CN117802025A

CN117802025A - 一种生产丁二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN117802025A
Application number: CN202410019280.4A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 杜旻; 王昕�; 王靖; 刘张宇
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2024-01-05
Filing date: 2024-01-05
Publication date: 2024-04-02

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产丁二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明通过从头合成牛源的精氨酸激酶基因ARG1和内源的大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因SpeC，构建质粒pTrc99a‑ARG1‑SpeC并转化至大肠杆菌ARGFM，获得单质粒的重组大肠杆菌PUTFM。该菌在特定培养基中生长良好。发酵时，通过在特定时段加入诱导剂IPTG，内源及异源基因均表达稳定。该反应体系简单、条件温和、周期适宜、副产物少，且清洁无污染，是一条简单、快速、高效的生产途径，从发酵结果看，重组大肠杆菌PUTFM能够稳定生产含14.8g/L丁二胺的发酵液，具有较高的产业化前景。

Description

一种生产丁二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产丁二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

1,4-丁二胺(1,4-butanediamine)，即腐胺(Putrescine)，又称1,4-二氨基丁烷，是一种包含两个氨基的脂肪族胺。广泛应用于医药、农业和工业领域，是一种具有高价值的小分子化合物。腐胺对肠道微生物有重要的调节作用，对采后农作物具有良好的保鲜效果，可与二元酸用于合成优质工业塑料尼龙-4,6。目前聚酰胺在全球范围的需求量与日俱增。除了传统的化学合成1,4-丁二胺，生物法制备也日渐成熟，逐渐取代化学合成法，成为1,4-丁二胺合成的主流方法。其中生物法主要分为生物催化法和细胞发酵法。催化法主要以L-精氨酸为原料，通过精氨酸激酶将其转化为鸟氨酸再通过鸟氨酸脱羧酶脱羧生成1,4-丁二胺。但需要昂贵的辅酶且重复利用率低下。相较而言，发酵法具备条件温和，原料多样，生产成本低过程可控等优点。

随着合成生物学的发展，大肠杆菌可作为模式工业菌株，进行大宗化学品的生产，其中就包括了1,4-丁二胺。但是1,4-丁二胺的发酵生产目前仍处于研究中，亟待开发以葡萄糖为底物的高产丁二胺发酵菌株。本发明从催化生产丁二胺的思路出发，在具有高产精氨酸的底盘细胞ARGFM中异源表达了牛源的精氨酸激酶，过表达大肠杆菌内源的鸟氨酸脱羧酶，构建了一步发酵生产丁二胺的重组大肠杆菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产丁二胺的重组大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌在合成丁二胺中的应用。该方法为一种清洁高效的丁二胺生物发酵方法，催化合成周期短，成本低，适合产业化大规模生产丁二胺。

本发明的设计原理为：在大肠杆菌中异源表达牛源的精氨酸激酶ARG1及大肠杆菌内源的鸟氨酸脱羧酶SpeC。将此路径构建在产精氨酸的大肠杆菌ARGFM中，以获得一定产量的丁二胺。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种生产丁二胺的重组大肠杆菌，以大肠杆菌ARGFM为出发菌株，通过表达内源鸟氨酸脱羧酶基因SpeC的同时表达异源精氨酸激酶基因ARG1，构建得到产丁二胺的重组大肠杆菌PUTFM，图1为重组大肠杆菌PUTFM的构建流程图。

其中，所述的鸟氨酸脱羧酶基因SpeC前含有启动子trc。

其中，所述的鸟氨酸脱羧酶基因SpeC是大肠杆菌的内源基因，其与启动子trc组成的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的精氨酸激酶基因ARG1来源于家牛(Bos taurus)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种生产丁二胺的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成精氨酸激酶基因ARG1，通过同源重组的方式，以质粒pTrc99a为载体，构建得到质粒pTrc99a-ARG1；

(2)合成含有启动子trc的鸟氨酸脱羧酶基因trc-SpeC，通过同源重组的方式，以步骤(1)得到的质粒pTrc99a-ARG1为载体，构建得到质粒pTrc99a-ARG1-SpeC；

