CN116970622A - 稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定遗传筛选元件的构建方法，包括先在宿主菌内敲除编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP；然后再导入MazE补充质粒，同时敲除基因组中的基因mazE，即获得所述稳定遗传筛选元件。本发明还提供一种利用上述方法构建的稳定遗传筛选元件。本发明还提供一种生产目的产物的工程菌，包括上述稳定遗传筛选元件，该元件中导入了含有目的基因及mazE基因的质粒。本发明还提供一种上述工程菌在发酵培养中的应用。上述筛选元件及工程菌实现替代抗生素的筛选功能，避免了抗生素添加导致的污染以及成本增加，同时可以稳定传代，达到高效筛选的目的，对生物合成的工业化生产具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生物工程发酵过程中能替代抗生素的稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用。
背景技术
秉承绿色及可持续生产的理念，人们开始利用生物合成化工产品。在生物合成中，结构明确的质粒常被用来调节基因表达，通过不同蛋白酶的组合来生产不同的化工产品。质粒在长期遗传过程中容易丢失，目前人们常用抗生素作为生存压力，以此减少质粒的丢失。利用抗生素虽能保证菌株在传代过程中维持相对稳定的遗传，但是抗生素的添加有以下几方面的缺陷，一是在工业生产中，抗生素的添加增加生产成本；二是在工业发酵中添加抗生素，难以与终产物分离；三是由于工业废水含有抗生素，其排放之后易导致耐药菌株出现；四是抗生素筛选易出现假阳性；五是菌株通过抗性基因合成的物质来破坏抗生素，造成生产能量的浪费进而导致代谢负担。因此，研究生物合成过程中如何减少质粒丢失是生物合成工业化应用的一个重要研究方向。
目前常用的两种替代抗生素的筛选方法，一是染色体整合在基因组上直接调节遗传物质的表达，无需抗生素的参与，但是基因组上的表达强度不足，生产效率低下；二是利用缺陷型互补菌株进行筛选，基于必需基因敲除的缺陷型菌株需在不同表达载体的菌株中重复进行敲除；基于非必需基因敲除的缺陷型菌株需利用特定的培养基，不适合工业化生产。
所以，现有的能替代抗生素的筛选方法仍不能满足生物合成工业化生产的需要。
发明内容
有鉴于此，本发明有必要提供一种生物工程发酵过程中能替代抗生素的高效且稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用。
在宿主菌中的程序性凋亡系统MazE-MazF中，毒素蛋白MazF是一种序列特异性核酸内切酶，通过识别MazF的识别位点：单链mRNA的ACA 序列并进行切割，抑制蛋白质合成；抗毒素蛋白MazE与毒素蛋白MazF 形成复合体，使得MazF蛋白酶活性无法发挥作用。因此，当MazF单独存在时，MazF蛋白酶活性使得大肠杆菌体内很多蛋白质包括必需蛋白质无法合成，导致菌体死亡；当MazE与MazF同时存在时，MazF蛋白酶活性被抑制，宿主菌可以正常生长。本发明基于这一对程序性凋亡系统以及温敏质粒构建了一个能替代抗生素的高效且稳定传代的筛选元件。
具体地，本发明提供一种稳定遗传筛选元件，包括宿主菌，其中，该宿主菌中敲除了编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，还导入了抗毒素MazE温敏补充质粒，同时敲除了所述宿主菌基因组中编码mazE 的基因。
其中，基因clpP是编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因中的一种。
基于上述，所述抗毒素MazE温敏补充质粒为重组质粒pKD46-mazE，且其中的pKD46质粒的非功能基因区有一个XbaI酶切突变位点。其中，重组质粒pKD46-mazE中的pKD46质粒为突变pKD46质粒，其相对于原始的pKD46质粒只改变了一个碱基，优选地，突变pKD46质粒是将原始 pKD46质粒中第5308位的碱基由A突变为G。
所述宿主菌为细菌或真菌，优选为，大肠杆菌、酵母菌或双歧杆菌等。更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌K12系列。
本发明还提供一种上述稳定遗传筛选元件的构建方法，包括：
步骤一、先在所述宿主菌内敲除编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，构建减少MazE降解途径的第一菌株；
