EA019338B1

EA019338B1 - Применение бактерий для производства биоэнергии

Info

Publication number: EA019338B1
Application number: EA201070605A
Authority: EA
Inventors: Жан-Поль Леонетти; Иван Матик; Жак Битон; Филипп Пулетти
Original assignee: Деинов; Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьянтифик; Юниверсите Монпелье 1
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2014-02-28
Also published as: CN101861395B; AU2008322867B2; EP2209900B1; UA103467C2; BRPI0820054B1; PT2209900E; ZA201004217B; FR2923491B1; PL2209900T3; WO2009063079A1; US9181564B2; US20110104766A1; CN101861395A; EA201070605A8; BRPI0820054A2; EP2209900B8; HRP20130784T1; FR2923491A1; CA2704429A1; CA2704429C

Abstract

Изобретение относится к композиции и способам производства биоэнергии. Более конкретно, изобретение относится к применению бактерии рода Deinococcus и/или родственных родов для модификации биомассы или производных биомассы с целью производства биоэнергетических продуктов или метаболитов.

Description

(57) Изобретение относится к композиции и способам производства биоэнергии. Более конкретно, изобретение относится к применению бактерии рода Эетососси8 и/или родственных родов для модификации биомассы или производных биомассы с целью производства биоэнергетических продуктов или метаболитов.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции и способам производства биоэнергии. Более конкретно, изобретение относится к применению бактерий рода Эетососсик и/или родственных родов для модификации биомассы или производных биомассы в целях производства биоэнергетических продуктов и метаболитов.

Уровень техники изобретения

Известно, что микроорганизмы применяют для проведения модификации биомассы, особенно растительной биомассы, для производства биоэнергетических продуктов, например этанола.

Существующие в настоящее время производственные процессы позволяют осуществить только культивирование и рост микроорганизмов для ферментации и извлечения этанола при температурах в области 30°С, вследствие небольшой продолжительности жизни используемых промышленных микроорганизмов (дрожжей). Такие процессы также влекут за собой основные затраты на биоэнергию для того, чтобы сконцентрировать этанол после ферментации, поскольку дрожжи, используемые в настоящее время для такой ферментации, не могут переносить концентрации более чем 100 г/л. Дополнительно, при ферментации такими дрожжами используется фактически только С₆-сахара типа глюкозы.

Также известно, что обработка биологического материала бактериальными штаммами придает им среди прочего улучшенные свойства.

Например, в патенте США № 6716631 8. Эс1 Сагбауге е( а1. описан способ, основанный на повторяющихся циклах рекомбинации и выбора/скрининга для придания требуемых свойств целым клеткам и целым организмам. Добавленные свойства представляют собой, например, повышенную способность к генетической рекомбинации, увеличенное число копии генома, повышенную способность экспрессировать и/или секретировать белки и вторичные метаболиты.

Выбрав подход молекулярной генетики, авторы предлагают способы модификации подходящих геномов клеток и организмов для придания им новых свойств.

В способе, описываемом в патенте США 6716631, применяют популяцию различных клеток, культивирование данных клеток с образованием гибридных клеток посредством слияния протопластов, затем скрининг и выбор клеток, которые развиваются с приобретением требуемого свойства, и повторение данных стадий до тех пор, пока не получат по меньшей мере одну клетку, которая обладает требуемой модификацией. Данный способ представлен в качестве выгодной альтернативы известным способам, основанным на программе усовершенствования штаммов.

Протопласты, подвергаемые указанному слиянию, могут происходить из прокариотических организмов.

Одним из предоставленных применений в данном патенте США является ферментация для получения, например, этанола, у которого выход продукта и затраты, как предлагают, усовершенствованны с применением указанных способов рекомбинации при помощи перестановки в ДНК используемых микроорганизмов. В качестве примера упоминают гомологичную рекомбинацию Кйобососсик, который, как известно, катализирует двухфазные реакции.

В международной патентной заявке № ЭДО 01/023526 описано получение и применение бактерий, устойчивых к действию ионизирующего излучения и способных приводить в действие биоочистку, в особенности рода Эетососсик (а именно О.габюбшапк и П.деоШеттаБк), модифицированных так, чтобы стать более эффективными при метаболизме, деградации или нейтрализации токсичного действия неорганических и органических загрязняющих веществ, таких как радионуклиды, тяжелые металлы и органические растворители. Рекомендуют, что данные бактерии следует обрабатывать с целью экспрессии гетерологичных ферментов, способных нейтрализовать токсичное действие указанных элементов. Бактериальные штаммы обрабатывают для объединения множества функций, кодируемых различными генами, в одном организме-хозяине.

В патентной заявке США I. Ναπιιηί е( а1., опубликованной 18 сентября 2003 г. под № 2003/0175977, описана эндогенная плазмида, полученная из штамма П.табюридпапк, рИЕ30, которую можно использовать в качестве вектора, способного самостоятельно реплицироваться в бактериях рода Оетососсик, и которую можно использовать для конструирования челночного вектора, также содержащего плазмиду, способную самостоятельно реплицироваться в Е.сой и ее потомках и способную реплицироваться в бактериях обоих родов Эешососсик и Е.сой.

В патенте США № 7160715 С.В. Бйеттапк описаны способы определения распределения и частоты появления разрывов нитей ДНК ίη у1уо. Данные способы включают применение белка РргА, получаемого из Эетососсик табюбитапк.

В патентной заявке США, опубликованной под № 2004/0224320 от имени К. 8а1о11 е1 а1., описана грамположительная бактерия (№ доступа в АТСС ВАА-149 или ее мутанты), которую выделяют и очищают. Изолят способен разлагать большое множество органических загрязняющих веществ и подходит для биоочистки множества органических загрязняющих веществ в присутствии ионизирующего излучения.

Кроме того, новую монографию по производству этанола с использованием ферментации штаммами микроорганизмов опубликовал под названием Е111апо1 ЕегтегИабоп 81га1пк ЕР. НеИепйаик под эги

- 1 019338 дой Министерства энергетики Соединенных Штатов и Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии (16 декабря 1998 г.). В данном документе, в котором суммируются данные, полученные участниками соответствующего исследования, указано что единственные штаммы микроорганизмов, которые можно использовать в существующем оборудовании, должны быть похожи на уже используемые штаммы, а именно 8ассйатотусек, 2утотоиак и Е.сой;

в ближайшее время увеличенная ферментация ксилозы и арабинозы могла бы стать намеченной целью, определяемой, тем не менее, как малоинтересной для увеличения эффективности конверсии других сахаров типа гексозы или олигомерного типа;

в течение долгого времени можно было бы добиться успеха в отношении более высоких рабочих температур и объединения стадий получения фермента, осахаривания и гидролиза.

Следовательно, существовала необходимость в способе ферментации биомассы и получения этанола и, необязательно, других метаболитов, который можно было бы осуществить в значительно лучших рабочих условиях, чем в условиях существующих в настоящее время способов, и которым в то же самое время можно было бы более просто управлять, чем известными способами, и способным привести к получению продуктов ферментации, который дешевле и легче модернизировать.

Изобретение способно привести к реализации таких требований и предоставить усовершенствованные способы для извлечения пользы от биомассы посредством производства альтернативных биоэнергетических продуктов, которые становятся все более и более необходимыми из-за значительного сокращения источников энергии ископаемого происхождения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов. Более конкретно, изобретение относится к применению определенных микроорганизмов для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов из биомассы или ее производных. Изобретение среди прочего основано на открытии, что микроорганизмы рода Бетососсик обладают неожиданными и благоприятными свойствами для модификации или конверсии биомассы или производных биомассы в целях получения соединений, которые можно использовать для производства биоэнергии, этанола в частности, в промышленном масштабе и экономично, и надежно при эксплуатации.

Цель настоящего изобретения, следовательно, состоит в представлении способа производства биоэнергетических продуктов или метаболитов, включающего взаимодействие с биомассой или производными биомассы природной или модифицированной бактерии, обладающей способностью заново собирать свой геном, полностью или частично, при разрушении от стрессового воздействия, предпочтительно природной или модифицированной бактерии рода Бетососсик или ее экстракта.

Дополнительной целью изобретения является предоставление способа конверсии биомассы или производных биомассы в биоэнергетические продукты или метаболиты, включающего обработку указанной биомассы или производных биомассы в присутствии бактерии рода Бетососсик или бактерии, обладающей способностью заново собирать свой геном, полностью или частично, при разрушении от стрессового воздействия, или ее экстракта.

