KR20240108559A - L-시스테인산의 제조 방법 - Google Patents
L-시스테인산의 제조 방법Info
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Abstract
본 발명은 L-시스테인산의 제조 방법으로서, O-아세틸-L-세린(OAS)을, 아황산염의 존재 하에 O-아세틸-L-세린 설프하이드릴라제 부류(OAS 설프하이드릴라제, EC 4.2.99.8)로부터 선택되는 적어도 하나의 효소와 반응시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 생물변환에 의해 제조된 L-시스테인산을 제공한다. L-시스테인산의 경제적 제조 방법은 환경 친화적이고 지속가능할 뿐만 아니라, 기술적으로 실행하기 쉽다. 상기 방법의 또 다른 이점은, 수요가 증가하고 있는, 천연 L-시스테인산이 이러한 방식으로 제조될 수 있다는 점이다.
Description
본 발명은, L-시스테인산의 제조 방법에 관한 것으로, 여기서 O-아세틸-L-세린(OAS)이, 아황산염의 존재 하에 O-아세틸-L-세린 설프하이드릴라제 부류(OAS 설프하이드릴라제, EC 4.2.99.8)로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 사용하여 전환된다. 이러한 생물변환의 결과로 L-시스테인산이 제공된다.
L-시스테인산은, 예를 들어, 양어장에서(나카무라(Nakamura)등의 Fisheries Science (2021) 87: 353-363) 또는 화장품 부문에서(US4053630), 예를 들어, 피부 관리용 Regu®-Slim (DSM)의 성분으로 사용될 수 있다. 펩타이드 화학에서, L-시스테인산은 수용성 보호기로 사용된다. 또한, L-시스테인산은 탈카르복실화에 의해 타우린으로 전환될 수 있다.
L-시스테인산((R)-2-아미노-3-설포프로판산, 3-설포-L-알라닌, CAS 498-40-8)은 화학적으로, 예를 들어, HCl 중 브롬 또는 DMSO 중 요오드 HCl을 사용하여, 알코올 용액에서 염소로 시스테인을 산화시킴으로써(타오(Tao) 등의 Amino Acids (2004) 27: 149-151), 또는 과포름산으로 시스틴을 산화분해(oxidative cleavage)함으로써 제조될 수 있다. 또한, L-시스테인산은 L-시스테인 설핀산의 산화에 의해 제조될 수도 있다. 지속가능하지 않은 것으로 간주되는 L-시스테인산의 화학적 제조를 위한 공지된 방법은, 환경적으로 유해한 화학물질을 사용하며, 특별히 식품, 화장품 및 제약 부문에서의 적용에서 소비자 수용도가 낮다. 따라서 더욱 환경 친화적이고 더욱 지속가능한 제조 방법이 필요하며, 그 중 하나가 생명공학적 방법이다.
L-시스테인산은 비 단백질생성성 L-아미노산으로, 이는, 예를 들어, 양털에서 단백질생성성 아미노산인 L-시스테인의 산화 생성물로 천연에서 검출될 수 있다. 시스테인산은 또한 메탄생성성 고세균에 의한 조효소 M(CoM, 2-머캅토에탄설폰산, CAS 3375-50-6) 생합성의 중간체이다.
선행 기술은, 예를 들어, 시스테인 대사가 조절되지 않은 미생물의 직접 발효(EP 1 191 106 B1) 또는 OAS의 OAS 설프하이드릴라제 촉매작용된 생체변형(EP 1 247 869 B1)에 의해 비 단백질생성성 아미노산을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 OAS와 친핵체의 반응을 촉매작용하여 하기 일반식 (1)에 따라 비 단백질생성성 아미노산을 형성하는, OAS 설프하이드릴라제를 기반으로 한다.
(1) OAS + 친핵체 -> 비 단백질생성성 아미노산 + 아세테이트
예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 시스테인 대사에서, OAS는 L-시스테인의 생합성 전구체로서 역할을 한다. 후자는 베타 위치의 아세테이트기가 티올 라디칼로 치환되어 형성된다. 베타 치환이라고 하는 이 반응은, OAS 설프하이드릴라제 부류(EC 4.2.99.8)의 효소에 의해 촉매작용된다. 따라서, OAS는 OAS 설프하이드릴라제 반응의 실제 기질(반응물이라고도 함)이고 친핵체는 가변적인 보조 기질이다.
EP 1 247 869 B1에서, 셀레니드, 셀레놀, 아지드, 시안화물, 아졸 및 이속사졸리논을 포함하여, 다수의 다양한 친핵체를, OAS와 OAS 설프하이드릴라제-촉매작용된(예를 들어, CysM-촉매작용된) 반응에 대한 친핵체로서의 적합성에 대해 시험하였다. 또한, 라디칼 R이 1가 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴 라디칼인 일반식 H-S-R의 티올 및 티오황산염 기로부터의 황 화합물을 시험하였다.
제조된 것은 자연에서 단백질 생합성을 위한 빌딩 블럭으로 사용되지 않는 S-페닐-L-시스테인과 같은 비 단백질생성성 아미노산이었다. 개시된 친핵체 중 어느 것도 L-시스테인산의 제조를 허용하지 않는다.
주(Joo)(2018) 등의 J. Agric. Food Chem. 66: 13454 - 13463은, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 박테리아에서 타우린 제조를 위한 대사 공학적 접근법을 설명하고 있다. 타우린 제조에 이르기 위해, L-시스테인 신타아제, 시스테인 디옥시게나제 및 L-시스테인 설핀산 디카르복실라제의 유전자가 균주에서 이종 발현되었다. 주(2018) 등의 J. Agric. Food Chem. 66: 13454 - 13463의 도 2는, 타우린으로의 다양한 대사 경로를 설명하며, 여기에는 또한 O-포스포-L-세린에서 출발하여 L-시스테인산을 통해 타우린으로 이어지는 경로("L-시스테인 설폰산 경로")가 포함되고, 이는 또한 원칙적으로 L-시스테인산의 제조에도 적합하다. 그러나, 이 도면은 또한 OAS에서 L-시스테인산으로 이어지는 알려진 생합성 경로는 없고 오직 L-시스테인으로만 이어진다는 것을 보여준다.