步骤二、然后在所述第一菌株中导入抗毒素MazE补充质粒，同时敲除所述宿主菌基因组中的mazE基因，即获得所述稳定遗传筛选元件。
基于上述，所述步骤一包括：利用CRISPER/Cas9系统敲除所述宿主菌中编码抗毒素MazE降解蛋白的基因clpP，使所述宿主菌体内的MazE 蛋白浓度足以中和其中的MazF的毒性作用，构建所述第一菌株。
基于上述，所述步骤二包括：将抗毒素mazE基因构建在具有RED同源重组功能的突变温敏质粒pKD46中，构建重组质粒pKD46-mazE；将所述重组质粒pKD46-mazE转进所述第一菌株，并应用RED同源重组技术以整合的方式敲除所述第一菌株基因组中的mazE基因片段，实现利用含有组成型启动子的mazF基因片段替换所述基因组上的mazE-mazF基因片段，构建所述稳定遗传筛选元件。
本发明还提供一种目的产物工程菌，包括上述稳定遗传筛选元件，该稳定遗传筛选元件中导入了含有目的基因及抗毒素mazE的质粒。
其中，本文中的“目的基因”是指目的产物的生物合成途径中的酶的基因，且含有该目的基因的工程菌经过发酵培养可以直接合成目的产物。
本发明还提供一种上述目的产物工程菌的应用，包括：将所述目的产物工程菌在无抗生素环境中进行发酵培养。
基于上述应用，包括：按照体积比1％～2％的接种量，将所述目的产物工程菌接种到发酵培养基中，在37℃～42℃的条件下进行发酵培养，制得所述目的产物。
基于上述应用，所述发酵培养基包括10～40g/L碳源，1～5g/L酵母粉，0～2g/LMOPS，5～8g/L NaHPO4，0.3～2g/L NaCl，2～5g/L KH2PO4， 1～5g/L NH4Cl，240～250g/LMgSO4，14～15.5g/L CaCl2，溶剂为水，其中，碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的一种或几种的混合。
基于上述，所述目的产物为肌醇、三七素、没食子酸、α-熊果苷、β- 熊果苷或阿魏酸等可生物合成的物质。
因此，本发明提供的上述稳定遗传筛选元件是一株菌株，是通过对菌株中毒素-抗毒素系统的利用，首先敲除抗毒素降解蛋白的合成基因clpP，然后构建一个含有抗毒素的温敏质粒，用来补充基因组上抗毒素敲除之后的抗毒素，然后利用含有组成型启动子的mazF基因片段替换基因组上的 mazEF基因片段，最终成功构建一个能够稳定传代且高效的替代抗生素的筛选系统。
本发明提供的目的产物工程菌通过在稳定遗传筛选元件中导入含有目的基因及抗毒素mazE的质粒来构建；30℃时，该目的产物工程菌体内同时存在含有抗毒素的温敏质粒和目的质粒，该目的产物工程菌可以正常生长；42℃时，温敏质粒停止复制，仅含有抗毒素的目的质粒菌株可正常生长；如此，通过利用上述稳定遗传筛选元件构建的上述目的产物工程菌达到了替代抗生素实现筛选功能的目的。
所以，本发明提供的目的产物工程菌具有以下优点：
1)该目的产物工程菌的生产无需添加抗生素，即在不添加抗生素的状态下进行发酵，但其生产目的产物的产量与抗生素筛选的菌株相当，节约生产成本；
2)该目的产物工程菌因无抗生素添加对终产物无污染，摆脱了应用抗生素筛选对终产物造成的影响；
3)无抗生素添加，工业废水排放之后不易在环境中出现耐药菌株；
4)以大肠杆菌程序性凋亡系统为基础构建的筛选元件具有较强的生存压力，质粒不易丢失，传代更稳定，假阳性低。
因此，本发明提供的上述稳定遗传筛选元件及利用该筛选元件的目的产物工程菌实现替代抗生素的筛选功能，避免了抗生素添加导致的污染以及成本增加，同时可以稳定传代，达到高效筛选的目的，对生物合成的工业化生产具有较大的应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的稳定遗传筛选元件的筛选原理图。
图2是本发明实施例二提供的没食子酸生物合成路径图。
图3是没食子酸利用抗生素和本发明实施例一提供的稳定遗传筛选元件的初代发酵产量对比图。
图4是本发明实施例二提供的生产没食子酸的工程菌传代20代、40 代、60代后，发酵培养24h时没食子酸的产量对比图。
图5是没食子酸的HPLC分析图；其中，图5A是没食子酸的标品HPLC 图，图5B是本发明实施例二提供的生产没食子酸的工程菌放大培养时获得的发酵液的HPLC图。
图6是利用本发明实施例二提供的生产没食子酸的工程菌放大培养时的没食子酸产量图。
其中，在序列表中：
SEQ ID No.1为基因clpP位点sgRNA使用的核苷酸序列。
