CN101861395B - 使用细菌生产生物能 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产生物能的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及使用奇球菌属(Deinococcus)和/或相关属的细菌进行生物质或生物质衍生物修饰，以生产生物能产物和代谢物。

Description

使用细菌生产生物能
发明领域
本发明涉及生产生物能的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及使用奇球菌属(Deinococcus)和/或相关属的细菌进行生物质或生物质衍生物的修饰，以生产生物能产物和代谢物。
发明背景
使用微生物进行生物质、主要是植物生物质的修饰，以生产生物能产物例如乙醇，已为人所知。
当前的工业方法只允许在30℃附近的温度下培养和生长微生物，以发酵和提取乙醇，这是由于使用的工业微生物(酵母)的脆弱性。它们还必须承担发酵后浓缩乙醇的主要生物能成本，因为目前用于这种发酵的酵母不能忍受高于100g/l的浓度。此外，这些酵母的发酵在实践中只能利用葡萄糖类型的C6糖类。
处理生物材料、尤其是细菌菌株，以赋予其改进的性质，这一点也已为人所知。
例如，S.DelCardayre等的美国专利No.6,716,631描述了基于重组和选择/筛选的反复循环的方法，来赋予整个细胞和整个生物体以所需性质。添加的性质是例如对遗传重组的增加的诱发适应力，增加的基因组拷贝数，增加的表达和/或分泌蛋白和次级代谢物的能力。
通过采用分子遗传学手段，作者提出了适当修饰细胞和生物体的基因组，以赋予其新的、改进的性质的技术。
在US6,716,631中描述的方法使用了不同细胞的群体，将这些细胞进行培养，通过原生质体融合形成了杂交细胞，然后筛选或选择朝向获得所需性质演化的细胞，并重复这些步骤，直到获得至少一个具有所需修饰的细胞。这种方法被提出作为基于菌种改良程序的已知方法的有优势的替代方案。
进行所述融合的原生质体可以源自于原核生物体。
在该美国专利中设想的应用之一是例如乙醇的发酵生产，提出使用所述重组方法，通过所使用的微生物的DNA改组(shuffling)来改进其产率和成本。例如，提到了已知能够催化两相反应的红球菌(Rhodococcus)的同源重组。
国际专利申请No.WO01/023526描述了对辐射具有抗性并能够执行生物治理的细菌，特别是奇球菌(尤其是耐辐射奇球菌(D.radiodurans)和D.geothermalis)的生产和使用，它们被修饰以便更有效地代谢、降解或脱毒无机和有机污染物，例如放射性核素、重金属和有机溶剂。推荐应该对这些细菌进行操作，以表达能够脱毒所述元素的异源酶。细菌菌株可以被操作，以便将由不同基因编码的各种不同功能组合在单一宿主中。
I.Narumi等在2003年9月18日公布的美国专利申请No.2003/0175977中，描述了源自于一株D.radiopugnans的内源质粒pUE30，它可以用作能够在奇球菌属的细菌中自主复制的载体，它还可用于构建也含有能够在大肠杆菌(E.coli)及其衍生株中自主复制、并能够在奇球菌属和大肠杆菌二者的细菌中都能复制的质粒的穿梭载体。
C.B.Fliermans的美国专利No.7,160,715描述了用于测量体内发生的DNA链断裂的分布和频率的方法。这些方法包括使用源自于耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)的PprA蛋白。
以K.Satoh等的名义公布的美国专利申请No.2004/0224320描述了分离和纯化的革兰氏阳性细菌(登记号ATCCBAA-149或其突变株)。该分离株能够降解多种多样的有机污染物，并适合于在存在电离辐射的情况下对各种不同的有机污染物进行生物治理。
此外，最近关于使用微生物菌株进行发酵生产乙醇的专著，在美国能源部(UnitedStatesDepartmentofEnergy)和国家可再生能源实验室(NationalRenewableEnergyLaboratory)的资助下，由J.R.Hettenhaus以《乙醇发酵菌株》(EthanolFermentationStrains)的题目出版(1998年12月16日)。在该文献中，总结了所涉及领域中由参与方做出的贡献，其中指出：
-仅有的可以在现有设备中使用的微生物菌株应该与已经使用的类似，即酵母(Saccharomyces)、发酵单胞菌(Zymomonas)和大肠杆菌(E.coli)；
-在短时期内，增加木糖和阿拉伯糖的发酵可以作为靶目标，但是特别指出增加其他己糖或寡聚体类型的糖类的转化效能没有多少利益；
-长远来说，在较高的操作温度以及酶生产、糖化和水解步骤的组合方面，可能获得利益。
因此，对于发酵生物质和获得乙醇以及任选的其他代谢物的方法，存在着需求，所述方法能够在比现有方法明显更好的操作条件下执行，同时能够比已知方法更容易中试，并且能够产生更廉价和更容易升级的发酵产物。
