CN110656078A

CN110656078A - 高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110656078A
Application number: CN201911132091.3A
Authority: CN
Inventors: 郑正高; 吉雅晴; 董春霞; 李荣贵
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-01-07

Abstract

本发明公开了一种高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法及应用，通过将强启动子驱动的efe基因整合到聚球藻PCC 7002的内源质粒pAQ1上，而非染色体或其它质粒上，获得了高产率、高稳定性且生长速度快的产乙烯工程菌，为利用海水培养蓝藻并高效生产乙烯提供了一条途径，在降低培养成本的基础上还能增加乙烯产量。本发明菌利用海洋蓝藻合成乙烯，在开发利用丰富的海洋资源的基础上还能促进乙烯制造产业尽早转型，将产生巨大的经济价值，更能降低现今乙烯传统合成伴随的环境污染。

Description

高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法及应用

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种能高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法和应用，为利用海水培养蓝藻并高效生产乙烯提供了一条途径。

背景技术

乙烯结构简单，但却在农业和工业中起着重要作用，其产量与国民生产生活息息相关。目前最常用的生产乙烯的方式是通过石油裂解制备乙烯，但存在生产成本高、环境不友好等弊端，这为微生物合成乙烯的发展带来契机。

利用微生物合成乙烯具低成本、低能耗、环境友好、易控制等优势。微生物直接合成乙烯的途径分为两条：第一条是大部分细菌采用的2-酮-4-甲基硫代丁酸(KMBA)途径，通过两步反应从蛋氨酸转化而来，蛋氨酸通过转氨作用生成中间产物KMBA，然后KMBA被氧化裂解产生乙烯，而KMBA被氧化的反应是十分低效的。第二条是乙烯合成酶(EFE)途径，主要是一些植物致病菌如丁香假单胞杆菌(Pseudomonas.syringae)采用，三羧酸循环中的中间产物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)在乙烯合成酶(ethylene-forming enzyme，EFE)的作用下直接生成乙烯。由于EFE途径合成乙烯的效率远远高于KMBA途径，所以EFE途径是目前利用微生物直接合成乙烯的主流技术手段。已有研究表明，将丁香假单胞杆菌乙烯合成酶基因(efe)在大肠杆菌(E.coli)中异源表达，可以检测到乙烯的生成，此外，efe基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、木霉(Trichoderma)中都实现了异源表达，并使转化后的工程菌株获得了生产乙烯的能力。

但是与利用大肠杆菌、酵母、木霉等微生物生产乙烯工程菌相比，利用蓝藻生产乙烯具有明显的优势：第一、由于蓝藻生长速率较快，乙烯合成速率较高；第二、蓝藻是光合自养生物，可以将CO₂固定后转化为乙烯，实现了乙烯的绿色合成，并大大降低培养的成本；第三、如若利用海洋蓝藻生产乙烯，可充分利用我国海洋资源，培养基廉价易得，资源友好。

目前在蓝藻中转入efe基因来生产乙烯的方式主要有两种：一种是利用穿梭载体，如1997年Sakai等将efe基因连在一个能在蓝藻中自主复制的质粒，转入淡水蓝藻聚球藻Synechococcus PCC 7942中进行表达，实现了乙烯合成，但是产率较低，并且很不稳定，不能连续培养生产乙烯；第二种利用同源双交换将efe基因整合到蓝藻基因组中进行表达，如2012年Ungerer等将efe基因整合到淡水蓝藻集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803的染色体基因组中，乙烯生产的稳定性大幅提高。

但是目前国内外暂无利用海洋蓝藻合成乙烯的报道，无法利用丰富的海洋资源来实现乙烯的生产。

发明内容

针对目前还没有利用海洋蓝藻生产乙烯的现状，本发明的目的是提供一种高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法和应用，获得能利用海水培养并高效生产乙烯的蓝藻工程菌，在降低培养成本的基础上还能增加乙烯产量。