테바티아(Tevatia) 등의 Algal Research (2015) 9: 21-26은 미세조류에서의 타우린의 천연 제조를 설명하고 있으며, L-시스테인산도 중간체로 검출된다. 테바티아 등의 Algal Research (2015) 9: 21-26의 도 1a)에서 설명된 바와 같이, 생합성 경로는 L-세린에서 L-시스테인산(도 1a의 "Cysteate")으로 이어진다. 설명된 생합성 경로 중 어느 것도 OAS를 통해 L-시스테인산으로 이어지지 않는다. 미세조류에서 검출된 L-시스테인산의 세포내 함량은 매우 낮았고, 메티오닌, 시스테인, 시스테인 설핀산, 하이포타우린 및 타우린과 같은, 후처리를 더욱 어렵게 만드는 여러 부산물이 동반되기 때문에, 미세조류의 성장은 L-시스테인산의 제조에 적합하지 않다.
대사 공학적 접근법에서, US 2019/0062757 A1(KnipBio)은 타우린 제조를 위한 이종 생산 균주를 설명하고 있으며, 상기 균주는 또한 L-시스테인산의 제조에 적합한 것으로 의도된다. US 2019/0062757 A1의 도 4 내지 9 및 12는 L-시스테인산을 중간체로 함유하여 원칙적으로 L-시스테인산의 제조에 적합한, 타우린으로의 다양한 생합성 경로를 설명하고 있다. 이러한 생합성 경로 중 어느 것도 OAS에서 출발하지 않는다. 또한, 하이포타우린 및 타우린 생산량만 보고되었으며 최대 419 ng/ml로 매우 낮았다. L-시스테인산의 생산 수율은 언급되지 않았다. L-시스테인산에 대해서는 더 높은 수율을 달성할 수 없다고 가정해야 한다. 따라서 이러한 대사 공학적 접근법은 L-시스테인산의 생명공학적 제조에 적합하지 않다.
따라서 선행 기술은 화학적 방법만을 개시하고 산업적 용도에 적합한 L-시스테인산을 제조하기 위한 경제적으로 실행 가능한 생명공학적 방법을 개시하지 않는다.
본 발명의 목적은 생물변환에 의해 L-시스테인산을 제조하는 생명공학적 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은, O-아세틸-L-세린(OAS)을, 아황산염의 존재 하에 O-아세틸-L-세린 설프하이드릴라제 부류(OAS 설프하이드릴라제, EC 4.2.99.8)로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 사용하여 전환하는 L-시스테인산의 제조 방법에 의해 달성된다. 이 방법은 생물변환에 의해 제조된 L-시스테인산을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 이점은, L-시스테인산의 제조를 위한 지속가능하고, 기술적으로 실현가능한 생물변환 방법이라는 점이다. 환경적으로 유해한 화학물질을 사용하지 않아도 된다. 화석 원료가 소비되지 않으며 독성 화학 폐기물 및/또는 폐가스가 생성되지 않는다. 따라서 본 발명의 제조 방법은 환경 친화적이고 지속가능하다. 또한, 이 방법에는 극단적인 반응 조건이나 특수 장비가 필요하지 않으므로 기술적으로 구현하기 쉽다. 이 방법의 또 다른 장점은 수요가 점점 늘어나고 있는 천연 L-시스테인산을 이러한 방식으로 제조할 수 있다는 점이다.
놀랍게도, 아황산염(이하 설파이트 또는 SO3 2-이라고 함)이 반응 (1)에서 친핵체로 적합하며 식 (2)에 따라 지금까지 알려지지 않은 반응에서 L-시스테인산의 합성을 허용함이 발견되었다.
(2) OAS + SO3 2- -> L-시스테인산 + 아세테이트
본 발명의 맥락에서, 제조 방법은 다음과 같이 구별된다:
1. 화학적 방법
2. 생물공학적 방법:
a) 대사 공학에 의함
대사 공학("경로 설계"라고도 함)은 생물변환과 달리, 유전적 및 조절적 공정의 최적화 또는 수정을 통해 유기체의 대사 경로를 수정하는 생명공학적 방법이다. 새로운 또는 수정된 효소가 효소의 유전자로 게놈을 보충함으로써 유기체에 도입될 수 있거나, 내인성 효소의 유전자를, 강화된 또는 약화된 수준으로 발현시켜, 유기체에서 새로운 대사 경로를 확립하거나 기존 대사 경로를 강화 또는 약화시킬 수 있다. 대사 공학의 목표는 유기체가 새로운 대사산물 또는 1세포 내인성 대사산물을 증가된 수율로 생산하는 것이다. 대사 공학적 방법은 효소 기질, 예를 들어 본 발명에서는 OAS와 같은, 대사산물에 특이적인 출발 물질을 사용하지 않으며; 대신, 문제의 유기체의 성장에 필요하고, 탄소원(예를 들어, 포도당), 질소원(예를 들어, 암모늄염, 또는 펩톤이나 효모 추출물과 같은 복잡한 아미노산 혼합물) 및 성장에 필요한 기타 염으로 구성된, 성장 배지라고도 하는 영양 배지만 사용한다. 이러한 영양 배지는 미생물학적 관행을 통해 당업자에게 알려져 있다.
b) 생물변환에 의함
생물변환은 효소적 촉매작용 하에서 하나 이상의 반응물이 생성물로 변환되는 것으로 정의되며, 효소 기질은 효소와 함께 반응 배치에 첨가된다. 반응 배치에서, 본 발명에서는 OAS와 같은, 첨가된 효소 기질은 식 (2)에 따라 효소적으로(본 발명에서는, 아황산염의 존재 하에 OAS 설프하이드릴라제 부류(EC 4.2.99.8)로부터 선택된 효소에 의해) 전환된다. 반응물(들)은 화학적 또는 생명공학적 제조에서 유래할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 OAS는, 예를 들어, 화학적 합성으로부터 또는 생산 균주의 발효에 의한 생명공학적 제조로부터 유래될 수 있다. 효소적 촉매작용에 사용되는 효소는, 생산 균주의 성장에 의한, 예를 들어, 발효에 의한, 생명공학적 제조로부터 유래하거나, 효소를 함유하는 생물학적 물질(예를 들어, 식물, 균류, 조류, 동물 기관)을 사용한다. 생산 균주의 성장으로부터 얻은 바이오매스, 또는 생물학적 물질을 직접 사용할 수 있거나, 생물변환의 요건에 따라 이들로부터 효소를 단리한다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 CysM 효소는 생산 균주의 발효에 의한 생명공학적 제조에서 유래한다.
천연 제조 방법은 유전자 변형 유기체(GMO)나 GMO를 이용한 생성물로 부터의 제품(반응물, 효소)을 사용하지 않는 생명공학적 제조 방법으로 정의된다. 본 발명에서, L-시스테인산의 제조 방법은 유기 반응물로서의 OAS와 OAS 설프하이드릴라제를 GMO를 이용하여 제조하지 않고, 화학적으로 제조하지 않은 경우에 천연 제조 방법이다. 식 (2)에서 보조 기질인 설파이트는 무기 화합물이며 근본적으로 식 (4) 내지 (8)에 따른 수중 SO2의 용해 생성물이며, 이는 (비가역적) 화학적 합성에 해당하지 않지만, SO2 가스의 가역적 수화 및 H2SO3 수화물의 pH 의존적 해리에 해당한다.
