboradores, 2000, J. Bacteriol. 182: 143-145). Las CysK de Salmonella typhimurium y Escherichia coli forman un gran grupo junto con las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina procedentes de otras eubacterias, de arqueas (Archaea) metanógenas y de plantas. Por el contrario, las CysM de Salmonella typhimurium y Escherichia coli están situadas en un grupo con afinidad muy pequeña con las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina procedentes de arqueas hipertermofilas (p.ej. Pyrococcus, Sulfolobus, Thermoplasma). Las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina en el sentido del presente invento están caracterizadas porque pueden catalizar la síntesis de L-cisteína a partir de O-acetil-L-serina y un sulfuro. Las enzimas emparentadas tanto con la CysM como con la CysK son por lo tanto sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina en el sentido del presente invento.

Aunque algunas publicaciones individuales muestran que las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina seleccionadas entre el grupo de las CysK presentan un espectro relativamente amplio de substratos (Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemistry 35: 1089-1104; Flint y colaboradores, 1996, J. Biol. Chem. 271 :16053-16067), no se tomó en consideración hasta ahora la posibilidad del empleo a escala técnica de sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina para la producción de aminoácidos no proteinógenos. La razón decisiva, que se oponía hasta ahora a una realización a escala técnica de la preparación enzimática de aminoácidos no proteinógenos con sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina, se encuentra en la inestabilidad de la O-acetil-L-serina precisamente en el intervalo de valores del pH que corresponden al intervalo de actividad de las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina. La O-acetil-L-serina se isomeriza, en dependencia del valor del pH, para formar N-acetil-L-serina. La reacción es irreversible y por ejemplo también es extremadamente rápida a un valor del pH de 7,6 con unos caudales de 1 % x min' . La velocidad de reacción disminuye con un valor decreciente del pH, por lo que el compuesto es estable p.ej. a un pH de 4,0. El mecanismo de la reacción se basa en un ataque nucleófilo intramolecular del grupo amino desprotonado situado en el carbono carbonílico del radical acilo (Tai y colaboradores, 1995, Biochemistry 34: 12311 -12322). El óptimo de valores del pH de las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina está situado por el contrario en la región del pH 8,0 (Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemistry 35: 1089-1 104; Tai y colaboradores 1995, Biochemistry 34: 1231 -12322) y por consiguiente en una región que es muy desventajosa en lo que se refiere a la isomerización de O-acetil-serina. Por esta razón, Ikegami y Murakoshi proponen una síntesis biomimética de aminoácidos no proteinógenos con O-acetil-L-serina, un compuesto nucleófilo, fosfato de piridoxal e iones de metales (preferiblemente Ga2+). Esta reacción es posible en un intervalo de valores del pH de 3,5 - 5,5 y garantiza por consiguiente la estabilidad de la O-acetil-L-serina. Con unos rendimientos máximos < 45 %, sin embargo, la eficiencia de este método no es demasiado alta. Una gran desventaja con respecto a la síntesis enzimática es la falta de selectividad para enantiómeros. Un problema adicional, que es resuelto mediante el procedimiento conforme al invento, fue por lo tanto poner a disposición un procedimiento enzimático para la preparación de aminoácidos no proteinógenos, puros en cuanto a los enantiómeros, que garantice un grado de conversión enzimático eficiente (» 45 %) con una pequeña isomerización, a pesar de la incompatibilidad entre la estabilidad de la O-acetil-L-serina y el óptimo de la actividad enzimática. El problema planteado por esta misión se resolvió mediante el procedimiento conforme al invento, que se distingue preferiblemente por el hecho de que - la reacción se lleva a cabo por debajo del valor óptimo del pH de las sulfhidrilasas de O-acetil-serina, y - la enzima se emplea en un grado de dosificación suficientemente alto. La región preferida de valores de pH para la preparación de aminoácidos no proteinógenos en el sentido del presente invento es el intervalo de valores del pH comprendidos entre pH 5,0 y 7,4. Es especialmente preferido el intervalo de valores del pH entre pH 6,0 y 7,1. Es particularmente preferido el intervalo de valores del pH entre pH 6.0 y 6.99 El valor del pH se mantiene constante con preferencia mediante un control activo del pH, para contrarrestar también la formación estequiométrica de ácido acético. El control activo del pH se realiza preferiblemente mediante una unidad de medición y regulación, que al producirse una desviación del valor del pH respecto del valor nominal ajusta de nuevo el deseado valor del pH por adición dosificada de una base o un ácido. Las reacciones hasta ahora descritas en la bibliografía para la síntesis de aminoácidos no proteinógenos con sulfhidrilasas de O-acetil-serina se llevaron a cabo, al contrario que en el modo de proceder conforme al invento, en la región del óptimo de valores del pH de las sulfhidrilasas de O-acetil-serina sin regulación activa del pH y solamente a escala analítica. Ademas, se utilizaron sin excepción enzimas del grupo filogenético de las enzimas CysK.

El invento se refiere por consiguiente también a un procedimiento para la preparación de un L-aminoácido no proteinógeno, en el que se hace reaccionar O-acetil-L-serina con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno, que está caracterizado porque se emplea CysM como sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina. Un grado de dosificación suficientemente alto de la enzima garantiza que también fuera del valor óptimo de la reacción enzimática tenga lugar un grado de conversión suficiente. Una concentración tal de enzima se presenta para el procedimiento preferiblemente cuando la actividad volumétrica de la sulfhidrilasa de O-acetil-serina, ACys, es por lo menos de 2 unidades / mi en la tanda. De modo especialmente preferido, la actividad es de 2 - 200 unidades / mi. La determinación de la actividad se efectúa conforme al ensayo descrito en el Ejemplo 3. En el transcurso del desarrollo del presente invento, se pudo observar que también las sulfhidrilasas de O-acetil-serina procedentes del grupo filogenético de las enzimas CysM constituyen sobresalientes enzimas para la preparación de aminoácidos no proteinógenos. El espectro de los compuestos nucleófilos que resultan apropiados como substratos es, de modo sorprendente, incluso incluso más amplio que el de las enzimas CysK. En una forma de realización especialmente preferida del invento, la reacción enzimática se realiza como procedimiento continuo. En este caso, durante la reacción se añaden dosificadamente de modo permanente O-acetil- L-serina, la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina y el compuesto nucleófilo, y al mismo tiempo se retira de la tanda una solución que contiene los L-aminoácidos no proteinógenos (solución de productos). Esto último sucede con preferencia de tal manera que el volumen es constante en la tanda de reacción. La ventaja especial de este modo de proceder consiste en que se ajusta un equilibrio de fluencia, por lo que se presenta en la tanda una concentración baja permanente de O-acetil-L-serina y por consiguiente se disminuye la isomerización. Con preferencia, se ajusta una concentración de O-acetil-L-serina de < 1 ,0 g/l. Este valor se puede controlar por variación del tiempo medio de permanencia de la solución en fa tanda de reacción. La carga previa de O-acetil-L-serina para la reacción continua se mantiene por debajo de un valor ácido del pH, preferiblemente a un pH de 4 - 5, a fin de garantizar una estabilidad suficiente. La O-acetil-L-serina era accesible hasta ahora solamente por una síntesis química mediante acetilación de L-serina y resultaba cara por causa de los altos precios de la L-serina. El documento de solicitud de patente alemana DE-10107002 del mismo solicitante, presentada el 15 de Febrero de 2001 , describe un procedimiento de fermentación para la preparación de O-acetil-L-serina. Por consiguiente, está disponible ciertamente un sistema barato de producción, pero el aislamiento de los productos a partir del caldo de fermentación plantea problemas por causa de la inestabilidad de la O-acetil-L-serina.