为实现上述目的，本发明将乙烯合成酶基因(efe)与强启动子通过同源重组整合到海洋蓝藻聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002中的内源质粒pAQ1中，从而构建出一种高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌Q1E。通过测定在海水培养下该工程菌的乙烯产率和生长速度发现，Q1E具有和目前文献报道的淡水蓝藻生产乙烯最高速度相近的乙烯产量，并且连续培养均能稳定生产乙烯，且生长速度与野生型菌株相近，这些结果证明了本发明构建的产乙烯蓝藻工程菌，确实可以在海水培养的条件下达到高效快速稳定生产乙烯的目标。具体的，本发明的技术方案如下：

一种高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建一个整合载体，上面含有聚球藻PCC7002的内源质粒pAQ1的两段同源片段，两段同源片段之间是强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因(efe)的融合片段，可通过同源双交换将强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因(efe)整合到聚球藻PCC7002的内源质粒pAQ1上；

(2)通过基因重组技术将所述整合载体上强启动子及其驱动的efe基因的融合片段整合到聚球藻PCC 7002的内源质粒pAQ1，筛选获得纯合阳性菌株Q1E。

通过测定Q1E在海水培养条件下的乙烯产量以及生长速率，证实该工程菌可以在海水培养的条件下达到高效快速稳定生产乙烯的目标。

上述制备方法中，优选的，所述乙烯合成酶基因(efe)是经过密码子优化的乙烯合成酶基因，其序列如序列表中SEQ ID：13所示。

所述强启动子例如蓝藻强启动子PcpcBA、铜离子诱导的启动子PpetE、强启动子Ptrc、PpsbA等，在本发明的实施例中应用了强启动子PcpcBA，所获得的菌株乙烯产量最高。

上述步骤(1)中，所述整合载体上强启动子及其驱动的efe基因的融合片段位于所述两段同源片段之间。整合载体的结构参见图1中B所示的实施例1构建的整合载体Q1EFE，两段同源片段FlanKA和FlanKB的序列分别如序列表中SEQ ID：14和15所示。为便于筛选，在两段同源片段之间还含有选择标记基因，可以是抗性标记基因，例如红霉素抗性基因(Em)、卡那霉素抗性基因(Kan)、链霉素抗性基因(Sm)等。

所述整合载体上不含有在聚球藻PCC7002内的复制起点，不能在聚球藻PCC7002内复制扩增。

步骤(1)可以通过PCR扩增和内切酶酶切连接的方式将强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因(efe)的融合片段、选择标记基因以及聚球藻PCC7002内源质粒pAQ1的两段同源片段连入载体中，构建整合载体。

步骤(2)将步骤(1)构建的整合载体转入野生型聚球藻PCC 7002，所述整合载体与内源质粒pAQ1发生同源双交换，将整合载体中强启动子及其驱动的efe基因和选择标记基因整合到内源质粒pAQ1上。通过连续划线传代培养得到纯合阳性菌株Q1E。

本发明提供了一种能在海水中高效生产乙烯的海洋蓝藻聚球藻PCC 7002工程菌的制备方法和应用，创造性的将强启动子驱动的efe基因整合到聚球藻PCC 7002的内源质粒pAQ1上(其拷贝数是染色体数目的约8倍)，而非染色体或其它质粒上，获得了高产率、高稳定性且生长速度快的产乙烯工程菌，为利用海水培养蓝藻并高效生产乙烯提供了一条途径。而利用海洋蓝藻合成乙烯，在开发利用我国丰富的海洋资源的基础上还能促进乙烯制造产业尽早转型，研究成果将产生巨大的经济价值，更能降低现今乙烯传统合成伴随的环境污染。

