CN113388630B - 合成l-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供合成L‑半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用，构建方法包括如下改造途径：(1)适配L‑半胱氨酸表达质粒pLH03与大肠杆菌底盘细胞，所述底盘细胞为K‑12系列菌株；(2)利用不同强度的组成型启动子对L‑半胱氨酸合成途径基因进行单独和/或组合表达；(3)单独和/或组合敲除L‑半胱氨酸分解途径基因及其前体L‑丝氨酸分解途径基因。本发明所构建的重组菌株基因改造较少，高产L‑半胱氨酸，具有较好的生产应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重组大肠杆菌生物合成L-半胱氨酸的菌株构建及应用该菌株进行L-半胱氨酸发酵生产的方法。
背景技术
L-半胱氨酸(L-cysteine)是一种具有活性巯基的氨基酸，由于其生理功能和化学特性，在医药、食品、农业、日化等行业有广泛用途(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2017,159,129-151)。
在医药领域，L-半胱氨酸具有特殊的巯基，对多类疾病治疗均具有显著作用。在生物体内，L-半胱氨酸对许多有害物质如甲醛等具有解毒作用。当机体出现过敏和炎症使得巯基酶活性降低时，L-半胱氨酸可以维持巯基酶活性，具有抗过敏与消除过敏的作用。在食品行业，L-半胱氨酸主要用于烘焙，是面团性质改良剂的主要成分。半胱氨酸通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的“-S-S-”减弱了蛋白质的结构。在农业领域，半胱氨酸在动物的免疫调节，皮肤和头发的合成以及体重增加过程中起着重要的作用。在日化行业，L-半胱氨酸在皮肤的角蛋白生成中维持重要的巯基酶活性，并且补充巯基，维持皮肤的正常代谢，含有的特殊巯基可以有效地减少皮表下层细胞产生的黑色素，同时由于L-半胱氨酸的巯基具有还原能力和化学反应活性，也能除去皮肤中已经产生的黑色素，可以作为美白化妆品。
L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解法、化学合成法和微生物发酵法、酶法转化、体外合成法(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2017,159,129-151；Appl.Microbiol.Biotechnol.2019,103.)。毛发水解法产生的废气如氨气，硫化氢和废酸对环境造成很大的污染。化学合成法得到的半胱氨酸均为DL型外消旋体，需进一步拆分，而光学异构体的拆分难度很大，操作程序较为复杂。酶法转化中底物DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)较为昂贵，工业化成本较高。体外合成法需要添加昂贵的辅因子，而且转化率也较低，难以实现工业化。微生物发酵法借助微生物具有合成所需氨基酸的能力来生产L-半胱氨酸，具有原材料来源广泛，成本低，反应条件温和，很容易实现大规模生产等优点，是一种经济高效的生产方法。大肠杆菌是用于生产L-氨基酸(如L-丝氨酸，L-甲硫氨酸等)的主要微生物，在L-半胱氨酸发酵工业中占有非常重要的地位。
由于L-半胱氨酸的广泛用途，市场上L-半胱氨酸总是处于供不应求的局面，目前L-半胱氨酸的年需求量超过5000吨(Metab.Eng.2020,58,17-34)。然而，L-半胱氨酸对细胞的毒性及复杂的调节机制阻碍了L-半胱氨酸高效生物合成，使得L-半胱氨酸发酵生产成为目前氨基酸发酵工业面临的主要挑战之一。因此，研发新的优良工业菌株就显得尤为关键。本发明通过比较不同的底盘细胞以及筛选L-半胱氨酸代谢途径基因的表达和缺失的组合，构建重组大肠杆菌能够利用不同碳源高产L-半胱氨酸。
发明内容
本发明的第一个目的在于，通过比较不同的底盘细胞以及筛选L-半胱氨酸代谢途径基因的表达和缺失的组合，提供利用不同碳源高产L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法。
本发明的第二个目的在于，提供利用上述构建方法构建获得的合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌，能够利用不同碳源高产L-半胱氨酸。
本发明的第三个目的在于，提供上述合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌在制备L-半胱氨酸中的应用，通过对培养基初始碳源和硫源浓度以及发酵过程优化，上述重组大肠杆菌可直接通过发酵生产L-半胱氨酸。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下改造途径：
(1)适配L-半胱氨酸表达质粒pLH03与大肠杆菌底盘细胞，所述底盘细胞为K-12系列菌株；
(2)利用不同强度的组成型启动子对L-半胱氨酸合成途径基因进行单独和/或组合表达；
(3)单独和/或组合敲除L-半胱氨酸分解途径基因及其前体L-丝氨酸分解途径基因。
作为一个优选方案，所述K-12系列菌株包括MG1655，W3110，JM109以及BW25113。
作为一个优选方案，所述组成型启动子为Ptrc1和Ptrc2中的一种或两种，所述Ptrc1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述Ptrc2的序列如SEQ ID NO.2所示。
作为一个优选方案，所述合成途径基因选自serA,serC,serB,cysM,nrdH,cysK,glpE中的一个或多个。
作为一个优选方案，所述分解途径基因选自yhaM,tnaA,sdaA中的一个或多个。