Una ventaja de la presente invención consiste en que se puede emplear directamente como fuente de O-acetil-L-serina en el procedimiento conforme al invento un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina, tal como se obtiene p.ej. a partir de una fermentación realizada según ese documento DE-10107002. Este modo de proceder es especialmente rentable y evita el aislamiento de un compuesto inestable. La preparación de sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina para la síntesis de aminoácidos no proteinógenos se efectúa preferiblemente con ayuda de técnicas de ADN recombinantes usuales, tal como son habituales para un especialista en la materia. Un gen, que codifica una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina, se clona para ello en un apropiado vector y a continuación transforma a una cepa hospedante apropiada. Como cepa hospedante se adecúa cualquier microorganismo, que sea accesible a las técnicas de ADN recombinantes y que sea apropiado para una preparación por fermentación de proteínas recombinantes. Un microorganismo preferido para la preparación de sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina es Escherichia coli. En principio, son posibles tanto la integración en el cromosoma del gen recombinante de sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina como también la utilización en un vector de plásmido auto-replicable. Al realizar la clonación se utilizan con preferencia vectores, que ya contienen elementos genéticos (p.ej. promotores regulables, terminadores), que hacen posible una expresión controlada, grandemente inducible, del gen de sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina. Son especialmente preferidos los vectores plásmidos con alto número de copias, tales como por ejemplo los vectores de Escherichia coli pUC18, pBR322, pACYC184 y sus derivados. Como promotores grandemente inducibles se adecúan por ejemplo los promotores lac, tac, trc, lambda PL, ara ó tet. La producción de sulfhidrilasas de O-acetil-L-serina se efectúa por ejemplo mediante cultivación de una cepa de microorganismo recombínante por fermentación. En este caso, se utilizan procedimientos de cultivación conocidos por un especialista en la materia, teniendo que ser adaptados los parámetros del procedimiento a la respectiva cepa de microorganismo. Como medios nutritivos se pueden pasar a emplear tanto medios completos como también medios mínimos. Se puede aplicar tanto un proceso discontinuo (batch) como también un proceso de alimentación discontinua (fed-batch). En el caso de la utilización de sistemas de promotores inducibles, en un momento apropiado se conecta la expresión del gen de sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina por adición de un correspondiente o inductor. Después de una fase de producción suficiente, las células que contienen una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina se cosechan mediante métodos conocidos (p.ej. mediante una centrifugación). La enzima sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina preparada de esta manera se puede aislar mediante métodos corrientes de la purificación de proteínas. En este caso, se pueden aplicar tanto procedimientos clásicos (p.ej. de precipitación, cromatografía con intercambio de iones, cromatografía con interacción hidrófoba, enfoque isoeléctrico) como también una moderna cromatografía de afinidad mediando utilización de "etiquetas de afinidad". Las secuencias, que codifican este apéndice de afinidad, ya pueden ser fusionadas al efectuar la clonación del gen que tiene la región codificadora, de manera tal que resultan proteínas de fusión con el correspondiente apéndice de afinidad. Éstas se aislan luego en una purificación en una sola etapa. Un ejemplo de apropiadas combinaciones del apéndice de afinidad y de la purificación por afinidad es la etiqueta StrepTag con cromatografía de afinidad con estreptavidina, adquirible comercialmente de la entidad IBA, Gottingen, Alemania. En el procedimiento conforme al invento puede pasar a emplearse una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina en forma purificada. Junto a la reacción en solución, es posible también una inmovilización de la enzima junto a un soporte. Métodos correspondientes constituyen estado de la técnica. Un aislamiento de la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina para la preparación de aminoácidos no proteinógenos no es sin embargo imperativamente necesario. Asimismo es posible emplear directamente en el procedimiento conforme al invento células de microorganismos que poseen actividad de sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina. Ejemplos de tales cepas de microorganismos son las cepas de Escherichia coli DH5a/pFL145 y BLR21(DE3)/pLE4. Éstas se describen en los Ejemplos 1 y 2 y fueron depositadas en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ en Braunschweig, bajo los números DSM 14088 y 14089 respectivamente. En esta variante del procedimiento conforme a la invención, se efectúa una biotransformación de O-acetil-L-serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno con células en reposo. Se produce en tal caso la penetración de las células con O-acetil-L-serina y un compuesto nucleófilo, al igual que la puesta en libertad del producto de reacción, el L-aminoácido no proteinógeno, por las células. Caso de que se desee, el intercambio de sustancias entre el interior de la célula y el medio de reacción se puede aumentar, tratando las células con sustancias que producen una permeabilización de las células. Dichas sustancias, tales como por ejemplo cloroformo o tolueno, y su utilización, son conocidas por un especialista en la materia. En una forma preferida de realización del procedimiento, un aminoácido no proteinógeno se forma por reacción de O-acetil-L-serina con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina, presentándose la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina intracelularmente dentro de un microorganismo. Se prefiere en especial la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos por reacción de una O-acetil-L-serina no purificada, obtenida por fermentación, con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina, presentándose la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina intracelularmente dentro de un microorganismo. Como compuestos nucleófilos para la sustitución en posición ß, catalizada por sulfhidrilasas de O-acetil-serina, se emplean en el procedimiento conforme al invento con preferencia compuestos que contienen un radical seleccionado entre el grupo formado por H H H— S — H-Se— — N=N=N" — C_=N — N— N= — N— O — Se prefiere especialmente añadir a la tanda de reacción un compuesto nucleófilo seleccionado entre el grupo formado por los siguientes compuestos: - tiosulfatos - tioles de la fórmula general (1 ): H— S-R1 ( 1 } significando R1 un radical alquilo, alcoxi, arilo o heteroarilo univalente con 1 a 15 átomos de C, sustituido o sin sustituir; - seleniuros - selenoles de la fórmula general (2): teniendo R1 el significado mencionado para la fórmula (1 ), H-Se-R1 ( 2 } iM¡á aziduros cianuros azoles de la fórmula general (3) en que X e Y son iguales o diferentes y significan CR4 ó N y R4 significa -H, -COOH, -OH, -NH2, -N02, -SH, -S03", -F, -Cl, -Br, -I, alquil C C5-carbon¡lo, así como sus ésteres, amidas o sales o R1, y R1 tiene el significado mencionado para la fórmula (1 ), y en que R2 y R3 son iguales o diferentes y significan R4, o en que C1 y C2 en la fórmula (4), en vez de llevar los sustituyentes R2 y R3, están unidos para formar un anillo mediante un puente [-CR5R6-]a en el que a es igual a 1 , 2, 3 ó 4, en que R5 y R6 son iguales o diferentes y significan R4, y uno o varios grupos [-CR5R6-] no contiguos pueden estar reemplazados por oxígeno, azufre o un radical ¡mino eventualmente sustituido con alquilo C C5 y dos grupos [-CR5R6-] contiguos pueden estar reemplazados por un grupo [-CR5=CR6-] o por un grupo [-CR5=N-], - isoxazolinonas de la fórmula general (5) ó (6): en que X, R1, R2 y R3 tienen los significados ya mencionados y C1 y C2 en la fórmula (6), en vez de llevar los sustituyentes R2 y R3, pueden estar unidos para formar un anillo mediante un puente definido como para la fórmula (4). Ejemplos de tiosulfatos son tiosulfato de sodio, tiosulfato de potasio o tiosulfato de amonio. Ejemplos de tioles son compuestos seleccionados entre el grupo formado por 2-mercapto-etanol, 3-mercapto-propanol, ácido 3-mercapto-propiónico, ácido 3-mercapto-1-propano-sulfónico, ácido mercapto-etano-sulfónico, 2-mercapto-etil-amina, ácido tio-glicólico, ácido tio-láctico, ácido tio-acético, ácido mercapto-succínico, ácido mercapto-pirúvico, ditiotreitol, ditioeritritol, 1 -tio-glicerol, tiofenol, 4-fluoro-tiofenol, 4-cloro-tiofenol, 4-mercapto-fenol, p-tio-cresol, ácido 5-tio-2-nitro-benzoico, 2-mercapto-tiazol, 2-mercapto-tiazolina, 2-mercapto-imidazol, 3-mercapto-1 ,2,4-triazol, 2-tiofeno-tiol, 2-mercapto-piridina, 2-mercapto-pirimidina, 2-tio-citosina, ácido 2-mercapto-nicotínico, 2-mercapto-1-metil-im¡dazol, 2-mercapto-benzotiazol, 2-mercapto-benzoxazol, 6-mercapto-purina. Ejemplos de selenoles son compuestos que se seleccionan entre el grupo formado por metil-selenol, etil-selenol, propil-selenol, fenil-selenol.