(3)将步骤(2)得到的质粒pTrc99a-ARG1-SpeC转入大肠杆菌ARGFM中，获得产丁二胺的重组大肠杆菌PUTFM。

其中，步骤(1)中，选择的酶切位点均为NcoI和SacI，价格便宜，有助于产业化降低成本。

上述重组大肠杆菌在合成丁二胺中的应用也在本发明所保护的范围之内。

具体的，将重组大肠杆菌PUTFM活化后，经一级种子液体培养基洗脱转接至二级种子液体培养基中扩大培养，再接种至发酵培养基中进行发酵培养。

其中，所述的扩大培养，其培养条件为：35～37℃，200～220rpm条件下培养12～14h；优选的，35℃，220rpm条件下培养12h。

其中，所述的发酵培养，其发酵条件为在35～37℃、pH 7.0～7.3下共发酵48～60h。优选的，在35℃、pH 7.3的条件下共发酵60h。

其中，所述的发酵培养，当OD₆₀₀达到0.4时，加入IPTG至终浓度125mM；当发酵培养基中初糖耗尽后，流加补料培养基，维持溶氧15％～35％、残糖含量1～5g/L、氨氮含量1～5g/L，继续进行发酵培养。

其中，所述的发酵培养基，其配方为：牛肉粉5～6g/L、酵母粉1～2g/L、葡萄糖25～30g/L、K₂HPO₄ 3～5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5～2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02～0.03g/L、MnSO₄·H₂O0.02～0.03g/L、生物素0.002～0.003g/L、VB₁ 0.002～0.003g/L、VB₃0.002～0.003g/L、VB₅0.002～0.003g/L、(NH₄)₂SO₄ 11～15g/L、氯霉素5～10mg/L、青霉素5～10mg/L、甜菜碱0.5～2.5g/L；优选的配方为：牛肉粉5.25g/L、酵母粉1.75g/L、葡萄糖25g/L、K₂HPO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、MnSO₄·H₂O0.02g/L、生物素0.002g/L、VB₁0.002g/L、VB₃ 0.002g/L、VB₅ 0.002g/L、(NH₄)₂SO₄11g/L、氯霉素5mg/L、青霉素5mg/L、甜菜碱0.5g/L。

其中，所述的补料培养基，分为补料A和补料B；具体的，补料A的配方为：600～700g/L葡萄糖+2.25～3g/L甜菜碱，补料B的配方为：300～400g/L硫酸铵+180～200g/L谷氨酸钠；优选的，补料A的配方为：600g/L葡萄糖+2.25g/L甜菜碱，补料B的配方为：300g/L硫酸铵+180g/L谷氨酸钠。

有益效果：

(1)采用此方法生产丁二胺，异源路径在重组菌株种表达良好，可获得终产物丁二胺14.8g/L。

(2)细胞发酵反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。

(3)本发明发酵生产丁二胺，直接以葡萄糖为原料，其成本较催化合成大幅下降。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为重组大肠杆菌PUTFM的构建流程图。

图2为重组大肠杆菌PUTFM的平板生长形态实物图。

图3为重组大肠杆菌PUTFM的丁二胺5L发酵罐发酵产量图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。例如使用的大肠杆菌DH5α，pTrc99a等材料都是商业化产品，可直接购买。

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1：pTrc99a-ARG1-SpeC重组质粒的构建

(1)合成含有启动子trc的鸟氨酸脱羧酶基因trc-SpeC，其核苷酸编码序列如SEQID NO.1所示：(由安徽通用生物公司合成)

CGGTACCCGGGGATCTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGATGAAATCAATGAATATTGCCGCCAGTAGTGAACTGGTATCCCGACTTTCTTCTCATCGTCGCGTGGTGGCGTTGGGAGATACTGATTTTACGGACGTCGCGGCAGTCGTCATTACCGCTGCGGATAGTCGCAGTGGCATTCTTGCGTTGCTTAAGCGCACCGGTTTTCATCTACCGGTGTTTTTGTATTCCGAACATGCTGTTGAATTACCTGCGGGCGTTACGGCGGTAATCAACGGCAACGAGCAGCAGTGGCTGGAGCTGGAATCCGCAGCCTGTCAGTATGAAGAGAATTTGCTGCCACCGTTTTATGACACGCTGACGCAGTACGTTGAGATGGGCAACAGCACCTTTGCTTGCCCTGGACATCAACATGGTGCGTTTTTTAAAAAGCATCCTGCCGGACGCCATTTTTACGATTTCTTTGGTGAGAACGTCTTTCGCGCCGATATGTGTAACGCTGACGTAAAATTGGGCGATCTGCTTATTCATGAAGGATCGGCGAAAGATGCGCAGAAATTCGCAGCCAAAGTCTTTCATGCCGATAAAACCTATTTTGTGCTGAACGGCACATCGGCAGCGAATAAAGTGGTGACGAATGCGCTGTTAACGCGTGGCGATCTGGTGCTCTTCGACCGTAACAACCATAAGTCGAATCATCACGGCGCGCTGATTCAGGCGGGGGCGACGCCGGTCTATCTGGAAGCTTCACGCAACCCGTTTGGTTTCATTGGCGGTATTGATGCGCACTGTTTTAATGAAGAGTATCTGCGCCAGCAAATTCGCGACGTTGCGCCAGAAAAAGCCGACCTGCCGCGCCCGTATCGCCTGGCGATTATTCAGCTGGGAACCTATGACGGCACTGTCTATAACGCCCGTCAGGTGATCGATACCGTTGGGCATCTGTGTGATTACATTCTGTTTGATTCCGCGTGGGTCGGTTATGAACAATTTATCCCGATGATGGCGGATAGCTCGCCGCTGCTGTTAGAACTTAACGAAAACGATCCGGGGATCTTTGTGACTCAGTCGGTGCACAAACAGCAGGCGGGATTCTCACAGACGTCGCAGATCCATAAAAAAGATAACCATATCCGCGGACAGGCGCGTTTTTGCCCGCATAAGCGGTTGAATAACGCCTTTATGCTCCATGCTTCTACCAGCCCTTTCTATCCGCTGTTTGCTGCACTGGATGTTAACGCCAAAATTCATGAAGGGGAGAGTGGGCGTCGGCTGTGGGCTGAGTGTGTTGAGATAGGGATTGAAGCGCGCAAGGCTATTCTTGCGCGCTGTAAGCTGTTCCGCCCGTTTATCCCGCCCGTTGTTGATGGCAAATTGTGGCAGGATTATCCGACATCAGTGTTAGCCAGCGACCGCCGTTTTTTCAGTTTTGAGCCGGGGGCGAAGTGGCACGGCTTTGAAGGATATGCCGCGGATCAGTATTTTGTTGATCCGTGCAAGCTGTTACTCACTACACCAGGTATCGATGCCGAAACCGGCGAATATAGCGACTTTGGCGTTCCGGCGACGATTCTGGCGCACTATCTGCGTGAGAACGGCATTGTGCCGGAGAAGTGCGATCTCAACTCCATTCTGTTTTTATTAACTCCGGCGGAAAGCCACGAGAAGCTGGCACAACTGGTGGCGATGCTGGCGCAATTTGAACAGCATATTGAGGATGACTCGCCGCTGGTTGAGGTGTTGCCGAGCGTTTATAACAAGTATCCGGTGCGCTATCGCGACTACACCCTGCGCCAGTTGTGTCAGGAGATGCACGATCTGTATGTCAGTTTCGACGTCAAAGACCTACAAAAAGCGATGTTCCGCCAGCAGAGTTTCCCGTCAGTGGTGATGAACCCCCAGGATGCGCATAGCGCTTATATTCGCGGTGACGTGGAGTTGGTGCGGATTCGTGATGCCGAAGGGCGAATTGCGGCAGAAGGGGCGTTGCCTTATCCACCTGGCGTGCTTTGCGTGGTACCCGGGGAAGTCTGGGGTGGGGCGGTTCAACGTTATTTCCTTGCACTGGAAGAAGGGGTGAATTTGTTGCCGGGATTTTCGCCGGAGCTGCAAGGTGTTTATAGCGAAACCGATGCGGATGGCGTGAAACGGTTGTACGGTTATGTGTTGAAGTAACGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATATCGACCTGCAGGCAT

所用上游引物序列如SEQ ID NO.2所示：

CGGTACCCGGGGATCTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATG

下游引物序列如SEQ ID NO.3所示：

ATGCCTGCAGGTCGATATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCG

合成精氨酸激酶基因ARG1，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.4所示：(由安徽通用生物公司合成)

ATGAGCAGCAAACCGCAGAGCATTGGTGTGATTGGGGCGCCGTTTTCGAAAG

GCCAGCCGCGTGGGGGAGTTGAGGAGGGTCCGACCGTGCTGCGCAAAGCGGGG

CTGCTGGAAAAACTGAAAGAACTGGAATGTGATGTGAAAGATTATGGTGATCTGA

GCTTCGCAGATAATCTGGATGATAGCCCGTTTCAGATTGTAAAAAATCCGCGTTGT

GTTGGTAAAGCAAGCGAAAAACTGGCAGATGTTGTTGCAGAAGTTAAAAAAACC

GGTCGTATTAGCCTGGTTCTGGGTGGTGATCATAGCCTGGCAATTGGTAGCATTAG

CGGTCATGCACGTGTTCATCCGGATCTGTGTGTTATTTGGGTTGATGCACATACCG

ATATTAATACCCCGCTGACCACCAAAACCGGTAATCTGCATGGTCAGCCGGTTAGC

TTTCTGCTGAAAGAACTGAAAGAAAAAATGCCGGAAGTTCCGGGTTTTTATTGGG

TTGCACCGTGTATTAGCGCAAAAGATATTGTTTATATTGGTCTGCGTGATGTTGATC

CGGGTGAACATTATATTCTGAAAACCCTGGGTATTAAATATTTTAGCATGACCGAA

GTTGATAAACTGGGTATTGGTAAAGTTATGGAAGAAACCTTTAGCTATCTGCTGGG

TCGTAAAAAACGTCCGATTCATCTGAGCTTTGATGTTGATGGTCTGGACCCTAGCT

TTACCCCGGCAACCGGTACCCCGGTTCAGGGTGGTCTGACCTATCGTGAAGGTCT

GTATATTACCGAAGAAATTTATAAAACCGGTCTGCTGAGCGGTCTGGATATTATGG

AAGTTAATCCGAGCCTGGGTAAAACCCCGGAAGAAGTTACCCGTACCGTTAATAC

CACCGTTGCAATTACAATGGCTTGTTTTGGTGTTGCACGTGAAGGTAATCATAAAC

CGATTGATTATCTGAGCCCGCCGAAATAAC

所用上游引物序列如SEQ ID NO.5所示：

AGGAAACAGACCATGATGAGCAGCAAACCGCAGA

下游引物序列如SEQ ID NO.6所示：

GATCCCCGGGTACCGTTATTTCGGCGGGCTCAGATAATCAA

反应条件为：95℃3min，95℃15s，60℃15s，72℃1min 15s，共30个循环；72℃5min。将得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段(trc-SpeC基因片段和ARG1基因片段)。

(2)构建质粒pTrc99a-ARG1-SpeC

将ARG1基因片段的序列与表达载体pTrc99a连接，用Takara公司的NcoI和SacI酶切，酶切反应体系为：10×Buffer 1μL，NcoI 1μL，SacI 1μL，ARG1基因片段或pTrc99a载体7μL。酶切体系于37℃下反应1h，分别将酶切后的载体与基因片段同源重组，反应体系为：5×CE II Buffer 5μL，Exnase II 2μL，酶切基因片段4μL，酶切载体10μL，37℃反应30min。将同源重组产物转化至大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性菌株DH5α-pTrc99a-ARG1并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性菌株DH5α-pTrc99a-ARG1接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、青霉素100mg/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pTrc99a-ARG1。