作为一个优选方案，所述改造途径还包括调节L-半胱氨酸代谢途径中的硫源转录调节因子cysB。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了利用上述构建方法构建获得的合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了所述合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌在制备L-半胱氨酸中的应用。
作为一个优选方案，所述重组大肠杆菌经过多级活化后，于温度30℃-37℃初始硫源为1g/L-9g/L，初始葡萄糖为5g/L-20g/L,进行分批发酵48h。
作为一个优选方案，所述重组大肠杆菌经过多级活化后，于温度30℃-37℃通气量0.5-3vvm，pH 6.7-7.3，初始硫源为1g/L-9g/L，流加500g/L的葡萄糖调节DO振荡，并适时补充硫源，进行补料分批发酵24-48h。
本发明中将表达质粒pLH03转化进K-12系列菌株的钙转感受态细胞中，本发明实施例中K-12系列菌株优选MG1655，W3110，JM109以及BW25113菌株。
本发明的优选实施例中，利用Ptrc1和Ptrc2分别单独过表达L-半胱氨酸代谢途径中的基因serA,serC,serB,cysM,nrdH,cysK,glpE，依次命名为LH1A，LH2A，LH1C，LH2C，LH1B，LH2B，LH1M，LH2M，LH1H，LH2H，LH1K，LH2K，LH1E，LH2E。将上述菌株全部制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH1A-pLH03，LH2A-pLH03，LH1C-pLH03，LH2C-pLH03，LH1B-pLH03，LH2B-pLH03，LH1M-pLH03，LH2M-pLH03，LH1H-pLH03，LH2H-pLH03，LH1K-pLH03，LH2K-pLH03，LH1E-pLH03，LH2E-pLH03。
本发明的又一优选实施例中，将产量有提高且具有显著性差异(p<0.05)的单基因进行组合，优选LH2A-pLH03，LH2C-pLH03，LH1B-pLH03，LH1M-pLH03，LH1H-pLH03，将这些结果较优的单基因操作进行组合过表达，构建菌株LH2A2C1B1M1H。本发明的又一优选实施例中，将产量有提高且具有极显著性差异(p<0.01)的单基因进行组合，优选LH2A-pLH03，LH1M-pLH03，将这些较优的单基因进行组合过表达，构建菌株LH2A1M。将菌株LH2A2C1B1M1H和LH2A1M制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH2A2C1B1M1H-pLH03，LH2A1M-pLH03。
本发明的又一优选实施例中，将LH2A1M菌株分别敲除半胱氨酸分解基因yhaM,tnaA,以及丝氨酸分解基因sdaA，构建菌株依次命名为LH2A1M△Y(△yhaM)，LH2A1M△T(△tnaA)，LH2A1M△S(△sdaA)。将上述菌株制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH2A1M△Y-pLH03，LH2A1M△T-pLH03，LH2A1M△S-pLH03。
本发明的又一优选实施例中，优选单敲除菌株LH2A1M△Y-pLH03，LH2A1M△T-pLH03，LH2A1M△S-pLH03，在LH2A1M菌株基础上分别组合敲除这些优选的单独敲除结果，构建菌株依次命名为LH2A1M△YT(△yhaM△tnaA)，LH2A1M△YTS(△yhaM△tnaA△sdaA)。将上述菌株全部制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH2A1M△YT-pLH03，LH2A1M△YTS-pLH03。
本发明的优选实施例中，分别优化了不同初始葡萄糖对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响，不同初始硫源对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响，不同碳源混合利用对对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长和生产的影响，不同碳源流加速率对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响，额外添加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响，染色体水平过表达硫源转录因子cysB对L-半胱氨酸生产的影响，以及额外补加不同浓度硫源对LH2A1M△YTSPtrc-cysB-pLH03补料分批发酵的影响。
本发明的优点在于，通过比较大肠杆菌底盘细胞与L-半胱氨酸表达质粒的适配性，筛选不同强度的组成型启动子对L-半胱氨酸合成途径基因进行单独表达与组合表达，单敲除与组合敲除分解基因，染色体水平调控硫源转录调控因子，获得高产L-半胱氨酸的重组大肠杆菌菌株。本发明所构建的重组菌株基因改造较少，高产L-半胱氨酸，具有较好的生产应用价值。
附图说明
图1为pLH03图谱。
图2为pLH02(PcysE-cysE)图谱。
图3为pLH02-1(PcysE-mCherry)图谱。
图4为pLH02-2(Ptrc1-mCherry)图谱。
图5为pLH02-3(Ptrc2-mCherry)图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：大肠杆菌底盘细胞与表达质粒pLH03(图1)的适配比较
本实施例中：