Ejemplos de aziduros son aziduro de sodio, aziduro de potasio o aziduro de amonio. Ejemplos de cianuros son cianuro de potasio, cianuro de sodio o cianuro de amonio. Ejemplos de azoles son compuestos que se seleccionan entre el grupo formado por 1 ,2-pirazol, 3-metil-pirazol, 4-metil-pirazol, 3,5-dimetil- pirazol, 3-amino-pirazol, 4-amino-pirazol, ácido pirazol-4-carboxílico, ácido pirazol-3,5-dicarboxíl¡co, 1 ,2,3-triazol, 1 ,2,4-triazol, 3-amino-1 ,2,4-tr¡azol, 1 ,2,3,4-tetrazol, indazol, ácido indazol-3-carboxílico, ácido indazol-5- carboxílico, 5-amino-indazol, benzotriazol, ácido benzotriazol-5-carboxílico, 5- amino-benzotriazol, amino-pirazolo-pirimidina, 8-aza-guanina, 8-aza-adenina. Ejemplos de isoxazolinonas son compuestos que se seleccionan entre el grupo formado por isoxazolin-5-ona, 3-metil-isoxazolin-5-ona, 4-metil- isoxazolin-5-ona, 4,5-dimetil-isoxazolin-2-ona, 1 ,2,4-oxadiazolidin-3,5-diona. La concentración del compuesto nucleófilo se escoge en la tanda con preferencia de tal manera que se presenta en una concentración equimolar con respecto a la O-acetil-L-serina. La temperatura de reacción se escoge con preferencia entre 5°C y 70°C. El intervalo especialmente preferido de temperaturas está situado entre 20°C y 40°C. Como disolvente para la reacción se utiliza con preferencia agua. Como productos de reacción se forman con preferencia L- aminoácidos de la fórmula general (7) en configuración L Id Áíá-iLA i-í¡ÍÍ»á siendo Z un radical univalente seleccionado entre las fórmulas (8) hasta (19) "S"~S°3" (8), — S- 1 (9) , do, be · (11), i jliii?H así como sus ésteres, éteres o sales, y teniendo R1, R2, R3, R4, X e Y los significados ya mencionados para las fórmulas (1 ) hasta (6). Con preferencia, un L-aminoácido no proteinógeno soluble, después de haberse terminado el procedimiento conforme al invento y después de haber efectuado una separación de la solución preferiblemente acuosa, mediante métodos conocidos, en biomasa y un material sobrenadante de cultivo, se aisla a partir de este material sobrenadante de cultivo. Tales métodos para el aislamiento de aminoácidos son asimismo conocidos por un especialista en la materia. Estos abarcan p.ej. operaciones de filtración, centrifugación, extracción, adsorción, cromatografía con intercambiadores de iones, precipitación y cristalización. En el caso de presentarse un aminoácido no proteinógeno difícilmente soluble, se lleva a cabo con preferencia una centrifugación con clasificación, como es conocida por un especialista en la materia, permaneciendo la biomasa en lo posible dentro del material sobrenadante de centrifugación. El producto separado se disuelve y reprecipita preferiblemente mediante métodos clásicos. Los siguientes Ejemplos sirven para explicar adicionalmente el invento.

