CN108866117B - 一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用 - Google Patents

一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用光合细菌合成3‑羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用，本发明旨在通过构建3‑羟基丙酸新的合成途径，通过在光合细菌R.pal中表达外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，建立一条新的生物合成3‑羟基丙酸的方法，从而获得含有本体丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB、外源丙二酸单酰辅酶A还原酶C段及丙二酸单酰辅酶A还原酶N段对应的编码基因的重组细胞，同时由本体表达的NAD(P)转氢酶PntAB和外源NAD(+)激酶YfjB的表达辅以还原力NADPH的供应。该重组细胞能够以丙二酸盐为底物合成3‑羟基丙酸，从而建立一条新的更为简短高效的生物催化生产3‑羟基丙酸的方法。

Description

一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞 和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用。
背景技术
3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物，可作为可降解塑料的聚合单体；因其具有显著的市场价值和应用前景，于2004年被美国能源部列为12种最重要的生物基化学品之一。
3-HP可以通过化学合成法和生物合成法获得。传统的化学合成法普遍存在原材料价格昂贵、毒性较大等缺陷，另一方面，其催化效率和选择性也较低，不能满足工业化应用的要求。然而，生物合成法则可以利用廉价的生物质资源进行生产，具有反应条件温和、操作简单、副产物较少、绿色环保、生产成本较低等优点。在资源和环境的双重压力下，生物法合成3-HP已经引起越来越多的兴趣，近年来发展迅速，取得了一系列进展。
目前，3-HP的合成主要有天然合成和代谢工程合成两大途径，尤以利用甘油、葡萄糖等廉价碳源合成3-HP的代谢工程研究发展迅速，已逐渐成为高效合成3-HP的重要手段。其中，以甘油为底物的途径包括辅酶A依赖型和非辅酶A依赖型两条途径；以葡萄糖为底物的途径中包含丙酸途径、乳酸途径、β-丙氨酸途径、草酰乙酸途径和丙二酸单酰辅酶A途径。丙二酸单酰辅酶A途径是已知的以葡萄糖为碳源合成3-羟基丙酸的最短途径，也是目前研究最深入的途径，本发明即基于该途径建立的一条新途径，进一步缩短了其代谢途径。
微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
发明内容
本发明的发明目的是提供了一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用，本发明对传统丙二酸单酰辅酶A途径进行改造，建立一条合成3-羟基丙酸新代谢途径的方法，在重组细胞体内，通过本体表达丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB结合利用基因工程手段异源表达丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR，同时通过本体表达NAD(P)转氢酶PntAB结合异源表达NAD(+)激酶YfjB辅以还原力的的补充，将丙二酸盐转化为目标产物3-羟基丙酸，从而建立一条新的3-羟基丙酸生物合成途径。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，它包括以下步骤：
(1)分别克隆mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因、lldA基因；
(2)构建载体pJQ200SK-mcrC/matA
分别扩增matA基因编码序列上下游的同源臂matA-up和matA-down，扩增mcrC基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；
将纯化后的matA-up、mcrC和matA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrC/matA；
(3)构建载体pJQ200SK-mcrN/lldA
分别扩增lldA基因编码序列上下游的同源臂lldA-up和lldA-down，扩增mcrN基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；
将纯化后的lldA-up、mcrN和lldA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrN/lldA；
(4)构建载体pJQ200SK-yfjB/RPA3450
分别扩增RPA3450基因编码序列上下游的同源臂RPA3450-up和RPA3450-down，扩增yfjB基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；
将纯化后的RPA3450-up、yfjB和RPA3450-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-yfjB/RPA3450；
(5)将包含pJQ200SK-mcrC/matA质粒的大肠杆菌与R.pal CGA009进行接合，筛选获得工程菌株R.pal CGA009-mcrC/matA；
(6)将包含pJQ200SK-mcrN/lldA质粒的大肠杆菌与所述R.pal CGA009-mcrC/matA进行接合，筛选获得工程菌株R.pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA；