В определенном аспекте настоящее изобретение относится к способу, включающему следующие стадии:

a) культивирование и/или рост указанной бактерии в аэробных и/или анаэробных условиях;

b) модификация биомассы или производных биомассы в биоэнергетические продукты или метаболиты промышленного значения (например, источники биоэнергии, такие как этанол, элементы химических структур, такие как янтарная кислота), используя композицию, содержащую указанную бактерию или ее экстракт; и

c) сбор по меньшей мере одного биоэнергетического продукта или метаболита, получающегося в результате указанной модификации биомассы или производных биомассы.

Данное изобретение также относится к применению бактерии рода Бетососсик или ее экстракта для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов из биомассы или производных биомассы.

Изобретение также относится к композиции, содержащей бактерию Бетососсик, и биомассе или производным биомассы.

Изобретение также относится к биоэнергетическим продуктам, получаемым при использовании способа, как описано выше.

Способ по изобретению можно осуществить, используя различные природные или модифицированные виды Бетососсик, такие как, не ограничивая, Бетососсик део!йегтайк, Бетососсик габюбигаик, Бетососсик тиггау1 или Бетососсик се11и1окбу11сик. В настоящем изобретении показано, что бактерии Бетососсик могут эффективно поддерживать производство биотоплива, такого как этанол, пропанол, бутанол, глицерин, бутандиол, пропандиол, или органических кислот химического значения и их солей, таких как уксусная кислота, пропионовая кислота, пировиноградная кислота, масляная кислота, молочная кислота и/или янтарная кислота или сложные эфиры, в особенности сложные эфиры, образуемые из

- 2 019338 упомянутых выше спиртов и кислот.

В изобретении также неожиданно показано, что Иетососсив может работать в условиях, таких как повышенные температуры, широкий диапазон величин рН, присутствие растворителей, присутствие неочищенных субстратов, подходящих для производства больших количеств биоэнергетических продуктов или метаболитов из различных субстратов.

Изобретение, таким образом, относится к новым способам и композициям для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов очень эффективным образом.

Описание фигур

Фиг. 1. Бактерицидный эффект этанола на Иетососсив деоШегтайв Ό8Μ11301 в экспоненциальной фазе роста: бактерицидная способность этанола значительна при содержании выше чем 8,2% в экспоненциальной фазе роста.

Фиг. 2. Бактерицидный эффект этанола на Иетососсив деоШегтайв Ό8Μ11301 в стационарной фазе: бактерицидная способность этанола значительна при содержании выше чем 11,7% в стационарной фазе.

Фиг. 3. Бактерицидный эффект бутанола на Иетососсив деоШегтайв Ό8Μ11301: бактерицидная способность бутанола значительна при содержании выше чем 1,5% в экспоненциальной фазе.

Фиг. 4. Бактерицидный эффект бутанола на Иетососсив деоШегтаПв Ό8Μ11301 в стационарной фазе: бактерицидная способность бутанола значительна при содержании выше чем 2% в стационарной фазе.

Фиг. 5. Влияние этанола на рост Иетососсив деоФеттайв Ό8Μ11300: черный квадрат, 0% этанола; белый квадрат, 0,8% этанола; черный кружок, 1,2% этанола; белый кружок 2,4% этанола; черный треугольник, 3,1% этанола.

Фиг. 6А. Влияние величины рН на рост И.део1йегта11в Ό8Μ 113000 (ИКН05): черный квадрат, рН 8; черный кружок, рН 7; белый квадрат, рН 6; белый кружок, рН 5; черный ромб, рН 4.

Фиг. 6В. Влияние величины рН на рост И.деоФеттайв НΑΜΒI 2481 (ИКН37): черный квадрат, рН 8; черный кружок, рН 7; белый квадрат, рН 6; белый кружок, рН 5; черный ромб, рН 4.

Фиг. 6С. Влияние величины рН на рост И.деоФеттайв НΑΜΒI 2480 (ИКН38): черный квадрат, рН 8; черный кружок, рН 7; белый квадрат, рН 6; белый кружок, рН 5; черный ромб, рН 4.

Фиг. 6И. Влияние величины рН на рост И.деоФеттайв НΑΜΒI 2411 (ИВН39): черный квадрат, рН 8; черный кружок, рН 7; белый квадрат, рН 6; белый кружок, рН 5; черный ромб, рН 4.

Фиг. 7. Рост И.се11и1ов11уйсив в различных жидких средах. Бактерии растили, как описано в материалах и методах примера 9. Черный кружок, рост в полной среде; черный квадрат, рост в содержащей СМ-целлюлозу минимальной среде; белый квадрат, рост в минимальной среде, лишенной источника углерода.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам производства биоэнергетических продуктов или метаболитов с использованием бактерий Иетососсив. В изобретении действительно показано, что бактерии Иетососсив могут продуцировать биоэнергетические продукты или метаболиты из биомассы очень эффективным образом.

Определения.

В контексте настоящего описания термин бактерии рода Иетососсив включает в себя штаммы дикого типа или природных вариантов Иетососсив, а также рекомбинантные штаммы, штаммы, получаемые посредством методик перестановки ДНК или посредством методик направленного развития.

Экстракт бактерии обозначает любую фракцию, получаемую из бактерии, такую как клеточную надосадочную жидкость, клеточный детрит, клеточные стенки, экстракт ДНК, ферменты или препараты ферментов, или любой препарат, получаемый из бактерии при помощи химической, физической и/или ферментативной обработки, который, по существу, не содержит живых бактерий.

В контексте настоящего изобретения термин биоэнергия обозначает возобновляемую энергию, получаемую из биомассы. Более конкретно, термин биоэнергетические продукты обозначает биотопливо и все конечные продукты модификации биомассы или производных биомассы, которые можно использовать в качестве топлива, такого как этанол. Термин метаболиты обозначает все возможные промежуточные молекулы, получаемые во время модификации биомассы или производных биомассы в биоэнергетические продукты, включая в качестве неограничивающих примеров несколько химических продуктов промышленного значения, таких как органические кислоты и структурные элементы.

В контексте настоящего изобретения термин биомасса относится к живому и недавно омертвевшему биологическому материалу, который можно использовать в качестве топлива или для промышленного производства. Обычно биомасса относится к растительному материалу, выращенному для получения электричества или производства биотоплива, но также включает в себя растительный или животный материал, применяемый для получения волокон, химических веществ или тепла. Биомасса также может включать в себя биологически разлагаемые отходы, которые можно сжигать как топливо. Термин биомасса не включает в себя органическое вещество, которое преобразуется при геологических процессах в вещества, такие как уголь или нефть.

- 3 019338

Промышленную биомассу можно вырастить из множества типов растений, включающих в себя китайский тростник, просо прутьевидное, коноплю, сахарную свеклу, пшеницу, кукурузу, тополь, иву, сорго обыкновенное, сахарный тростник и множество видов деревьев, в диапазоне от эвкалипта до масличной пальмы.

Биомасса по изобретению включает в себя сырую биомассу и/или вторичную биомассу. Сырая биомасса представляет собой необработанный материал из биологического материала. Примеры включают в себя лесопродукты, такие как зрелые деревья, не подходящие для производства пиломатериалов или бумаги, сельскохозяйственные продукты, такие как травы, зерновые культуры и навоз животных, и водные продукты, такие как водоросли и морская водоросль. Вторичная биомасса представляет собой любой материал, первоначально полученный из сырой биомассы, которую подвергли значительным химическим и физическим изменениям. Примеры включают в себя бумагу, кожу, хлопок, коноплю, природные резиновые продукты, побочные продукты пищевой промышленности и используемые кулинарные жиры.

Как применяют в настоящем документе, термин производные биомассы обозначает все молекулы, полученные из сырой биомассы и/или из вторичной биомассы, как определено выше, и, в частности, любой материал, первоначально полученный из сырой биомассы, который подергался значительным химическим и физическим изменениям, такой как, например, крахмал, целлюлоза, гемицеллюлозы и лигнин.

Как применяют в настоящем документе, промежуточные формы представляют собой молекулы, получаемые посредством физико-химической или биохимической конверсии производных биомассы, такие как сахара, крахмал и синтетический газ на биологической основе (сингаз).

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к применению бактерий Иешососсик для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов из биомассы. В настоящем изобретении действительно показано, что бактерии рода Иетососсик проявляют неожиданные свойства, которые позволяют им взаимодействовать при производстве биоэнергетических продуктов или метаболитов, ферментируя биомассу или производные биомассы.