SEQ ID No.2～3分别为clpP位点sgRNA采用的引物核苷酸序列。
SEQ ID No.4～7分别为构建clpP敲除片段采用的引物核苷酸序列。
SEQ ID No.8～13分别为构建mazE敲除片段采用的引物核苷酸序列。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至在载体中，之后不再赘述。
实施例一
本发明实施例提供一种稳定遗传筛选元件BW3，该稳定遗传筛选元件 BW3是一株基于大肠杆菌的菌株，具体地，其包括大肠杆菌BW，该大肠杆菌BW中敲除了编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因之一clpP，还导入了抗毒素MazE温敏补充质粒，同时敲除了所述宿主菌基因组中编码 mazE的基因。本实施例中采用的大肠杆菌BW为大肠杆菌K12系列 MG1655；所述抗毒素MazE温敏补充质粒中采用突变后的pKD46质粒，该质粒相对于原始pKD46质粒，其第5308位为碱基G；基因clpP的基因序列如NCBI数据库中的Gene ID:945082所示。
本实施例提供的上述稳定遗传筛选元件的构建方法包括以下步骤：
步骤一、先在大肠杆菌BW内敲除编码clpAP的基因，构建减少MazE 降解途径的菌株BW1；
步骤二、然后在菌株BW1中导入抗毒素MazE补充质粒，同时敲除所述宿主菌基因组中的mazE基因，即获得所述稳定遗传筛选元件BW3。
步骤一主要利用CRISPER/Cas9技术敲除编码clpAP的基因之一clpP 基因构建菌株BW1，具体步骤如下：
1.1菌株BW-pCas 9的培养
电转化法将载体pCas 9导入大肠杆菌BW中，在壮观霉素平板上30℃培养20小时筛选阳性克隆转化子命名为BW-pCas 9，挑取平板上所长的 BW-pCas 9单克隆，接种到1.5ul/mL壮观霉素的LB液体培养基中30℃培养。
1.2基因clpP位点sgRNA质粒的构建
(1)基因组中clpP位点sgRNA使用的靶向序列和引物序列分别如SEQ ID No.1～3及表1和表2所示。
表1基因clpP位点sgRNA使用的靶向序列
表2引物序列表
(2)构建基因clpP位点sgRNA质粒
以表2所示的P1/P2为引物，CRISPER系统专用质粒pTarget质粒为模板， PCR获得含有sgRNA的核苷酸序列长度为2200bp，琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，PCR纯化液化学转化法到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在其中重组自连，形成带有氨苄青霉素的pTarget 质粒，即构建的clpP位点的sgRNA质粒。
1.3构建clpP敲除片段
该构建clpP敲除片段的步骤采用的引物序列如SEQ ID No.4～7及表3 所示。
表3引物序列表
以野生大肠杆菌MG1655为模板，P3/P4和P5/P6为引物，PCR扩增得到基因clpP两段同源臂；接着以该两个片段为模板，利用PCR重叠延伸的方法得到一个clpP敲除片段，利用琼脂糖凝胶电泳的方法纯化PCR产物。
1.4构建带有壮观霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株BW’
采用电转化法将上述构建的clpP位点的sgRNA质粒和上述clpP敲除片段导入上述BW Cas 9菌株中，在该BW Cas 9菌体中sgRNA指引cas9蛋白识别整合位点序列对其切割，菌体自身的修复功能使整合片段同源重组替换假义位点，得到带有壮观霉素和氨苄青霉素的基因工程菌株BW’，在相应抗性的平板上30℃培养24小时。
1.5消掉上述基因工程菌株BW’中的sgRNA质粒和pCas质粒以得到不需要抗生素的菌株BW1
(1)消除基因工程菌株BW’中的sgRNA质粒
在带有壮观霉素液体LB中培养上述基因工程菌株BW’，同时加入10 mmol/L的阿拉伯糖，30℃培养24小时，诱导cas9蛋白表达降解sgRNA质粒，得到已消除sgRNA质粒的基因工程菌株BW”。
(2)消除基因工程菌株BW”中的pCas质粒
在42℃于无抗生素液体LB中将上述基因工程菌BW”培养48小时，使其中的温敏型pCas质粒降解，得到mazE降解基因clpP敲除的菌株BW1。
步骤二构建本实施例所述的稳定遗传筛选元件具体包括以下步骤
2.1利用温敏质粒构建抗毒素补充质粒
