CN102242065A - 一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种蓝藻工程菌及其制备方法和应用。所述蓝藻工程菌为cesA基因缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的质粒或基因组上整合有木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7个纤维素合成相关基因cmcase、ccp、acsA、acsB、acsC、acsD、bglxA；所述7个基因由蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子PcpcBA来启动表达。该工程菌纤维素含量占细胞壁干重的13％左右，同时，该蓝藻工程菌生产纤维素的生长周期短，而且不存在木材中的木质素的污染问题，其提取和纯化过程可以大大简化，并且对环境的污染程度也可以相应的大大减少，是一种理想的生产纤维素的生物工程菌，进而作为生产生物乙醇的原料。

Description

一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纤维素高产的蓝藻工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
近年来受能源危机的影响，世界各国都在积极探索各种形式的新能源，以此替代有限的化石能源(煤，石油，天然气)。生物能源作为新能源的代表，正在发挥着越来越大的作用。目前生物能源主要包含生物乙醇，生物柴油，生物气体三大类。乙醇不仅是一种重要的化工原料，同时也是一种高效低污染的石油替代型能源，所以其重要性不言而喻。现有的乙醇生产平台主要依靠淀粉和糖类物质以及玉米杆和麦秆等纤维素材质的发酵与分解。例如美国近年来利用玉米大量生产乙醇，而巴西凭借其地理位置的优势大面积耕种甘蔗进而分解为乙醇，使其以燃料乙醇为代表的生物能源产业的发展受到了全世界瞩目。
尽管美国具有玉米生产乙醇的技术平台优势，但这严重占用了现有耕地，与食物的供应产生了冲突；而巴西有地理位置的优势，可以大面积耕种甘蔗，但这种策略并不适用于其他不具备此地理环境的国家。而最为传统的依靠降解玉米杆和麦秆等植物的纤维素以生产乙醇的方式，因为其中大量木质素难以被去除，导致生产过程具有低效率，高能耗和高污染的缺点。因此需要寻求技术上的突破来探索其他生产乙醇的方式，一方面不占用耕地，另一方面降低生产成本，同时还应当减少环境的污染。
蓝藻作为一种能够光合自养的微生物，其低廉的培养成本，高效的生长速率以及特殊的细胞结构，为其作为产生生物能源的工程菌提供了很大潜力。而木醋杆菌Gluconacetobacterxylinum ATCC 53582是一种可以天然向胞外分泌结晶型纤维素(I型)的细菌。其分泌的纤维素已经广泛应用于医疗，食品，制造业等各个领域。但培养木醋杆菌的高额成本和生长过程中产生的次级代谢物以及废弃物对环境的污染，使其不适于进行大规模的培养生产。若单纯用其分泌的纤维素降解为乙醇作为能源，这样需要更高昂的代价。
发明内容
本发明旨在提供一种纤维素高产、培养成本低的蓝藻工程菌。
本发明提供的技术方案如下：
1.一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述工程菌为cesA基因(SEQ ID NO：1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的质粒或基因组上整合并表达木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7个连续的纤维素合成相关基因cmcase(SEQID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)、bglxA(SEQ ID NO：10)；
2.如方案1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因由蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：11)或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)来启动表达。
3.如方案1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因整合到蓝藻的质粒为pAQ1、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6、pAQ7之一上，或整合到蓝藻基因组上。
4.方案1所述蓝藻工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002自身的纤维素合成基因cesA(SEQ ID NO：1)敲除或破坏，得到蓝藻突变体；
2)构建Q1载体，所述载体上含有红霉素抗性基因(Em)，载体序列中含有2段与蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的质粒pAQ1同源的DNA区域，分别是图4中的5’Homologous Region(SEQ ID NO：13)和3’Homologous Region(SEQ ID NO：14)；
3)将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582基因组中的连续7个纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)和bglxA(SEQID NO：10)进行PCR扩增，得到长度约14.5Kb的片段，将所述片段连到上一步构建的Q1载体上，这7个连续基因的表达均受控于连在Q1载体上的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：11)或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)(图4)；
4)将上一步得到的Q1载体转化至第1)步产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的蓝藻工程菌。
5.如方案4所述的制备方法，其特征在于，第1)步中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。