Бактерии Оетососсик. как было показано, обладают способностью заново собирать свой геном, полностью или частично, при разрушении от стрессового воздействия (РСТ/ЕР2006/005826 Вабтап-2аЬгабка). Как упоминалось ранее, данные бактерии, особенно Идабюбигапк, были предложены для биоочистки. Однако никогда не описывали или предполагали, что бактерии Эетососсик будут способны продуцировать биоэнергетические продукты или метаболиты из биомассы. Кроме того, никогда не предполагалось, что бактерии Иетососсик, обладающие необходимыми биологическими свойствами, можно выделить и культивировать.

В изобретении в настоящий момент впервые показано, что возможно выделить или культивировать бактерии Иетососсик, обладающие по меньшей мере одним из следующих ниже свойств, и что указанные бактерии способны продуцировать биоэнергетические продукты или метаболиты:

жизнеспособны или функциональны при высоких температурах (например, приблизительно 40-70°С);

жизнеспособны или функциональны в диапазоне величин рН приблизительно от 3 до приблизительно 9,5, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 4 до приблизительно 8;

жизнеспособны или функциональны в присутствии токсичных веществ, в частности органических растворителей, например этанола;

способны конвертировать С₆- и С₅-сахара;

способны активировать расщепление целлюлозы с получением глюкозы;

способны активировать расщепление гемицеллюлозы с получением ксилозы;

способны расти в аэробных и/или анаэробных условиях в присутствии соответствующего источника углерода.

Кроме того, бактерии Эешососсик типично лишены любой патогенности и, следовательно, их можно использовать без защитных мер.

В изобретении, таким образом, впервые описана способность бактерий Эетососсик вырабатывать биоэнергетические продукты или метаболиты из биомассы, а также их неожиданная способность расти и культивироваться при определенных условиях, адаптированных для такого применения. Изобретение также относится к применению для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов любых бактерий, обладающих способностью заново собирать свой геном, полностью или частично, при разрушении от стрессового воздействия.

В предпочтительном варианте осуществления в способе по данному изобретению используют термофильные виды Иетососсик, предпочтительно выбранные из Иетососсик деоШегтаПк, Иешососсик габюбигапк и Иетососсик тиггауг

В предпочтительном варианте осуществления изобретения в способе применяют бактерии Иешососсик, жизнеспособные в присутствии токсичных веществ, в особенности в присутствии органических растворителей, например этанола. В настоящем описании действительно показано, что штаммы Иешососсик могут расти в присутствии высоких концентраций растворителей, таких как этанол или бу

- 4 019338 танол, позволяя получать биотопливо более эффективным образом.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в способе применяют бактерию, которая может расти в диапазоне температур приблизительно от 40 до 70°С, предпочтительно от 50 до 60°С. В более предпочтительном варианте осуществления в способе используют бактерию, которая может расти как при повышенных температурах (выше 40°С), так и в присутствии токсичного вещества или органического растворителя, как описано выше.

В дополнительном определенном варианте осуществления настоящего изобретения в способе применяют бактерии Осшососсщ. которые могут быть жизнеспособными и функциональными в условиях концентраций №1С1 или эквивалентных солей, возможно достигающих приблизительно 5% мас./об.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в способе применяют бактерию, которая жизнеспособна в интервале величин рН от приблизительно 3 до 9,5, предпочтительно от 4 до 8. Действительно, авторы изобретения обнаружили, что штаммы Оетососсик могут поддерживать жизнедеятельность в таких строгих условиях, которые особенно благоприятны для конверсии биомассы.

В предпочтительном варианте осуществления в изобретении применяют бактерию Оетососсик, которая способна конвертировать С₆- и/или С₅-сахара, и/или обеспечивать расщепление целлюлозы до получения глюкозы, и/или обеспечивать расщепление гемицеллюлозы до получения ксилозы.

В определенном варианте осуществления изобретение относится к способу, где указанная бактерия Оетососсик способна расти в присутствии ксилана и обеспечивать расщепление ксилана.

О таких ферментативных активностях, объединенных с высокой термоустойчивостью, устойчивостью в широком диапазоне величин рН и устойчивостью к воздействию токсичных веществ, ранее никогда не сообщали, и они являются выдающимися. Как показано в примерах, бактерии Оетососсик, обладающие указанными выше свойствами, можно выделить, культивировать и они могут производить существенные количества биоэнергетических продуктов или метаболитов из биомассы.

В этом отношении другое преимущество изобретения заключается в способе, где указанные бактерии Эетососсик выращивают в минимальной среде, содержащей С₆-сахара, предпочтительно глюкозу или более сложные сахара, предпочтительно сахарозу, целлобиозу или крахмал, или С₅-сахара, предпочтительно ксилозу в качестве источника углерода. Дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в факте, что указанные бактерии Эешососсик могут расти в присутствии С₃-углеводов, предпочтительно глицерина или пирувата натрия.

Определенные примеры бактерий, пригодных для использования в настоящем изобретении, представляют собой штаммы Эетососсик деоШегшайк под номерами доступа Ό8Μ11300, Ό8Μ11301, Ό8Μ11302, ΗΑΜΒΙ2480, ΗΑΜΒΙ2481 и ΗΑΜΒΙ2411; штаммы Эетососсик шиггау1 под номерами доступа Ό8Μ11303 и Ό8Μ11305 или штамм Эешососсик се11и1окйу11сик под номером доступа Ό8Μ18568^Τ (перечисленные в табл. 1) или штаммы, по существу, схожие с ними или их мутантов.

Таблица1

Обозначение	Род	Вид	Ссылка	Код	Темп. °С	Библиографическая справка
ЦКН05	Эетососсиз	§ео1}1егтаНз	ϋ5Μ	11300	45-50	Реггейа е/ а/, 19971пИ 5ν8ί Вас1епо1,47(4): 939-47
ϋΚΗ06	Ое^пососсиз	§ео1кегтаН$	О5М	11301	45-50	Реггейа е1 αΐ, 1997 ΙηΙ) 8 уз1 Вас1ег1о1. 47(4):939-47
ОКН 07	Оетососсиз	деоМегтаИз	ϋ8Μ	11302	45-50	Реггейа е1 αΐ, 1997 1п( 1 8νδΐ Вас1епо1,47(4): 939-47
ϋΚΗ 37	Петососсиз	8ео1кегтаНз	ΗΑΜΒΙ	2481	45-50	Ко1ап Я а1, 2003 11п4 М1сгоЫо1 Вю1есЬпо1, 30:225-238
ОКН38	Оетососсиз	Зео/кегтаНз	ΗΑΜΒΙ	2480	45-50	Ко1ап е( а1, 2003 3 Ιηιΐ М1сгоЫо1 Вю1есЬпо1 30:225-238
ΏΚΗ 39	Оетососсг/з	§ео1кегтаИз	ΗΑΜΒΙ	2411	45-50	Уа15апеп е( а·, 1997, АррПеД М1сгоЫо1о§у 84:1069-1084
ОКН 08	Оетососсиз	тиггау!	О8М	11303	45-50	Реггейа е1 а1. 1997 ΙηΙ ί 8ν8ΐ Вас1епо1,47(4): 939-47
ОКН 10	Ретососсиз	тиггау}	Ю8М	11305	45-50	Реггейа е1 а1. 1997 ΙηΙ Д 8νδΙ Вас(епо1,47(4): 939-47
ΏΚΗ46	Ое/иосоесги	се!1и1озИуИси$	ϋ3Μ	18568'	45	Ά'εοη е1 а!, 2007, ΙηΙ 1 о£ 8уз( & ЕуоЫбопагу М1СгоЫо1, 57, 16851688

- 5 019338

Все штаммы, перечисленные выше в таблице, способны расти в среде для культивирования типа РСУ при величине рН 7. Другие подходящие среды для культивирования описаны в экспериментальном разделе.

Следует понимать, что дополнительные штаммы Пешососсик, обладающие свойствами, как в настоящем документе продемонстрировано и описано, специалисты в данной области могут в настоящее время подвергнуть скринингу и идентифицировать на основе идей настоящего изобретения, например, при помощи последующих руководства и тестов, как описано в экспериментальном разделе.

Как указано выше, штаммы Оешососсик, применяемые в настоящем изобретении, можно использовать либо в природном виде, либо модифицированными (например, химически или генетически) для приобретения улучшенных свойств. В этом отношении в конкретном варианте осуществления в способе применяют бактерию Пешососсик, которую модифицируют при помощи ускоренного развития, или при помощи методик перестановки ДНК, или посредством вставки эукариотической, прокариотической или синтетической не относящейся к Оешососсик ДНК, или посредством вставки ДНК другого штамма Оешососсик, причем указанная модификация влияет на жизнеспособность, рост или функции указанной бактерии так, чтобы стимулировать модификацию биомассы.