附图说明

图1.整合载体Q1EFE与野生型聚球藻PCC 7002基因组进行同源双交换的示意图。

图2.PCR鉴定纯合阳性产乙烯蓝藻工程菌株Q1E的凝胶电泳结果图。

图3.利用气相色谱测定产乙烯蓝藻工程菌Q1E在生长期的乙烯特征峰出峰结果(A)和乙烯产率图(B)。

图4.产乙烯蓝藻工程菌Q1E和野生型菌株的生长速度曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

大肠杆菌HB101：购自takara公司，产品目录号：D9051。蓝细菌Synechococcussp.PCC7002(2003年6月由美国宾夕法尼亚州立大学生化和分子生物系Donald A.Bryant教授赠送，其来源于法国巴黎的巴斯德研究所蓝藻保藏库(Pasteur Culture Collection)，1962年由C.Van Baalen在海洋污垢中分离得到)及本发明构建的衍生突变体，生长于A⁺液体或者固体培养基中。A⁺固体培养基：在A⁺液体培养基中加入琼脂，使其终浓度为1.2％(质量百分含量)。液体培养时，以照明日光灯光源，光强为100uE/m²·s，温度30℃，并通以含1％CO₂(v/v)的空气。

实验用的大肠杆菌菌株DH5α生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度分别为：100μg/mL Amp⁺，50μg/mL Kan⁺。实验所用其他原始质粒pet-15b、PUC-19、pGEM-7zf均购买于生物技术公司，常见于市面。

其中Trace metal mix含有如下组分：

实施例1、整合载体的构建和阳性工程菌株的筛选

(1)整合载体Q1EFE的构建

整合载体Q1EFE的结构如图1中B所示，其中FlankA和FlankB分别表示聚球藻PCC7002内源质粒pAQ1上的同源片段(参见图中1中A)。以野生型聚球藻PCC 7002基因组总DNA为模板，利用引物对P1/P2、P3/P4(引物序列见表1)分别扩增出FlanKA和FlanKB片段，利用引物对P5/P6、P7/P8分别扩增出PcpcBA和efe片段，用引物对P9/P10扩增出红霉素抗性基因片段Em；然后将FlanKA、Em、FlanKB三个片段同时用XhoⅠ、BGⅡ酶切回收连接，以最终回收产物作为模版，以P1/P4扩增出FlanKA-Em-FlanKB这约2kb的片段，然后用SphⅠ和PstⅠ酶切连入pGEX-7zf质粒得到中间质粒Q1-1；将PcpcBA和efe两个片段同时用NdeⅠ酶切回收连接，以最终回收产物作为模版，以P5/P8扩增出PcpcBA-efe这约1.7kb的片段，然后用XhoⅠ和NotⅠ酶切连入中间质粒Q1-1得到整合载体Q1EFE。

(2)阳性菌株的筛选和PCR验证其为纯合菌株

将整合载体Q1EFE通过转化入野生型聚球藻PCC 7002，整合载体Q1EFE与基因组发生同源双交换，如图1中C所示，通过同源双交换将整合载体中PcpcBA-efe-Em片段转入聚球藻PCC 7002的内源质粒pAQ1内。

聚球藻PCC 7002转化的方法如下：

取培养的600μL聚球藻PCC 7002(OD_730nm值为0.8)，6000r/min离心2min，弃400μL上清液，加入制备好的质粒10μL，轻轻混匀，遮光静置4-8小时。将藻液均匀涂在A+固体培养基上，静置12-14小时，倒Top agar(5mL Top agar包含红霉素5μL(10mg/mL))。静置培养15天左右。

从A⁺固体培养基上挑选出单菌落，继续在已加入红霉素抗性的A+固体培养基上培养，连续划线传代使得突变体纯合。利用引物对P11和P12对阳性菌株进行PCR鉴定(鉴定结果见图2，野生型PCR条带705bp，突变体PCR条带大小3477bp)，鉴定结果表明，阳性菌株已经完全看不到野生菌的特异条带，即阳性菌株Q1E已经纯合。