6.一种生产纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)用方案4所述的方法制备出蓝藻工程菌；
b)将所得的工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使工程菌生长到OD值达到1.0～2.0；
c)将所述工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BG11中约2周；
d)从所述工程菌提取纤维素。
7.如方案6所述的生产纤维素的方法，其特征在于，在所述A+培养基和BG11培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98％～99％，CO2占1％～2％；培养过程始终保证温度25℃～35℃，光照强度30μE/m2s～300μE/m2s。
8.方案1所述蓝藻工程菌在生产纤维素方面的应用。
9.如方案8所述应用，其特征在于，所述纤维素用于生产乙醇，进而用作生物能源。
经检测，野生型蓝藻Synechococcus sp.PCC 7002的纤维素含量占细胞壁干重的质量百分比约为2％，而本发明构建的蓝藻工程菌，纤维素含量可以达到自身细胞壁干重的约13％，同时，该蓝藻工程菌生产纤维素的生长周期短(总共约3周时间)，而且不存在木材中的木质素的污染问题，其提取和纯化过程可以大大简化，并且对环境的污染程度也可以相应的大大减少，是一种理想的生产纤维素的生物工程菌。
附图说明
图1(a)野生型Synechococcus sp.PCC 7002；(b)Synechococcus sp.PCC 7002cesA缺失突变体。
图2(a)野生型Synechococcus sp.PCC 7002；(b)Synechococcus sp.PCC 7002蓝藻工程菌。
图3实施例的葡萄糖标准曲线。
图4本发明构建的Q1载体质粒图。
具体实施方式
1.首先，通过生物学中常用的“同源双交换”的方法将蓝藻Synechococcus sp.PCC 7002自身的纤维素合成基因cesA(SEQ ID NO：1)敲除(同源双交换，也就是在需要敲除的目的基因5’和3’两端各选取一段长度适宜的DNA片段，一般从400bp至3Kb均可。在这两个片段的中间连入一个卡那霉素抗性基因，再将连好的这三个片段一同插入一个无法在蓝藻中复制的载体上，将载体转入蓝藻，在卡那霉素的筛选作用下迫使蓝藻基因组上产生同源双交换，使目的基因被抗生素基因所替代，从而达到目的基因的敲除。基因敲除后，原先的cesA基因缺失，而完全被卡那霉素抗性基因所替代。此外，采用将卡那霉素抗性基因插入cesA，而非将此基因完全敲除的方法，同样也可以使这个基因失去功能。本实验采用同源双交换，选取了cesA基因上下游各1Kb的片段作为同源交换区，上游片段序列见SEQ ID NO：2，下游片段序列见SEQ ID NO：3)，cesA基因的功能丧失导致蓝藻细胞壁中起到结构交联作用的纤维素成分减少，通过超薄切片透射电子显微镜，能够观察到蓝藻Synechococcus sp.PCC 7002自身cesA缺失突变体的细胞壁肽聚糖层被严重破坏。若将此突变体培养在低盐浓度的BG11淡水培养基中，通过扫描电子显微镜能够观察到其细胞拉长，同时细胞表面凹凸不平，说明此突变体的细胞壁已经十分脆弱(见图1，(a)野生型Synechococcus sp.PCC 7002，细胞有较为规整的结构和平滑的表面；(b)Synechococcus sp.PCC 7002cesA缺失突变体，细胞有拉长，变小等形态变化，表面也极其凹凸不平)。
2.接下来，将木醋杆菌Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582基因组中的连续7个纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)，ccp(SEQ ID NO：5)，acsA(SEQ ID NO：6)，acsB(SEQ ID NO：7)，acsC(SEQ ID NO：8)，acsD(SEQ ID NO：9)，bglxA(SEQ ID NO：10)进行PCR扩增，得到包含上述7个基因的长度约14.5Kb的片段，将所述片段连到自主构建的Q1载体上(Q1载体的构建起始于一个无法在蓝藻Synechococcus sp.PCC 7002中自主复制的质粒，其上连接了2段与Synechococcus sp.PCC 7002自身质粒pAQ1同源的DNA区域，分别是图4中的5’Homologous Region(SEQ ID NO：13)和3’Homologous Region(SEQ IDNO：14)。这两段同源区域中间是Synechococcus sp. PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQID NO：11)或Synechocystis sp.PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)以及上述7个连续的纤维素合成相关基因，以及一个红霉素抗性基因与其自身启动子。这7个纤维素合成相关基因的表达都受控于PcpcBA启动子。通过同源双交换作用，Q1载体两段同源区域中间的PcpcBA启动子，7个纤维素合成相关基因以及Em抗性基因都会被整合至蓝藻自身pAQ1质粒上，使得外源引入的基因大量表达。此外，发明人也尝试将外源质粒通过同源单交换的方法整合到Synechococcus sp.PCC 7002的自身pAQ1中，也可以使得14.5Kb上的基因大量表达。如果通过同源双交换或者同源单交换的方式，将14.5Kb的片段整合到Synechococcus sp.PCC 7002自身的其他质粒，如pAQ3，或pAQ4，或pAQ5，或pAQ6，或pAQ7，或者基因组上，也都可以得到相近的结果。选用蓝藻Synechococcus sp. PCC 7002或Synechocystis sp.PCC 6803的cpcBA基因的启动子PcpcBA(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12)来启动外源这7个基因的表达。将此特定质粒转化至自身cesA基因缺失的蓝藻Synechococcus sp.PCC 7002突变体，将此突变体培养在A+培养基中，使藻体生长到OD值为1.0～2.0(培养基中加入终浓度100μg/ml的卡那霉素和终浓度25μg/ml的红霉素作为选择性压力，生长温度范围可以从25℃～35℃，光照强度可以从30μE/m2s～300μE/m2s，培养过程中始终吹气培养，气体成分为空气占98％～99％，CO2占1％～2％)。此时，部分藻体已经具有了纤维素的少量分泌。培养时间大约需要1周左右。