В другом варианте осуществления изобретения применяемая бактерия может представлять собой рекомбинантный или модифицированный бактериальный штамм, предпочтительно используя способ, такой как описано в международной патентной заявке № РСТ/ЕР2006/005826.

Как указано выше, в изобретении показано, что бактерии рода Оешососсик или их производные, выбранные, например, из О.деоШегтайк. О.габюбигапк или О.тиггаут проявляют благоприятные свойства и способны продуцировать биоэнергетические продукты или метаболиты из различных неочищенных субстратов. Настоящее изобретение, следовательно, относится к применению бактерий рода Эешососсик для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов из биомассы или производных биомассы. Настоящее изобретение также относится к способу производства биоэнергетических продуктов или метаболитов из биомассы или производных биомассы, подвергая воздействию или культивируя указанную биомассу в присутствии бактерий рода Оешососсик или их экстрактов, и извлекая полученный биоэнергетический продукт или метаболит.

Культивирование или воздействие можно осуществить в любых подходящих условиях или окружающей среде, позволяющих провести модификацию биомассы или производного для того, чтобы получить биоэнергетический продукт. В этом отношении способ можно осуществить в реакторе, в ферментере, на открытом воздухе в присутствии подходящих питательных веществ или добавок, если необходимо. Способ типично осуществляют в условиях величин рН, температуры выше 40°С и в присутствии подходящих субстратов.

Определенная цель по данному изобретению заключается в предоставлении способа, включающего следующие стадии:

b) модификация (например, конверсия или обработка) биомассы или производных биомассы в биоэнергетические продукты или метаболиты, используя композицию, содержащую указанную бактерию или ее экстракт; и

Другая цель по изобретению заключается в предоставлении способа конверсии биомассы или производных биомассы, используя по меньшей мере одну бактерию или бактериальный экстракт, такой как определено выше, или композицию, такую как описано выше, включающем комбинацию:

по меньшей мере одной операции размещения в культуру и развитие указанного бактериального штамма или экстракта указанного бактериального штамма в условиях, подходящих для роста и развития;

по меньшей мере одной операции конверсии биомассы или производных биомассы под действием подходящего количества указанного бактериального штамма или экстракта указанного бактериального штамма в условиях, подходящих для указанной конверсии биомассы или производных биомассы; и сбора по меньшей мере одного биоэнергетического продукта или метаболита, полученного при указанной конверсии биомассы или производных биомассы, в частности сбора этанола, получаемого таким образом.

В описанных выше способах первую стадию культивирования и/или роста указанной бактерии и вторую стадию модификации биомассы или производных биомассы в биоэнергетические продукты или метаболиты, используя композицию, содержащую указанную бактерию или ее экстракт, можно осуществлять либо одновременно, либо последовательно; третью стадию сбора биоэнергетических продуктов или метаболитов можно осуществлять одновременно с первой и/или второй стадией или последовательно. В этом отношении, на биомассу можно воздействовать бактерией в подходящих условиях для того, чтобы обеспечить размножение указанной бактерии, тем самым увеличивая эффективность способа. Альтернативно, бактериальные штаммы можно размножить отдельно в подходящих для культивирования условиях и впоследствии добавить к биомассе. Следует понимать, что точное количество бактерий, используемых первоначально для того, чтобы эффективно конвертировать биомассу, по существу, в био

- 6 019338 энергетические продукты или метаболиты, специалисты в данной области могут подобрать в зависимости от типа бактерий, типа биомассы или производных и условий культивирования.

В конкретном варианте осуществления способа по изобретению бактерии Пешососсик выращивают отдельно от конвертируемой биомассы.

В другом конкретном варианте осуществления в способе применяют композицию, содержащую бактерию Оетососсик или ее экстракт и по меньшей мере одну подходящую добавку или эксципиент, предпочтительно по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из антивспенивающих веществ и питательных веществ. Подходящие антивспенивающие вещества представляют собой дисперсанты, детергенты и поверхностно-активные вещества, в частности, и в общем амфифильные соединения.

В конкретном варианте осуществления способ по изобретению осуществляют в реакторе для конверсии биомассы. Под реактором подразумевают общепринятый ферментационный чан или любое устройство или систему для конверсии биомассы, специально сконструированные для выполнения изобретения и, следовательно, состоящие, в частности, из ферментеров, биофильтров, дисковых биофильтров и других ферментеров с газовой и/или жидкой фазой для обработки биомассы или производных биомассы. Устройство, которое можно использовать по изобретению, можно использовать непрерывно или при загрузке отдельных порций.

В реакторе для выполнения способа по изобретению применяют по меньшей мере одну бактерию или бактериальный экстракт по изобретению и/или по меньшей мере одну композицию, такую как определено выше, в то время как указанный реактор устроен и поставляется так, чтобы физико-химические условия в нем устанавливались и поддерживались таким образом, чтобы указанная бактерия была активной для рассматриваемого применения и так, чтобы в нем, необязательно, был возможен и предпочтительно активизирован бактериальный рост.

В другом варианте осуществления способа по изобретению бактерии растут в реакторе во время конверсии биомассы или производных биомассы, в то время как подходящие физико-химические условия устанавливают и поддерживают для того, чтобы был возможен данный бактериальный рост и предпочтительно активизирован. Например, можно использовать колбы Эрленмейера вместимостью 500 мл в присутствии 100 мл среды Тйегшик 167 или минимальной среды, описываемой ниже, при температуре 50°С.

В альтернативных вариантах осуществления изобретения конверсию биомассы или производных биомассы проводят при аэробиозе, анаэробиозе или при микроаэробиозе.

Согласно дополнительному аспекту целью изобретения является реактор для конверсии биомассы или производных биомассы, используя по меньшей мере одну бактерию Оетососсик или бактериальный экстракт, такой как определено выше, или такую композицию, как определено выше.

Способ по данному изобретению можно использовать для производства биоэнергии из различных типов биомассы. В предпочтительном варианте осуществления биомасса включает в себя древесину и древесные отходы, лесосечные отходы, отходы бумажного производства, сельскохозяйственные зерновые культуры, сельскохозяйственные отходы, съедобные и/или несъедобные растения или их фрагменты, солома, отходы садоводства, водные растения, отходы животноводства, отходы животноводческого хозяйства, навоз, органические бытовые отходы и/или промышленные органические отходы. Биомасса также может включать в себя биологически разлагаемые отходы.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу модификации биомассы или производных биомассы или промежуточных форм в биоэнергетические продукты или метаболиты, где производные биомассы предпочтительно представляют собой лигнин, целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал и где промежуточные формы предпочтительно представляют собой углеводы, такие как ксилан, глюкороноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан, ксилоглюкан, крахмал, сахарозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, глюкозу, ксилозу, маннозу, арабинозу, рамнозу, галактозу и/или фруктозу.

Определенный объект по изобретению представляет собой способ для производства биотоплива. В контексте настоящего изобретения термин биотопливо обозначает топливо, получаемое из живых или недавно омертвевших биологических источников углерода. Биотопливо можно получать из возобновляемых ресурсов, особенно растительной или животной биомассы или из бытовых и промышленных отходов. Биотопливо по изобретению включает в себя биотопливо первого поколения и/или биотопливо второго поколения.

Биотопливо первого поколения получают из растительного или животного органического материала, предпочтительно из сахара, крахмала, растительного масла или животных жиров. Основным источником для производства биотоплива первого поколения являются съедобные растения или их фрагменты. Биотопливо первого поколения включает в себя растительное масло, биодизель, биоспирты, биогаз, сингаз и твердое биотопливо. Биоспирты включают в себя этанол, пропанол и бутанол. Более предпочтительно способ по изобретению используют для производства этанола, пропанола, бутанола. Наиболее предпочтительное биотопливо представляет собой этанол.

Биотопливо второго поколения производят предпочтительно из несъедобных растений или фрагментов несъедобных растений. Они включают в себя непищевые зерновые культуры, отходы биомассы,

- 7 019338 стебли пшеницы, зерна и деревьев. Предпочтительно биотопливо по изобретению включает в себя целлюлозное биотопливо.

В зависимости от исходной биомассы для производства биоэнергетических продуктов или метаболитов, таких как биотопливо, может потребоваться два последовательных этапа: стадия гидролиза, катализируемого ферментами, предпочтительно целлюлазами или лакказами, которые разрушают длинные цепи сложных углеводов, таких как целлюлоза или лигнин, соответственно, на более мелкие поддающиеся ферментации сахара; и стадия ферментации, на которой дополнительно разрушаются органические соединения, такие как сахара, до спиртов. Следует отметить, что штаммы Оетососсик по настоящему изобретению можно использовать либо для одной из двух, либо для двух указанных реакций. Действительно, в изобретении показано, что Оетососсик могут гидролизовать длинные углеводные цепи (например, ксилан или целлюлозу) и также могут продуцировать метаболиты (например, этанол, глицерин, бутандиол, пропандиол, а также уксусную, пропионовую, пировиноградную и масляную кислоты) из С₃-, С₅- или С₆-сахаров. Тем не менее, следует отметить, что штаммы Оешососсик при желании можно использовать в сочетании с любыми другими бактериальными штаммами.