实施例2、利用气相色谱来检测阳性工程菌在海水培养条件下乙烯的产率

将野生型聚球藻PCC7002和阳性纯合菌株Q1E在抽滤除菌后的海水中进行培养，分别取不同生长时期的藻样，通过气相色谱去测定乙烯的产量。测定方法：取1mL的藻加入22.5mL的玻璃瓶中，同时放入磁力转子，用橡胶塞密封玻璃瓶，置于光下照射1个小时，期间持续低速搅拌(10～20rpm/min)；用微量进样器取100μL气体样品注入气气相色谱(采用Agilent Technologies，Eclipse×DB-C18 5-μm色谱柱4.6×150mm)，所使用的柱料是氧化铝，其气相色谱分析参数是：进样器温度：100℃；柱温：45℃；气流速度：20mL/min；进样气体：氩气；和乙烯标准品比对，乙烯出峰时间约为2.9～3.0分钟。

气相色谱的出峰结果如图3中A所示，野生型聚球藻PCC7002没有乙烯特征峰，而不同生长时期的Q1E和乙烯标准品都在3.0分钟左右出现了乙烯的特征峰。通过比对100μL乙烯标准品的特征峰面积，我们测定了各种生长时期下Q1E的乙烯产率，结果见图3中B所示，发现在OD₇₃₀达到2.4时，乙烯的产率最高，达到4205μL L^-1h^-1，这是首次得到能利用海水培养高效生产乙烯的蓝藻工程菌。

并且在用海水连续培养2个月后，乙烯的产率还能保持在相同的水平，也证明了Q1E具有稳定的乙烯生产能力。

实施例3、测定产乙烯蓝藻工程菌Q1E在海水培养条件下的生长速率

我们还测定了野生型聚球藻PCC7002和阳性纯合菌株Q1E的生长速率，见图4，结果发现野生型聚球藻PCC7002的代时为4.4小时，而Q1E的代时为4.9小时，说明Q1E工程菌几乎有着和野生型聚球藻PCC7002一样快的生长速度。

综上，我们成功构建了一种可利用海水培养高效稳定生产乙烯且生长速度很快的蓝藻工程菌。

表1本发明所用的引物序列

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法及应用

<130> WX2019-99-001

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaacgcatgc ggggttttct cgtgtttagg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatcctcgag ctttctctta tgcacagatg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaacagatct cctcctgaat aaatctattt 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatcctgcag ctcaccaaag attcacctgt 30

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaacctcgag gttataaaat aaacttaaca aatc 34

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatccatatg gaattaatct cctacttgac 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaccatatg atgaccaatt tgcaaacttt 30

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatcgcggcc gcttatttat catcatcatc tt 32

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaacctcgag gatcgaaggc ggccgccgcg tgctataatt atacta 46

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatcagatct ctcatgtttg acagcttatc 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctcgctgat tttaaattct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catccatcag ttcttaaaac 20

<210> 13

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgaccaatt tgcaaacttt tgaattaccc accgaagtga ctggctgtgc cgctgatatt 60