(1)重组质粒pKD46-mazE
首先，对原始的pKD46质粒进行突变，在pKD46质粒非功能基因区突变出一个XbaI酶切位点，将第5308位由碱基A突变为碱基G，以构建突变pKD46质粒；然后，利用突变的pKD46质粒中的NotI和XbaI两个酶切位点进行切割；随后，利用mazE基因替换该两个酶切位点中的基因片段，最终成功构建质粒pKD46-mazE。
(2)利用RED同源重组以整合的方式敲除mazE
采用电转化法将上述重组载体pKD46-mazE转入上述敲除clpP的菌株 BW1中，在氨苄青霉素的平板上筛选阳性克隆转化子，得到菌株BW2；该菌株BW2于30℃过夜培养，得到一株具有同源重组功能同时又能在基因组中 mazE敲除时补充抗毒素的基因工程菌株。
(3)构建mazE敲除片段
该步骤中采用的引物如SEQ ID No.8～13及表4所示。
表4引物序列表
以野生大肠杆菌MG1655为模板，P7/P8和P11/P12为引物，PCR扩增得到基因mazEF两段同源臂；以人工合成的1x trc启动子为模板，P9 和P10为引物，PCR扩增得到1x trc-mazF片段，接着以上述基因mazEF 两段同源臂和1x trc-mazF片段为模板，利用PCR重叠延伸的方法得到一个mazE基因敲除片段，利用琼脂糖凝胶电泳的方法纯化PCR产物mazE 基因敲除片段。
(4)构建筛选元件BW3
利用电转化将上述mazE基因敲除片段转入菌株BW2中，在电转化时，菌体生长到0.2时，加入1.5g阿拉伯糖诱导上述重组质粒pKD46-mazE中同源重组蛋白发挥作用，转入上述mazE基因敲除片段后，该mazE基因敲除片段中的1x trc-mazF片段将代替基因组上的mazE-mazF片段，以重组的方式达到敲除mazE基因的目的，在氨苄青霉素的平板上筛选阳性克隆转化子，30℃过夜培养，得到本实施例提供的一株mazE基因敲除菌株 BW3，该菌株BW3在30℃以下能存活，即能作为稳定遗传筛选元件。
请参阅图1，本实施例提供的菌株BW3主要通过在突变的温敏质粒 pKD46中表达mazE基因形成pKD46-mazE重组质粒以及敲除基因组中相应的mazE基因来构建，作为筛选载体。筛选时需导入含有目的基因和抗毒素基因的质粒构建目的产物工程菌，30℃时，目的产物工程菌体内同时存在pKD46-mazE重组质粒和目的质粒，目的产物工程菌可以正常生长。42℃时，突变的温敏质粒pKD46停止复制，仅含有mazE的目的质粒菌株可正常生长，如此就达到了筛选的目的。
经过实验验证：菌株BW3经过42℃培养后，kan平板上有菌落长出，而含有氨苄青霉素的平板上未发现菌落生长，表明菌株BW3中pKD46质粒已丢失，故无法在含有氨苄青霉素的平板上生长；pCS27质粒已成功转入菌株中，替代pKD46质粒补充抗毒素蛋白的作用，故卡那霉素平板上存在菌落，表明了含有同样标记基因的质粒能够成功替换温敏质粒。即，42℃时，菌株BW3中的温敏质粒可被目的质粒替换。
实施例二
本实施例提供一种生产没食子酸的工程菌BW5，其包括实施例一提供的菌株BW3，该菌株BW3中导入了用于生产没食子酸的基因和抗毒素mazE的质粒，其中，用于生产没食子酸的基因包括图2所示的途径中的编码的对羟基苯甲酸羟化酶pobA**、3-脱氢莽草酸脱水酶quic和3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶aroG的基因。本实施例中，pobA**源自铜绿假单胞菌，且经过了两个氨基酸位点的突变Y385F/T294A；quiC来自恶臭假单胞菌； aroG源自大肠杆菌。
本实施例提供的上述生产没食子酸的工程菌BW5的构建方法如下：
(1)构建重组质粒pCS-pobA**-quic-aroG
重组质粒pCS-pobA**-quic-aroG的构建方法包括：利用EcoRI和MluI对空质粒pCS进行酶切构建pCS质粒载体；基因pobA**利用EcoRI和BamHI 进行酶切；基因quic利用BamHI和HindIII进行酶切；基因aroG利用HidIII 和MluI进行酶切；通过限制性核酸内切酶的特异性识别将基因pobA**、quic 和aroG与pCS质粒载体连接在一起，通过化学转化法构建上述重组质粒 pCS-pobA**-quic-aroG。
(2)构建替换质粒pCS-pobA**-quic-aroG-mazE
在上述重组质粒pCS-pobA**-quic-aroG多克隆位点利用SacI和BcuI 进行切割，利用mazE基因替换SacI和BcuI这两个酶切位点中间的基因，成功构建重组载体pCS-pobA**-quic-aroG-mazE。