本发明能够为这些期望带来解决方案，并提供改进的方法，通过生产替代的生物能产品从生物质获取利益，由于化石来源能源的显著减少，这正变得越来越有必要。
发明内容
本发明涉及生产生物能产物或代谢物的方法和组合物。更具体来说，本发明涉及使用特定微生物，从生物质或其衍生物生产生物能产物或代谢物。本发明尤其源自于下述发现，即奇球菌属的微生物具有出人意料的有利性质来修饰或转化生物质或生物质衍生物，以获得可用于在工业规模上经济可靠地生产生物能、特别是乙醇的化合物。
因此，本发明的目标在于生产生物能产物或代谢物的方法，包括将生物质或生物质衍生物接触天然或修饰的、在由胁追造成破坏时具有完全或部分地重新装配其基因组的能力的细菌，优选为天然或修饰的奇球菌属细菌，或其提取物。
本发明的另一个目标是将生物质或生物质衍生物转化成生物能产物或代谢物的方法，包括在存在奇球菌属细菌或在由胁迫造成破坏时具有完全或部分地重新装配其基因组的能力的细菌，或其提取物的情况下，处理所述生物质或生物质衍生物。
在具体方面，本发明涉及的方法包括下列步骤：
a)在好氧和/或厌氧条件下培养和/或生长所述细菌，
b)使用含有所述细菌或其提取物的组合物，将生物质或生物质衍生物修饰成具有工业重要性的生物能产物或代谢物(例如生物能源例如乙醇，化学构件(chemicalbuildingblocks)例如琥珀酸)，以及
c)收集从所述生物质或生物质衍生物的修饰产生的至少一种生物能产物或代谢物
本发明还涉及使用奇球菌属细菌或其提取物，从生物质或生物质衍生物生产生物能产物或代谢物。
本发明还涉及含有奇球菌属细菌和生物质或生物质衍生物的组合物。
本发明还涉及使用上述方法生产的生物能产物。
本发明的方法可以使用各种不同的天然或修饰的奇球菌属菌种来进行，例如但不限于Deinococcusgeothermalis，耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)，Deinococcusmurrayi或Deinococcuscellulosilyticus。本发明显示，奇球菌属细菌可以有效地促进生物燃料例如乙醇、丙醇、丁醇、甘油、丁二醇、丙二醇，或化学上重要的有机酸及其盐例如乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸、乳酸和/或琥珀酸或酯的生产，特别是在上面提到的醇与酸之间形成的酯的生产。
本发明还出人意料地显示，奇球菌可以在例如升高的温度，宽范围的pH，存在溶剂，存在原料底物的条件下操作，适合于从各种不同底物生产大量的生物能产物或代谢物。
因此，本发明提供了以非常有效的方式生产生物能产物或代谢物的新方法和组合物。
附图说明
图1：乙醇对处于指数生长期的DeinococcusgeothermalisDSM11301的杀细菌剂效应：在指数生长期中，含量高于8.2％时，乙醇的杀细菌剂潜力明显。
图2：乙醇对处于静止期的DeinococcusgeothermalisDSM11301的杀细菌剂效应：在静止期中，含量高于11.7％时，乙醇的杀细菌剂潜力明显。
图3：丁醇对处于指数生长期的DeinococcusgeothermalisDSM11300的杀细菌剂效应：在指数期中，含量高于1.5％时，丁醇的杀细菌剂潜力明显。
图4：丁醇对处于静止期的DeinococcusgeothermalisDSM11300的杀细菌剂效应：在静止期中，含量高于2％时，丁醇的杀细菌剂潜力明显。
图5：乙醇对DeinococcusgeothermalisDSM11300生长的影响：黑色方块，0％乙醇；白色方块，0.8％乙醇；黑色圆圈，1.2％乙醇；白色圆圈，2.4％乙醇；黑色三角形，3.1％乙醇。
图6A：pH对D.geothermalisDSM113000(DRH05)生长的影响：黑色方块，pH8；黑色圆圈，pH7；白色方块，pH6；白色圆圈，pH5；黑色菱形，pH4。
图6B：pH对D.geothermalisHAMBI2481(DRH37)生长的影响：黑色方块，pH8；黑色圆圈，pH7；白色方块，pH6；白色圆圈，pH5；黑色菱形，pH4。
图6C：pH对D.geothermalisHAMBI2480(DRH38)生长的影响：黑色方块，pH8；黑色圆圈，pH7；白色方块，pH6；白色圆圈，pH5；黑色菱形，pH4。
图6D：pH对D.geothermalisHAMBI2411(DRH39)生长的影响：黑色方块，pH8；黑色圆圈，pH7；白色方块，pH6；白色圆圈，pH5；黑色菱形，pH4。
图7：D.cellulosilyticus在不同液体培养基中的生长。细菌按照实施例9的材料与方法中的描述生长。黑色圆圈，在丰富培养基中生长；黑色方块，在含有CM-纤维素的基本培养基中生长；白色方块，在缺乏碳源的基本培养基中生长。
发明详述
本发明涉及使用奇球菌属细菌生产生物能产物或代谢物的方法。本发明确实显示了奇球菌属细菌以非常有效的方式，从生物质生产生物能产物或代谢物。