Следующие ниже примеры приведены с целью иллюстрации и никоим образом не с целью ограничения.

Примеры

Пример 1. Тесты для отбора.

Для того чтобы определить, снабжен ли микроорганизм свойствами, требуемыми для изобретения, определенные тесты необходимо провести, чтобы определить, способен ли род, вид и/или бактериальный штамм обладать необходимыми свойствами и функционировать в способе конверсии биомассы или производных биомассы, и чтобы определить, какие значительные усовершенствования можно получить таким образом.

Данные определенные тесты по изобретению проводят в следующих ниже условиях.

Среда для культивирования.

О.деоФегтайк (Ό.Ο.) культивируют при 50°С при перемешивании в аэробной среде. Среду для культивирования 167 используют для поддержания жизнедеятельности штаммов. Минимальную среду используют в экспериментах ферментации, в частности, чтобы охарактеризовать метаболиты. В данном случае 500 мл среды для культивирования инкубируют в течение от 1 до 7 дней при перемешивании в колбе Эрленмейера вместимостью 1 л после засевания 5 мл сливной культуры Ό.Ο.

Среда 167 Тйеттик

Триптон	1	Г
Дрожжевой экстракт	1	г
Агар	28	г
Нитрилотриуксусная кислота	100	мг
СаЗОа х 2Н₂О	40	мг
МдС1₂ х 6Н_гО	200	мг
0,01 М цитрат Ре	0,5	мл
Раствор микроэлементов (смотри ниже)	0,5	мл
Фосфатный буфер (смотри ниже)	100	мл
Н₂О	900	мл
Довести при помощи Ν&ΟΗ до величины рН 7,2, стерилизовать в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. Фосфатный буфер стерилизовать в автоклаве отдельно и добавить в среду

Фосфатный буфер

КН₂РО₄	5, 44	г
йа₂НРО₄ х 12Н₂О	43	г
Н₂О	1000	мл
Довести до величины рН 7,2

- 8 019338

Раствор микроэлементов

Н₂ЗО₄	0, 5	МЛ
Μη3Ο₄ х Н₂О	2,28	г
Ζη30ί X 7Н₂О	0,5	г
Н3ВО3	0,5	г
СиЗО₄ х 5Н₂О	25	мг
Иа₂Мо0₄ х 2Н₂О	25	мг
СоС1₂ х 6Н₂О	45,00	мг
Н₂О	1000	мл

Минимальная среда ΜΘΡδ-буфер

МОР5-кислота	400	мМ
ИН₄С1	200	мМ
ΝβΟΗ	100	мМ
КОН	100	мМ
СаС1₄	5	м
К₂ЗО₄	276	мМ
МдС1₂	5,28	мМ
рН 7, фильтрованный, стерилизованный

Источник углерода

Глюкоза	160	ММ
фильтрованный, стерилизованный

Фосфат

К_гНРО₄	12, 3	мМ
КН₂РО<\|	7,7	мМ
фильтрованный, стерилизованный

Витамины

0-биотин	10	мкМ
ниацин	10	мкМ
пиридоксаль-НС1	10	мкМ
тиамин“НС1	10	мкМ
хранить при рН 4, фильтрованный, стерилизованный

Раствор микроэлементов

Н₂ЗО₄	5	МЛ
МпЗО₄ х Н₂0	22,8	г
Ζη80ί х 7Н₂О	5	г
Η3ΒΟ3	5	г
СиЗО₄ х 5Н₂О	250	мг
Ыа₂Мо0₄ х 2Н₂О	250	мг

СоС1₂ х 6Н₂О	450	МГ
Н₂О	1000	мл
фильтрованный, стерилизованный

Источник железа

ГеС1₃	200	М
Цитрат натрия	200	м
фильтрованный, стерилизованный

- 9 019338

Аминокислоты

Зег	100	мМ
61п	100	мМ
фильтрованный, стерилизованный

Данные растворы для хранения в концентрированном состоянии 10Х разбавляют непосредственно перед использованием.

Определение лакказной активности бактерии.

Принцип:

Сирингалдазин + О₂^Окисленный сирингалдазин + 2Н₂О Лакказа.

Реагенты:

A) 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6,5 при 30°С;

B) 0,216 мМ сирингалдазин (3 мл приготавливают в абсолютном этаноле из сирингалдазина, получаемого в 81дта Ргоб., № 8-7896);

C) фермент.

	тест	контроль
Н₂О	0,50 мл	Неферментированная среда, 0,5 мл или разведение
Реагент А	2,20 мл	2,20 мл
Реагент В	0,3 мл	0, 3 мл
Реагент С	Ферментированная среда, 0,5 мл или разведение	0

Увеличение оптической плотности регистрируют при 530 нм.

В данных условиях одна единица фермента приводит к увеличению оптической плотности на 0,001 в минуту при рН 6,5 и при 30°С.

Определение целлюлозной активности бактерии.

Принцип.

Тест основан на последующем преобразовании ΝΑΌ в ΝΑΌΗ во время разрушения целлюлозы. Увеличение поглощающей способности затем отслеживают при 340 нм, следуя инструкции поставщика, доступной по ссылке в Интернете: (11ир://\\л\лу.5щтаа1йпс11. сот/|т§/а55с15/18160/Сс11и1а5С.рс1Г).

Определение продукции этанола.

Этанол определяют количественно, используя два способа.

Ферментный способ: ΑΌΗ.

Этанол + ΝΑΌ ^Ацетальдегид + ΝΑΌΗ.

Данный способ основан на последующем преобразовании ΝΑΌ в ΝΑΌΗ в присутствии этанола и алкогольдегидрогеназы.

Данную реакцию объясняют по увеличению поглощающей способности при 340 нм. Для данного измерения использовали набор 8щта Ν7160, следуя инструкциям производителя, доступным по ссылке в Интернете: (ййр ://^^^. 5щтаа1йпс1г сотАщта/ЬиПсбп/Ш 160ВиЬ.рбГ).

Измерения при помощи обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия.

НРЬС Οίίδοη с автоматическим впрыскивателем, детекция посредством рефрактометрии.

Колонка: Рйепотепех Вехех ΒΟΑ, 300x7,8 мм.

Температура колонки: 65°С.

Подвижная фаза: 0,005н. серная кислота.

Скорость потока: 0,600 мл/мин.

Первоначально строят калибровочную кривую, впрыскивая на колонку среду для культивирования, содержащую известные концентрации этанола. Измеряют площадь пика, элюированного на 22,26 мин, соответствующего этанолу. Вычерчивают график калибровочной кривой.

Затем количество этанола, продуцируемого бактерией, измеряют, впрыскивая надосадочную жидкость культуры на колонку. Площадь пика, элюированного на 22,26 мин и соответствующего этанолу, измеряют. Концентрацию этанола, присутствующего в надосадочной жидкости, определяют, сравнивая с калибровочной кривой.

Обнаружение и определение количества других метаболитов, возможно продуцируемых в разнообразных соотношениях, можно осуществить, следуя обычным способам анализа и оценки.

- 10 019338

Бактерии являются гаплоидными организмами, которые воспроизводятся двоичным делением и которые питаются минеральными и органическими веществами, обнаруженными в окружающей среде.

Их потребности в газах, особенно в отношении кислорода, различаются, и культуру и способы ферментации, которые будут использоваться, необходимо приспособить согласно тому, являются ли они строгими аэробными, строгими анаэробными или факультативными аэро-анаэробными микроорганизмами.

Активность целлюлазы, предпочтительно необходимая по изобретению, имеет место при расщеплении целлюлозы, в то время как активность лакказы обеспечивает или облегчает расщепление лигнина.

Производство при ферментации биомассы биоэнергетических продуктов, таких как этанол, в особенности, и/или других метаболитов, осуществляют, следуя рабочим условиям, последовательно адаптированным в повторяющихся тестах до условий и параметров методики по настоящему изобретению, которые, в частности, представляют собой количества бактериальной среды для культивирования, рабочие условия температуры и/или давления и вариантов аэробной, анаэробной или микроаэробной ферментации. После определенных тестов и исследований, описанных выше, отобранные природные или генетически модифицированные штаммы задействуют согласно способу по изобретению.