(7)将包含pJQ200SK-yfjB/RPA3450质粒的大肠杆菌与所述R.pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA进行接合，筛选获得工程菌株R.pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450；
(8)将活化后的R.pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450接种到含有丙二酸盐的培养液中培养，光照培养，最终发酵获得3-羟基丙酸。
进一步的：所述步骤(8)中R.pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450按2∶100的比例接种到含有丙二酸盐的培养基中。
进一步的：所述步骤(8)中在30℃、光照条件下低速搅拌培养，当OD660不再增长后，继续培养12-24小时。
进一步的：所述YfjB基因来源于大肠杆菌。
本发明还提供了所述合成3-羟基丙酸的方法中获得的重组细胞，所述重组细胞包含mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因和lldA基因。
进一步的：所述的重组细胞为光合细菌沼泽红假单胞菌R.pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450。
本发明还提供了所述的重组细胞在用于制备化合物或组合物中的应用，所述化合物和组合物包括：3-羟基丙酸、异丁醇、异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体和橡胶硫化剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：本发明中利用新丙二酸单酰辅酶A途径合成3-羟基丙酸的方法与传统丙二酸单酰辅酶A途径相比其优点在于：传统的通过丙二酸单酰辅酶A途径合成3-羟基丙酸需要经过多步酶催化反应，首先葡萄糖通过多步转化为乙酰辅酶A，在乙酰辅酶A羧化酶ACC的作用下生成丙二酸单酰辅酶A，进一步在丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR作用下转化为3-HP。而本发明则直接以丙二酸盐为底物，直接在丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB作用下生成丙二酸单酰辅酶A，接下来在丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR作用下转化为3-羟基丙酸。
(1)本发明充分利用光合细菌R.pal本体的丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB，大大缩短了3-羟基丙酸的生物合成途径；
(2)本发明充分利用了优化的丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR，大大提高了3-羟基丙酸的转化效率；
(3)通过本体表达NAD(P)转氢酶PntAB结合异源表达NAD(+)激酶YfjB辅以还原力的的补充，进一步提高了3-羟基丙酸的转化效率；
本发明主要结合本体表达和通过基因工程的手段，在细胞中本体表达丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB和NAD(P)转氢酶PntAB，利用基因工程手段异源表达丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR和NAD(+)激酶YfjB，获得的重组细胞含有表达上述酶的基因，该重组细胞能够从丙二酸盐合成3-羟基丙酸。最终在光合细菌R.pal细胞中成功建立一种高效的3-羟基丙酸生物合成代谢途径，获得了可以高效合成3-羟基丙酸的重组细胞，从而建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化生产3-羟基丙酸的方法。
附图说明
图l是本发明中合成3-羟基丙酸新途径的改造示意图。
图2是本发明中pJQ200SK-mcrC/matA的质粒图谱。
图3是本发明中pJQ200SK-mcrN/lldA的质粒图谱。
图4是本发明中pJQ200SK-yfjB/RPA3450的质粒图谱。
图5是本发明中3-羟基丙酸标准品的HPLC检测图谱。
图6是本发明中重组细胞3-羟基丙酸产物的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。
实施例1
如图1所示，本发明通过在沼泽红假单胞菌中共同表达本体的丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB；来源于基于参考文献合成基因表达的丙二酸单酰辅酶A还原酶C段McrC、丙二酸单酰辅酶A还原酶N段McrN；本体的NAD(P)转氢酶PntAB和来源于大肠杆菌(Escherichiacoli DH5α)的NAD(+)激酶YfjB，利用丙二酸盐转化为丙二酸单酰辅酶A，并进一步通过生物合成3-羟基丙酸。
本发明中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶C段McrC的编码基因序列来源于参考文献(Liu et al.2016，Metabolic Engineering)，基因由生物公司合成。
所述丙二酸单酰辅酶A还原酶N段McrN的编码基因序列来源于参考文献(Liu etal.2016，Metabolic Engineering)，基因由生物公司合成。
所述NAD(+)激酶YfjB的编码基因来源于大肠杆菌Escherichia coli DH5α(GenBank：CP026085.1)。
1.外源基因的克隆
1.1外源基因的克隆
1.1.1丙二酸单酰辅酶A还原酶C段McrC编码序列的克隆
根据参考文献(Liu et al.2016，Metabolic Engineering)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后分别与载体pUC57(购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接获得pUC57-mcrC。mcrC基因序列如SEQ ID No：1所示。