定义
在本申请的上下文中，术语“奇球菌属(Deinococcus)的细菌”包括奇球菌属的野生型或天然变异菌株，以及重组菌株，通过DNA改组技术或通过定向进化技术获得的菌株。
“细菌的提取物”是指从细菌获得的任何级份，例如细胞上清液，细胞碎片，细胞壁，DNA提取物，酶或酶制备物，或任何通过化学、物理和/或酶法处理从细菌产生的制备物，它基本上不含活细菌。
在本发明的上下文中，术语“生物能”是指源自生物质的可再生能源。更具体来说，术语“生物能产物”是指“生物燃料”和所有可以用作燃料的生物质或生物质衍生物修饰的最终产物，例如乙醇。术语“代谢物”是指在将生物质或生物质衍生物修饰成生物能产物的过程中产生的所有可能的中间分子，包括但不限于几种工业上重要的化学产物，例如有机酸和构件。
在本发明的上下文中，术语“生物质”是指活的和最近死亡的可以用作燃料或用于工业生产的生物材料。更通常，生物质是指长成用来发电或生产生物燃料的植物物质，但是它也包括用于生产纤维、化学物质或热量的植物或动物物质。生物质也可以包括可以作为燃料燃烧的可生物降解废物。术语生物质不包括已经被地质过程转变成诸如煤或石油的物质的有机材料。
工业生物质可以从大量类型的植物，包括芒属植物、柳枝黍、大麻、甜菜、小麦、玉米、杨树、柳树、高梁、甘蔗，以及从桉树到油棕的各种不同树种生长。
本发明的生物质包含原料生物质和/或次级生物质。原料生物质是来自生物物质的未加工的材料。例子包括林业产品，例如不适合用于木材或造纸的成熟树木，农业产品，例如草、作物和动物粪肥，以及水生产品，例如藻类和海草。次级生物质是任何最初源自于原料生物质，经历了显著的化学和物理变化的材料。例子包括纸张、皮革、棉花、麻、天然橡胶产品、食品加工副产物以及用过的烹调油。
本文中使用的术语“生物质衍生物”是指所有源自于上面定义的原料生物质和/或次级生物质的分子，特别是任何最初源自于原料生物质、已经经历了显著的化学和物理变化的物质，例如淀粉、纤维素、半纤维素和木质素。
本文中使用的“中间产物平台”是通过生物质衍生物的生理化学或生物化学转化获得的分子，例如糖类、淀粉和生物基合成气体(合成气)。
详细描述
本发明提出了使用奇球菌属细菌从生物质生产生物能产物或代谢物。本发明确实显示出，奇球菌属细菌表现出出人意料的性质，该性质允许它们在通过发酵生物质或生物质衍生物生产生物能产物或代谢物中进行协作。
奇球菌属细菌已经显示出当由胁迫造成破坏时，具有全部或部分地重新装配它们的基因组的能力(PCT/EP2006/005826Radman-Zahradka)。正如前面提到的，这些细菌，特别是耐辐射奇球菌，已被提议用于生物治理。但是，从未公开过或建议过奇球菌属细菌能够从生物质生产生物能产物和代谢物。此外，从未建议过具有所需生物学性质的奇球菌属细菌可以被分离并培养。
现在，本发明第一次显示了能够分离或培养具有至少一种下列性质的奇球菌属细菌，并且所述细菌能够生产生物能产物或代谢物：
-它在高温下(例如大约40-70℃)是活的或有功能的；
-它在从大约3到大约9.5，优选在大约4到大约8之间的pH范围内是活的或有功能的；
-它在存在毒性剂，特别是有机溶剂例如乙醇的情况下是活的或有功能的；
-它能够转化C6和C5糖类；
-它能够促进纤维素消化以产生葡萄糖；
-它能够促进半纤维素消化以产生木糖；
-它在存在适合碳源的情况下能够在好氧和/或厌氧条件下生长。
此外，奇球菌属细菌典型地不具有任何病原性，因此可以没有特定限制地使用。
因此，本发明第一次公开了奇球菌属细菌从生物质制造生物能产物或代谢物的能力，以及它们出人意料的在适应于这些应用的具体条件下生长和培养的能力。本发明还提出了使用任何在由胁迫造成破坏时具有全部或部分地重新装配它们的基因组的能力的细菌，来生产生物能产物或代谢物。
在优选实施方案中，本发明的方法使用了嗜热的奇球菌属菌种，优选选自Deinococcusgeothermalis、耐辐射奇球菌和Deinococcusmurrayi。
在本发明的优选实施方案中，方法使用了在存在毒性剂，特别是存在有机溶剂例如乙醇的情况下可存活的奇球菌属细菌。本申请的确显示，奇球菌属菌株可以在存在高水平溶剂、例如乙醇或丁醇的情况下生长，允许以更有效的方式生产生物燃料。
在本发明的另一个优选实施方案中，方法使用了可以在从大约40到70℃，优选从50℃到60℃的温度范围内生长的细菌。在更优选的实施方案中，方法使用了可以在升高的温度(高于40℃)下，也可以在存在上面公开的毒性剂或有机溶剂的情况下生长的细菌。
在本发明的另一个具体实施方案中，方法使用了在NaCl或等价的盐可能达到大约5％重量/体积的浓度条件下可以存活或有功能的奇球菌属细菌。
在本发明的另一个优选实施方案中，方法使用了在大约3到9.5、优选在4到8之间的pH范围内存活的细菌。确实，本发明人发现，奇球菌属菌株可以在这种严紧条件下维持，这对于转化生物质是特别有利的。
在优选实施方案中，本发明使用了能够转化C6和/或C5糖类，和/或促进纤维素消化以产生葡萄糖，和/或促进半纤维素消化以产生木糖的奇球菌属细菌。