(3)构建生产没食子酸的工程菌BW5
采用电转化法将重组载体pCS-pobA**-quic-aroG-mazE转入实施例一提供的菌株BW3中，在卡那青霉素平板上筛选阳性克隆转化子，37℃过夜培养，即获得了本实施例提供的生产没食子酸的工程菌株BW5。
筛选元件的稳定性及高效性表征试验
(1)构建对照菌株BW4
采用电转化法将重组载体pCS-pobA**-quic-aroG转入野生大肠杆菌 BW中，在卡那青霉素平板上筛选阳性克隆转化子，37℃过夜培养，获得对照菌株BW4。
(2)筛选条件
对照菌株BW4利用抗生素进行筛选；菌株BW5为实验组菌株，利用稳定遗传元件进行筛选。
具体地，将对照菌株BW4的单菌落接到4mL的带有卡那青霉素的液体LB试管中，实验组菌株BW5的单菌落接到4mL的不添加抗生素的液体LB试管中，37℃培养12小时，以体积比2％的接种量将菌液转接到50 mL的发酵摇瓶中，依旧是将菌株BW4转接到含有卡那抗生素的发酵培养基中，菌株BW5转接到不含抗生素的发酵培养基中，在OD600＝0.6时加入 IPTG进行诱导。所述发酵培养基包括15g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、2g/L MOPS、5g/L NaHPO4、1g/LNaCl、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、250mg/L MgSO4和15mg/L CaCl2，发酵温度为37℃，转速为220rpm。
发酵每隔12h取发酵液样直至48h，并采用高效液相色谱(HPLC) 测定目标产物没食子酸的产量，其中初代发酵结果如图3所示，最终产量对比图如图4所示。
从图3中可以看出：在初代发酵中，无抗发酵，抗生素发酵以及利用稳定遗传元件发酵，没食子酸的产量相当。从图4中可以看出：20代时，无抗发酵产量大幅下降，40代时已无法检测到没食子酸的产量，表明了抗生素筛选的必要性；相比于初代发酵，20代，40代以及60代时，利用稳定遗传元件和抗生素进行发酵，虽然产量有所降低，但二者产量相当，表明本发明构建的遗传元件的遗传稳定性相当于抗生素筛选。
(3)工程菌株BW5的放大培养
将保存于-80℃保菌管的菌株BW5适量转接至平板划线，置于37℃培养12h左右。挑选划线的单克隆菌落转接至试管中，置于37℃培养12h 左右，获得试管培养物。将该试管培养物全部转接至摇瓶再次进行活化，置于37℃培养12h左右，获得摇瓶培养物。将该摇瓶培养物按体积比10％的接种量以火焰封口法转接至1L发酵罐中，温度保持在30℃，转速控制在200～800rpm，以蠕动泵补加氨水控制pH在6.5左右，溶解氧控制在 30％，当底糖消耗完时，以蠕动泵流加80％(w/v)的葡萄糖，控制发酵液中残糖量为1～2g/L(使用SBA-40C生物传感分析仪检测发酵液残留葡萄糖)，以紫外分光光度计测量菌株的生物量(OD600)。
1)以从发酵罐中取出的发酵液作为样品，采用高效液相色谱(HPLC) 分析方法对生成产物没食子酸进行检测，检测结果如图5所示。
检测条件如下：
色谱柱：Diamonsil C18，ID 5μm，250×4.6mm；
流动相：有机相为甲醇，流动相为千分之一甲酸水溶液，柱温40℃，流速1mL/min检测波长为270nm。梯度洗脱程序如下表5所示：
表5 HPLC检测梯度洗脱程序
| 时间(min) | 有机相％ | 流动相％ |
| 0 | 5 | 95 |
| 20 | 20 | 80 |
| 22 | 100 | 0 |
| 24 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 95 |
| 30 | 0 | 95 |
取上述发酵液样品1000μL，过滤膜，取过膜后液体采用上述方法进行高效液相色谱分析，分析结果如图5中的图5B所示。采用上述方法取含有没食子酸的标品水溶液进行高效液相色谱分析，分析结果如图5中的图 5A所示，图5A为标品图。从图5A中可以看出：没食子酸的特征峰保留时间为19.954min；从图5B中可以看出在19.897min也有一个特征峰，由此可以判断图5B中保留时间为19.897min的特征峰为没食子酸，因此，本实施例提供的方法可以制备出没食子酸。
2)发酵罐中发酵液取样后用高效液相色谱测定目标产物没食子酸的产量。最终产量对比图如图6所示。