Gentechnikgesetz(GenTG, 독일 유전공학법)의 § 3 3번 4문의 의미 내에서 자가 복제는, (ZKBS, 독일 생물학적 안전 중앙위원회)가 발표한 성명(참조번호: 1991의 6790-10-02)에 따르면, 바이러스 및 플라스미드 포함하여 유전적으로 동일하거나 상이한 형태의 하나의 종만 공여 및 수용 유기체로서 사용되는 공정이다.
본 발명의 맥락에서, 반응 배치는 반응물(출발 물질), 효소 및 선택적으로 다른 반응물의 혼합물로 정의되며, 여기서 반응물은 생성물로 전환된다.
본 발명의 의미 내에서 반응의 수율은 반응 조건 하에서 생성물로 전환되는 사용된 반응물의 양으로 정의된다. 수율은 절대량(g 또는 mmol), 단위 부피당 생성물의 절대량을 기준으로 한 부피 수율(농도)(mM 또는 g/L), 또는 수율 백분율이라고도 하는, (반응물과 생성물의 분자량을 고려하여) 사용된 반응물의 백분율로서의 생성물의 상대적 수율로 표시될 수 있다.
발효는 산업적 규모로 세포 배양물을 제조(배양)하기 위한 공정 단계로서, 바람직하게는 미생물 생산 균주가 배양 배지, 온도, pH, 산소 공급 및 배지 혼합의 정의된 조건 하에서 성장하게 된다. 생산 균주의 구성(유전적 구성)에 따라, 발효의 목적은 단백질/효소 또는 대사산물을, 각각의 경우 추가 사용을 위해 가능한 최고 수율로 생산하는 것이다. 본 발명에 따른 방법의 성분인 OAS 및 OAS 설프하이드릴라제는 발효에 의해 제조될 수 있다. 발효의 최종 생성물은 생산 균주의 세포(발효 세포)의 바이오매스와, 성장 배지로부터 발효 과정에서 형성된 바이오매스가 제거된 발효 배지(발효 상층액)로 구성된 발효 브로쓰 및 발효 세포에 의해 분비되는 대사산물이다. 발효의 표적 생성물은 발효 세포 또는 발효 배지에 존재할 수 있다. 예를 들어, OAS는 발효 배지에서 발견되는 반면, OAS 설프하이드릴라제 효소는 발효 세포에서 발견된다.
오픈 리딩 프레임(ORF, cds 또는 코딩 서열과 동의어)은 시작 코돈으로 시작하고 종료 코돈으로 종료되며 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 또는 RNA 영역을 의미한다. ORF는 코딩 영역 또는 구조 유전자라고도 한다.
유전자는 생물학적 활성 RNA를 생산하는 데 필요한 모든 기본 정보를 포함하는 DNA 부분을 의미한다. 유전자에는 전사에 의해 단일 가닥 RNA 사본이 생성되는 DNA 부분과 이 복제 과정의 조절과 관련된 발현 신호가 포함되어 있다. 발현 신호에는, 예를 들어, 적어도 하나의 프로모터, 전사 시작점, 번역 시작점 및 리보솜 결합 부위(RBS)가 포함된다. 터미네이터와 하나 이상의 오퍼레이터는 추가로 가능한 발현 신호이다.
유전자 작제물은 유전자가 다른 유전 요소(예를 들어, 프로모터, 터미네이터, 선택 마커, 복제 기원)에 연결된 DNA 분자를 의미한다. 본 발명의 맥락에서 유전자 작제물은 원형 DNA 분자이고 플라스미드, 벡터 또는 발현 벡터로 지칭된다. 유전자 작제물의 유전적 요소는 세포 성장 동안 이의 염색체 외 유전을 일으키고 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산을 일으킨다.
본 발명에 따른, 아황산염을 사용한 OAS의 생물변환으로부터의 L-시스테인산은, 추가 후처리 단계 없이 직접 추가로 사용되거나 공지된 방법에 의해 농축되거나 정제될 수 있다. 여기서 농축 정도는 추후 사용에 따라 다르다. 이러한 방법은 아미노산을 단리하는 방법 중에서 당업자에게 공지되어 있다. 예로는 여과, 원심분리, 추출, 흡착, 이온 교환 크로마토그래피, 침전, 결정화가 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 L-시스테인산이 반응 배치로부터 농축된다는 점을 특징으로 한다. 예를 들어, 원심분리에 의해 미립자 바이오매스를 제거하는 것이 특히 바람직하다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 방법은, 본 발명에 따른 방법에서 제조된 L-시스테인산이 추가로 직접 사용된다는 것, 즉 L-시스테인산을 함유하는 반응 배치가 여과, 원심분리, 추출, 흡착, 이온 교환 크로마토그래피, 침전 및 결정화를 포함하여 추가 후처리, 정제 또는 단리 단계 없이 추가로 사용된다는 것을 특징으로 한다.
OAS 설프하이드릴라제는 지금까지 다양한 식물과 미생물로부터 단리되어 왔다. 이. 콜라이에서, 예를 들어, CysK 및 CysM이라고 하는 두 개의 OAS 설프하이드릴라제 효소가 있다. 관련 유전자도 마찬가지로 알려져 있으며 각각 cysK 및 cysM으로 지정되어 있다.
본 발명의 의미 내에서 OAS 설프하이드릴라제는 식 (3)에 따라 OAS로부터 단백질생성성 아미노산 L-시스테인의 합성을 촉매작용할 수 있다는 점을 특징으로 하며, 이 경우에 사용된 친핵체는 설파이드이다. 따라서 CysM 관련 효소와 CysK 관련 효소는 모두 본 발명의 의미 내에서 OAS 설프하이드릴라제이다.
(3) OAS + S2- -> L-시스테인 + 아세테이트
두 효소 모두 매우 유사한 반응 메커니즘을 갖고 L-시스테인의 생합성에 관여하지만, CysM은 CysK와 달리 식 (1)에 따라 OAS와 반응할 수 있는 친핵체에 대해 다양한 기질 스펙트럼을 가지고 있다.
예를 들어, CysK와 달리 CysM은 OAS와 티오황산염의 반응을 촉매작용하여 S-설포시스테인(CAS 번호 1637-71-4)을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 반응은 티오황산염을 유일한 황 공급원으로 사용하여 박테리아 성장에 중요한 역할을 한다.