EJEMPLO 1 Clonación de los genes cvsK ó cvsM procedentes de Escherichia coli como gen de fusión con la secuencia StrepTag Para la clonación de los genes cysK o cysM respectivamente a partir de Escherichia coli se llevaron a cabo en primer lugar reacciones en cadena de polimerasa con los siguientes pares de cebadores de oligonucleótidos protegidos por un fosforotioato con ayuda de polimerasa de ADN de Pwo. cysKS 1 : 5 '-gat cga ggt ctc gaa tga gta aga ttt ttg aag a-3 ' SEQ.ID.NO. 1 cysKS2: 5 '-gat cga ggt ctc ggc gct ctg ttg caá ttc ttt ctc ag3' SEQ.ID.NO. 2 o cysMS3: 5'-gat cga ggt ctc gaa tga gta cat tag aac aaa c-3 SEQ.ID.NO.3 cysMS5: 5'-gat cga ggt ctc ggc gct aat ccc cgc ccc ctg gct aa3'SEQ.ID.NO.4 En tal caso, a través de las secuencias de cebadores se introdujeron sitios de corte para la endonucleasa de restricción Bsal (nucleótidos subrayados). Como matriz sirvió el ADN cromosomal de E. coli W3110 (ATTC 27325). Los materiales amplificados obtenidos se digirieron con la enzima de restricción Bsal y a continuación se clonaron en el vector pASK-IBA3 tratado con Eco31 l (IBA = Institut für Bioanalytik (Instituto de Bioanalitica), Góttingen, Alemania). Este vector permite una clonación como fusión de genes con una secuencia en el extremo 3', que codifica un péptido con afinidad (WSHPQFEK SEQ. ID. NO. 5) que lleva la denominación StrepTagíl. La expresión de la fusión de genes con ayuda del promotor tet conduce a una proteína con el apéndice StrepTagíl en el extremo terminal de C. Este último se puede usar para el aislamiento de la proteína, puesto que el StrepTagíl medía en una fijación a columnas con estreptavídina.

EJEMPLO 2 Purificación de las proteínas CvsK v CvsM respectivamente Con la estructura artificial cysM-StrepTag (pFL145) se podía consignar en la cepa DH5a de E. colí (Clonetech, Heidelberg, Alemania) una expresión muy buena de genes. En tal caso, la cultivación y la expresión se llevaron a cabo de acuerdo con los datos de la entidad Institut für Bioanalytik, Góttingen, Alemania. La cepa DH5a/pFI145 fue depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares DSMZ de acuerdo con el convenio de Budapest bajo el número DSMZ 14088. En el caso de la estructura artificial cysK-StrepTag (pLE1), por el contrario, la expresión era solamente muy débil. Por transclonación de la fusión de genes como fragmento para Xbal-Hindlll en un vector con el promotor de T7 (pRSET5a) (Stratagene, Heidelberg, Alemania) y por expresión en la cepa BLR21 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Alemania) se pudo conseguir sin embargo también en este caso (pLE4) una buena formación del producto de gen. La cepa BLR21 (DE3)/pLE4 fue depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares DSMZ de acuerdo con el convenio de Budapest bajo el número DSMZ 14089. El aislamiento de las proteínas CysK y CysM respectivamente se efectuó mediante cromatografía de afinidad en columnas con estreptavidina, procediéndose en principio de acuerdo con los datos del fabricante, la entidad Instituí für Bionalytik, Góttingen, Alemania. El rendimiento, en el caso de utilizarse un cultivo de 250 mi, fue de 3 mg de proteína CysK purificada y respectivamente de 4,5 mg de proteina CysM purificada. Ambas proteínas, por causa del cofactor fosfato de piridoxal, presentaban una manifiesta coloración de amarillo y poseían un máximo de absorción a 420 nm.

EJEMPLO 3 Determinación de la actividad enzimática La medición de la actividad de las sulfhidrilasas de O-acetil-L-serlna se efectúa por detección del producto de reacción "natural" L-cisteína (Cys) o, en el caso de CysM, alternativamente también como S-sulfo-L-cisteína (S-Cys). Ambos productos se pueden detectar de una manera muy específica y muy sensible con el ensayo según Gaitonde (1967, Biochem. J. 104: 627-633). Para ambos compuestos se tuvieron que registrar curvas de calibración separadas, puesto que el complejo cromático con sulfo-cisteína presenta una menor intensidad. Una tanda típica de ensayo contenía 10 mM de O-acetil-serina (adición a partir de 200 mM de una solución original en 500 mM de un tampón de succinato de sodio, de pH 5,5), 10 mM de sulfuro de sodio o tiosulfato de sodio, 100 mM de un tampón de fosfato de potasio, de pH 7,0, 5 µ?/??? de una enzima purificada, y se incuba a 37°C. La actividad específica A se indica en unidades / mg de proteína, es decir en µ???? (micromoles) de producto x min" x mg"1 de proteína. ACys significa la actividad específica de la formación de cisteína con un sulfuro. As-cys significa la actividad específica de la formación de S-sulfo-cisteína con un tiosulfato. La actividad específica con las proteínas aisladas en el Ejemplo 2 fue: CysK: Acys 140 unidades / mg CysM: Acys 199 unidades / mg CysM: As-cys 145 unidades / mg Al determinar la actividad de las sulfhidrilasas de O-acetil-serina en células en reposo se ajustó en primer lugar una suspensión de células con una densidad óptica (OD) de 20,0 (medida a 600 nm). A continuación, las células se permeabilizaron por adición de cloroformo hasta 10 % en volumen y se incubaron a la temperatura ambiente durante 5 min. Para el ensayo enzimático, se ajustó entonces una densidad óptica de 1 ,0 y se llevó a cabo con las células, como antes se describe, la reacción con O-acetil-L-serina y un sulfuro o tiosulfato respectivamente. La actividad específica de las células, A, se Índica en este contexto en µ???? x min x (mi de suspensión de células con una densidad óptica de 1 ,0 a 600 nm)'1; en forma abreviada: unidades / mi de OD.