种子培养基中组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠；固体培养基加琼脂15g/L。
发酵培养基组成：10g/L葡萄糖,12g/L磷酸氢二钾,3g/L磷酸二氢钾,0.1g/L氯化钠,5g/L硫代硫酸铵,0.3g/L硫酸镁,0.015g/L氯化钙0.002g/L硫酸亚铁,1g/L柠檬酸钠,5mg/L维生素B1,1mL/L微量元素(0.15g/L钼酸钠,2.5g/L硼酸,0.7g/L氯化钴,0.25g/L硫酸铜,1.6g/L氯化锰,0.3g/L硫酸锌)，50mg/L硫酸安普霉素。
具体实施过程如下：
(1)选择不同的大肠杆菌底盘细胞接入种子培养基中活化后制备钙转感受态。
(2)将表达质粒pLH03(来源于pACYC184质粒，Biotechnol.J.2018,No.e1700695)(图1)转化进上述四种菌株的钙转感受态细胞中，分别为MG1655，W3110，JM109以及BW25113菌株(四种菌株均为市售常规产品)，获得L-半胱氨酸生产菌。
(3)将上述L-半胱氨酸生产菌于冰上化冻，取1ml接入装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行活化，12层纱布封口，培养温度为30℃，培养转速为220rpm，培养时间为20h。
(4)将上述种子培养液转移1ml至装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵，12层纱布封口，培养温度为30℃，培养转速为220rpm，培养时间为48h。
(5)取上述48h发酵液测定菌体浓度。菌体浓度采用浊度法测量。将新鲜培养的菌液适当稀释后，使用分光光度计在600nm下检测。
(6)取第(4)步的发酵液体系，在4℃条件下12000rpm离心10min，收集上清液。
(7)将上清液在10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)与10mM二硫苏糖醇(DTT)反应10min后，通过柱前衍生HPLC(LC-10AT,Shimadzu,Japan)检测L-半胱氨酸含量。
HPLC的条件如下：
C18柱(GL Sciences Inc.,Japan)
UV检测器(SPD-20A,Shimadzu,Japan)
检测波长：330nm
柱温：30℃
流动相A：50mM KH2PO4(pH 3.9)
流动相B：50％甲醇
梯度洗脱：[90％A(26min)→20％A(6min)→90％A(9min)]
流速：0.5ml/min
48h生长与产量结果如表1。
表1不同底盘细胞与表达质粒适配性的表征(生长与产量)
实施例2：不同强度的组成型启动子单独过表达L-半胱氨酸代谢途径中的基因
(1)以pLH02(PcysE-cysE)(来源于pACYC184质粒，Biotechnol.J.2018,No.e1700695)(图2)为出发质粒，用荧光蛋白mCherry替换cysE基因，通过一步连接(无缝克隆)构建pLH02-1(PcysE-mCherry)质粒(图3)，构建所需引物如表2。
表2质粒构建引物列表(SEQ ID NO.3—SEQ ID NO.6)
(2)以步骤(1)所构建的pLH02-1(PcysE-mCherry)(图3)为出发质粒，通过对诱导型启动子Ptrc(来源于常用高拷贝质粒pTrc99a)的lacO结合位点进行随机突变，获得两种强度不同的组成型启动子Ptrc1和Ptrc2(见
SEQ ID NO.1：
TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTCAGCGGTTAACAATTTCACACAGGAAACAGACC和SEQ ID NO.2：
TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTCAACGGTTAACAATTTCACACAGGAAACAGACC)，分别替换pLH02-1(PcysE-mCherry)质粒中的PcysE，通过一步连接(无缝克隆)构建pLH02-2(Ptrc1-mCherry)质粒(图4)和pLH02-3(Ptrc2-mCherry)(图5),构建所需引物如表3。
表3质粒构建引物列表(SEQ ID NO.7—SEQ ID NO.10)
(3)以pLH02-3(PcysE-mCherry)为对照，在SM1培养基中进行培养24h后，经酶标仪检测荧光强度，比较两种启动子的相对强弱，结果如表4。
表4组成型启动子Ptrc1、Ptrc2相对PcysE的表达强度
(4)利用Ptrc1和Ptrc2分别单独过表达L-半胱氨酸代谢途径中的基因serA,serC,serB,cysM,nrdH,cysK,glpE，依次命名为LH1A，LH2A，LH1C，LH2C，LH1B，LH2B，LH1M，LH2M，LH1H，LH2H，LH1K，LH2K，LH1E，LH2E；所用引物如表5。
表5过表达所用引物(SEQ ID NO.11—SEQ ID NO.42)
(5)将上述菌株全部制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH1A-pLH03，LH2A-pLH03，LH1C-pLH03，LH2C-pLH03，LH1B-pLH03，LH2B-pLH03，LH1M-pLH03，LH2M-pLH03，LH1H-pLH03，LH2H-pLH03，LH1K-pLH03，LH2K-pLH03，LH1E-pLH03，LH2E-pLH03。
(6)所得菌株按照实施例1所述条件进行摇瓶发酵。
(7)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表6所示。
表6单基因过表达对生长与产量的影响
实施例3：不同强度的组成型启动子组合过表达L-半胱氨酸代谢途径中的基因