1.1.2丙二酸单酰辅酶A还原酶N段McrN编码序列的克隆
根据参考文献(Liu et al.2016，Metabolic Engineering)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后分别与载体pUC57(购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接获得pUC57-mcrN。mcrN基因序列如SEQ ID No：2所示。
1.1.3 NAD(+)激酶YfjB编码序列的克隆
选取来自大肠杆菌(Escherichia coli)的NAD(+)激酶YfjB编码基因yfjB(Accession No.CP026085)，由引物扩增获得。yfjB基因序列如SEQ ID No：3所示。
2.同源重组自杀质粒的构建
2.1 pJQ200SK-mcrC/matA自杀质粒的构建
以R.pal CGA009基因组为模板，使用引物matA-up-F(5‘-AGTGGATCCCCCGGGCTGCAGCTTGCTGACAAGTTCGATGTGGT-3’)和matA-up-R(5‘-GTGGCGCTCATCCCCAGGCTTGCGACATCGT-3’)、matA-down-F(5‘-ATTACCGTGTAACGACTATTGATGAGCGAAGCA-3’)和matA-down-R(5‘-TTGATATCGAATTCCTGCAGAGTCTATCATTCCGGTAGCGGA-3’)分别扩增matA基因编码序列上下游1kb左右的同源臂matA-up和matA-down，以合成的pUC57-mcrC质粒为模板，使用mcrC-F(5‘-CAAGCCTGGGGATGAGCGCCACCACCGGCGCA-3’)和mcrC-R(5‘-ATCAATAGTCGTTACACGGTAATCGCCCGTC-3’)扩增mcrC基因；使用限制性内切酶PstI单切线性化自杀质粒pJQ200SK；②使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Co.)，将纯化后的matA-up、mcrC和matA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK按照100ng：100ng：100ng：100ng的比例混合于10μL反应体系中，于50℃水浴孵育15min；In-Fusion产物转化大肠杆菌S17-1，通过Gm抗性筛选和菌落PCR筛选，经酶切和测序验证后，获得重组自杀质粒pJQ200SK-mcrC/matA。
2.2 pJQ200SK-mcrN/lldA自杀质粒的构建
以R.pal CGA009基因组为模板，使用引物lldA-up-F(5‘-GTGGATCCCCCGGGCTGCAGAATTCGATGTAGCGATCGTGGAC-3’)和lldA-up-R(5‘-GGGAATTGCCGTCCGCCTCTT-3’)、lldA-down-F(5‘-TCAACATCCCTGCCAACATTTAATTCCGCCTGCACAATTCCGTCT-3’)和lldA-down-R(5‘-TTGATATCGAATTCCTGCAGACCGGTGAATCAAACCGTAAGAC-3’)分别扩增lldA基因编码序列上下游1kb左右的同源臂lldA-up和lldA-down，以合成的pUC57-mcrN质粒为模板，使用mcrN-F(5‘-CGGACGGCAATTCCCATGCACCACCACCACCACCACCACCACAGCGGAACAGGACGACT-3’)和mcrN-R(5‘-TTAAATGTTGGCAGGGATGTTGA-3’)扩增mcrN基因；使用限制性内切酶PstI单切线性化自杀质粒pJQ200SK；使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Co.)，将纯化后的lldA-up、mcrN和lldA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK按照100ng：100ng：100ng：100ng的比例混合于10μL反应体系中，于50℃水浴孵育15min；In-Fusion产物转化大肠杆菌S17-1，通过Gm抗性筛选和菌落PCR筛选，经酶切和测序验证后，获得重组自杀质粒pJQ200SK-mcrN/lldA。
2.3 pJQ200SK-yfjB/RPA3450自杀质粒的构建
以R.pal CGA009基因组为模板，使用引物RPA3450-up-F(5‘-GTGGATCCCCCGGGCTGCAGAGTCGAGCTACACCGAGGGCTTCGT-3’)和RPA3450-up-R(5‘-ATGATTATTCATGGACTTCCTCCTGAAAGGCTGT-3’)、RPA3450-down-F(5‘-ATTATTCTAAGGTAGGTTTCGGAGAGGATGGTCATG-3’)和RPA3450-down-R(5‘-TTGATATCGAATTCCTGCAGAGCCGTAGCTGTCGATCATCCA-3’)分别扩增RPA3450基因编码序列上下游1kb左右的同源臂RPA3450-up和RPA3450-down，以大肠杆菌基因组为模板，使用yfjB-F(5‘-AGGAGGAAGTCCATGAATAATCATTTCAAGTGTAT-3’)和yfjB-R(5‘-TCCGAAACCTACCTTAGAATAATTTTTTTGACCAGC-3’)扩增yfjB基因；使用限制性内切酶PstI单切线性化自杀质粒pJQ200SK；使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Co.)，将纯化后的RPA3450-up、yfjB和RPA3450-down三个片段和线性化后的pJQ200SK按照100ng：100ng：100ng：100ng的比例混合于10μL反应体系中，于50℃水浴孵育15min；In-Fusion产物转化大肠杆菌S17-1，通过Gm抗性筛选和菌落PCR筛选，经酶切和测序验证后，获得重组自杀质粒pJQ200SK-yfjB/RPA3450。