또한, EP 1 247 869 B1(Wacker)에는 비 단백질생성성 아미노산의 제조를 위한 CysM의 용도가 개시되어 있다.
바람직하게는, 본 방법은 OAS 설프하이드릴라제가 박테리아 효소, 특별히 바람직하게는 CysM, 특히 바람직하게는 균주 이. 콜라이로부터의 CysM인 것을 특징으로 한다.
아황산은 가역적 평형 상태로 동시에 존재하는 다수의 화학종을 형성하는데, 본 발명에 따른 생물변환에서 친핵체로서의 이들 각각의 적합성은 예측할 수 없었다. 따라서, 아황산(H2SO3)은 가스상 SO2의 수용액이고, 이염기산으로서, 수용액의 pH에 따라 다른 평형 상태로 존재하며, 상기 평형 상태의 종은 또한 친핵체로서의 적합성이 다양하다는 것이 알려져 있다. 하기 평형 상태 (4) 내지 (8)이 알려져 있다:
(4) SO2(가스상) <-> SO2(용해됨)
(5) SO2(용해됨) + H2O <-> H2SO3
(6) H2SO3 <-> HSO3 - + H
(7) HSO3 - <-> SO3 2- + H
(8) 2 HSO3 - <-> S2O5 2- + H2O
아황산과 이의 염은 항균 효과를 나타내기 때문에 식품 산업에서 방부제로 사용된다. 이는 아황산과 이의 염이 미생물을 사멸시킬 수 있다는 것을 의미하는데, 이는 미생물 생존에 필요한 효소의 불활성화에 기인할 수 있다. 따라서 당업자는, CysM 효소가 아황산 또는 이의 염을 사용할 때 불활성화될 것이며 L-시스테인산은 EP 1 247 869 B1에 개시된 방법에 의해 제조될 수 없을 것이라고 예상할 것이다.
전술한 이유로 인해, 설파이트와 OAS가 생물변환에 사용되는 경우, L-시스테인산이 제조될 수 있다는 것은 당업자에게 놀라운 일이었다.
원칙적으로, 가능한 모든 아황산염이 반응에 적합하다. 바람직하게는, 본 방법은 사용되는 아황산염이 Na2SO3, K2SO3, (NH4)2SO3, NaHSO3 (또는 이의 무수물 Na2S2O5) 또는 KHSO3인 것을 특징으로 한다. 특히 바람직하게는, 사용되는 아황산염은 Na2SO3, NaHSO3 (또는 이의 무수물 Na2S2O5) 및 (NH4)2SO3, 특별히 바람직하게는 Na2SO3 및 NaHSO3 (또는 이의 무수물 Na2S2O5)이다.
아황산의 무수물인 가스상 이산화황을 사용하는 것이 가능하며, 이는 반응 배치에 도입될 수 있고, 아황산 H2SO3로 수화되고, pH에 따라, 탈양성자화된 형태의 HSO3 - 및 SO3 2-와 평형 상태에 있다.
이 방법에는 OAS의 가용성이 필요하다. 예를 들어, L-세린의 높은 가격으로 인해 비용이 많이 드는 L-세린의 아세틸화에 의한 OAS 제조를 위한 화학적 공정이 가능하거나, 아니면 직접적으로 사용될 수 있는 라세미체 O-아세틸-D/L-세린의 제조 또는 OAS를, 예를 들어, 분해를 통해 미리 라세미체로부터 얻는 것이 가능하다. 직접적인 아세틸화의 경우, 예를 들어, L-세린의 하이드록실 또는 아미노기에 대한 비선택적 아세틸화 또는 중성 내지 알칼리성 pH 값에서 OAS의 NAS로의 알려진 재배열에 의해 N-아세틸-L-세린(NAS)이 부산물로 형성될 수 있고(타이(Tai)(1995) 등의 Biochemistry 34: 12311-12322), 이는 수율을 감소시키거나 L-세린의 아미노기 상에 보호기의 사전 도입을 요구한다. 따라서 L-세린의 직접적인 아세틸화는 경제적으로 실행 가능한 방법에는 실용적이지 않다.
예를 들어 EP 1 233 067 B1에 개시된 바와 같이 OAS의 생명공학적 제조도 알려져 있다. 이는 조절되지 않은 시스테인 대사를 나타내어 높은 수준의 OAS를 제공하는 유기체의 사용을 수반한다. 결과적으로 OAS 제조를 위한 비용 효율적인 제조 시스템을 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 OAS가 발효적 제조로부터 농축된다는 점을 특징으로 한다. 발효적 제조는 GMO의 도움으로 또는 GMO가 아닌 유기체의 도움으로 수행될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 OAS가 GMO가 아닌 미생물의 도움으로 발효적으로 제조된다는 점을 특징으로 하며, 이 경우 OAS가 균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306의 도움으로 발효적으로 제조되는 것이 특별히 바람직하다. 마지막으로 언급된 특히 바람직한 실시양태는 실시예 1에 개시되어 있다.
본 발명의 L-시스테인산의 제조 방법은 바람직하게는 천연 제조 방법인 것을 특징으로 한다. 이는 GMO가 본 방법에 사용되지 않을 뿐만 아니라, 반응물 OAS와 효소 OAS 설프하이드릴라제가 모두 천연 생성물에서 유래하고, 즉, GMO를 사용하여 제조되지도 않고 화학적으로 제조되지도 않는다는 것을 의미한다.
이러한 특히 바람직한 실시양태는 OAS 및 OAS 설프하이드릴라제 CysM 둘 모두가 천연적으로 제조되는 L-시스테인산의 천연 제조 방법을 설명하는, 본 발명에 따른 실시예에 개시되어 있다. OAS 생산 균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306(실시예 1) 및 CysM 생산 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145(실시예 2)는 자가 복제에서 유래하며 GMO로 분류되지 않는다. OAS와 OAS 설프하이드릴라제가 모두 GMO를 사용하지 않고 제조될 수 있다는 사실은 본 발명의 특별한 이점을 발생시키는데, 이는, 본 발명이, 현재 사료 부문과 화장품 분야에의 적용 가능성으로 인해 큰 관심을 받고 있는 L-시스테인산의 천연 제조 방법을 개시하고 있기 때문이다.