从图6中可以看出利用筛选元件和抗生素分别进行发酵的产量相当，表明本研究中构建的筛选元件确实可以在工业生产替代抗生素。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
序列表：
<110> 北京化工大学
<120> 稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用
<130> 2021.12.8
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> RNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
TCCTAGGTAT AATACTAGTC TGTACATTAA CTCCCCAGGG TTTTAGAGCT AGAAATAGC 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
TCCTAGGTAT AATACTAGTC TGTACATTAA CTCCCCAGGG TTTTAGAGCT AGAAATAGC 59
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
CTAGTATTAT ACCTAGGACT GAGCTAGCT 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
GGCTTCTGCG TACGAAGATC CGAAAG 26
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
TTCCGTCTCC TGGATAAAAT TGAAAAAACC 30
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
TTTTTTCAAT TTTATCCAGG AGACGGAATG CCAGAGGCGC AACTGTG 47
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ACCGCGACCG CCAGCAC 17
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
GTCCGCGTGG TAGCTAATGA TC 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
AACCCTTTCC TCAAACCGCT ATCAT 25
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ATGATAGCGG TTTGAGGAAA GGGTTTTGAC AATTAATCAT CCGGCTCGT 49
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ATCGGGTACG TATCGGCTTA CCATGGTCTG TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCC 53
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ATGGTAAGCC GATACGTACC CG 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
AAAGTCAAAG CGCCCTTCTT CC 22
Claims (10)
1.一种稳定遗传筛选元件，其特征在于：包括宿主菌，且该宿主菌中敲除了编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，还导入了抗毒素MazE温敏补充质粒，同时敲除了所述宿主菌基因组中的基因mazE。
2.根据权利要求1所述的稳定遗传筛选元件，其特征在于：所述抗毒素MazE温敏补充质粒为重组质粒pKD46-mazE，且其中的pKD46质粒的非功能基因区有一个XbaI酶切位点。
3.一种权利要求1或2所述的稳定遗传筛选元件的构建方法，包括：
步骤一、先在宿主菌内敲除编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，构建减少MazE降解途径的第一菌株；