EJEMPLO 4 Investigación de las posibilidades de catálisis de las sulfhidrilasas de O- acetil-L-serina CvsK y CysM respectivamente Con el fin de preparar aminoácidos no proteinógenos con ayuda de las sulfhidrilasas de O-acetil-serina, se emplearon en la reacción otros compuestos nucleófilos en vez de un sulfuro o tiosulfato. Para su detección, se llevó a cabo una derivatización en columna previa para aminoácidos con orto-ftalodialdehído. Con este método se pudo llevar a cabo un amplio escrutinio de apropiados substratos nucleófilos. Las tandas contenían 4 mM de O-acetil-serina (adición a partir de 200 mM de una solución original en 500 mM de un tampón de succinato de sodio, de pH 5,5), 20 mM de un compuesto nucleófilo, 100 mM de un tampón de fosfato de potasio, de pH 7,0, 5 µg ml de una enzima purificada. La reacción se detuvo con 1/100 volúmenes de ácido acético (al 96 % v/v = volumen/volumen) y se analizó por HPLC (cromatografía de líquido de alto rendimiento) con una columna HP Aminoquant (200 mm x 2,1 mm) de acuerdo con los datos del fabricante, la entidad Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania.

Con el fin de caracterizar a los productos formados, la masa molecular se detectó mediante HPLC-MS (HPLC-espectrometría de masas). Para esto sirvió una columna de Luna-C18 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con ácido fórmico (al 0,1 % v/v) como fase móvil. La ionización se llevó a cabo en la modalidad de electroproyección (Elektrospray) positiva. La siguiente Tabla muestra la reactividad de las dos enzimas CysK y CysM respectivamente frente a diferentes compuestos nucleófilos y la masa determinada en el análisis por HPLC-MS (MH+).

Nucleófilo (o sal) CysK * CysM * Producto MH+ Mercapto- +++ +++ S-Hidroxietil- 166 etanol L-cisteína Ditiotreitol +++ +++ S-Mercapto- 242 dihidroxibutil- L-cisteína Tiofenol ++ +++ S-Fenil- 198 L-cisteína 2-Mercapto- ++ +++ Tiazol-2-il- 205 tiazol L-cisteína 3-Mercapto-1 ,2,4- + +++ 1 ,2,4-Triazol- 189 triazol 3-il-L-cisteína Seleniuro de sodio +++ +++ L-Seleno-císteína 170 Fenil-selenol ++ +++ Fenil-L-seleno-cisteína 246 Aziduro de +++ +++ Azido-L-alanina 131 sodio Cianuro de +++ +++ Ciano-L-alanina 1 15 potasio 1 ,2-Pirazol ++ ++ 1 ,2-Pirazolil- 156 L-alanina 1 ,2,4-Triazol +++ ++ 1 ,2,4-Triazolil-1 -L- 57 alanina 1 ,2,3,4- +++ ++ 1 ,2,3,4-Tetrazol-2-il-L- 158 Tetrazol alanina 1.2,3- ++ + 1 ,2,3-Benzotriazol-2-il- 207 Benzotriazol alanina 5-Carboxi-1 ,2,3- ++ + 5-Carboxi-1 ,2,3- 242 benzotriazol benzotriazol-2-il- alanina 8-Aza-guanina - + Aza-guan-8-il- 240 L-alanina 1 .2.4- - + 1 ,2,4-Oxadiazolidin- 190 Oxadiazolidin-3,5- dionil-L-alanina diona * +++ grado de conversión mayor que 70 % después de 30 min, ++ grado de conversión mayor que 40 % después de 30 min, + grado de conversión mayor que 10 % después de 30 min, - grado de conversión menor que 5 % después de 30 min.

EJEMPLO 5 Preparación por fermentación de la sulfhidrílasa de O-acetii-L-serina CysM Como cultivo precursor para la fermentación se inocularon 20 mi del medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de un extracto de levadura, 10 g/l de NaCI), que adicionalmente contenía 100 mg/l de ampicilina, con la cepa DH5ot/pFL145 (véase con anterioridad), y se incubaron a 30°C y 150 rpm en un aparato sacudidor durante una noche. A continuación, toda la tanda se transfirió a 100 mi del medio SM1 (12 g/l de K2HP04; 3 g/l de KH2P04; 5 g/l de (NH4)2S04; 0,3 g/l de MgS04 x 7 H20; 0,015 g/l de CaCI2 x 2 H20; 0,002 g/l de FeS04 x 7 H20; 1 g/l de citrato de trísodio x 2 H20, 0,1 g/l de NaCI; 1 ml/l de una solución de oligoelementos, que consta de 0,15 g/l de Na2Mo0 x 2 H20; 2,5 g/l de Na3B03; 0,7 g/l de CoCI2 x 6 H20; 0,25 g/l de CuS04 x 5 H20; 1 ,6 g/l de MnCl2 x 4 H20; 0,3 g/l de ZnS0 x 7 H20), que había sido suplementado con 5 g/l de glucosa; 0,5 mg/l de vitamina Bi y 100 mg/l de ampicilina. La incubación ulterior del cultivo precursor se efectuó a 30°C durante 8 horas a 150 rpm. Como fermentador sirvió un aparato Biostat M de la entidad Braun Biotech (Melsungen, Alemania) con un volumen máximo de cultivo de 2 I. Con el cultivo precursor descrito (que tenía una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 2), el fermentador se inoculó con 900 mi del medio de fermentación (15 g/l de glucosa; 10 g/l de triptona; 5 g/l de un extracto de levadura; 5 g/l de (NH4)2S04; 1 ,5 g/l de KH2P04; 0,5 g/l de NaCI; 0,3 g/l de MgS04 x 7 H20; 0,015 g/l de CaCI2 x 2 H20; 0,075 g/l de FeS04 x 7 H20; 1 g/l de citrato de trisodio x 2 H20 y 1 ml/l de una solución de oligoelementos, véase más arriba, 5 mg/l de vitamina B1 y 100 mg/l de ampicilina, ajustado a un pH de 7,0 con amoníaco al 25 %). Durante la fermentación se ajustó una temperatura de 32°C y el valor del pH se mantuvo constante a un valor de 7,0 por adición dosificada de 25 % v/v de amoníaco. El cultivo se gaseó con aire comprimido esterilizado a 1 ,5 vol/vol/min y se agitó con un número de revoluciones del agitador de 200 rpm. Después de haber disminuido la saturación con oxígeno a un valor de 50 %, se aumentó el número de revoluciones a través de un aparato de control hasta un valor de 1.200 rpm, para obtener una saturación con oxígeno de 50 % (determinada con una sonda de p02, calibrada a una saturación de 100 % a 900 rpm). Tan pronto como el contenido de glucosa en el fermentador hubo disminuido desde inicialmente 15 g/l hasta aproximadamente 5-10 g/l, se efectuó una adición dosificada de una solución al 56 % p/v (= en peso/volumen) de glucosa. La alimentación se efectuó con un caudal de 3-6 ml/h, siendo mantenida la concentración de glucosa en el fermentador entre 0,5 y 10 g/l. La determinación de la glucosa se llevó a cabo con un aparato analizador de glucosa de la entidad YSI (Yellow Springs, Ohio, EE.UU.). Al alcanzarse una densidad óptica de 30, se indujo la producción de la enzima mediante las adiciones de 3 mg/l de tetraciclina. La duración de la inducción fue de 7 horas. Después de este período de tiempo se sacaron muestras y las células se separaron del medio de cultivo por centrifugación y se lavaron. La suspensión resultante de células se analizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La actividad de sulfhidrilasa de O-acetil-serina, medida con un tiosulfato As-cys fue de 12 unidades / mi de OD. Las células se cosecharon por centrifugación, se congelaron bruscamente en nitrógeno líquido y se conservaron a -20°C.