tccttaggtc gcgccctgat tcaagcctgg cagaaagacg gcatttttca aattaaaacc 120

gatagtgaac aagaccgtaa aactcaagaa gctatggccg ctagcaaaca gttttgtaaa 180

gaacccttga cctttaaatc cagttgcgtg agcgatttaa cttattctgg ctacgtggcc 240

tccggtgaag aagttaccgc tgggaaaccc gactttcccg aaatttttac cgtgtgtaaa 300

gatttatccg tgggcgacca acgggttaaa gctggatggc cctgtcatgg ccccgttccc 360

tggcccaaca acacctacca gaaaagtatg aaaactttta tggaagaatt ggggttagcc 420

ggagaacgct tgttaaaact gaccgctttg gggtttgaac tgcccattaa tacctttact 480

gatttgaccc gtgacggatg gcatcacatg cgcgtgttac gttttccccc ccaaacctcc 540

actctgagtc ggggcattgg tgcccatacc gattatggtc tgttggtgat tgccgctcag 600

gatgacgttg gcggtctgta cattcgtccc cccgtggaag gggaaaaacg gaatcgcaac 660

tggttgcccg gcgaaagctc tgccggcatg tttgaacatg acgaaccctg gacctttgtt 720

acccccactc ccggggtgtg gaccgttttt cccggagata ttctgcaatt tatgaccggg 780

ggacagttac tgtccactcc ccataaagtg aaattgaata cccgtgaacg gtttgcctgt 840

gcttattttc acgaacccaa ctttgaagcc tctgcttacc ccttgtttga accctccgcc 900

aatgaacgga ttcattatgg cgaacacttt accaacatgt ttatgcggtg ctaccccgat 960

cgcattacca ctcaacgtat taacaaagaa aaccggttag cccatctgga agatttgaaa 1020

aaatacagtg acacccgcgc tactggtagc gattacaaag atcatgatgg cgattacaaa 1080

gatcacgaca tcgattacaa agatgatgat gataaataa 1119

<210> 14

<211> 518

<212> DNA

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 14

ggggttttct cgtgtttagg cagcatcttg atccgcctca tcattgttat agacttcgag 60

caaatctcgt aaaacaagct cccggatata gtcgctgaaa tttaagcctt gctcattggc 120

ttttttagta gccgcgctgt acatgagtgg gggaaaacga accgcgctcg ctgattttaa 180

attcttattc ggtctagtcg tcatgggatc gcctaagaaa gtctctatca ttttacagta 240

tccaaaagat ttgacacccc cattcatggt ggtatttttt cttttccttt tccccatagc 300

actgtggcta gcaataaagc tatgggcgat ccctacattt attctgtagc accaacgcta 360

cagcccctta atttcctgtg gataaacagt gtggaaattg agaagaacac atgagaattt 420

gtccagtttt attttgatgg ttattttttg cggttgcttt ttaagggaat tgtgcgtgtg 480

gtttccagtc cccatctgtg cataagagaa aggaattc 518

<210> 15

<211> 389

<212> DNA

<213> Synechococcus PCC7002

<400> 15

gtcgacgcct cctgaataaa tctatttata caggggttgg acacggcccc taattttgct 60

tggtcacgct gtaaccaatg agcaaagacc ttttcgcgct gatcgttagg ggcgatcgcc 120

tcatagaccc gctgacggtt atcccgcgat ccaaagcgcc ccttgtattc caatttccgg 180

tcaaccttgc ctaggagcgc ctgagcaatt tcgagcgggc tcattttgtc ggtgatcgtt 240

ctgccaagaa tccacttgat cggcttggca taccgcaaac aattttcctt gaacccttca 300

aggctcgccc cggtgaatgt cacccctggt tttaagaact gatggatgtt gagtagctct 360

aacaggtgaa tctttggtga gaggcatgc 389

Claims

1.一种高效生产乙烯的海洋蓝藻工程菌的制备方法，包括以下步骤：

1)构建了一个整合载体，上面含有聚球藻PCC7002的内源质粒pAQ1的两段同源片段，在两段同源片段之间是强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因的融合片段；

2)通过基因重组技术将所述整合载体上强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因的融合片段整合到聚球藻PCC 7002的内源质粒pAQ1，筛选获得纯合阳性菌株Q1E。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙烯合成酶基因是经过密码子优化的乙烯合成酶基因，其序列如序列表中SEQ ID：13所示。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述强启动子是蓝藻强启动子PcpcBA、铜离子诱导的启动子PpetE或者强启动子Ptrc或PpsbA。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述两段同源片段是FlanKA和FlanKB，序列分别如序列表中SEQ ID：14和15所示。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述整合载体上，在两段同源片段之间还含有选择标记基因。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述选择标记基因是抗性标记基因。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)通过PCR扩增和内切酶酶切连接的方式将强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因的融合片段、选择标记基因以及聚球藻PCC7002内源质粒pAQ1的两段同源片段连入载体中，构建整合载体。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)将步骤)构建的整合载体转入野生型聚球藻PCC 7002，所述整合载体与内源质粒pAQ1发生同源双交换，将整合载体中强启动子及其驱动的乙烯合成酶基因和选择标记基因整合到内源质粒pAQ1上。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)通过连续划线传代培养得到纯合阳性菌株Q1E。