步骤二、然后在所述第一菌株中导入抗毒素MazE补充质粒，同时敲除所述宿主菌基因组中的mazE基因，即获得所述稳定遗传筛选元件。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤一包括利用CRISPER/Cas9系统敲除所述宿主菌中编码抗毒素MazE降解蛋白clpAP的基因clpP，使所述宿主菌体内的MazE蛋白浓度足以中和其中的MazF的毒性作用，构建所述第一菌株。
5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤二包括将抗毒素mazE基因构建在具有RED同源重组功能的突变温敏质粒pKD46中，构建重组质粒pKD46-mazE；将所述重组质粒pKD46-mazE转进所述第一菌株，并应用RED同源重组技术以整合的方式敲除所述第一菌株基因组中的mazE基因片段，实现利用含有组成型启动子的mazF基因片段替换所述基因组上的mazE-mazF基因片段，构建所述稳定遗传筛选元件。
6.一种生产目的产物的工程菌，其特征在于：包括权利要求1或2所述的稳定遗传筛选元件，该稳定遗传筛选元件中导入了含有目的基因及抗毒素mazE基因的质粒。
7.一种权利要求6所述的生产目的产物的工程菌的应用，包括：将所述目的产物工程菌在无抗生素环境中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：它包括按照体积比1%～2%的接种量，将所述目的产物工程菌接种到发酵培养基中，在37℃～42℃的条件下进行发酵培养，制得所述目的产物。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基包括10～40 g/L碳源，1～5 g/L酵母粉，0～2 g/L MOPS，5～8 g/L NaHPO4，0.3～2 g/L NaCl，2～5 g/L KH2PO4，1～5 g/L NH4Cl，240～250 g/L MgSO4，14～15.5 g/LCaCl2，溶剂为水，其中，碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的一种或几种的混合。
10.根据权利要求7或8或9所述的应用，其特征在于：所述目的产物为肌醇、三七素、没食子酸、α-熊果苷、β-熊果苷或阿魏酸等可生物合成的物质。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210430596.3A CN116970622A (zh) | 2022-04-22 | 2022-04-22 | 稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202210430596.3A CN116970622A (zh) | 2022-04-22 | 2022-04-22 | 稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116970622A true CN116970622A (zh) | 2023-10-31 |
Family
ID=88471803
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210430596.3A Pending CN116970622A (zh) | 2022-04-22 | 2022-04-22 | 稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116970622A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117511982A (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-06 | 中国科学院南海海洋研究所 | 内源性接合质粒中成瘾性毒素-抗毒素系统的敲除方法及其应用 |
-
2022
- 2022-04-22 CN CN202210430596.3A patent/CN116970622A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117511982A (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-06 | 中国科学院南海海洋研究所 | 内源性接合质粒中成瘾性毒素-抗毒素系统的敲除方法及其应用 |
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