EJEMPLO 6 Preparación por fermentación de la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina CvsK Para la preparación de la enzima CysK se procedió en principio tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. No obstante, en este caso se utilizó la cepa BLR21 (DE3)/pLE4. Después de haberse consumido los 15 g/l previamente dispuestos de glucosa, se emprendió una alimentación con una solución al 60 % (v/v) de glicerol. El caudal fue de 9,5 ml/h. Al mismo tiempo, se indujo la producción de la enzima por adición de 0,4 mM de isopropil-ß-tiogalactósido (IPTG). Después de un período de tiempo de inducción de 21 horas, se sacaron muestras y las células se separaron del medio de cultivo por centrifugación y se lavaron. La suspensión resultante de células se analizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La actividad específica de sulfhidrilasa de O-acetil-serina, medida con sulfuro, ACys, fue de 2 unidades / mi de OD.

Las células se cosecharon por centrifugación, se congelaron bruscamente en nitrógeno líquido y se conservaron a -20°C.

EJEMPLO 7 Preparación enzimática de S-fenil-L-cisteína con células en reposo En un recipiente regulable en cuanto a temperatura, con sonda de pH y control del pH, se disolvió en primer lugar el hidrocloruro de O-acetil-L-serina (Sigma, Deisenhofen, Alemania) en 100 mi de agua, de tal manera que se presentase una concentración final de 200 mM (29,4 g/l) de O-acetil-L-serina. Después de ello, se añadieron mediando agitación 200 mM de tiofenol. A continuación, la tanda se llevó por valoración con NaOH 5 M rápidamente a un valor del pH de 6,7 y se incorporó en la mezcla inmediatamente una suspensión de células de la cepa de producción de CysM DH5 /pFL145. La suspensión de células poseía una actividad específica As-cys de 12 unidades / mi de OD. La densidad óptica (medida a 600 nm) de las células en la tanda fue de 2,0 y por consiguiente la actividad de O-acetil-serina tenía un valor As-cys de 24 unidades / mi. Durante la reacción, el valor del pH se mantuvo constante por adición dosificada de 5 M de NaOH a través del sistema para controlar el pH. Durante la reacción se observó la formación de un precipitado de color blanco. Después de 30 min se sacó una muestra y se mezcló con ácido acético al 1 % (v/v). El precipitado se separó por centrifugación, se disolvió en el mismo volumen de ácido fosfórico al 21 % (v/v) y se analizó por HPLC. El material sobrenadante de la centrifugación fue asimismo cromatografiado. El análisis se llevó a cabo mediante una HPLC en fase inversa (reversed phase) en una columna con LUNA 5 µ C18(2) (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Como eluyente sirvió ácido fosfórico diluido (0,1 mi de ácido fosfórico concentrado / 1) con un caudal de 0,5 ml/min. El contenido en cuanto a S-fenil-L-cisteína fue en el material sobrenadante de 1 ,6 g/l y en el precipitado de 24,8 g/l. Esto corresponde a un rendimiento de reacción total de 67 %, referido a la O-acetil-L-serina. El tratamiento de la tanda se llevo a cabo también con una cantidad inicial reducida de sulfhidrilasa de O-acetil-serina a 12 y 2 unidades / mi respectivamente. Esto condujo sin embargo a una reacción enzimática decelerada, y como consecuencia de la isomerización de O-acetil-L-serina, a rendimientos disminuidos de 52 y 15 % respectivamente.

EJEMPLO 8 Preparación enzimática de S-fenil-L-cisteína con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En vez de utilizar O-acetil-L-serina como sustancia pura, este experimento se llevó a cabo en un caldo de fermentador que contenia O-acetil-L-serina. Éste se obtuvo mediante una fermentación, tal como se describe en el documento de solicitud de patente alemana DE-10107002. Al final de la fermentación, con el fin de estabilizar a la O-acetil-L-serina, se ajustó un valor del pH de 4,0 con ácido fosfórico al 21 % (v/v). Las células se separaron por centrifugación y el caldo de termentador se llevo a una concentración de 30 g/l de O-acetil-L-serina mediante concentración por evaporación. A continuación, a 100 mi de caldo se les añadieron 200 mM de tiofenol y, después de valoración a un pH de 6,7, células de la cepa de producción de CysM DH5a/pFL145. La actividad de As-cyS fue de 24 unidades / mi. Después de ello se siguió procediendo como en el Ejemplo 7. El rendimiento, referido a la O-acetil-L-serina, fue de 65 %. Una tanda idéntica con células de la cepa de producción de CysK BLR21 (DE3)/pLE4 proporcionó un rendimiento de 72 % cuando se emplearon 38 unidades de ACys / mi.