(1)选出实施例2中产量有提高且具有显著性差异(p<0.05)的单基因进行组合，也即是LH2A-pLH03，LH2C-pLH03，LH1B-pLH03，LH1M-pLH03，LH1H-pLH03，将这些结果较优的单基因操作进行组合过表达，构建菌株LH2A2C1B1M1H，构建所需引物同表5。
(2)选出实施例2中产量有提高且具有极显著性差异(p<0.01)的单基因进行组合，也即是LH2A-pLH03，LH1M-pLH03，将这些较优的单基因进行组合过表达，构建菌株LH2A1M。
(3)将步骤(1)和步骤(2)所构建的菌株制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH2A2C1B1M1H-pLH03，LH2A1M-pLH03。
(4)所得菌株按照实施例1所述条件进行摇瓶发酵。
(5)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表7所示。
表7多基因组合过表达对生长与产量的影响
实施例4：单独敲除L-半胱氨酸以及前体丝氨酸代谢途径中降解基因
(1)选出实施例3中表现较优的组合表达结果，也即是LH2A1M-pLH03，在LH2A1M菌株基础上分别敲除半胱氨酸分解基因yhaM,tnaA,以及丝氨酸分解基因sdaA，构建菌株依次命名为LH2A1M△Y(△yhaM)，LH2A1M△T(△tnaA)，LH2A1M△S(△sdaA)，所用引物如表8。
表8敲除所用引物(SEQ ID NO.43—SEQ ID NO.54)
(2)将上述菌株全部制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH2A1M△Y-pLH03，LH2A1M△T-pLH03，LH2A1M△S-pLH03。
(3)所得菌株按照实施例1所述条件进行摇瓶发酵。
(4)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表9所示。
表9分解基因单敲除对生长与产量的影响
实施例5：组合敲除L-半胱氨酸以及前体丝氨酸代谢途径中降解基因
(1)选出实施例4中有效果的单敲除菌株，也即是LH2A1M△Y-pLH03，LH2A1M△T-pLH03，LH2A1M△S-pLH03。在LH2A1M菌株基础上分别组合敲除这些较优的单独敲除结果，构建菌株依次命名为LH2A1M△YT(△yhaM△tnaA)，LH2A1M△YTS(△yhaM△tnaA△sdaA)，所用引物同表8。
(2)将上述菌株全部制备钙转感受态，转化pLH03质粒，获得L-半胱氨酸生产菌株，依次命名为LH2A1M△YT-pLH03，LH2A1M△YTS-pLH03。
(3)所得菌株按照实施例1所述条件进行摇瓶发酵。
(4)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表10所示。
表10分解基因组合敲除对生长与产量的影响
实施例6：不同初始葡萄糖对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响
(1)选出实施例5中表现最优的组合敲除菌株，也即是LH2A1M△YTS-pLH03。
(2)为了优化初始葡萄糖浓度，浓度梯度设施为5g/L，10g/L，15g/L，20g/L。
(3)其他发酵条件按照实施例1所述进行摇瓶发酵。
(4)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表11所示。
表11不同初始葡萄糖对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响
实施例7：不同初始硫源对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响
(1)选出实施例5中表现最优的组合敲除菌株，也即是LH2A1M△YTS-pLH03。
(2)为了优化初始硫源浓度，浓度梯度设施为1g/L，3g/L，5g/L，7g/L，9g/L。
(3)初始葡萄糖浓度设置为10g/L,其他发酵条件按照实施例1所述进行摇瓶发酵。
(4)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表12所示。
表12不同初始硫源对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响
ND:not detected
实施例8：不同碳源混合利用对对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长和生产的影响
(1)选出实施例5中表现最优的组合敲除菌株，也即是LH2A1M△YTS-pLH03。
(2)摇瓶培养基中碳源分别设置为：10g/L葡萄糖，10g/L甘油，10g/L木糖，5g/L葡萄糖+5g/L甘油，5g/L葡萄糖+5g/L木糖，其余保持不变。
(3)其他发酵条件按照实施例1所述进行摇瓶发酵。
(4)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，结果如表13所示。
表13不同碳源混合利用对LH2A1M△YTS-pLH03摇瓶生长与产量的影响
实施例9：不同碳源流加速率对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响
(1)选出实施例5中表现最优的组合敲除菌株，也即是LH2A1M△YTS-pLH03。
(2)将上述L-半胱氨酸生产菌冰上化冻，取1ml接入装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行活化，12层纱布封口，培养温度为30℃，培养转速为220rpm，培养时间为20h。