Пример 2. Получение этанола в присутствие Эетососсщ део1йегша118.

В колбу Эрленмейера вместимостью 500 мл, содержащую 100 мл минимальной среды при 50°С, инокулят О.део111егта115 (ИС) в количестве 10¹⁰ добавляют при 50°С. Культуру размещают при перемешивании, чтобы обеспечить насыщение воздухом.

Данная культура затем готова к применению в общепринятом ферментационном чане для биомассы, в котором при наилучших условиях можно получать этанол и другие метаболиты с превосходным выходом продукта при 55°С.

Через 1-7 дней в реакторе с биомассой, которую необходимо обработать, наличие упомянутых выше этанола и метаболитов количественно определяли посредством ВЭЖХ (следуя протоколу, описанному выше). Наблюдали исчезновение глюкозы и сопутствующее производство этанола, чью концентрацию оценивали аналитически. Обнаруживали другие интересующие метаболиты. Замена глюкозы на ксилозу в среде для культивирования также обеспечивала бактериальный рост и получение этанола.

В одном варианте осуществления данного примера похожие результаты можно получить при проведении и бактериальном культивировании и ферментации в одном чане.

Пример 3. Бактерицидные эффекты этанола и бутанола на Эетососсщ део111егта1Ь.

Материалы и методы.

Данный способ позволяет провести оценку бактерицидных эффектов органических растворителей на бактерий при росте или в стационарной фазе. Тестируемые растворители представляют собой этанол и бутанол. Тестируемые бактерии, принадлежащие к роду Эетососсщ:

развиваются в диапазоне от 40 до 70°С;

являются активными в диапазоне рН от 3 до 9,5;

способны заново собирать, полностью или частично, свой геном, разрушенный при стрессовом воздействии, особенно при облучении, в частности УФ- или гамма-лучами, обезвоживании, под действием фермента, ультразвука или при химическом воздействии.

Тестирование необходимо проводить при оптимальной для роста температуре для исследуемого штамма. Из предварительной культуры в стационарной фазе в обогащенной питательной среде 10 мл обогащенной питательной среды засевали при 1% об./об. Обогащенная питательная среда содержит: 2 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л глюкозы; раствор стерилизуют автоклавированием (20 мин при 120°С). К данному раствору добавляют следующие ниже растворы: МОР8-буфер (10Х) рН 7 [400 мМ МОР8-кислоты, 200 мМ ХН₄С1, 1000 мМ ХаОН. 100 мМ КОН, 5 мкМ СаС1₂, 2,76 мМ Ыа₂8О₄, 5,28 мМ МдС1₂]; микропищевые добавки (10000Х) [300 мМ (ХН₄)₆(Мо₇)₂₄, 4 мМ Н₃ВО₃, 0,3 мМ СоС1₂, 0,1 мМ Си8О₄, 2,5 мМ МпС1₂, 0,1 мМ 2и8О₄]; 20 мМ РеС1₃ (100Х) в 20 мМ С₆Н₅Ха₃О₇, 1 г/л К₂НРО₄: растворы стерилизуют фильтрацией (45 мкм).

200 мкл культуры распределяют в 96-луночный микропланшет. Для того чтобы избежать какоголибо явления испарения растворителя, микропланшет покрывают непроницаемой стерильной пленкой.

Как только достигают фазы экспоненциального роста (оптическая плотность 0,5 при 600 нм), или стационарной фазы (плато), добавляют растворитель. Тестируемое содержание составляет от 0 до 31% этанола и от 0 до 2,5% бутанола. Культуру затем инкубируют при перемешивании в течение 1 ч.

Подсчет: В конце инкубации и для каждой концентрации растворителя 20 мкл культуры переносят в другой микропланшет и разбавляют по каскадной схеме (разведение 1/10 в 9 лунках). Среда для культивирования при разбавлении представляет собой обогащенную питательную среду. 5 мкл при каждом разведении помещают в трех повторах на агаровую среду РОУ, 5 г/л пептона, 2,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л глюкозы, 14 г/л агара: среду стерилизуют автоклавированием 20 мин при 120°С. Как только обеспечивается рост, для каждого процентного соотношения исследуемого растворителя осуществляют подсчет для того, чтобы оценить влияние органических растворителей на штамм.

- 11 019338

Результаты.

Концентрация растворителя, рассматриваемая авторами изобретения, при которой имеет место потеря бактериальной жизнеспособности, соответствует минимальной концентрации растворителя, при которой авторы изобретения наблюдают потерю одного логарифма относительно контроля.

Тестируемые штаммы (фиг. 1-4) представляют удовлетворительную устойчивость к растворителям, исходя из перспективы индустриального применения в ферментере.

Пример 4. Рост бактерий в присутствии С₃-, С₅- и С₆-источников углерода.

Материалы и методы.

Предварительное культивирование осуществляли либо в среде А, содержащей пептон (2 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), глюкозу (10 г/л), либо в среде Ρ6Υ. После центрифугирования среды для культивирования бактериальный осадок дважды промывали минимальной средой А, чтобы удалить все источники питательных веществ в инокуляте. Данный инокулят использовали для засевания (1/66) среды для культивирования А (200 мкл), содержащей один из следующих ниже источников углерода при 1% (мас./об.): И(+)глюкоза, И(+)целлобиоза, сахароза, крахмал, И(+)ксилоза, ксилан из березняка, глицерин, пируват натрия. В случае штаммов ΌΚΉ07, ΌΚΉ39, ΌΚΉ08 и ΌΒΗ10 в среду для культивирования добавляли глутамат (10 мМ). Бактериальный рост осуществляли при 45°С в 96-луночных микропланшетах при перемешивании, и после чего следовало измерение оптической плотности при 544 нм с использованием спектрофотометра (С11ашс1соп тиШ1аЬе1 Йс1се1юп Р1а1Гогт р1а!е, 8е1епсеТее) или при 600 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов 8рее1гойаг ОМЕ6А (ВМС ЬаЫесй).

Используемые источники углерода для сравнения: ксилан из березняка (95588, Р1ика), целлобиоза (22150, Р1ика), И(+)ксилоза (95730, Р1ика), глюкоза (68270-1К6, 81дта), сахароза (89378-1К6, 81дта), крахмал (89765-5006, 8щта). глицерин (453752, Саг1оЕгЬа), пируват натрия (81дта).

Композиции и препараты среды для культивирования.

Среда Ρ6Υ: пептон (10 г/л), глюкоза (1 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), смесь стерилизовали в автоклаве в течение 20 мин при 120°С.

Среда А: различные растворы, используемые для получения среды А, готовили из маточного раствора, простерилизованного фильтрацией:

Раствор (рН 7), содержащий: буфер 40 мМ МОР8-кислоты, 20 мМ ИН₄С1, 10 мМ КОН, 10 мМ ИаОН, 0,5 мкМ СаС1₂, 0,276 мМ Иа₂8О₄, 0,528 мМ М§С1₂.

Раствор микропищевых добавок (рН 5): 3 нМ (ЫН₄)₆(МО₇)₂₄, 400 нМ Н₃ВО₃, 30 нМ СоС1₂, 10 нМ Си8О₄, 250 нМ МпС1₂, 10 нМ Ζιι8Ο₄

Раствор витаминов, рН 4, (каждый 1 мкг/л): Ό-биотин, ниацин, пиридоксаль-НС1, тиамин-НС1, витамин В12.

Источник фосфата: 5,7 мМ К₂НРО₄.

мкМ РеС1₃ (приготовленного в растворе цитрата натрия, затем отфильтрованного).

Результаты.

Бактерии, перечисленные в табл. 2, способны размножаться в минимальной среде для культивирования (среда А), содержащей в качестве единственного источника углерода сахар С6, такой как глюкоза, сахароза, целлобиоза и крахмал. Следует отметить, что штаммы ИКН37 и ИКН06 также способны расти в присутствии глицерина и пирувата натрия (углеводы С3).

Бактерии, перечисленные в табл. 3, также способны размножаться в минимальной среде для культивирования, содержащей в качестве единственного источника углерода сахар С₅ (ксилозу или ксилан); за исключением штаммов ΌΚΉ06 и ΌΚΉ07, которые не способны расти в присутствии ксилана и ксилозы соответственно.

- 12 019338

Тестирование усваивания различных источников углерода в С₆ и С₃ осуществляли для различных видов Б.деоФегтаПк и Б.тиггауЕ -ΔΘΌ<0,2; + ΔΘΌ=0,2; ++0,3>ΔΘΌ>0,4; +++0,4>ΔΘΌ>0,5 ;

++++ΔΘΌ>0,6. ΔΘΌ соответствует разнице между значениями ОБ при 544 нм в исходное время роста Т0 и во время Т196 ч (приблизительно 8 дней) (табл. 2).