EJEMPLO 9 Preparación enzimática continua de S-fenil-L-cisteína con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo Una meta de la realización de la reacción es conseguir unos grados de conversión lo más altos que sean posibles, referidos al producto de partida O-acetil-L-serina, que es caro e inestable. Con el fin de garantizar esto, se elaboró un procedimiento continuo. En este caso, se procede en primer lugar tal como se ha descrito en el Ejemplo 8, solamente que se aumentó a 48 unidades/ml la cantidad empleada de actividad de CysM As-cys- Después de un período de tiempo de reacción de 20 min se añadieron a través de unidades de dosificación un caldo de fermentador que contenía A-acetil-L-serina (30 g/l), tiofenol, y una suspensión de células de la cepa de producción de CysM DH5a/pFL145 (240 OD a 600 nm, en un tampón de fosfato de potasio, de pH 7,0). Los caudales fueron respectivamente de 150, 2,5 y 3 ml/h. Al mismo tiempo, se comenzó con la retirada en régimen continuo de una solución de productos desde el recipiente de reacción con un caudal de 155,5 ml/h. Los caudales se escogieron de tal manera que el volumen de reacción en el reactor permaneció constante y el tiempo medio de permanencia en el reactor fue de 30 min. Con este modo de proceder se ajustó en la tanda un equilibrio de fluencia con una concentración constante de O-acetil-L-serina de 1 ,0 g/l. Por causa de esta baja concentración - en la que la enzima por causa de su coeficiente KM todavía más bajo posee todavía una muy buena actividad - se pudo reducir al mínimo con éxito la isomerización para N-acetil-L-serina. El rendimiento de reacción, referido a la O-acetil-L-serina, fue de 85 %.

EJEMPLO 10 Preparación enzimática de azido-L-alanina con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio tal como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de aziduro de sodio. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades / mi en la tanda, se determinó un grado de conversión de 45 %.

EJEMPLO 11 Preparación enzimática de ciano-L-alanina con un caldo de termentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de cianuro de potasio. La adición del cianuro se efectuó tan sólo después de que la tanda se hubo ajustado a un valor del pH de 6,7. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 65 %.

EJEMPLO 12 Preparación enzimática de S-sulfo-L-cisteína con un caldo de termentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de tiosulfato de sodio. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 16 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 91 %.

EJEMPLO 13 Preparación enzimática de S-tiazol-2-il-L-cisteína con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de 2-mercapto-tiazol. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 62 %.

EJEMPLO 14 Preparación enzimática de S-1 ,2,4-triazol-3-il-L-cisteína con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo.

En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de 3-mercapto-1 ,2(4-triazol. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 74 %.

EJEMPLO 15 Preparación enzímática de seleno-L-cisteína con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de seleniuro de sodio. El seleniuro de sodio se preparó por reducción de selenito de sodio con borohidruro de sodio. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 75 %.

EJEMPLO 16 Preparación enzimática de fenil-seleno-L-cisteína con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8 con células que contenían CysM. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de fenil-selenol. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 62 %.

EJEMPLO 17 Preparación enzimática de 1 ,2,4-triazol-1 -il-L-alanina con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo.

En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8.

En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de 1 ,2,4-triazol. Para esta reacción, las células fueron permeabilizadas mediante un tratamiento con cloroformo al 10 % (v/v) Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda se determinó un grado de conversión de 48 %.

EJEMPLO 18 Preparación enzimática de 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L-serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol. Para esta reacción, las células fueron permeabilizadas mediante un tratamiento con cloroformo al 10 %. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 54 %.

EJEMPLO 19 Preparación enzimática de 1 ,2,4-oxadiazolidin-3,5-dionil-L-alanina (= ácido quisquálico) con un caldo de fermentador que contiene O-acetil-L- serina y células en reposo En este Ejemplo se procedió en principio como en el Ejemplo 8. En vez de tiofenol se emplearon 200 mM de 1 ,2,4-oxad¡azolidin-2,5-diona. Para esta reacción, las células fueron permeabilizadas mediante un tratamiento con cloroformo al 10 %. Después de un período de tiempo de reacción de 30 min con células correspondientes a una actividad de 72 unidades/ml en la tanda, se determinó un grado de conversión de 1 1 %.