당업자는 OAS와 같이 방법에서 반응물로 사용하고자 하는 물질이 화학적 또는 발효적 제조에서 유래하는지 여부를 결정하기 위해 동위원소 분석을 사용할 수 있다. 구별이 가능한 동위원소 분석 방법은, 예를 들어, 사이퍼(Sieper) 등의 Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006) 20: 2521-2527에 설명되어 있고, 이는 예를 들어, 생성물이 화학적(석유 기반) 제조에서 유래하는지 아니면 (식물 기반 원료에서)발효적 제조에서 유래하는지에 따라 달라지는 탄소 또는 질소의 동위원소 비율의 결정을 기반으로 한다.
본 발명의 이점은, 예를 들어, EP 1 233 067에 따라 수행된 발효로부터 얻은 OAS 함유 발효 브로쓰가, 예를 들어, 추출, 흡착, 이온 교환 크로마토그래피, 침전 및 결정화를 포함한 추가 후처리, 정제 또는 단리 단계 없이 원심분리에 의해 미립자 바이오매스를 제거한 후, OAS의 공급원으로서 본 발명에 따른 방법에서 직접 사용될 수 있다는 점이다. 이 절차는 특히 경제적이며 불안정한 화합물이 단리되는 것을 방지한다.
균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306를 사용하여 OAS를 제조하는 발효적 방법은 EP 1 233 067 B1 및 본 발명의 실시예 1에 개시되어 있다. 이러한 균주는 부다페스트 조약에 따라 DSMZ(브라운슈바이크(Braunschweig) 소재의 미생물 및 세포 배양물의 독일 콜렉션(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) GmbH)에 번호 DSM 13495하에 기탁되어 있다.
본 방법은 바람직하게는 CysM을 포함하는 OAS 설프하이드릴라제가 발효적 제조에서 유래하고, 특히 바람직하게는 GMO가 아닌 미생물의 도움으로 발효적으로 제조되고, 특별히 바람직하게는, 특별히 바람직하게는 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 도움을 포함하여, 이. 콜라이 균주의 도움으로 제조된다는 점을 특징으로 한다.
실시예 2는 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145를 사용한 CysM의 발효적 생명공학 제조 절차를 개시하고 있다. 생산 균주는, 이 경우 이. 콜라이 DH5α같은 숙주 균주, 및 OAS 설프하이드릴라제를 발현시키는데 적합한 유전자 작제물, 바람직하게는 유전자 작제물 pFL145로 구성된다. 숙주 균주 및 유전자 작제물, 및 생산 균주의 제조는 EP 1 247 869 B1(Wacker)에 설명되어 있다. 생산 균주는 부다페스트 조약에 따라 DSMZ-미생물 및 세포 배양물의 독일 콜렉션 GmbH(브라운슈바이크 소재)에 번호 DSM 14088하에 기탁되어 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 발효에 의해 얻은 OAS 설프하이드릴라제는 추가 후처리 없이 발효 브로쓰로 사용될 수 있거나, 예를 들어 원심분리에 의해 발효 브로쓰로부터 세포의 재분리 후 세포 현탁액으로 사용될 수 있다. 더욱이, OAS 설프하이드릴라제는 세포 현탁액의 기계적 파괴 후 세포 균질액의 형태로, 또는 (예를 들어, 클로로포름에 의해) 화학적으로 투과화된 세포의 형태로, 아니면 세포 균질액으로부터 미립자 구성성분을 제거한 후 세포 추출물로, 아니면 예를 들어, 크로마토그래피로 정제된 효소로 사용될 수 있다.
OAS 설프하이드릴라제를, 추가 후처리 없이 발효 브로쓰로, 발효 브로쓰로부터 세포의 재분리 후 세포 현탁액으로, 또는 세포 현탁액의 기계적 파괴 후 세포 균질액으로 또는 (예를 들어, 클로로포름에 의해) 화학적으로 투과화된 세포의 형태로 사용하는 것이 바람직하다.
OAS 설프하이드릴라제를, 발효 브로쓰로부터 세포의 재분리 후 세포 현탁액으로 또는 세포 균질액으로 사용하는 것이 특히 바람직하다.
특별히 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 발효 브로쓰로부터 단리되고 재현탁된 생산 균주의 세포가 OAS 설프하이드릴라제로서 사용되는 것을 특징으로 한다.
특히 바람직한 실시양태에서, L-시스테인산의 제조 방법은 OAS 설프하이드릴라제 및 OAS 둘 다 발효에 의해 제조된다는 점을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 생물변환 방법의 반응물로서의 OAS는 대략 pH 7의 pH에서 N-아세틸-L-세린으로 이성질체화되고, 그러면 더 이상 설파이트와 반응하여 L-시스테인산을 형성하는 데 적합하지 않다. 상기 반응의 메커니즘은 타이(1995) 등의 Biochemistry 34: 12311-12322에서 연구되었고, 아실 라디칼의 카르보닐 탄소에 대한 탈양성자화된 아미노기에 의한 분자내 친핵성 공격을 수반한다. 이 반응은 pH가 감소함에 따라 억제되므로, 화합물은, 예를 들어, pH 4.0에서 안정적이다.
따라서 본 발명에 따른 생물변환 방법은 OAS가 L-시스테인산을 형성하는 반응이 OAS의 N-아세틸-L-세린으로의 이성질체화를 최소화하는 pH 조건 하에서 수행된다는 사실로 구별된다.
바람직하게는, 본 방법은 반응이 적어도 5.5, ≤7.5, 특히 바람직하게는 ≤7.0, 특별히 바람직하게는 ≤6.5의 pH 값에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
생물변환 방법의 추가 바람직한 실시양태에서, 기질 OAS는, 소위 공급 공정(실시예 5)에서 OAS 설프하이드릴라제 및 설파이트로 구성된 반응 배치에 계량 주입된다. 계량 주입된 OAS에서, N-아세틸-L-세린으로의 이성질체화를 억제하는 pH는 바람직하게는 pH ≤6.5, 특히 바람직하게는 pH ≤6.0, 특별히 바람직하게는 pH ≤5.5로 설정된다. 동시에, 반응 배치의 pH는 L-시스테인산을 형성하는 반응을 촉진하는 방식으로 조정된다.
식 (2)에 따르면, OAS가 L-시스테인산을 형성하는 반응은 화학양론적 양의 아세트산을 방출하며, 이는 반응이 진행됨에 따라 배치의 pH 감소로 이어질 수 있다. 지나치게 낮은 pH는 OAS 설프하이드릴라제의 활성에 영향을 미치기 때문에, pH가 지나치게 크게 떨어지는 것을 방지할 필요가 있다. 이는 배치 내 적합한 고농축 완충액에 의해 수동적으로 수행할 수도 있고 측정 및 조절 장치에 의해 능동적으로 달성할 수도 있다.