将trc-SpeC基因片段的序列与载体pTrc99a-ARG1连接，用Takara公司的BamHI和SalI酶切，酶切反应体系为：10×Buffer 1μL，BamHI 1μL，SalI 1μL，ARG1基因片段或pTrc99a-ARG1载体7μL。酶切体系于37℃下反应1h，分别将酶切后的载体与基因片段同源重组，反应体系为：5×CE II Buffer 5μL，Exnase II 2μL，酶切基因片段4μL，酶切载体10μL，37℃反应30min。将同源重组产物转化至大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性菌株DH5α-pTrc99a-ARG1-SpeC并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性菌株DH5α-pTrc99a-ARG1-SpeC接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、青霉素100mg/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pTrc99a-ARG1-SpeC。

实施例2：重组大肠杆菌PUTFM的构建和诱导表达

1、重组大肠杆菌PUTFM的构建

配制PUTFM含Amp&CmR抗性的种子固体培养基，其配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠2.5g/L、牛肉粉10g/L、葡萄糖1g/L、氯霉素5mg/L、青霉素5mg/L、琼脂粉25g/L，用氢氧化钠调节pH至7.0～7.2之间，121℃灭菌25min。其中，氯霉素和青霉素待冷却至45℃后再加入，使抗生素氯霉素、青霉素至终浓度5mg/L，在超净台倒入无菌培养皿中待凝固后使用。

将实施例1获得的重组质粒pTrc99a-ARG1-SpeC与高产精氨酸的大肠杆菌ARGFM的感受态细胞混合，冰浴25min后，42℃热激45s，接着冰浴3min。于超净台中，添加1mL无抗性的种子固体培养基，置于37℃摇床上培养1h。培养完成后，4000rpm离心5min，于超净台中去上清800μL，将剩余菌体重悬，并涂布于PUTFM含Amp&CmR抗性的种子平板上，涂布完成后，将PUTFM种子平板过夜培养12h，构建得到重组大肠杆菌PUTFM。平板生长图见图2。从图2中可以看出，此菌株在加入PUTFM种子固体平板上呈现圆形透明菌落，边缘光滑，菌株对营养成分要求较高，平板菌落较小。

将阳性菌株接种至5mL PUTFM含Amp&CmR抗性的种子液体培养基，液体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠2.5g/L、牛肉粉10g/L、葡萄糖1g/L、氯霉素5mg/L、青霉素5mg/L，用氢氧化钠调节pH至7.0～7.2之间，121℃灭菌25min。其中，氯霉素和青霉素待冷却至室温后再加入，使氯霉素、青霉素至终浓度5mg/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。当OD₆₀₀至0.6～0.8时，取800μL 30％的甘油和800μL的菌液混合于无菌甘油管中并在-80℃冰箱保藏菌种PUTFM。

2、重组大肠杆菌PUTFM的诱导表达及5L发酵流程

一级种子平板：取50μL冻存的甘油菌涂布于PUTFM含Amp&CmR抗性的一种子固体培养基中(其组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠2.5g/L、牛肉粉10g/L、葡萄糖1g/L、氯霉素5mg/L、青霉素5mg/L、琼脂粉25g/L，用氢氧化钠调节pH至7.0～7.2之间，121℃灭菌25min，冷却至45℃后加入抗生素氯霉素、青霉素至终浓度5mg/L，在超净台倒入无菌培养皿中待凝固后使用)，在37℃恒温箱中活化培养16h。