3.R.pal重组菌株的构建
将R.pal CGA009在30℃，光照下活化培养至OD660于0.2-0.7；将含有重组自杀质粒pJQ200SK-mcrC/matA的大肠杆菌S17-1活化培养至OD600于0.2-0.5；分别取2.5ml R.palCGA009菌液和1ml大肠杆菌S17-1菌液，收集菌体后，使用PM培养基洗涤两次，重悬混合后滴于不加抗生素的CA平板，30℃暗培养48-60小时，进行接合；挑取边缘菌落于含Gm抗生素的PMS平板上进行划线，继续培养一周左右；待长出菌落后挑取单菌落于含10％蔗糖的PMS平板上进行划线，继续培养；待长出菌落后挑取单菌落同时于含10％蔗糖的PMS平板和含Gm抗生素、10％蔗糖的PMS平板上划线，继续培养；最后挑取只在含10％蔗糖的PMS平板上生长的菌进行菌落PCR验证，并进行测序确定。最终获得R.pal CGA009(mcrC/matA)工程菌株。
将R.pal CGA009(mcrC/matA)工程菌株在30℃，光照下活化培养至OD660于0.2-0.7；将含有重组自杀质粒pJQ200SK-mcrN/lldA的大肠杆菌S17-1活化培养至OD600于0.2-0.5；两者进行接合，同上进行Gm抗生素压力和蔗糖压力双重筛选，最终进行菌落PCR验证和测序确定。最终获得R.pal CGA009(mcrC/matA-mcrN/lldA)工程菌株。
将R.pal CGA009(mcrC/matA-mcrN/lldA)工程菌株在30℃，光照下活化培养至OD660于0.2-0.7；将含有重组自杀质粒pJQ200SK-yfjB/RPA3450的大肠杆菌S17-1活化培养至OD600于0.2-0.5；两者进行接合，同上进行Gm抗生素压力和蔗糖压力双重筛选，最终进行菌落PCR验证和测序确定。最终获得本发明最终的R.pal CGA009(mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450)工程菌株。
本发明获得的重组细胞包含下述酶的编码基因片段：mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因和lldA基因，该重组R.pal菌能够从丙二酸盐合成3-羟基丙酸。
所述的重组细胞为光合细菌沼泽红假单胞菌R.pal细胞，通过基因工程技术构建而成的。所述的重组细胞可以用于制备化合物，所述化合物为3-羟基丙酸。
4.R.pal工程菌的培养
将构建好的R.pal CGA009(mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450)工程菌株，通过培养瓶进行发酵培养，利用高效液相色谱技术(HPLC)对发酵产物进行定性和定量的检测。
将活化后的上述工程菌按2∶100的比例接种到含有40/3mM丙二酸盐的PM液体培养基中，30℃，光照条件下，使用磁力搅拌器低速搅拌培养。当OD660不再增长后，继续培养12-24小时。最后离心收集发酵液上清，利用HPLC定量检测3-羟基丙酸。
5.HPLC定性检测产物
检测条件：HPLC系统采用Thermo的ULTIMATE 3000型号液相色谱仪，色谱柱为ZORBAXSB-18(4.6mm×50mm，1.8mm)，检测器为VWD检测器，检测波长为210nm；
反应产物进样(5μL)，1％的乙腈和99％NaH2PO4(PH 2.0)，0.5mL/min流速。该缓冲液组分维持15min，3-羟基丙酸的保留时间为2min。
实验结果如图5和图6所示。图5表明，3-羟基丙酸标准品保留时间为1.9分钟左右。图6表明，在重组细胞3-羟基丙酸产物的HPLC检测图谱中1.9分钟左右有物质检出，结合图5和图6，定性为3-羟基丙酸。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcggaa caggacgact ggcaggaaag attgcgttaa ttaccggtgg cgccggcaat 60
atcggcagtg aattgacacg tcgctttctc gcagagggag cgacggtcat tattagtgga 120
cggaatcggg cgaagttgac cgcactggcc gaacggatgc aggcagaggc aggagtgccg 180
gcaaagcgca tcgatctcga agtcatggat gggagtgatc cggtcgcggt acgtgccggt 240
atcgaagcga ttgtggcccg tcacggccag atcgacattc tggtcaacaa tgcaggaagt 300
gccggtgccc agcgtcgtct ggccgagatt ccactcactg aagctgaatt aggccctggc 360
gccgaagaga cgcttcatgc cagcatcgcc aatttacttg gtatgggatg gcatctgatg 420
cgtattgcgg cacctcatat gccggtagga agtgcggtca tcaatgtctc gaccatcttt 480
tcacgggctg agtactacgg gcggattccg tatgtcaccc ctaaagctgc tcttaatgct 540
ctatctcaac ttgctgcgcg tgagttaggt gcacgtggca tccgcgttaa tacgatcttt 600
cccggcccga ttgaaagtga tcgcatccgt acagtgttcc agcgtatgga tcagctcaag 660
gggcggcccg aaggcgacac agcgcaccat tttttgaaca ccatgcgatt gtgtcgtgcc 720
aacgaccagg gcgcgcttga acgtcggttc ccctccgtcg gtgatgtggc agacgccgct 780
gtctttctgg ccagtgccga atccgccgct ctctccggtg agacgattga ggttacgcac 840