실시예 5에 개시된 바와 같이, 측정 및 조절 장치에 의한 능동적인 pH 조절이 바람직하며, 이는 pH가 목표 값과 편차가 있는 경우 알칼리 용액 또는 산을 계량 첨가하여 원하는 pH를 복원한다(소위 pH-stat 방법).
반응 온도는 바람직하게는 5℃ 내지 70℃ 사이에서 선택된다. 반응 온도는 10℃ 내지 60℃가 바람직하고, 15℃ 내지 50℃가 특히 바람직하며, 20℃ 내지 40℃가 특별히 바람직하다.
L-시스테인산의 제조 방법은 바람직하게는 수성 환경에서 수행되고, 즉, 반응에 사용되는 용매는 바람직하게는 물이다.
L-시스테인산을 제조하는 본 발명에 따른 방법은 불연속 작업 또는 연속 작업으로 수행될 수 있다. 불연속 작업(배치 작업)에서는, 반응 과정에서 모든 반응물을 배치에 첨가하고 반응이 끝난 후 배치를 후처리한다. 연속 작업에서는, 반응 동안에 OAS, OAS 설프하이드릴라제 및 아황산염을 지속적으로 계량하고 L-시스테인산 생성물을 함유한 용액을 동시에 배치에서 제거한다. 반응 용기에서의 체류 시간 동안 반응물이 완전히 반응하여 L-시스테인산 생성물을 형성할 수 있는 방식으로 반응물이 계량 주입되는 정상 상태가 확립되었다. 비천연 아미노산의 연속 제조 방법은 예를 들어, EP 1 247 869 B1(Wacker)에 개시되어 있다.
L-시스테인산을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법의 불연속 작업이 바람직하다.
바람직하게는, 본 방법은 아황산염의 농도가 OAS에 대해 적어도 등몰 농도, 특히 바람직하게는 적어도 1.5배 몰 초과, 특별히 바람직하게는 적어도 2배 몰 초과, 추가로 바람직하게는 적어도 5배 몰 초과인 것을 특징으로 한다.
배치 내 OAS 농도는 바람직하게는 적어도 1 g/L, 특히 바람직하게는 적어도 10 g/L, 특별히 바람직하게는 적어도 40 g/L이다.
OAS의 생물변환에서, 사용된 OAS의 몰량을 기준으로 한 L-시스테인산의 몰 수율은 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 70%, 특별히 바람직하게는 적어도 80%이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않고 추가로 설명될 것이다:
실시예 1:
OAS의 제조
EP 1 233 067 B1(Wacker)에 개시되어 있고 부다페스트 조약에 따라 DSMZ-미생물 및 세포 배양물의 독일 콜렉션 GmbH(브라운슈바이크 소재)에 번호 DSM 13495 하에 기탁된 균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306을 사용했다. OAS는 EP 1 233 067 B1에 설명된 바와 같이 발효에 의해 제조되었다. 발효가 끝나면, 21%(v/v) 인산을 사용하여 pH를 4.5로 설정하여 OAS를 안정화시켰다. 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 제거했다(Heraeus Megafuge 1.0 R). 발효 상층액 중 HPLC로 측정된 OAS의 함량은 15.3 g/L였다.
OAS 및 L-시스테인산의 HPLC 분석:
실시예에서 분석된 화합물의 정량 측정을 위해, OAS 및 L-시스테인산에 대해 각각 보정된 HPLC 방법을 사용하였고; 보정에 사용된 모든 기준 물질은 상업적으로 이용가능하였다(Sigma-Aldrich). 아미노산 분석에서 알려진 바와 같이, o-프탈디알데히드를 사용한 컬럼 전 유도체화(OPA 유도체화)를 위해 동일한 제조업체의 장치가 장착된 Agilent 1260 Infinity II HPLC 시스템을 사용하였다. OPA 유도체화된 생성물 OAS 및 L-시스테인산을 검출하기 위해, HPLC 시스템에 형광 검출기를 장착하였다. 검출기는 여기 파장 330 nm 및 방출 파장 450 nm로 설정되었다. 또한 길이 100 mm, 내부 직경 4.6 mm, 입자 크기 2.6 μm, 컬럼 오븐에서 40℃로 열 평형화된, Thermo ScientificTM의 AccucoreTM aQ 컬럼도 사용하였다.
용리액 A: 25 mM 인산나트륨, pH 6.0. 용리액 B: 메탄올. 분리는 그래디언트 모드로 수행되었다: 0-25분에 걸쳐 10% 용리액 B에서 60% 용리액 B로, 이어서 2분에 걸쳐 60% 용리액 B에서 100% 용리액 B로, 이어서 추가로 2분간 100% 용리액 B로, 유속 0.5 ml/분. L-시스테인산의 체류 시간: 3.2 분. OAS의 체류 시간: 17.0 분
실시예 2:
CysM 효소의 제조
EP 1 247 869 B1 (Wacker)에 개시되어 있고 부다페스트 조약에 따라 DSMZ-미생물 및 세포 배양물의 독일 콜렉션 GmbH(브라운슈바이크 소재)에 번호 DSM 14088 하에 기탁된 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145를 사용했다. CysM 효소는 진탕 플라스크에서의 성장 및 발효 둘 모두에 의해 제조되었다.
A) 진탕 플라스크에서의 성장: 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 전배양물을 LBamp 배지(10 g/l 트립톤(GIBCOTM), 5 g/l 효모 추출물(BD Biosciences), 5 g/l NaCl, 100 mg/L 암피실린(Sigma-Aldrich))에서 제조했다(37℃ 및 120 rpm에서 밤새 성장). 25 ml의 전배양물을 250 ml의 LBamp 배지(배플이 있는 1 L 삼각 플라스크)의 본 배양을 위한 접종원으로 사용했다. 본 배양물을 30℃ 및 110 rpm에서 진탕시켰다. 4시간 후, 세포 밀도 OD600 1.0/ml에 도달했다(OD600: 600 nm에서의 흡광도의 측정에 의한 세포 현탁액 1 ml당 세포 밀도의 광도 측정; Thermo ScientificTM의 GenesysTM 10S UV-Vis 분광 광도계). 이후 유도제 테트라사이클린(Sigma-Aldrich, 3 mg/L 최종 농도)을 첨가하였고 30℃ 및 110 rpm에서 추가로 20시간 동안 성장을 계속시켰다. 성장의 종료 시에, 세포 밀도 OD600은 3/ml이었다.
B) EP 1 247 869 B1에 개시되어 있는 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145를 이용한 CysM의 발효적 제조. 발효로부터의 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 제거하고(Heraeus Megafuge 1.0 R) KPi 6.5 완충액(0.1 M 인산칼륨, pH 6.5)에 현탁하여, 세포 밀도 OD600은 90/ml이었다.