在具体实施方案中，本发明涉及了方法，其中所述奇球菌属细菌能够在存在木聚糖的情况下生长，并促进木聚糖的消化。
这样的酶活性，与高耐热性、宽范围的pH耐受性和毒性剂耐受性相结合，以前从未报道过，是引人注目的。正如在实施例中显示的，可以分离、培养具有上述性质的奇球菌属细菌，并从生物质生产大量的生物能产物或代谢物。
就此而言，本发明的另一个优点在于这样的方法，其中所述奇球菌属细菌生长在含有C6糖、优选为葡萄糖，或更复杂的糖、优选为蔗糖、纤维二糖或淀粉，或C5糖、优选为木糖，来作为碳源的基本培养基中。本发明的另一个优点在于下述事实，即所述奇球菌属细菌可以在存在C3碳水化合物，优选为甘油或丙酮酸钠的情况下生长。
适合用于本发明的细菌的具体例子是保藏号为DSM11300、DSM11301、DSM11302、HAMBI2480、HAMBI2481和HAMBI2411的Deinococcusgeothermalis菌株；保藏号为DSM11303和DSM11305的Deinococcusmurrayi菌株；或保藏号为DSM18568T的Deinococcuscellulosilyticus菌株(列于表1中)，或基本上与其类似的菌株或其突变株。
表1：奇球菌属(Deinococcus)菌株列表
所有上表中列出的菌株都能够在pH7下在PGY类型的培养基中生长。其他适合的培养基公开在实验部分中。
应该理解，具有本文证明和发现的性质的其他奇球菌属菌株，现在可以由专业技术人员，根据本申请的讲述内容，例如通过仿效在实验部分中描述的指导和试验，进行筛选和鉴定。
正如上面提到的，在本申请中使用的奇球菌属菌株可以以天然形式使用，或者可以被修饰(例如化学或遗传地)以获得改进的性质。就此而言，在具体的实施方案中，本发明使用了通过加速进化，或通过DNA改组技术，或通过插入真核生物、原核生物或合成的非奇球菌DNA，或通过插入另一种奇球菌菌株DNA而进行修饰的奇球菌细菌，所述修饰影响了所述细菌的存活力、生长或功能以促进生物质的修饰。
在本发明的另一个实施方案中，使用的细菌可以是有利地使用例如在国际专利申请No.PCT/EP2006/005826中描述的方法重组或修饰的细菌菌株。
正如前面讨论的，本发明显示出，在例如D.geothermalis、耐辐射奇球菌或D.murrayi中选择的奇球菌属细菌或其衍生菌，表现出有利的性质，能够从各种不同的原料底物生产生物能产物或代谢物。因此，本发明涉及使用奇球菌属细菌，从生物质或生物质衍生物生产生物能产物或代谢物。本发明还涉及通过将所述生物质暴露或培养在存在奇球菌属细菌或其提取物的情况下，并回收产生的生物能产物或代谢物，而从生物质或生物质衍生物生产生物能产物或代谢物的方法。
培养或暴露，可以在任何允许生物质或衍生物修饰以产生生物能产物的适合条件条件或环境下进行。就此而言，方法可以按照需要，在反应器中，在发酵罐中，在户外，在存在适合的营养物质或添加剂的情况下进行。方法典型在pH条件，高于40℃的温度和存在适合底物的情况下进行。
本发明的具体目标在于包括下列步骤的方法：
a)在好氧和/或厌氧条件下培养和/或生长所述细菌，
b)使用含有所述细菌或其提取物的组合物，将生物质或生物质衍生物修饰(例如转化或处理)成生物能产物或代谢物，以及
c)收集从所述生物质或生物质衍生物的修饰产生的至少一种生物能产物或代谢物。
本发明的另一个目标在于使用至少一种例如上面描述的细菌或细菌提取物或例如上面描述的组合物，转化生物质或生物质衍生物的方法，包括下列组合：
·在适合的生长和发育条件下将所述细菌菌株或所述细菌菌株提取物进行培养和发育的至少一种操作，
·在适合量的所述细菌菌株或所述细菌菌株提取物的作用下，在适合于所述生物质或生物质衍生物转化的条件下，转化生物质或生物质衍生物的至少一种操作，以及
·收集至少一种源自于所述生物质或生物质衍生物转化的生物能产物或代谢物，特别是收集由此产生的乙醇。
在上述方法中，培养和/或生长所述细菌的第一个步骤，和使用含有所述细菌或其提取物的组合物将生物质或生物质衍生物修饰成生物能产物或代谢物的第二个步骤，可以同时或相继地进行；收集生物能产物或代谢物的第三个步骤，可以与第一和/或第二个步骤同时、或相继地进行。就此而言，生物质可以与细菌在允许所述细菌扩增的适合条件下相接触，从而增加工艺效率。可选地，细菌菌株可以在适合的培养条件下单独扩增，然后添加到生物质中。应该理解，为了将生物质有效转化成大量生物能产物或代谢物所最初使用的细菌的准确量，可以由专业技术人员根据细菌的类型、生物质或衍生物的类型以及培养条件进行调整。
在本发明的方法的具体实施方案中，奇球菌属细菌独立于生物质转化进行生长。
在另一个具体实施方案中，方法使用的组合物包含奇球菌属细菌或其提取物，以及至少一种适合的添加剂或赋形剂，优选为选自消泡剂和营养剂的至少一种剂。适合的消泡剂特别是分散剂、去污剂和表面活性剂，更通常为两亲性化合物。