(3)将上述种子培养液转移1ml至装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵，12层纱布封口，培养温度为30℃，培养转速为220rpm，培养时间为12h。
(4)将上述种子培养液转移150ml至装有900ml发酵培养基的1.5L发酵罐中进行发酵。
(5)发酵过程中，通过使用25％氨水进行自动校正，将pH值保持在7.0。空气流速保持在1vvm。分批补料培养的温度保持在30℃。
(6)初始葡萄糖耗完后，开始流加500g/L葡萄糖保持溶氧振荡，控制500g/L葡萄糖的流加速率为2.9g/L/h和3.2g/L/h，发酵时间为24h。
(7)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，发酵结果如表14所示。
表14不同碳源流加速率对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响
实施例10：额外添加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响
(1)选出实施例5中表现最优的组合敲除菌株，也即是LH2A1M△YTS-pLH03。
(2)初始葡萄糖耗完后，按照实施例9以3.2g/L/h的速率流加500g/L葡萄糖保持溶氧振荡。
(3)在发酵19h时，一次性添加不同浓度的硫源(硫代硫酸铵)，硫浓度设置为2g/L、3g/L、4g/L；发酵时间为24h。
(4)其他发酵条件按照实施例9所述进行补料分批发酵。
(5)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，发酵结果如表15所示。
表15额外添加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响
实施例11：额外流加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响
(1)选出实施例5中表现较优的组合敲除菌株，也即是LH2A1M△YTS-pLH03。
(2)初始葡萄糖耗完后，按照实施例9以3.2g/L/h的速率流加500g/L葡萄糖保持溶氧振荡。
(3)在发酵12h时，流加125g/L浓度的硫源(硫代硫酸铵)，硫源流加速率设置为0.15g/L/h、0.30g/L/h；发酵时间为24h。
(4)其他按照实施例9所述条件进行补料分批发酵。
(5)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，发酵结果如表16所示。
表16额外流加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS-pLH03补料分批发酵的影响
实施例12：染色体水平过表达硫源转录因子cysB对L-半胱氨酸生产的影响
选出实施例5中表现较优的组合敲除结果，也即是LH2A1M△YTS。
(1)将上述菌株制备电转感受，利用诱导型启动子Ptrc过表达L-半胱氨酸代谢途径中的硫源转录调控因子cysB,构建LH2A1M△YTS Ptrc-cysB，所需引物如表17。
表17构建所需引物(SEQ ID NO.55—SEQ ID NO.60)
(2)将上述构建菌株制备钙转感受态，将表达质粒pLH03转化进上述菌株的钙转感受态细胞中，获得L-半胱氨酸生产菌LH2A1M△YTSPtrc-cysB-pLH03。
(3)按照实施例1所述条件进行摇瓶发酵，当OD600为0.6～0.8时，添加不同浓度IPTG进行表达程度的调控。
(4)按照实施例1进行生长与产量的检测，结果如表18所示。
表18染色体水平过表达硫源转录因子cysB对L-半胱氨酸生产的影响
实施例13：额外补加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS Ptrc-cysB-pLH03补料分批发酵的影响
(1)选择实施例12中表现最优的菌株及对应的表达浓度，也即是0.05mM IPTG诱导下的LH2A1M△YTS Ptrc-cysB-pLH03菌株。
(2)初始葡萄糖耗完后，以3.2g/L/h的速率流加500g/L葡萄糖保持溶氧振荡。
(3)在发酵19h时，一次性添加不同浓度的硫源(硫代硫酸铵)，硫源浓度设置为2g/L、3g/L、4g/L；发酵时间为24h。
(4)其他按照实施例9所述条件进行补料分批发酵。
(5)按照实施例1的检测方法进行生长与产量的检测，发酵结果如表19所示。
表19额外添加不同浓度硫源对LH2A1M△YTS Ptrc-cysB-pLH03补料分批发酵的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用
<130> /
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtcagcggt taacaatttc 60
acacaggaaa cagacc 76
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtcaacggt taacaatttc 60
acacaggaaa cagacc 76
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ctacttgtac agctcgtcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
atggtgagca agggcgagga 20
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
gccccgacat ctcggggctt ctacttgtac agctcgtcca 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