추가 사용을 위해 진탕 플라스크 성장 또는 발효로부터의 세포를 원심분리(15000 rpm에서 10분, SS34 로터가 장착된 Sorvall RC5C 원심분리기)에 의해 단리했다. 아래에 설명된 바와 같이, 세포 균질액의 제조를 위한 추가 사용을 위해, 세포 펠릿을 세포 현탁액으로서 KPi 6.5 완충액에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 세포 밀도 OD600이 30/ml가 되기에 충분한 KPi 6.5 완충액의 양을 사용하여 제조하였다: 예를 들어, 3/ml의 OD600을 갖는 진탕 플라스크 성장으로부터의 50 ml의 세포를 원심분리하고 5 ml의 KPi 6.5 완충액(10배 농축)에 재현탁시키거나 또는 90/ml의 OD600를 갖는 발효로부터의 1 ml의 세포를 3 ml의 Kpi 6.5 완충액(3배 희석)에 재현탁시켰다.
이에 의해 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 세포가 제조되었고, 발효 브로쓰로부터 단리하고 재현탁하였고, 본 발명에 따른 방법에서 OAS 설프하이드릴라제 CysM으로 다음에 사용되었다.
세포 균질액을 제조하기 위해, MP Biomedicals의 FastPrep-24TM 5G 세포 균질화기를 사용했다. 30/ml의 세포 밀도 OD600을 갖는 KPi 6.5 완충액 중 세포 현탁액 1 ml를 유리 비드가 포함된 제조업체-조립된 1.5 ml 튜브("Lysing Matrix B")에서 분쇄시켰다(간격 사이에 매번 30초씩 정지하면서 6000 rpm의 진탕 빈도로 3 x 20초). 얻은 세포 균질액을 본 발명에 따른 방법에서 OAS 설프하이드릴라제(CysM 효소)로 직접 사용하거나 세포 추출물 제조에 사용하였다.
세포 추출물을 제조하기 위해, 얻은 세포 균질액을 원심분리하고(10분 동안 15,000 rpm, SS34 로터 장착된 Sorvall RC5C 원심분리기), 상층액을 세포 추출물로 지정하여 본 발명에 따른 방법에서 OAS 설프하이드릴라제(CysM 효소)로 사용하거나, CysM 효소 활성의 측정을 위해 추가로 사용하였다.
세포 추출물의 단백질 함량은 제조업체의 지침에 따라 "Qubit® 단백질 검정 키트"를 사용하여 Thermo Fisher Scientific의 Qubit 3.0 형광 광도계를 사용하여 측정되었다. 진탕 플라스크 성장으로부터 얻은 세포 추출물의 단백질 함량은 5.3 mg/ml이었다. 발효로부터의 세포 추출물의 단백질 함량은 4.0 mg/ml이었다.
CysM 효소 활성은 EP 1 247 869 B1(Wacker)에 설명된 대로 측정되었다. 이를 위해, OAS(Sigma-Aldrich)를 Na2S 및 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 성장으로부터의 세포 추출물의 존재 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. KPi 6.5 완충액 중 검정액(0.4 ml 최종 부피)은 10 mM OAS(500 mM 숙신산나트륨 완충액 pH 5.5 중의 200 mM 스톡 용액으로부터 첨가), 10 mM 황화나트륨 Na2S 및 CysM 함유 세포 추출물 5 μl를 함유했다. CysM 반응에서 제조된 시스테인을 가통(Gaitonde) (1967)등의 Biochem. J. 104: 627-633에 의한 방법에 따라 닌하이드린(Sigma-Aldrich)을 사용하여 측정하였다. 진탕 플라스크 내 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 성장으로부터의 세포 추출물 중 CysM 효소 활성은 57.1 U/ml였다. 진탕 플라스크 성장으로부터의 세포(3/ml의 OD600)를 10배 농축하여 세포 추출물을 제조하였기 때문에, 진탕 플라스크 성장으로부터의 세포의 효소 활성은 5.7 U/ml이었다. 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 발효 후 세포 추출물 중 CysM 효소 활성은 58.1 U/ml이었다. 발효로 부터의 세포(90/ml의 OD600)를 30/ml의 OD600으로 희석하여 세포 추출물 제조하였기 때문에, 농축된(90/ml의 OD600) 발효 세포의 세포 현탁액 중 효소 활성은 174.4 U/ml였다.
진탕 플라스크 내 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 성장으로부터의 세포 추출물의 특정 CysM 효소 활성은 단백질 mg당 10.8 U이었다. 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 발효 후 세포 추출물의 특정 CysM 효소 활성은 14.5 U/mg이었다. 세포 추출물의 제조 과정에서 CysM 활성이 세포로부터 완전히 방출되었다고 가정하면, 세포 추출물에서 측정된 CysM 효소 활성은 하기 실시예에서 CysM 세포 현탁액에 존재하는 효소 활성과 동일하게 된다.
1 U/ml CysM 효소 활성은 1 ml의 세포 추출물의 검정 조건 하에서 OAS 및 Na2S로부터의 분당 1 μmol의 시스테인의 제조로 정의된다(부피 활성). 단백질 mg당 U 단위의 특정 CysM 효소 활성은 세포 추출물의 부피 활성(U/ml)을 세포 추출물의 단백질 농도(mg/ml)로 나누어 얻은 것이며 세포 추출물 중 단백질 1 mg을 기준으로 U 단위의 CysM 효소 활성으로 정의된다.
실시예 3:
진탕 플라스크 배양에서 제조된 CysM의 도움으로 시판되는 OAS 및 Na
2
SO
3
로부터 L-시스테인산의 제조
두 개의 배치가 동시에 수행되었다.
배치 1: 100 ml 삼각 플라스크에 처음에 8.25 ml의 NaPi 6.5 완충액(50 mM 인산나트륨, pH 6.5)을 채우고, NaPi 6.5 완충액 중 Na2SO3 0.2 M 용액 1 ml, 57.1 U/ml(배치에서 2.3 U/ml 최종 농도)의 활성을 갖는 (실시예 2A의) 진탕 플라스크 성장으로부터의 CysM 세포 추출물 0.4 ml 및 pH 5.5의 0.5 M 숙신산나트륨 중 OAS x HCl(Sigma-Aldrich) 0.2 M 용액 350 μl를 연속적으로 첨가했다. 배치 부피는 10 ml이었다.
배치 2: 배치(Na2SO3가 없는 비교 배치)는 배치 1과 동일한 구성을 가진다. Na2SO3 용액 대신, 배치 2는 1 ml의 NaPi 6.5 완충액을 수용했다.