在具体实施方案中，本发明的方法在转化生物质的反应器中进行。“反应器”是指常规的发酵罐或任何特别设计用以执行本发明的生物质转化装置或系统，因此具体来说包括生物反应器，生物过滤器，旋转式生物接触器，和其他用于处理生物质或生物质衍生物的气相和/或液相生物反应器。可用于本发明的装置可以以连续或分批装料的方式使用。
在反应器中，为了执行本发明的方法，使用了至少一种细菌或细菌提取物，和/或至少一种例如上面定义的组合物，与此同时，所述反应器的安排和提供使得生理化学条件在其中建立并维持，使得所述细菌针对所考虑的应用进行工作，并任选使得细菌在其中可能生长并优选促进生长。
在本发明的方法的另一个实施方案中，细菌在转化生物质或生物质衍生物的过程中在反应器中生长，同时建立并维持使这种细菌可能生长、优选促进生长的适合生理化学条件。例如，可以使用500ml锥形瓶(Erlenmeyer)，其中有50℃温度的100ml167Thermus培养基或下面描述的基本培养基。
在本发明的可选实施方案中，生物质或生物质衍生物的转化在好氧、厌氧或微需氧条件下进行。
根据另一方面，本发明的目标是使用例如上面定义的奇球菌属细菌或细菌提取物，或例如上面定义的组合物，用于转化生物质或生物质衍生物的反应器。
本发明的方法可用于从各种不同类型的生物质生产生物能。在优选实施方案中，生物质包括木材和木材残余料，林业残余料，制造厂残余料，农业作物，农业残余料，可食用和/或不可食用植物或其部分，稻草，园艺残余料，水生植物，动物废料，家畜经营残余料，粪肥，有机城市废料和/或工业有机废料。生物质也可包括可生物降解废物。
在具体实施方案中，本发明涉及将生物质或生物质衍生物或中间产物平台修饰成生物能产物或代谢物的方法，其中生物质衍生物优选为木质素、纤维素、半纤维素、淀粉，其中中间产物平台优选为碳水化合物例如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖、淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和/或果糖。
本发明的具体目标在于生产生物燃料的方法。在本发明的环境中，术语“生物燃料”是指源自于剩余的或最近死亡的生物碳源的燃料。生物燃料可以从可再生资源，特别是植物或动物生物质，或从城市和工业废物生产。本发明的生物燃料包括“第一代生物燃料”和/或“第二代生物燃料”。
第一代生物燃料从植物或动物有机材料，优选从糖、淀粉、植物油或动物脂肪获得。用于生产第一代生物燃料的主要来源是可食用植物或其部分。第一代生物燃料包括植物油、生物柴油、生物醇类、生物气、合成气和固体生物燃料。生物醇类包括乙醇、丙醇和丁醇。更优选，本发明的方法用于生产乙醇、丙醇和丁醇。最优选的生物燃料是乙醇。
第二代生物燃料优选从不可食用植物或植物的不可食用部分生产。它们包括非粮食作物，生物质废物，小麦、玉米的茎秆和木材。优选，本发明的生物燃料包括纤维素生物燃料。
根据起始生物质，生物能产物或代谢物例如生物燃料的生产需要两个连续的步骤：水解步骤，由酶、优选为纤维素酶或漆酶催化，将长的、复杂的碳水化合物链例如纤维素或木质素分别分解成较小的可发酵糖；以及发酵步骤，该步骤将有机化合物例如糖类进一步分解成醇类。应该指出，本发明的奇球菌属菌株可用于任何一个或两个所述反应。本发明的确显示，奇球菌能够水解长的碳水化合物链(例如木聚糖或纤维素)，也能够从C3、C5或C6糖产生代谢物(例如乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇，以及乙酸、丙酸、丙酮酸和丁酸)。但是，应该指出，如果需要，奇球菌属菌株可以与任何其他细菌菌株组合使用。
给出下面的实施例进行说明，而不是限制。
实施例
实施例1：选择试验
为了确定微生物是否具有本发明所需的性质，必须进行特定的试验以便确定属、种和/或细菌菌株是否能够具有所需性质，并在转化生物质或生物质衍生物的方法中发挥作用，并确定可以由此获得哪些显著改进。
本发明的这些特定试验在下述条件下进行：
培养基：
D.geothermalis(D.G.)在50℃和搅拌下培养在好氧培养基中。167培养基用于维持菌株。基本培养基用于发酵实验，特别是用于代谢物的表征。在这种情况下，在用5mlD.G.合生培养物接种后，将500ml培养基在搅拌下在1L锥形瓶中温育1到7天。
167Thermus培养基
胰蛋白胨 1 g
酵母提取物 1 g
琼脂 28 g
次氮基三乙酸 100 mg
CaSO4x2H2O 40 mg
MgCl2x6H2O 200 mg
0.01M柠檬酸铁 0.5 ml
微量元素溶液(参见下文) 0.5 ml
磷酸盐缓冲液(参见下文) 100 ml
H2O 900 ml
用NaOH调整到pH 7.2，在121℃高温高压灭菌15分钟。将磷酸盐缓冲液单独高温高压灭菌，添加到培养基中。
磷酸盐缓冲液
微量元素溶液：
H2SO4 0.5 ml
MnSO4xH2O 2.28 g
ZnSO4x7H2O 0.5 g
H3BO3 0.5 g
CuSO4x5H2O 25 mg
Na2MoO4x2H2O 25 mg
CoCl2x6H2O 45.00 mg