ctcatcgtgt ggagtaagca atggtgagca agggcgagga 40
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
ggtcgacgga tccgcgcaac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
ggtctgtttc ctgtgtgaaa 20
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 9
tggggttagt ggctgctgcg ggtctgtttc ctgtgtgaaa 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 10
ggcgttgaaa tgccaataac ggtcgacgga tccgcgcaac 40
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 11
ctgtaggctg gagctgcttc gaag 24
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 12
ctccagcgat acctttgcca tggtctgttt cctgtgtgaa at 42
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 13
atggcaaagg tatcgctgga gaaag 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 14
ttagtacagc agacgggcgc gaat 24
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 15
tcctctaaac cagcatattc atccaagaat tacctttgcg tgatatttcc ctgtaggctg 60
gagctgcttc gaag 74
<210> 16
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 16
aaaaaacggg caagtcagtg acctgcccgt tgattttcag agaaggggaa ttagtacagc 60
agacgggcgc gaatggt 77
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 17
ctgtaggctg gagctgcttc gaag 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 18
ttagtacagc agacgggcgc gaat 24
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 19
ccgagagatt cttttgtgtg atgcaagcca catttttgcc ctcaacggtt ggcctttctg 60
ctgtaggctg 70
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 20
ttgaagattt gagccatttc ccctcaccac gttgcgttgc tattaacccg ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa 70
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 21
aaacaattat gtccgcgctg tg 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 22
gtttaagcac ctctgccggt a 21
<210> 23
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 23
atcactgccc gatgcagccg gaatttcagt tttgtgcgag ccatcttcca ggcctttctg 60
ctgtaggctg 70
<210> 24
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 24
atcttcaggc aggtcgcacc aggtaatgtt aggcattaag gctcctgtaa ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa 70
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 25
agctgtggat tacgctgtcg 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 26
cgtggtaatc cagtggcatc a 21
<210> 27
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 27
caattacgcc tgttgaacca agttcttatt cccttttcaa cttccaaatc ggcctttctg 60
ctgtaggctg 70
<210> 28
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 28
aagcgaccag cgcgagtgag ttctttttca gtaagttaac ggccattgcg ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa 70