Таблица 2

Источники	ϋΚΗ05	О. ϋΚΗ06	деоЪЪегтаИз	О. тиггау1 ИКН08 ПЕНЮ
ЭКН07	ОВ.Н37 ЭВН38 ϋΚΗ39
углерода при 1% (мас ./об.) углеводы С6: И-(+)-глюкоза	+++	+	++	++	+ + +	+ + +	+	+
0-( + )-	++	-	+ + +	+++	++	+++	+ +	-
целлобиоза Сахароза	+++	+ +	++	++	+ + +	+ + +	++
Крахмал	+++	++	++	++	+++	-	++	-
углеводы СЗ: Глицерин	-	-	-	++	-	-	-	-
Пируват натрия	-	+	-	-	-	-	-	-

Тестирование усваивания различных источников углерода в С₅ и С₆ осуществляли для различных видов Б.деоШегтаПк: -ΔΘΌ<0,2; + ΔΘΌ=0,2; ++0,3>ΔΘΌ>0,4; +++0,4>ΔΘΌ>0,5 ; ++++ΔΘΌ>0,6. ΔΘΌ соответствует разнице между значениями ОБ при 600 нм в исходное время роста Т0 и во время Т64 ч (приблизительно 2,5 дня) (табл. 3).

Источники углерода при 1% (масс./об.)

О-(+)-глюкоза

Ксилан

Ксилоза

Таблица 3
ϋΚΗ05	ОКНО 6	ОКН07	ϋΚΗ37	ΏΚΗ38	ϋΚΗ39
+++	++	+	+ + + +	+ + +	+ + +
+++	-	+	+ + + +	+++ +	+++ +
+++	+++		++++	+ + +	+

Пример 5. Рост бактерий при высокой концентрации этанола.

Материалы и методы.

Данный способ позволяет провести оценку способности микроорганизмов развиваться в присутствии высокой концентрации этанола. Тестируемые бактерии, принадлежащие к роду Бетососсик деоШеттаПк:

развиваются в диапазоне от 40 до 70°С;

являются активными в диапазоне рН от 3 до 9,5;

Тестирование необходимо проводить при оптимальной для роста температуре для исследуемого штамма. Из предварительной культуры в стационарной фазе в обогащенной питательной среде для каждой концентрации этанола засевали 20 мл обогащенной питательной среды при 1% об./об. Обогащенная питательная среда содержит: 2 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л глюкозы; раствор стерилизуют автоклавированием (20 мин при 120°С). К данному раствору добавляют следующие ниже растворы: МОР8-буфер (10Х) рН 7 [400 мМ кислого МОР8-буфера, 200 мМ ΝΉ₄Ο, 1000 мМ ЫаОН, 100 мМ КОН, 5 мкМ СаС1₂, 2,76 мМ №-ь8О₊ 5,28 мМ МдС1₂]; микропищевые добавки (10000Х) [300 мМ ^₄)₆(Мо₇)₂₄, 4 мМ Н₃ВО₃, 0,3 мМ СоС1₂, 0,1 мМ Си8О₄, 2,5 мМ МпС1₂, 0,1 мМ 2и8О₄]; 20 мМ РеС1₃(100Х) в 20 мМ С₆Н₅№₃О₇; 1 г/л К₂НРО₄: растворы стерилизуют фильтрацией (45 мкм).

Этанол добавляют в Т0, содержание меняется от 0 до 31%. Последующий рост осуществляют для каждой тестируемой концентрации этанола. ОБ считывают при 600 нм с использованием спектрофотометра (БУ Ь1дй1 Х85, 8ЕСОМЛМ). Аликвотную часть по 1 мл культуры забирают во время: Т0, Т0 + 1 ч, Т0 + 3 ч, Т0 + 18 ч, Т0+20 ч, Т0 + 22 ч, Т0 + 24 ч.

Когда необходимо для считывания, культуру разбавляют до одного к десяти в обогащенной питательной среде. Кривые роста можно получить для каждой тестируемой концентрации этанола. В конце периода инкубации и для каждой тестируемой концентрации проводили подсчет, чтобы оценить влияние этанола на штамм.

- 13 019338

Результаты.

Некоторые тестируемые штаммы, такие как Эетососсик део!йеттайк Ό8Μ11300, способны расти в среде для культивирования, содержащей этанол (см. фиг. 5). Для некоторых штаммов, таких как Оейюсоссик део!йеттайк Ό8Μ11300, показана устойчивость к высокой концентрации этанола в среде для культивирования (см. фиг. 6А).

Пример 6. Получение представляющих интерес метаболитов при помощи Оетососсик тштауь Материалы и методы.

Данный способ позволяет провести оценку способности микроорганизма продуцировать представляющие интерес метаболиты (в группе, состоящей из глицерина, бутандиола, пропандиола и уксусной, пропионовой, пировиноградной и масляной кислот) из биомассы или производного биомассы.

Тестируемые бактерии, принадлежащие к роду Эетососсик део!йеттайк:

развиваются в диапазоне от 40 до 70°С;

являются активными в диапазоне рН от 3 до 9,5;

Тестирование необходимо проводить при оптимальной для роста температуре для исследуемого штамма. Из предварительной культуры (в стационарной фазе), полученной в обогащенной питательной среде, 20 мл обогащенной питательной среды засевали при 1% об./об.

Обогащенная питательная среда содержит: 2 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л глюкозы; раствор стерилизуют автоклавированием (20 мин при 120°С). К данному раствору добавляют следующие ниже растворы: раствор ΜΘΡδ-буфер (10Х) рН 7 [400 мМ ΜΘΡδ-кислоты, 200 мМ ИН₄С1, 1000 мМ №1ОН. 100 мМ КОН, 5 мкМ СаС1₂, 2,76 мМ Ыа₂8О₄, 5,28 мМ ΜдС1₂]; микропищевые добавки (10000Х) [300 мМ (ИН₄)₆(Мо₇)₂₄, 4 мМ Н₃ВО₃, 0,3 мМ СоС1₂, 0,1 мМ Си8О₄, 2,5 мМ ΜηΟ₂, 0,1 мМ ΖηδΟ₄]; 20 мМ РеС1₃ (100Х) в 20 мМ С₆Н₅Ха₃О₇; 1 г/л К₂НРО₄: растворы стерилизовали фильтрацией (45 мкм).

Культуру оставляли в инкубаторе при 45°С при перемешивании, пока она не достигала своей стационарной фазы. Как только достигали стационарной фазы, культуру центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость выливали в другую пробирку и размещали при -80°С. Анализ ВЭЖХ с УФ и рефрактометрию (ионообменная колонка (Н+)Вютай, подвижная фаза 5 мМ Н₂8О₄, поток в подвижной фазе 0,6 мл/мин, изократический способ) позволяет идентифицировать представляющие интерес метаболиты.

Результаты.

Некоторые тестируемые штаммы продуцируют некоторые из представляющих искомый интерес метаболитов (табл. 4).

Таблица 4 Метаболиты, продуцируемые Эетососсик титгау! Ό8Μ11305 (выражены в г/л)

	ГЛЮКОЗА	УКСУСНАЯ КИСЛОТА	ПРОПИОНОВАЯ КИСЛОТА	ПИРОВИНОГРАДНА КИСЛОТА
ΩΕΗΙΟ СМ	7,76	0, 138	1,044	0, 043

Пример 7. Рост Оетососсик део!йеттайк в различных условиях величин рН.

Материалы и методы.

Штаммы культивируют при 45°С в среде ΡΟΥ при различных величинах рН. рН доводили при помощи 10% ИН₃ (об./об.) или 10н. НС1. Рост сопровождался измерением оптической плотности при 600 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов 8рес!ток!аг ΟΜΕ6Α, ΒΜΟ ЬаЫесй.

Результат.

Четыре штамма (Э.деоШеттайк) обладали способностью размножаться в диапазоне рН от 5 до 8 (см. фиг. 6Α-6Ό).

Пример 8. Выделение устойчивых к УФ-излучению термофильных бактерий из естественной окружающей среды.

Обработка образцов горячей воды.

Образцы горячей воды концентрировали фильтрацией на 0,22 мкм нитроцеллюлозном фильтре ^ПИроте, Франция), затем помещали в суспензию в 10 мл стерильной воды. Отфильтрованный раствор затем обрабатывали ультразвуком в течение приблизительно 60 с для того, чтобы ресуспендировать бактерии.

Обработка образцов древесины и гравия.