H2O 1000 ml
基本培养基
MOPS缓冲液
碳源
磷酸盐
维生素
微量元素溶液
H2SO4 5 ml
MnSO4xH2O 22.8 g
ZnSO4x7H2O 5 g
H3BO3 5 g
铁源
氨基酸
这些储存溶液为10X浓缩状态，临用时稀释。
细菌漆酶活性的检测
原理：
丁香醛连氮+O2——>氧化的丁香醛连氮+2H2O
漆酶
试剂：
A.100mM磷酸钾缓冲液，在30℃下pH6.5
B.0.216mM丁香醛连氮(在无水乙醇中配制3ml，丁香醛连氮从SigmaProd.获得，No.S-7896)
C.酶
测试 空白
H2O 0.50ml 未发酵培养基0.5ml或稀释液
试剂A 2.20ml 2.20ml
试剂B 0.3ml 0.3ml
试剂C 发酵培养基0.5ml或稀释液 0
在530nm处记录光密度的增加。
在这些条件下，一单位酶在pH6.5和30℃下每分钟产生0.001的光密度增加。
细菌纤维素酶活性检测：
原理：
测试是基于在纤维素降解过程中跟踪NAD向NADH的转化。然后按照供应商的说明书，在340nm处监测吸光度的增加，说明书可以在下列英特网链接上获得：
(http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/18160/Cellulase.pdf)
乙醇生产的检测：
乙醇使用两种方法进行定量。
酶法：
该方法基于在存在乙醇和乙醇脱氢酶的情况下跟踪NAD向NADH的转化。
该反应翻译成340nm处吸光度的增加。对于该测量来说，按照制造商的说明书使用了SigmaN7160试剂盒，说明书可以在下列英特网链接上获得：
(http://www.sigmaaldrich.com/sigma/bulletin/N7160BUL.pdf).
通过反相高效液相色谱法测量
条件：
HPLC：Gilson，带有自动进样器，通过折射计检测，
柱：PhenomenexRezexROA，300mmx7.8mm
柱温：65℃
流动相：0.005N硫酸
流速：0.600ml/min
首先，通过将含有已知浓度乙醇的培养基注入柱子，制作了校正曲线。测量了在22.26min处洗脱的对应于乙醇的峰面积。将校正曲线作图。
接下来，通过将培养上清液注射到柱子中测量了由细菌生产的乙醇的量。测量了在22.26min处洗脱并对应于乙醇的峰面积。通过与校正曲线的比较推导出上清液中存在的乙醇的浓度。
按照常规的分析和评估方法，可以对可能以不同比例产生的其他代谢物进行检测和定量。
细菌是单倍体生物，通过二分裂繁殖，以环境中提供的矿物质和有机物质为食。
它们的气体、特别是对于氧气的需求是可变的，使用的培养和发酵技术必须根据根据它们是严格好氧、严格厌氧还是兼性好氧-厌氧微生物而进行调整。
本发明有利地需要的纤维素酶活性，参与纤维素的降解，同时漆酶活性允许或促进了木质素的降解。
从生物质发酵生产生物能产物例如特别是乙醇和/或其它代谢物，按照操作条件进行，这些操作条件随后被调整以适应于反复测试本发明的条件和技术参数，它们具体来说是细菌培养基的量，温度和/或压力操作条件，以及好氧、厌氧或微需氧发酵的选择。
在上面描述的特定测试和分析后，按照本发明的方法实施选择的天然或遗传修饰菌株。
实施例2：在存在Deinococcusgeothermalis的情况下生产乙醇
在含有100ml处于50℃的基本培养基的500ml锥形瓶中，在50℃下加入1010个D.geothermalis(DG)的接种物。将培养物置于搅拌下以促进通气。
然后准备该培养物用于常规的生物质发酵罐中，其中在最佳条件下，可以在55℃下以出色的产率获得乙醇和其他代谢物。
在有待处理生物质的反应器中1到7天后，通过HPLC定量上面提到的乙醇和代谢物的存在(按照前面描述的方案)。观察到了葡萄糖的消失和伴随的乙醇的产生，其浓度通过分析加以估计。检测到了其他关注的代谢物。在培养基中用木糖取代葡萄糖也允许细菌生长和乙醇生产。
在本实施例的实施方案的一个变体中，通过在相同的罐中同时进行细菌培养和发酵，可以获得类似的结果。
实施例3：乙醇和丁醇对Deinococcusgeothermalis的杀细菌剂效应
材料和方法
本方法可以评估有机溶剂对生长或静止期中的细菌的杀细菌剂效应。测试的溶剂是乙醇和丁醇。测试的细菌属于奇球菌属：
-在40到70℃之间生长
-在pH3到pH9.5之间工作
-能够全部或部分地重新装配它们的基因组裂口，这些裂口由胁迫、尤其是辐射、特别是UV或γ射线，由干燥，由酶的作用，由超声或由化学胁迫造成。
试验在测试的菌株的最适生长温度下进行。从富集培养基中处于静止期的预培养物，以1％v/v接种10ml富集培养基。富集培养基含有：蛋白胨2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l；将溶液通过高温高压(120℃，20分钟)进行灭菌。向该溶液中添加下列溶液：MOPS缓冲液(10X)pH7[酸MOPS400mM，NH4Cl200mM，NaOH1000mM，KOH100mM，CaCl25μM，Na2SO42.76mM，MgCl25.28mM]；微量营养物质(10000X)[(NH4)6(Mo7)O24300mM，H3BO34mM，CoCl20.3mM，CuSO40.1mM，MnCl22.5mM，ZnSO40.1mM]；FeCl3(100X)20mM，在C6H5Na3O720mM中；K2HPO41g/l；将溶液过滤(45μm)除菌。