PROTOCOLO DE SECUENCIAS <1 10> Consortium fuer elektrochemische Industrie GmbH <120> Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos <130> Aminoácidos no naturales II <140> <141> <160> 5 <170> Patentln Versión 2.0 <210> 1 <211 > 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador para PCR <400> 1 gatcgaggtc tcgaatgagt aagatttttg aaga <210> 2 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador para PCR <400> 2 gatcgaggtc tcggcgctct gttgcaattc tttctcag <210> 3 <211 > 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador para PCR <400> 3 gatcgaggtc tcgaatgagt acattagaac aaac <210> 4 <211 > 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador para PCR <400> 4 gatcgaggtc tcggcgctaa tccccgcccc ctggctaa <210> 5 <21 1> 8 <212> Proteína (PRT) <213> Secuencia artificial <220> <223> Péptido con afinidad para StrepTagli para la purificación de la proteína <400> 5 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 . - Procedimiento para la preparación de un L-aminoácido no proteinógeno mediante una biotransformación enzimática, en el que la O-acetil-L-serina se hace reaccionar con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno, estando caracterizado este procedimiento porque se lleva a cabo a un valor del pH situado en el intervalo entre pH 5,0 y 7,4. 2. - Procedimiento según la reivindicación 1 , caracterizado porque se lleva a cabo a un valor del pH situado en el intervalo entre pH 6,0 y 7,1. . 3. - Procedimiento según la reivindicación 1 , caracterizado porque se lleva a cabo a un valor del pH situado en el intervalo entre pH 6.0 y 6.99. 4. - Procedimiento para la preparación de un L-amino-ácido no proteinógeno, en el que se hace reaccionar O-acetil-L-serina con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno, caracterizado porque como sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina se emplea CysM. 5. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sulfhidrilasa de O-acetil-serina posee una actividad volumétrica Acys de por lo menos 2 unidades / mi en la tanda. 6.- Procedimiento para la preparación de un L-aminoácido no proteinógeno, en el que se hace reaccionar O-acetil-L-serina con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L- serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno, caracterizado porque se 5 añaden dosificadamente de modo permanente la O-acetil-L-serina, la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina y un compuesto nucleófilo y al mismo tiempo se retira una solución que contiene el L-amino-ácido no proteinógeno. * 7.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina se emplea en forma 10 purificada. 8. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina se emplea después de una inmovilización junto a un soporte. 9. - Procedimiento para la preparación de un L-am¡no-ácido no 15 proteinógeno, en el que se hace reaccionar O-acetil-L-serina con un compuesto nucleófilo mediando catálisis por una sulfhidrilasa de O-acetil-L- serina para formar un L-aminoácido no proteinógeno, caracterizado porque como O-acetil-L-serina se emplea un caldo de fermentador que contiene O- acetil-L-serina. 20 10.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5 u 8, caracterizado porque la sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina se emplea en forma de células de microorganismos en reposo, que poseen una actividad de sulfhidrilasa de O-acetil-L-serina. 1 1 - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el compuesto nucleófilo contiene un radical seleccionado entre el grupo formado por H H H_s_ H-Se— — N=N=N" — C=N — N-N= — -0— 12.- Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el compuesto nucleófilo se selecciona entre el grupo formado por los tiosulfatos, los tioles de la fórmula general (1 ): H— S— R1 ( 1 ) en que R1 significa un radical alquilo, alcoxi, arilo o heteroarilo univalente con 1 a 15 átomos de C, sustituido o sin sustituir, por los seleniuros, los selenoles de la fórmula general (2): H^Se-R1 ( 2 ) en que R tiene el significado mencionado para la fórmula (1 ), por los aziduros, los cianuros, los azoles de la fórmula general (3) ó (4): H H -N C1' \ li N W // Y— X 3/ ( 3 ) , R' ( 4 ) en que X e Y son iguales o diferentes y significan CR4 ó N y R4 significa -H, -COOH, -OH, -NH2) -NO2", -SH, -SO3", -F, -Cl, -Br, -I, alquil C C5-carbonilo, así como sus ésteres, amidas o sales o R1, y R1 tiene el significado mencionado para la fórmula (1 ), y en que R2 y R3 son iguales o diferentes y significan R4, o en que C1 y C2 en la fórmula (4) en vez de llevar los sustituyentes R2 y R3, están unidos para formar un anillo mediante un puente [-CR5R6-]a, en el que a es igual a 1 , 2, 3 ó 4, en que R5 y R6 son iguales o diferentes y significan R4, y uno o varios grupos [-CR5R6-] no contiguos pueden estar reemplazados por oxígeno, azufre o un radical ¡mino eventualmente sustituido con alquilo C1-C5 y dos grupos [-CR5R6-] contiguos pueden estar reemplazados por un grupo [-CR5=CR6-] o por un grupo [-CR5=N-], por las isoxazolinonas de la fórmula general (5) ó (6): en que X, R1, R2 y R3 tienen los significados ya mencionados y C1 y C2 en la fórmula (6), en vez de llevar los sustituyentes R2 y R3, pueden estar unidos para formar un anillo mediante un puente definido como para la fórmula (4). 13.- Procedimiento según la reivindicación 10 u 11 , caracterizado porque el compuesto nucleófilo se selecciona entre el grupo formado por 2-mercapto-etanol, 3-mercapto-propanol, ácido 3-mercapto-propiónico, ácido 3- mercapto-1-propano-sulfónico, ácido mercapto-etano-sulfónico, 2-mercapto-etil-amina, ácido tio-glicólico, ácido tio-láctico, ácido tio-acético, ácido mercapto-succínico, ácido mercapto-pirúvico, ditiotreitol, ditioeritritol, 1-tio-glicerol, tiofenol, 4-fluoro-tiofenol, 4-cloro-tíofenol, 4-mercapto-fenol, p-tio-cresol, ácido 5-tio-2-nitro-benzoico, 2-mercapto-tiazol, 2-mercapto-tiazolina, 2-mercapto-imidazol, 3-mercapto-1 ,2,4-triazol, 2-tiofeno-tiol, 2-mercapto-piridina, 2-mercapto-pirimidina, 2-tio-citosina, ácido 2-mercapto-nicotínico, 2-mercapto-1-metil-imidazol, 2-mercapto-benzotiazol, 2-mercapto-benzoxazol, 6-mercapto-purina, tiosulfato de sodio, tiosulfato de potasio, tiosulfato de amonio, aziduro de sodio, aziduro de potasio, aziduro de amonio, cianuro de potasio, cianuro de sodio, cianuro de amonio, metil-selenol, etil-selenol, propil-selenol, fenil-selenol, 1 ,2-pirazol, 3-metil-pirazol, 4-metil-pirazol, 3,5-dimetil-pirazol, 3-amino-pirazol, 4-amino-pirazol, ácido pirazol-4-carboxílico, ácido pirazol-3,5-dicarboxílico, 1 ,2,3-triazol, 1 ,2,4-triazol, 3-amino-1 ,2,4-triazol, 1 ,2,3,4-tetrazol, indazol, ácido indazol-3-carboxílico, ácido indazol-5-carboxílico, 5-amino-indazol, benzotriazol, ácido benzotriazol-5-carboxílico, 5-amino-benzotn'azol, amino-pirazolo-pirimidina, 8-aza-guanina, 8-aza-adenina, isoxazolin-5-ona, 3-metil-isoxazolin-5-ona, 4-metil-isoxazolin-5-ona, 4,5-dimetil-lsoxazolin-2-ona, 1 ,2,4-oxadiazol¡din-3,5-diona. 14.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la concentración del compuesto nucleófilo se escoge de manera tal que éste se presenta en una concentración equimolar con respecto a la O-acetil-L-serina. 15. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 5°C y 70°C. 16. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por el L-aminoácido no natural se selecciona entre el grupo de los aminoácidos de la fórmula general (7) en configuración L siendo Z un radical univalente de acuerdo de las fórmulas (8) hasta (19) -S— S03" (8) , -S— R (9) , -Se~H (io), -Se-R'm,, — N=N=N" (12) / — C=N {13) así como sus ésteres, éteres o sales, y R\ R2, R3, R4, X e Y tienen los significados mencionados para las fórmulas (1 ) hasta (6). 17.- Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el L-aminoácido no proteinógeno se aisla mediante métodos conocidos después de haberse terminado el procedimiento. 18.- Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el aislamiento se efectúa mediante una operación de filtración, centrifugación, extracción, adsorción, cromatografía con intercambiadores de iones, precipitación o cristalización.