二级种子摇瓶：取5mL一级种子液体培养基将活化后的平板菌落洗脱至含Amp+CmR抗性的二级种子液体培养基的摇瓶中扩大培养，控制其终体积为250mL。将种子摇瓶在35℃，220rpm条件下培养12h。其中，二级种子液体培养基，其配方为：蛋白胨4g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖25g/L、K₂HPO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、MnSO₄·H₂O0.02g/L、生物素0.002g/L、VB₁ 0.002g/L、VB₃ 0.002g/L、VB₅ 0.002g/L、氯霉素5mg/L、青霉素5mg/L。

5L发酵罐：将二级种子火焰接种至含Amp+CmR抗性的发酵培养基的5L发酵罐中，开始发酵时总体积为2.5L(接种量10％v/v)。发酵开始后，当OD₆₀₀达到0.4时加入IPTG至终浓度125mM，发酵过程中，当观察到发酵培养基中初糖耗尽溶氧反弹后开始同时流加补料(补料A:600g/L葡萄糖+2.25g/L甜菜碱，补料B：300g/L硫酸铵+180g/L谷氨酸钠)，控制溶氧15％～35％，残糖含量1～5g/L，氨氮含量1～5g/L，pH7.3(用氨水/NaOH溶液及磷酸调节)，35℃条件下共发酵60h获得发酵液。其中，含Amp+CmR抗性的发酵培养基，其配方为：牛肉粉5.25g/L、酵母粉1.75g/L、葡萄糖25g/L、K₂HPO₄3g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L、FeSO₄·7H₂O0.02g/L、MnSO₄·H₂O 0.02g/L、生物素0.002g/L、VB₁ 0.002g/L、VB₃ 0.002g/L、VB₅ 0.002g/L、(NH₄)₂SO₄ 11g/L、氯霉素5mg/L、青霉素5mg/L、甜菜碱0.5g/L。

将发酵液12000rpm离心2min，取上清进行液相检测其产物丁二胺，测定方法为：使用安捷伦高效液相色谱系统和GRACE Alltima C18色谱柱(5μm 250×4.6mm)，流动相为100％乙腈和纯水；流速1mL·min-1梯度洗脱；柱温箱温度为35℃；进样量20μl；紫外检测器。记录发酵过程中糖耗、OD₆₀₀，结果如图3所示，从图中可以看出重组大肠杆菌PUTFM发酵60h生产丁二胺14.8g/L。

本发明提供了一种生产丁二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种生产丁二胺的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌ARGFM为出发菌株，通过表达内源鸟氨酸脱羧酶基因SpeC的同时表达异源精氨酸激酶基因ARG1，构建得到产丁二胺的重组大肠杆菌PUTFM。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的鸟氨酸脱羧酶基因SpeC前含有启动子trc。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的鸟氨酸脱羧酶基因SpeC是大肠杆菌的内源基因，其与启动子trc组成的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的精氨酸激酶基因ARG1来源于家牛Bos taurus，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求1所述的生产丁二胺的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.权利要求1～4任意一项所述的重组大肠杆菌在合成丁二胺中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将重组大肠杆菌PUTFM接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵条件为在35～37℃、pH 7.0～7.3下共发酵48～60h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养，当OD₆₀₀到达0.4时，加入IPTG至终浓度125mM；当发酵培养基中初糖耗尽后，流加补料培养基，维持溶氧15％～35％、残糖含量1～5g/L、氨氮含量1～5g/L，继续进行发酵培养。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基，其配方为：牛肉粉5～6g/L、酵母粉1～2g/L、葡萄糖25～30g/L、K₂HPO₄ 3～5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5～2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02～0.03g/L、MnSO₄·H₂O 0.02～0.03g/L、生物素0.002～0.003g/L、VB₁0.002～0.003g/L、VB₃ 0.002～0.003g/L、VB₅ 0.002～0.003g/L、(NH₄)₂SO₄ 11～15g/L、氯霉素5～10mg/L、青霉素5～10mg/L、甜菜碱0.5～2.5g/L。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的补料培养基，分为补料A和补料B，其中，补料A的配方为：600～700g/L葡萄糖+2.25～3g/L甜菜碱，补料B的配方为：300～400g/L硫酸铵+180～200g/L谷氨酸钠。