将200μl培养物分配在96孔微孔板上。为了避免任何溶剂蒸发现象，将微孔板用不透性无菌薄膜覆盖。
一旦达到指数生长期(600nm处光密度为0.5)后或一旦达到静止期(平台)后，加入溶剂。测试的含量是乙醇0到31％，丁醇0到2.5％。然后将培养物在搅拌下温育1小时。
计数：在温育结束时，对于每种溶剂浓度，将20μl培养物转移到另一个微孔板上，并连续稀释(以1/10连续稀释9个孔)。稀释培养基是富集培养基。将5μl每种稀释液的三份平行样铺设在PGY琼脂培养基上。蛋白胨5g/l，酵母提取物2.5g/l，葡萄糖0.5g/l，琼脂14g/l；培养基通过在120℃高温高压灭菌20分钟进行灭菌。一旦允许其生长后，对于被测溶剂的各百分数进行计数，以评估有机溶剂对菌株的影响。
结果
被我们视为细菌存活力丧失时的溶剂浓度，对应于我们观察到相对于对照来说损失一个对数时的最低溶剂浓度。
从在发酵罐中的工业应用前景来看，测试的菌株(图1到4)表现出令人满意的溶剂耐受性。
实施例4：细菌在存在C3、C5和C6碳源情况下的生长
材料与方法
预培养在含有蛋白胨(2g/l)、酵母提取物(5g/l)、葡萄糖(10g/l)的培养基A中或在PGY培养基中进行。在将培养基离心后，将细菌沉淀用基本培养基A洗涤两次，以消除所有接种物中的营养物源。用该接种物接种(1/66)含有1％(w/v)下列碳源之一的培养基A(200μl)：D(+)葡萄糖，D(+)纤维二糖，蔗糖，淀粉，D(+)木糖，来自桦木的木聚糖，甘油，丙酮酸钠。在菌株DRH07、DRH39、DRH08和DRH10的情况下，将谷氨酸(10mM)添加到培养基中。细菌生长在45℃下，在96孔微孔板上，在搅拌下进行，然后使用分光光度计(Chameleon多标记物检测平台板，ScienceTec)在544nm处，或使用spectrostarOMEGA微孔板读板器(BMGLabtech)在600nm处测量光密度。
使用的碳源参比物：来自桦木的木聚糖(95588，Fluka)，纤维二糖(22150，Fluka)，D(+)木糖(95730，Fluka)，葡萄糖(G8270-1KG，Sigma)，蔗糖(S9378-1KG，Sigma)，淀粉(S9765-500G，Sigma)，甘油(453752，CarloErba)，丙酮酸钠(Sigma)。
培养基的组成和制备
PGY培养基：蛋白胨(10g/l)，葡萄糖(1g/l)，酵母提取物(5g/l)，将混合物在120℃高温高压灭菌20分钟。
培养基A：用于制备培养基A的各种不同溶液从过滤除菌的储液制备：
-溶液(pH7)，含有：酸MOPS缓冲液40mM，NH4Cl20mM，KOH10mM，NaOH10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM。
-微量营养物溶液(pH5)：(NH4)6(MO7)O243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM。
-维生素溶液，pH4，(每种1μg/l)：D-生物素，烟酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl，维生素B12。
-磷酸源：K2HPO45.7mM。
-FeCl320μM(制备在柠檬酸钠溶液中，然后过滤)。
结果
表2(下文)中列出的细菌能够在含有C6糖类例如葡萄糖、蔗糖、纤维二糖和淀粉作为唯一碳源的基本培养基(培养基A)中繁殖。应该指出，菌株DRH37和DRH06也能够在存在甘油和丙酮酸钠(C3碳水化合物)的情况下生长。
表3中列出的细菌也能够在含有C5糖类(木糖或木聚糖)作为唯一碳源的基本培养基中繁殖；例外是菌株DRH06和DRH07，它们分别不能在存在木聚糖和木糖的情况下生长。
表2：在各种不同的D.geothermalis和D.murrayi菌种上进行的各种不同C6和C3碳源的同化试验：-ΔOD＜0.2；+ΔOD＝0.2；++0.3≥ΔOD＞0.4；+++0.4≥ΔOD≥0.5；++++ΔOD≥0.6。ΔOD对应于在生长起始时间T0和时间T196小时(大约8天)544nm处OD值之间的差值。
D.geothermalisD.murrayi
1％(w/v)碳源DRH05DRH06DRH07DRH37DRH38DRH39DRH08DRH10
单一C6碳水化合物：
D-(+)-葡萄糖++++++++++++++++
D-(+)-纤维二糖++-+++++++++++++-
蔗糖+++++++++++++++++-
淀粉++++++++++++-++-
单一C3碳水化合物：