3.最后，把在A+培养基中生长了1周的蓝藻工程菌离心收集(离心时采用无菌的离心杯，转数为5,000～6,000rpm)，再转移到淡水培养基BG11中继续培养(BG11加入终浓度4μg/L左右的VB12，同时加入终浓度100μg/ml的卡那霉素和终浓度25μg/ml的红霉素作为选择性压力，生长温度范围可以从25℃～35℃，光照强度可以从30μE/m2s～300μE/m2s，培养过程中始终吹气培养，气体成分为空气占98％～99％，CO2占1％～2％)。淡水培养基中的低盐环境导致细胞壁因为渗透压的改变而变脆弱，进一步刺激了纤维素的分泌。又经过大约2周时间，几乎所有藻体的表面都有纤维素的包裹以及穿透。由于纤维素大量分泌对蓝藻本身的生长产生了影响，所以两周后蓝藻细胞会由绿色变为白色。这是纤维素大量分泌的体现(图2，(a)野生型Synechococcus sp.PCC 7002，细胞表面平滑，没有纤维素的分泌；(b)Synechococcus sp.PCC 7002蓝藻工程菌，大量纤维素穿透并包裹了细胞体)。
4.纤维素含量的检测
采用生化中经典的“硫酸蒽酮法”检测纤维素的含量。具体步骤为，首先称取5mg左右已经提取完成的Synechococcus sp.PCC 7002野生型和本发明构造的纤维素工程菌细胞壁材料(干重而非湿重)，用72％的硫酸1.5ml在室温将细胞壁中的纤维素降解2小时，使纤维素充分变为葡萄糖。离心将杂质沉淀后分别取上清液500μL。然后分别配制10，20，30，40，50，60，100μg/μL的葡萄糖溶液用于做标准曲线，每种浓度的溶液各取样500μL。所有样品中各加入1ml新鲜配制的硫酸蒽酮溶液(即纯硫酸中加入0.2％的蒽酮)，沸水浴15分钟，冰上冷却10分钟，室温放置10分钟，然后用紫外分光光度计测定在620nm波长处的紫外吸收值，通过标准曲线可以推算出目标样品中的葡萄糖含量，也就是纤维素的含量，由此计算出纤维素占细胞壁的质量百分比。
葡萄糖标准曲线如图3。
经过计算，野生型Synechococcus sp.PCC 7002纤维素约占细胞壁2％，而本发明的蓝藻工程菌纤维素含量约占细胞壁的13％左右(均为干重而非湿重)。
5.培养基配方
BG11培养基配方如下：
 NaNO3   1.5g
 K2HPO4   0.04g
 MgSO4·7H2O   0.075g
 CaCl2·2H2O   0.036g
 Citric acid   0.006g
 Ferric ammonium citrate   0.006g
 EDTA(disodium salt)   0.001g
 NaCO3   0.02g
 Trace metal mix A5   1.0ml
 Aga r(if needed)   10.0g
 Distilled water   1.0L
灭菌后PH值应调至7.1。
其中微量元素母液A5：
 H3BO3   2.86g
 MnCl2·4H2O   1.81g
 ZnSO4·7H2O   0.222g
 NaMoO4·2H2O   0.39g
 CuSO4·5H2O   0.079g
 Co(NO3)2·6H2O   49.4mg
 Distilled water   1.0L
A+培养基配方：
Figure BDA0000070305810000041
Figure BDA0000070305810000051
标“*”的为事先单独灭菌然后在超净台加的组分
固体A+培养基制备方法：
与LB和Bg11固体培养基只需在液体中添加Agar粉不同，固体A+培养基的制备流程比较复杂。这是因为A+培养基的盐浓度很高有关，如果在A+中直接加Agar粉灭菌，会导致炭化，培养基将呈黄色或黑色，产生有毒物质而使蓝藻无法正常生长。因此，在配制时，先分别配成2×的A+和Agar粉溶液(3％)，灭菌后凉至可倒板时再混匀，然后按比例加入须后加的几个组分及抗生素，混匀后倒板。
序列表
<110>北京大学
<120>一种蓝藻工程菌及其制备方法和应用
<130>
<160>14
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>2367
<212>DNA
<213>蓝藻(Synechococcus sp.PCC 7002)cesA
<400>1
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tgccgaaaat aaaaaattat acttatgctc gttgacagac caagtaagta tgatttttga    300
gctaacaaag atggatcgta tttttactac ctttaaagat cgtgatgaat ttaataggaa    360
agtgattgaa gcttctgagg catagtatgt ttgtcttctt gagcttggtt tgttattggt    420
gattgctgct aaaaaaatca tgataggtag ggcttttaag cagagtatat cgagcagcaa    480
caagactgaa tcaagagttc caattacata ttttatcctg aaatttttct tgtctatttt    540
atagagtgtg acttcttgac agacggaagt taaaggagta ttgaaacatg attttgcttc    600
tcatccatta ctaaaattct tttttactac tttttgatca gcttgatttt agttgtgctt    660
gagtctcctt cgtgtgcatc gctattggag attatgggca tcattgcacc caaaatagac    720
aggaaaaaac ctaaagaagt taaaaagatt acatttcccc aatgatcccc gcgctaggtt    780
agcaataccc tccgattgct tatcaagcta gaccgtcctc acccagtggc ggttttttat    840
tgcccaaggg ctggcccccc cgaccggaaa attaaggcac aatagttaaa cgttgcccgc    900
cctcaccttt tatttctcca tgagtcagcc ccacatcgtc attatcggcg gcggtttcgc    960