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 29
gcagtgctcg aaatcctcac g 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 30
ggattcaggg cggcaaacag 20
<210> 31
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 31
atcacaaaaa tccccctacc ccgtcacgct catatccagg gtaatttcga ggcctttctg 60
ctgtaggctg 70
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 32
atgcgcatga ttcgtatttc cgtttaaaat gaagatacgg cgcgatgata ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa 70
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 33
ctgaagccgc acgcagtaaa g 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 34
caacgcttct gccgcttcag 20
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 35
gtggcttatg ccgcccctta ttccatcttg catgtcatta tttcccttct ggcctttctg 60
ctgtaggctg 70
<210> 36
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 36
tgtgaccgat agtcagcgag ttatcttcaa aaatcttact catggcctgt ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa 70
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 37
cctgtttacg atgatcccgc tg 22
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 38
gttacgagat tccaccttcg cc 22
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 39
tagcaaagaa tcgcgcttta ggtaacattg aaaaaacatt ttagagtgat ggcctttctg 60
ctgtaggctg 70
<210> 40
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 40
gcaacttctg gtgcgcgtcg gcaacgttaa tacattcgaa ctgatccatg ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa 70
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 41
ctccagcatc agcacggata aac 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 42
gaatatcgac cagcaccgcc 20
<210> 43
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 43
ctccgttcct ggcattttct tgatttacct gaaattttaa ggtttttaat acgtcttgag 60
cgattgtg 68
<210> 44
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 44
ggacaagatg cgccagcatc gcatccggca cgatccccaa aacctggcgt gatgtaacgc 60
actgagaagc 70
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 45
gtgtgtttct ccgttcctgg 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 46
ctaccgcgta aagacaggtt g 21
<210> 47
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 47
tgtaatattc acagggatca ctgtaattaa aataaatgaa ggattatgta acgtcttgag 60
cgattgtg 68
<210> 48
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 48
tgtagggtaa gagagtggct aacatcctta tagccactct gtagtattaa gatgtaacgc 60
actgagaagc 70
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 49
gtaatattca cagggatcac 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 50