Образцы древесины и гравия погружали в стерильную воду, затем перемешивали на вортексе и обрабатывали ультразвуком в течение приблизительно 60 с.

Обработка образцов камней, мха, лишайника, грязи, ила, биопленки, почвы и каловых масс животных.

- 14 019338

Образцы мха, лишайника, грязи, почвы и каловых масс животных помещали в суспензию в стерильную воду (об./об.), затем перемешивали на вортексе. Образцы затем обрабатывали ультразвуком в течение приблизительно 60 с.

Выделение устойчивых к УФ-излучению термофильных бактерий.

После обработки ультразвуком от 500 мкл до 2 мл суспензии наносили на ΡΟΥ-агаровую обогащенную питательную среду для культивирования, простерилизованной автоклавированием (20 мин при 120°С), содержащей 1 г/л глюкозы (8|§та-Л1бпс11. Франция), 10 г/л пептона (Ника, Франция) и 5 г/л дрожжевого экстракта (Ника, Франция). Затравленные среды для культивирования затем подвергали 3 обработкам УФ-излучением, используя ВЬХ-Е254 Мойик (УйЬег-Ьоигта!, Франция) при 4 мДж/см², где каждую обработку проводили с интервалом 4 ч. После инкубации при 45°С в течение от 3 до 4 дней термофильные представляющие интерес колонии становились видимыми.

Пример 9. Расщепление целлюлозы Оейюсоссик се11и1окйуйсик.

Материалы и методы.

Предварительное культивирование штамма О.Се11и1ок11уйсик проводили в обогащенной питательной среде (см. композицию ниже). Данную предварительную культуру использовали для засевания (1% об./об.) 10 мл обогащенной питательной среды, минимальной среды, содержащей карбоксиметилцеллюлозу (СМ-целлюлозу), или той же самой среды, лишенной источника углерода.

Выращивание бактерий осуществляли при 30°С в пробирке фалькона вместимостью 50 мл при перемешивании (110 об/мин) и сопровождали измерением оптической плотности при 600 нм при помощи спектрофотометра (νΡΆ Вю\\ауе, измеритель плотности клеток).

Обогащенная питательная среда: 2 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л глюкозы; раствор (рН 7), содержащий: 40 мМ МОР8-кислоты, 20 мМ ΝΗ₄Ο, 10 мМ КОН, 10 мМ ΝαΟΗ, 0,5 мкМ СаС1₂, 0,276 мМ №ь8О₊ 0,528 мМ МдС1₂; раствор микропищевых добавок (рН 5): 3 нМ АН₄)₆(МО-)₂₄, 400 нМ Н₃ВО₃, 30 нМ СоС1₂, 10 нМ Си8О₄, 250 нМ МпС1₂, 10 нМ ΖηδΟ₄; раствор витаминов, рН 4, (1 мкг/л каждого): Ό-биотин, ниацин, пиридоксаль-НС1, тиамин-НС1, витамин В12; источник фосфата: 5,7 мМ К₂НРО₄; 20 мкМ ЕеС1₃.

Минимальная среда: раствор (рН 7), содержащий: 40 мМ МОР8-кислоты, 20 мМ N^01, 10 мМ КОН, 10 мМ №1ОН, 0,5 мкМ СаС1₂, 0,276 мМ №₂8О₄, 0,528 мМ МдС1₂; раствор микропищевых добавок (рН 5): 3 нМ (1МН₄)₆(МО₇)₂₄, 400 нМ Н₃ВО₃, 30 нМ СоС1₂, 10 нМ Си8О₄, 250 нМ МпС1₂, 10 нМ Ζη8Ο₄; раствор витаминов, рН 4, (1 мкг/л каждого): Ό-биотин, ниацин, пиридоксаль-НС1, тиамин-НС1, витамин В12; источник фосфата: 5,7 мМ К₂НРО₄; 20 мкМ ЕеС1₃

Результат.

Продемонстрировали, что штамм О.се11и1окйуйсик, обозначаемый ^8ΜΖ под номером О8М 18568^Т(\Уеоп е! а1., 2007) обладает СМ-целлюлозной активностью (\Уеоп е! а1., 2007, 1п!егпайопа1 )оигпа1 ок 8ук!етайс апб Еуо1ийопагу М1сгоМо1о§у, 57, 1685-1688.)

Как показано на фиг. 7, О.се11и1окйуйсик способна размножаться в среде, содержащей СМ-целлюлозу в качестве единственного источника углерода; изменение оптической плотности при 600 нм через 10 дней роста в данной среде было значительным (АОО_{600 нм}=0,5) по сравнению с контрольной культурой (среда, лишенная источника углерода; (АОО_{600 нм}=0,18). Данный результат указывает на то, что О.се11и1ок11уйсик способна не только расщеплять (деполимеризовать) СМ-целлюлозу, но также способна усваивать продукты, получаемые при таком расщеплении (целлобиозу и глюкозу).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ производства биотоплива, включающий приведение органического растительного материала в контакт с бактерией рода Оетососсик или с ферментсодержащим экстрактом такой бактерии и сбор биотоплива или промежуточного продукта.
2. Способ по п.1, включающий следующие стадии:

a) культивирование и/или рост указанной бактерии в аэробных и/или анаэробных условиях;

b) экспонирование органического растительного материала действию композиции, содержащей указанную бактерию или ее экстракт; и

c) сбор по меньшей мере одного биотоплива или промежуточного продукта, полученных в результате модификации органического растительного материала.
3. Способ по п.2, в котором стадии а), Ь) и с) осуществляют одновременно или последовательно.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором биотопливо представляет собой растительное масло, биодизель, биоспирт, такой как этанол, пропанол, бутанол, глицерин, бутандиол или пропандиол, биогаз, сингаз, твердое биотопливо или целлюлозное биотопливо.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором промежуточный продукт выбран из органических кислот и их солей, таких как уксусная кислота, пропионовая кислота, пировиноградная кислота, масляная кислота, молочная кислота или янтарная кислота, или сложных эфиров, включая сложные эфиры, образованные между спиртами и кислотами.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором органический растительный материал представляет собой

- 15 019338 древесину, древесные отходы, лесосечные отходы, промышленные отходы, сельскохозяйственные зерновые культуры, сельскохозяйственные отходы, съедобные и/или несъедобные растения или их фрагменты, солому, отходы садоводства, водные растения, навоз, органические бытовые отходы и/или промышленные органические отходы.
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором органический растительный материал включает лигнин, целлюлозу, гемицеллюлозу, ксилан, глюкороноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан, ксилоглюкан, крахмал, сахарозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, глюкозу, ксилозу, маннозу, арабинозу, рамнозу, галактозу и/или фруктозу.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором используют бактерию, которая является жизнеспособной в присутствии токсических веществ, в особенности в присутствии органических растворителей, например этанола.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором указанный способ осуществляют при температуре в диапазоне приблизительно от 40 до 70°С, предпочтительно от 50 до 60°С.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором указанный способ осуществляют в интервале величин рН от приблизительно 3 до 9,5, предпочтительно от 4 до 8.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором используют бактерию Оейюсоссик, которая способна конвертировать С₆- и/или С₅-сахара, и/или промотировать расщепление целлюлозы с получением глюкозы, и/или промотировать расщепление гемицеллюлозы с получением ксилозы.
12. Способ по любому из пп.1-11, в котором указанная бактерия выбрана из Эейюсоссик деоФеттайк, Эейюсоссик табюбитапк, Эейюсоссик тиггау1 и Эейюсоссик се11и1окйубсик.
13. Способ по п.12, в котором указанная бактерия выбрана из штаммов Эейюсоссик део!йеттайк под номерами доступа Ό8Μ11300, Ό8Μ11301, Ό8Μ11302, ΗΑΜΒΙ2480, ΗΑΜΒΙ2481, ΗΑΜΒΙ2411, или из штаммов Эейюсоссик тиггау1 под номерами доступа Ό8Μ11303, Ό8Μ11305, или из штамма Эейюсоссик се11и1ок11уйсик под номером доступа Ό8Μ18568^Τ, или из штаммов, по существу, схожих с ними, или их мутантов.
14. Способ по любому из пп.2-13, в котором указанная композиция дополнительно содержит один или несколько антивспенивающих веществ и/или питательных веществ.
15. Способ по любому из пп.1-14, в котором бактерию Эейюсоссик используют в комбинации с другой бактерией.
16. Способ по любому из пп.1-15, в котором применяют реактор для конверсии биомассы.
17. Применение бактерии рода Эейюсоссик или ее экстракта для производства биотоплива или его промежуточного продукта из органического растительного материала.