cggactctat acggcgctcc gtctgttgca atttccctgg                         1000
<210>4
<211>1029
<212>DNA
<213>木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582)cmcase
<400>4
atgtcggtca tggcggcgat gggaggggcg caggtgcttt catccaccgg tgcgttcgca     60
gacaccgccc ccgatgcggt cgcgcagcaa tgggccatct tccgcgccaa gtatcttcgt    120
cccagcggac gtgtcgtgga tacgggcaat ggtggcgaat cccatagtga ggggcagggc    180
tatggcatgc tctttgccgc gtcggcgggg gaccttgcgt cgttccagtc gatgtggatg    240
tgggcgcgca ccaacctgca gcataccaat gacaagctgt tttcctggcg gttcctcaag    300
gggcatcagc ccccggtgcc cgacaagaac aatgccacag atggcgacct gctgatcgcg    360
cttgcgcttg gtcgtgcggg caagcgtttc cagcgccccg attacattca ggacgccatg    420
gccatttatg gcgatgtgct gaacctgatg acgatgaagg cgggaccgta tgtcgtcctc    480
atgcccggtg ctgtcggctt taccaagaag gacagcgtga tcctcaacct gtcctattac    540
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cgcttttcct atgatgcgat tcgggtgccg ctttattttt attgggcgca tatgctggcg    780
ccgaacgtgt tggctgattt cacccgattc tggaataatt tcggggctaa tgccctgcca    840
ggatgggttg atctgacaac aggggcgcgt tcgccgtaca acgccccgcc tggatatctt    900
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ataaagtga                                                           1029
<210>5
<211>1062
<212>DNA
<213>木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582)ccp
<400>5
gtgagtgctt cagggtctga tgaggtggct gggggagggc aggctggaag tccgcaggat     60
tttcagcggg tcctgcgttc ttttggtgtc gaaggtgggc agtattccta ccggccgttt    120
gttgaccgtt cctttgatgt gacaggcgtg cccgaggctg ttgaaaggca cttcgatcag    180
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<210>6
<211>2172
<212>DNA
<213>木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582)acsA
<400>6
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<211>2727
<212>DNA
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<400>7
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ccctctgacc agcttgtgac gtccgcgcgc cttgtgctgt cgggttcgat gtcgcccaac    720
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atcacgaacg atacgctgtg ggccacgatc tcgcagaact cgcagcttca gatcacgaca    960
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<212>DNA
<213>木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582)acsC
<400>8
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gcacaggatg ggctgatccg tctggtcaag gccaatcctt ccgatttccg ggcgcaactg    660
gcgcttgcac aggtcctgac ctatcagccc ggcacccgga tggaggggct gcagcggctt    720
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gcgggactgt cgccggatga ctattccccg gccatccgca ccattgccga tgaaatggcg    1800
atcaaggccg atctggccag ccgcctttcg atggtttcga atcccacgcc gcttgtgcgc    1860
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ccgcagaccg ggtatgatat accgcgtttc ggcaccaatc tgttcgcgct ggaacggaac    3000
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gcaggtgtgg cgcctgatgt ccgctttgcc aataactggg tcagtgccga tgtcggtgcc    3120