atgtagggta agagagtggc 20
<210> 51
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 51
gtgattagtc tattcgacat gtttaaggtg gggattggtc cctcatcttc acgtcttgag 60
cgattgtg 68
<210> 52
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 52
ttagtcacac tggactttga ttgccagacc accgcgtgag gtttcgcggt gatgtaacgc 60
actgagaagc 70
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 53
gaagtccagt caccttgtca g 21
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 54
tacgcttgat ccggctac 18
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 55
ctgtaggctg gagctgcttc gaagttcct 29
<210> 56
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 56
ggtctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacattat acgag 55
<210> 57
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 57
tttaattctg tcaggttttt ataaacaaag ggtcgcgaaa gcggcccttt 50
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 58
accacctcaa caatatagcg aagttgttgt aatttcatgt taaaccatcc 50
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 59
acagcaatat gtctcttcgg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 60
ttatttttcc ggcagtttta 20
Claims (8)
1.合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下改造途径：
（1）适配L-半胱氨酸表达质粒pLH03与大肠杆菌底盘细胞，所述底盘细胞为K-12系列菌株；
（2）利用不同强度的组成型启动子对L-半胱氨酸合成途径基因进行单独或组合表达，所述单独表达是指表达2A、2C、2B、2M、2E中的一种；
所述组合表达是指表达2A、2C、2B、2M、2E中的一种和1A、1B、1M、1H、1E中的一种，其中不包括2A1A、2B1B、2M1M和2E1E的组合；
或者组合表达是指表达2A、2C、2B、2M、2E中的两种；
或者组合表达是指表达2A2C1B1M1H；
所述1是指启动子Ptrc1，所述Ptrc1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述2是指启动子Ptrc2，所述Ptrc2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述A是指serA，所述C是指serC，所述B是指 serB，所述M是指 cysM ，所述E是指 glpE，所述H是指nrdH；
（3）单独和/或组合敲除L-半胱氨酸分解途径基因及其前体L-丝氨酸分解途径基因。
2.根据权利要求1所述的合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述K-12系列菌株包括MG1655， W3110， JM109以及BW25113。
3.根据权利要求1所述的合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述分解途径基因选自yhaM，tnaA，sdaA中的一个或多个。
4.根据权利要求1所述的合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述改造途径还包括过表达L-半胱氨酸代谢途径中的硫源转录调节因子cysB。
5.利用权利要求1-4任一所述构建方法构建获得的合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌。
6.权利要求5所述合成L-半胱氨酸的重组大肠杆菌在制备L-半胱氨酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌经过多级活化后，于温度30℃-37℃，初始硫源为1 g/L-9 g/L，初始葡萄糖为5 g/L-20 g/L， 进行分批发酵48 h。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌经过多级活化后，于温度30℃-37℃，通气量0.5-3 vvm， pH 6.7-7.3，初始硫源为1 g/L-9 g/L，流加500 g/L的葡萄糖调节DO振荡，并适时补充硫源，进行补料分批发酵24-48 h。
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| GR01 | Patent grant | ||
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