ggaatggagt tgccggcctg cagtgagacc agcctgctgg cccgtactga tctgcgcacg 900
attgatgcca gtggccgcac gacgctcatc tgcgccggcg accagattga agaggtgatg 960
gcgctcaccg gtatgttgcg tacctgtggg agtgaagtga tcatcggctt ccgttcggct 1020
gcggcgctgg cccagttcga gcaggcagtc aatgagagtc ggcggctggc cggcgcagac 1080
tttacgcctc ccattgcctt gccactcgat ccacgcgatc cggcaacaat tgacgctgtc 1140
ttcgattggg ccggcgagaa taccggcggg attcatgcag cggtgattct gcctgctacc 1200
agtcacgaac cggcaccgtg cgtgattgag gttgatgatg agcgggtgct gaattttctg 1260
gccgatgaaa tcaccgggac aattgtgatt gccagtcgcc tggcccgtta ctggcagtcg 1320
caacggctta cccccggcgc acgtgcgcgt gggccgcgtg tcatttttct ctcgaacggt 1380
gccgatcaaa atgggaatgt ttacggacgc attcaaagtg ccgctatcgg tcagctcatt 1440
cgtgtgtggc gtcacgaggc tgaacttgac tatcagcgtg ccagcgccgc cggtgatcat 1500
gtgctgccgc cggtatgggc caatcagatt gtgcgcttcg ctaaccgcag ccttgaaggg 1560
ttagaatttg cctgtgcctg gacagctcaa ttgctccata gtcaacgcca tatcaatgag 1620
attaccctca acatccctgc caacatttaa 1650
<210> 2
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagcgcca ccaccggcgc acgcagtgca tcggtcggat gggcggaaag cctgatcggg 60
ttgcatttgg ggaaagttgc cttgattacc ggtggcagcg ccggtattgg tgggcagatc 120
gggcgcctcc tggctttgag tggcgcgcgc gtgatgctgg cagcccgtga tcggcataag 180
ctcgaacaga tgcaggcgat gatccaatct gagctggctg aggtggggta taccgatgtc 240
gaagatcgcg tccacattgc accgggctgc gatgtgagta gcgaagcgca gcttgcggat 300
cttgttgaac gtaccctgtc agcttttggc accgtcgatt atctgatcaa caacgccggg 360
atcgccggtg tcgaagagat ggttatcgat atgccagttg agggatggcg ccataccctc 420
ttcgccaatc tgatcagcaa ctactcgttg atgcgcaaac tggcgccgtt gatgaaaaaa 480
cagggtagcg gttacatcct taacgtctca tcatactttg gcggtgaaaa agatgcggcc 540
attccctacc ccaaccgtgc cgattacgcc gtctcgaagg ctggtcagcg ggcaatggcc 600
gaagtctttg cgcgcttcct tggcccggag atacagatca atgccattgc gccgggtccg 660
gtcgaaggtg atcgcttgcg cggtaccggt gaacgtcccg gcctctttgc ccgtcgggcg 720
cggctgattt tggagaacaa gcggctgaat gagcttcacg ctgctcttat cgcggctgcg 780
cgcaccgatg agcgatctat gcacgaactg gttgaactgc tcttacccaa tgatgtggcc 840
gcactagagc agaatcccgc agcacctacc gcgttgcgtg aactggcacg acgttttcgc 900
agcgaaggcg atccggcggc atcatcaagc agtgcgctgc tgaaccgttc aattgccgct 960
aaattgctgg ctcgtttgca taatggtggc tatgtgttgc ctgccgacat ctttgcaaac 1020
ctgccaaacc cgcccgatcc cttcttcacc cgagcccaga ttgatcgcga ggctcgcaag 1080
gttcgtgacg gcatcatggg gatgctctac ctgcaacgga tgccgactga gtttgatgtc 1140
gcaatggcca ccgtctatta ccttgccgac cgcgtcgtca gtggtgagac attccaccca 1200
tcaggtggtt tgcgttacga acgcacccct accggtggcg aactcttcgg cttgccctca 1260
ccggaacggc tggcggagct ggtcggaagc acggtctatc tgataggtga acatctgact 1320
gaacacctta acctgcttgc ccgtgcgtac ctcgaacgtt acggggcacg tcaggtagtg 1380
atgattgttg agacagaaac cggggcagag acaatgcgtc gcttgctcca cgatcacgtc 1440