tcgcctctgg gctttacgct gccgaacgtg atcggtggtg ttgaattcgc cccgcgtgtc    3180
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<210>9
<211>471
<212>DNA
<213>木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582)acsD
<400>9
atgacaattt ttgagaaaaa accggatttc accctgtttc ttcagaccct gtcatgggaa     60
attgatgatc aggtcgggat cgaggttagg aacgagctcc tgcgtgaggt cggacggggc    120
atgggcacgc gcatcatgcc gccgccgtgc cagaccgtgg acaagctgca gatcgaactg    180
aacgcgcttc tggccctgat cggctggggc accgtgacgc tcgaactcct cagcgaggac    240
cagtccctgc gcatcgtgca tgaaaacctg ccgcaggttg gcagcgcggg cgaaccttcg    300
ggtacgtggc tggctccggt gctggagggg ctatatggcc gctgggtgac gtcgcaggcg    360
ggtgcgtttg gtgattatgt cgttacacgc gatgtggacg ccgaggatct gaatgctgtt    420
ccgcgtcaga ccatcatcat gtacatgcgc gtgcgcagtt ccgcgacctg a             471
<210>10
<211>2229
<212>DNA
<213>木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum ATCC 53582)bglxA
<400>10
atgatgatgt ctcgtaaact gatgttgctg tctgccgtgg cgtttggcgg gatcgttgct    60
ctgtcgcccg gcgcgcaggc ccgcgaggga caggatgccc cggccaccac ggccactacg    120
gcggacagcc gggcgcgcga tctgctgtcg cacatgacgc ttcaggacaa actgtcgatg    180
gttttcacca ttgatggggg gggcacgatg ggcaatgcgc ccatcccgcc tggcggcctg    240
gggtcggcgg catatctgaa gacgccggcc gggctgccgc cgttacagat cagtgatgcg    300
ggccttggcc tgcgtaaccc gtcgcatgtg cgcccgcacg gacaggcggt cggtctgccg    360
tccggccttg caacggccag cacatgggac ccggacatgg cgcggcaggg tggggcgatg    420
atcggcgccg aggcctggcg gcaggggttc aatgtgctgc tggccggtgg cgccgacctg    480
acgcgtgacc cgcgcggggg acgcaatttc gaatatgcgg gcgaggaccc tttgctgacg    540
gggcgggtgg ttggggccac catcgccggt atccagtcgc aacatgtgat ttcgacgttg    600
aagcatttcg cgatgaacga tcttgagaca tcgcgcatga ccatgagtgc ggatatcgat    660
actgaggcga tgcgcgaaag cgaccttttg ggatttgaaa ttgcgatgga ggtcgggcat    720
cccgggtcgg tgatgtgttc gtacaaccgc gtcaacgaca tctatgcctg cgaaaatccc    780
tatctgctga caaaggtgct gaagcaggac tggaaatatc ccggctttgt catgtccgac    840
tggggggcga cccattcgtc cgcccgatcc gctctggcgg ggctggatca ggaatcatcg    900
ggtgacgatg ccgatgcccg cccctttttc cgcgagatcc tggcgcgtga tgtcaaggat    960
gggcgcgtcc ccaccagccg ggtggatgac atggcgcagc gtattgtccg ctccatgtat   1020
gatgtggggc tggtggacca tccgccggtc atgcagccgc tggacgtcgt gaccgatacc   1080
cttaccgcgc agcgtgatga ggaagaaggc gcggtgctgc tgaagaacag tgggaacctg   1140
ctgccgctgt cgcccacggc gcatgtcgcc gtgattggcg ggcatgccga tgtgggcgtg   1200
atttcgggcg gggggtccag ccaggtcgat ccgatcggcg cgcccgcgat tggcgtggtc   1260
aagggaccgg gcaagaagga ctggcccggc gacccggtat atttcccgtc ttcgccatat   1320
cgcatgatgc aggcggaagc accgtcggcg cacctgacct atacctctgg cgcggacatc   1380
gcgcgcgcgg cggatgcggc gcgcagggcg gatgttgcgg tcgtgttcgt gacgcagttt    1440
tcctatgaag gcatggatac cgccaatgcc atgacgctgg atggcaatca ggacgcgttg    1500