두 배치 모두 체스트 진탕기(Infors)에서 37℃ 및 140 rpm으로 인큐베이션하였다. 1시간 및 3시간 후, 각 경우의 배치 1 ml를 80℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 반응을 중지하고 원심분리한 후, 상층액을 HPLC로 분석했다. HPLC로 검출된 L-시스테인산의 양은 표 1에 나타나 있다.
| 시간 [h] |
Na2SO3가 있는 배치 1 L-시스테인산 [mg/L] |
Na2SO3가 없는 배치 2 L-시스테인산 [mg/L] |
| 0 | 0.0 | 0.0 |
| 1 | 78.0 | 0.0 |
| 3 | 95.8 | 0.0 |
실시예 4:
진탕 플라스크 배양에서 제조된 CysM의 도움으로 Na
2
SO
3
및 발효로부터의 OAS 함유 배양 상층액으로부터 L-시스테인산의 제조
100 ml 삼각 플라스크에 처음에 15.3 g/L의 OAS 함량(실시예 1)을 갖는 균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306의 발효로부터의 세포 배양 상층액 1 ml를 채우고, NaPi 6.5 완충액 6 ml, NaPi 6.5 완충액 중 Na2SO3 1 M 용액 1 ml 및 진탕 플라스크 성장으로부터의 CysM 세포 현탁액 2 ml(실시예 2A의 것, 30/ml의 세포 밀도 OD600; 57.1 U/ml의 CysM 효소 활성)를 연속적으로 첨가하였다. 배치 부피는 10 ml이었다. 배치의 CysM 효소 활성은 11.4 U/ml이었다. 배치를 체스트 진탕기(Infors)에서 37℃ 및 140 rpm에서 배양했다. 2시간 후, 배치 1 ml를 80℃에서 5분간 인큐베이션하고 원심분리한 후 상층액을 HPLC로 OAS 및 L-시스테인산의 함량에 대해 분석했다. 시간에 따른 반응 과정은 표 2에 요약되어 있다.
| 시간 [h] | OAS [mg/L] | L-시스테인산 [mg/L] |
| 0 | 1530.0 | 0.0 |
| 2 | 0.0 | 1473.3 |
실시예 5:
일정한 pH에서 OAS의 생물변환에 의한 L-시스테인산의 예비 제조
0.5 L 온도 조절 가능 이중벽 유리 용기(Diehm)를 호스 연결을 통해 온도 조절 장치(Lauda)에 연결하고 온도를 37℃로 조정했다.
(실시예 2B의) 균주 DH5α/pFL145의 발효로부터의 KPi 6.5 완충액 중 CysM 함유 세포 현탁액 50 ml(90 ml의 OD600, 8720 U의 CysM 효소 활성) 및 KPi 6.5 완충액 중 Na2S2O5 400 g/L 용액(13.9 mmol, 분자량 190.1 g/mol) 6.6 ml를 처음에 채웠다. 용해된 형태에서, 이는 27.8 mmol의 NaHSO3에 해당했다(나중에 계량되는 OAS 양 15.6 mmol에 대해 1.78배 몰 초과). 배치를 자석 교반기로 교반하였다. 배치에는 또한, 제조업체의 지침에 따라 pH-stat 모드에서 작동되는 pH 조절 장치(TitroLine 알파 적정기, Schott)에 연결된 pH 전극(Mettler Toledo)이 장착되었다. pH-stat 조건 하에서, 반응 용기의 pH는, 조절 장치에 연결된 뷰렛으로부터 2 M NaOH를 계량 첨가하여 전체 반응 기간 동안 설정된 pH 6.5로 일정하게 유지되었다. (실시예 1의) 균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306의 발효로부터 얻은 150 ml의 OAS 함유 세포 배양 상층액(OAS 함량: 15.3 g/L, 2.3 g; 15.64 mmol)을 펌프(Watson Marlow 101U/R 연동 펌프)를 통해 저장소로부터 0.35 ml/분의 유속으로 배치에 계량 주입하였다.
반응 시간은 19시간이었다. 배치는 개방형 반응 용기에서 수행되었기 때문에, 증발로 인해 반응 완료 후 배치 부피는 185 ml였다. 반응 시작 후 0.5시간, 3시간 및 19시간 후에, 배치의 1 ml 분취량을 각 경우에 제거하고 L-시스테인산 함량을 HPLC로 분석했다. 시간 경과에 따른 L-시스테인산의 형성은 표 3에 요약되어 있다. 19시간의 반응 시간 후, 배치 내 L-시스테인산 함량은 12,970 mg/L(76.65 mM)이었으며, 이는 배치 부피 185 ml에 대한 L-시스테인산의 절대 몰 수율 14.18 mmol에 해당한다. 사용된 OAS의 양은 15.64 mmol로, 이는 90.1%의 수율에 해당한다.
| 시간 [h] |
L-시스테인산 [mg/L] |
L-시스테인산 [mM] |
| 0.5 | 758.0 | 4.47 |
| 3 | 4244.0 | 25.08 |
| 19 | 12970.0 | 76.65 |
Claims (15)
- L-시스테인산의 제조 방법으로서, O-아세틸-L-세린(OAS)을, 아황산염의 존재 하에 O-아세틸-L-세린 설프하이드릴라제 부류(OAS 설프하이드릴라제, EC 4.2.99.8)로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 사용하여 전환하는 것인 L-시스테인산의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, OAS 설프하이드릴라제는 박테리아 효소인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, OAS 설프하이드릴라제는 균주 이. 콜라이(E. coli)로부터의 CysM인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, OAS 설프하이드릴라제는 발효적 제조로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, OAS 설프하이드릴라제는 GMO가 아닌 미생물의 도움으로 발효적으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, OAS 설프하이드릴라제는 균주 이. 콜라이 DH5α/pFL145의 도움으로 발효적으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, OAS는 발효적 제조로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, OAS는 GMO가 아닌 미생물의 도움으로 발효적으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, OAS는 균주 이. 콜라이 W3110/pACYC-cysEX-GAPDH-ORF306의 도움으로 발효적으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 제조 방법인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 아황산염이 Na2SO3, K2SO3, (NH4)2SO3, NaHSO3 (또는 이의 무수물 Na2S2O5) 또는 KHSO3인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아황산염의 농도는 적어도 OAS와 등몰 농도인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 반응은 5.5 이상 7.5 미만의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 OAS의 몰량을 기준으로 L-시스테인산의 몰 수율이 60% 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, L-시스테인산이 반응 배치로부터 농축되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20240108559A true KR20240108559A (ko) | 2024-07-09 |
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