gaggctggtc ggctgatgac tattgtggcc ggtgatcaga tcgaagccgc tatcgaccag 1500
gctatcactc gctacggtcg cccagggccg gtcgtctgta cccccttccg gccactgccg 1560
acggtaccac tggtcgggcg taaagacagt gactggagca cagtgttgag tgaggctgaa 1620
tttgccgagt tgtgcgaaca ccagctcacc caccatttcc gggtagcgcg ctggattgcc 1680
ctgagtgatg gtgcccgcct cgcgctggtc actcccgaaa ctacggctac ctcaactacc 1740
gagcaatttg ctctggctaa cttcatcaaa acgacccttc acgcttttac ggctacgatt 1800
ggtgtcgaga gcgaaagaac tgctcagcgc attctgatca atcaagtcga tctgacccgg 1860
cgtgcgcgtg ccgaagagcc gcgtgatccg cacgagcgtc aacaagaact ggaacgtttt 1920
atcgaggcag tcttgctggt cactgcacca ctcccgcctg aagccgatac ccgttacgcc 1980
gggcggattc atcgcggacg ggcgattacc gtgtaa 2016
<210> 3
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaataatc atttcaagtg tattggcatt gtgggacacc cacggcaccc cactgcactg 60
acaacacatg aaatgctcta ccgctggctg tgcacaaaag gttacgaggt catcgttgag 120
caacaaatcg ctcacgaact gcaactgaag aatgtgaaaa ctggcacgct cgcggagatt 180
gggcaactag ctgatctcgc ggtagtcgtt ggtggcgacg gtaatatgct gggcgcggca 240
cgcacactcg cccgttacga tattaaagtt attggaatca accgtggcaa cctgggtttc 300
ctgactgacc ttgaccccga taacgcccag caacagttag ccgatgtgct ggaaggccac 360
tacatcagcg agaaacgttt tttgctggaa gcgcaagtct gtcagcaaga ttgccagaaa 420
cgcatcagca ccgcgataaa tgaagtggtg cttcatccag gcaaagtggc gcatatgatt 480
gagttcgaag tgtatatcga cgagatcttt gcgttttctc agcgatctga tggactaatt 540
atttcgacgc caacaggctc caccgcctat tccctctctg caggcggtcc tattctgacc 600
ccctctctgg atgcgattac cctggtgccc atgttcccgc atacgttgtc agcacgacca 660
ctggtcataa acagcagcag cacgatccgt ctgcgttttt cgcatcgccg taacgacctg 720
gaaatcagtt gcgacagcca gatagcactg ccgattcagg aaggtgaaga tgtcctgatt 780
cgtcgctgtg attaccatct gaatctgatt catccgaaag attacagtta tttcaacaca 840
ttaagcacca agctcggctg gtcaaaaaaa ttattctaa 879

Claims (6)

1.一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1) 分别克隆mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因、lldA基因；
(2) 构建载体pJQ200SK-mcrC/matA
分别扩增matA 基因编码序列上下游的同源臂matA-up和matA-down，扩增mcrC 基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；
将纯化后的matA-up、mcrC和matA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrC/matA；
(3) 构建载体pJQ200SK-mcrN/lldA
分别扩增lldA 基因编码序列上下游的同源臂lldA-up和lldA-down，扩增mcrN 基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；
将纯化后的lldA-up、mcrN和lldA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrN/lldA；
(4) 构建载体pJQ200SK-yfjB/RPA3450
分别扩增RPA3450基因编码序列上下游的同源臂RPA3450-up和RPA3450-down，扩增yfjB基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；
将纯化后的RPA3450-up、yfjB和RPA3450-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-yfjB/RPA3450；