gtggcggcgg tcgcgcgcgc caatccgcgt acggttgtcg tgatggaaac gggcgatccg    1560
gtcatgatgc cctggctgga caatgtcggt gcggtgatgg aggcatggta tcccggttcg    1620
ggcggtggcg ccgcgattgc gcgcctgctg tatggcaagg tggccccgtc gggtcgtctg    1680
ccgatgacat tccccgcatc gcccgtccaa ttggcccacc ctgatattgt aggtgtcacg    1740
gccaacagtg tgtttgaaat gcagttccat accgatcagg aacttgtcta tgacgaaggc    1800
agcgaggttg gctatcgctg gttcgaccat acgcatgcga cgccgctctt tgcgtttggc    1860
catggcctga cctacaccac ttttgcccat gatggcctgc gtgtcgcgca tcatggggac    1920
gatgtcgtcg ccacctttac ggtgcgcaat acgggcacgc gcgtgggggt ggatgtgccg    1980
cagctttatg tccgcctgcc cgatggcggg gggcgtcgcc ttgcaggatg gcagcgtgtg    2040
acgcttgcgc cgggtgaaag ccgtgaactg tcggtggtgc tggaaccacg cgtgctggcg    2100
catttcgatg agaagcatga ccgccggaac gtgccatcgg gggaatatcg catctggctg    2160
gggtcgtctg ccgtggatga gtcgcagcag gtgacgttcc accttgccgg ccggaacatg    2220
gccccctga                                                            2229
<210>11
<211>400
<212>DNA
<213>蓝藻(Synechococcus sp.PCC 7002)PcpcBA
<400>11
aaacatgaag ttttatgaca gatcttttta caagatgtaa tgtttaaatg ccggcagacg     60
ttgtataaca tttacctaag attaagagtc actcgcagta ctccttagaa accccatagg    120
ttccaaggaa ctagcatgaa ctttatctgg caactttaag aatctgagaa attcaatgaa    180
tgtaaagttt cttaaatgcc aaggtgaaaa acaagcaaaa atagctgaca ctcttaattg    240
gctttgggga ttaagtttcc aactcgaaaa caaaaccttt tatcgactct aggattttgt    300
tttcagcaag agagcccctc agcacttgct tcactcttgt tagtaagcaa accgcacaaa    360
ataaatccca ctcatcaaaa tataagtagg agataaaaac                          400
<210>12
<211>590
<212>DNA
<213>蓝藻(Synechocystis sp.PCC 6803)PcpcBA
<400>12
gttataaaat aaacttaaca aatctatacc cacctgtaga gaagagtccc tgaatatcaa     60
aatggtggga taaaaagctc aaaaaggaaa gtaggctgtg gttccctagg caacagtctt    120
ccctacccca ctggaaacta aaaaaacgag aaaagttcgc accgaacatc aattgcataa    180
ttttagccct aaaacataag ctgaacgaaa ctggttgtct tcccttccca atccaggaca    240
atctgagaat cccctgcaac attacttaac aaaaaagcag gaataaaatt aacaagatgt    300
aacagacata agtcccatca ccgttgtata aagttaactg tgggattgca aaagcattca    360
agcctaggcg ctgagctgtt tgagcatccc ggtggccctt gtcgctgcct ccgtgtttct    420
ccctggattt atttaggtaa tatctctcat aaatccccgg gtagttaacg aaagttaatg    480
gagatcagta acaataactc tagggtcatt actttggact ccctcagttt atccggggga    540
attgtgttta agaaaatccc aactcataaa gtcaagtagg agattaattc               590
<210>13
<211>518
<212>DNA
<213>蓝藻(Synechococcus sp.PCC 7002)5’Homologous Region
<400>13
ggggttttct cgtgtttagg cagcatcttg atccgcctca tcattgttat agacttcgag     60
caaatctcgt aaaacaagct cccggatata gtcgctgaaa tttaagcctt gctcattggc    120
ttttttagta gccgcgctgt acatgagtgg gggaaaacga accgcgctcg ctgattttaa    180
attcttattc ggtctagtcg tcatgggatc gcctaagaaa gtctctatca ttttacagta    240
tccaaaagat ttgacacccc cattcatggt ggtatttttt cttttccttt tccccatagc    300
actgtggcta gcaataaagc tatgggcgat ccctacattt attctgtagc accaacgcta    360
cagcccctta atttcctgtg gataaacagt gtggaaattg agaagaacac atgagaattt    420
gtccagtttt attttgatgg ttattttttg cggttgcttt ttaagggaat tgtgcgtgtg    480
gtttccagtc cccatctgtg cataagagaa aggaattc                            518
<210>14
<211>389
<212>DNA
<213>蓝藻(Synechococcus sp.PCC 7002)3’Homologous Region
<400>14
gtcgacgcct cctgaataaa tctatttata caggggttgg acacggcccc taattttgct     60
tggtcacgct gtaaccaatg agcaaagacc ttttcgcgct gatcgttagg ggcgatcgcc    120
tcatagaccc gctgacggtt atcccgcgat ccaaagcgcc ccttgtattc caatttccgg    180
tcaaccttgc ctaggagcgc ctgagcaatt tcgagcgggc tcattttgtc ggtgatcgtt    240
ctgccaagaa tccacttgat cggcttggca taccgcaaac aattttcctt gaacccttca    300
aggctcgccc cggtgaatgt cacccctggt tttaagaact gatggatgtt gagtagctct    360
aacaggtgaa tctttggtga gaggcatgc                                      389

Claims (9)

1.一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述工程菌为cesA基因(SEQ ID NO：1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的质粒或基因组上整合并表达木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7个连续的纤维素合成相关基因cmcase(SEQID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)、bglxA(SEQ ID NO：10)。
2.如权利要求1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因由蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：11)或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)来启动表达。
3.如权利要求1所述的蓝藻工程菌，其特征在于，所述7个连续的纤维素合成相关基因整合到蓝藻的质粒pAQ1、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6、pAQ7之一上，或整合到蓝藻基因组上。
4.权利要求1所述的蓝藻工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002自身的纤维素合成基因cesA敲除或破坏，得到蓝藻突变体；
2)构建Q1载体，所述载体上含有红霉素抗性基因，载体序列中含有2段与蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的自身质粒pAQ1同源的DNA区域，分别是5’Homologous Region(SEQ ID NO：13)和3’Homologous Region(SEQ ID NO：14)；
3)将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582基因组中的连续7个纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)和bglxA(SEQID NO：10)进行PCR扩增，得到长度约14.5Kb的片段，将所述片段连到上一步构建的Q1载体上，这7个连续基因的表达均受控于连在Q1载体上的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：11)或蓝藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的cpcBA基因的启动子(SEQ ID NO：12)；
4)将上一步得到的Q1载体转化至第1)步产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的蓝藻工程菌。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，第1)步中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。
6.一种生产纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)用权利要求4所述的方法制备出蓝藻工程菌；
b)将所得的工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使工程菌生长到OD值达到1.0～2.0；
c)将所述工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BG11中约2周；
d)从所述工程菌提取纤维素。
7.如权利要求6所述的生产纤维素的方法，其特征在于，在所述A+培养基和BG11培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98％～99％，CO2占1％～2％；培养过程始终保证温度25℃～35℃，光照强度30μE/m2s～300μE/m2s。
8.权利要求1所述蓝藻工程菌在生产纤维素方面的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述纤维素用于生产乙醇，进而用作生物能源。
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