(5) 将包含pJQ200SK-mcrC/matA质粒的大肠杆菌与沼泽红假单胞菌CGA009（R. palCGA009）进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009-mcrC/matA；
(6) 将包含pJQ200SK-mcrN/lldA质粒的大肠杆菌与所述R. pal CGA009-mcrC/matA进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA；
(7) 将包含pJQ200SK-yfjB/RPA3450质粒的大肠杆菌与所述R. pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450；
(8) 将活化后的R. pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450接种到含有丙二酸盐的培养液中培养，光照培养，最终发酵获得3-羟基丙酸。
2.根据权利要求1所述的利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于：所述步骤（8）中R. pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450按2:100的比例接种到含有丙二酸盐的培养基中。
3.根据权利要求2所述的利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于：所述步骤（8）中在30 ℃、光照条件下低速搅拌培养，当OD660不再增长后，继续培养12-24小时。
4.根据权利要求1所述的利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于：所述YfjB基因来源于大肠杆菌。
5.权利要求1所述合成3-羟基丙酸的方法中获得的重组细胞，其特征在于所述的重组细胞为光合细菌沼泽红假单胞菌R. pal CGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450。
6.权利要求5所述的重组细胞在用于制备化合物或组合物中的应用，其特征在于所述化合物和组合物包括：3-羟基丙酸、异丁醇、异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体和橡胶硫化剂。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113278641B (zh) * 2020-05-27 2022-06-21 安徽华恒生物科技股份有限公司 生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌、其构建方法及其应用
CN114381412B (zh) * 2020-10-20 2023-11-24 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法与应用
CN115948264A (zh) * 2022-01-29 2023-04-11 北京化工大学 产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用
CN115851803A (zh) * 2022-09-30 2023-03-28 厦门大学 一种高产香草醇的光合细菌构建方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567622A (zh) * 2016-03-02 2016-05-11 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用
CN107400652A (zh) * 2017-07-09 2017-11-28 东北林业大学 一种动态调控3‑羟基丙酸合成的工程菌构建方法
CN108070546A (zh) * 2016-11-10 2018-05-25 北京科技大学 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8637286B2 (en) * 2010-02-23 2014-01-28 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567622A (zh) * 2016-03-02 2016-05-11 浙江工业大学 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用
CN108070546A (zh) * 2016-11-10 2018-05-25 北京科技大学 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用
CN107400652A (zh) * 2017-07-09 2017-11-28 东北林业大学 一种动态调控3‑羟基丙酸合成的工程菌构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
3-羟基丙酸途径研究进展;刘冰等;《化学与生物工程》;20070725(第7期);第8-11页 *
A gene cluster encoding malonyl-CoA decarboxylase (MatA), malonyl-CoA synthetase (MatB) and a putative dicarboxylate carrier protein (MatC) in Rhizobium trifolii - Cloning, sequencing, and expression of the enzymes in Escherichia coli;An,JH等;《EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY》;19981031(第257期);第395-402页 *
生物法合成丙烯酸的研究进展;孟青青等;《中国生物工程杂志》;20121015;第32卷(第10期);第119-127页 *

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