甘油---++----
丙酮酸钠-+------
表3：在各种不同的D.geothermalis菌种上进行的各种不同C5和C6碳源的同化试验：-ΔOD＜0.2；+ΔOD＝0.2；++0.3≥ΔOD＞0.4；+++0.4≥ΔOD≥0.5；++++ΔOD≥0.6。ΔOD对应于在生长起始时间T0和时间T64小时(大约2.5天)600nm处OD值之间的差值。
1％(w/v)碳源DRH05DRH06DRH07DRH37DRH38DRH39
D-(+)-葡萄糖++++++++++++++++
木聚糖+++-+++++++++++++
木糖++++++-++++++++
实施例5：细菌在高乙醇浓度中的生长
材料与方法
本方法能够评估微生物在存在高浓度乙醇的情况下生长的能力。测试的细菌属于Deinococcusgeothermalis菌种：
-在40到70℃之间生长
-在pH3到pH9.5之间工作
-能够全部或部分地重新装配它们的基因组裂口，这些裂口由胁迫、尤其是辐射、特别是UV或γ射线，由干燥，由酶的作用，由超声或由化学胁迫造成。
试验在测试的菌株的最适生长温度下进行。对于每种待测试的乙醇含量，从富集培养基中处于静止期的预培养物，以1％v/v接种20ml富集培养基。富集培养基含有：蛋白胨2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l；将溶液通过高温高压(120℃，20分钟)进行灭菌。向该溶液中添加下列溶液：MOPS缓冲液(10X)pH7[酸MOPS缓冲液400mM，NH4Cl200mM，NaOH1000mM，KOH100mM，CaCl25μM，Na2SO42.76mM，MgCl25.28mM]；微量营养物质(10000X)[(NH4)6(Mo7)O24300mM，H3BO34mM，CoCl20.3mM，CuSO40.1mM，MnCl22.5mM，ZnSO40.1mM]；FeCl3(100X)20mM，在C6H5Na3O720mM中；K2HPO41g/l；将溶液过滤(45μm)除菌。
在T0时加入乙醇，含量在0到31％之间不等。对于每种测试的乙醇含量进行生长的跟踪。使用分光光度计(UVLightXS5，SECOMAM)在600nm处读取OD。在下列时间取出1ml等份培养物：T0，T0+1H，T0+3H，T0+18H，T0+20H，T0+22H，T0+24H。
当必须读数时，将培养物在富集培养基中稀释十倍。对于每种测试的乙醇含量可以画出生长曲线。在温育期结束时，对于每种测试的乙醇含量，进行计数以评估乙醇对菌株的影响。
结果
测试的某些菌株，例如DeinococcusgeothermalisDSM11300，能够在含有乙醇的培养基中生长(参见图5)。某些菌株，例如DeinococcusgeothermalisDSM11300，在具有高乙醇含量的培养基中显示出抗性(参见图6A)。
实施例6：通过Deinococcusmurrayi生产目的代谢物
材料与方法
本方法能够评价微生物从生物质或生物质衍生物生产重要代谢物(由甘油，丁二醇，丙二醇和乙酸，丙酸，丙酮酸和丁酸组成)的能力。
测试的细菌属于Deinococcusgeothermalis菌种：
-在40到70℃之间生长
-在pH3到pH9.5之间工作
-能够全部或部分地重新装配它们的基因组裂口，这些裂口由胁迫、尤其是辐射、特别是UV或γ射线，由干燥，由酶的作用，由超声或由化学胁迫造成。
试验在测试的菌株的最适生长温度下进行。从在富集培养基中制备的预培养物(处于静止期)，接种20ml富集培养基：以1％v/v接种。
富集培养基含有：蛋白胨2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l；将溶液通过高温高压(120℃，20分钟)进行灭菌。向该溶液中添加下列溶液：MOPS缓冲液(10X)pH7[酸MOPS400mM，NH4Cl200mM，NaOH1000mM，KOH100mM，CaCl25μM，Na2SO42.76mM，MgCl25.28mM]；微量营养物质(10000X)[(NH4)6(Mo7)O24300mM，H3BO34mM，CoCl20.3mM，CuSO40.1mM，MnCl22.5mM，ZnSO40.1mM]；FeCl3(100X)20mM，在C6H5Na3O720mM中；K2HPO41g/l；将溶液过滤(45μm)除菌。
将培养物在45℃下，在搅拌下留在培养箱中，直到它达到其静止期。一旦静止期达到后，将培养物以4000rpm离心10分钟。将上清液倒入另一个管中，置于-80℃下。HPLCUV分析和折射计(离子交换柱(H+)Biorad，流动相H2SO45mM，流动相流速0.6ml/min，等强度状态)能够鉴定目的代谢物。
结果
测试的某些菌株产生了某些寻找的目的代谢物(表4)。
表4：由DeinococcusmurrayiDSM11305产生的代谢物(以g/l表示)
实施例7：Deinococcusgeothermalis在各种不同pH条件下的生长
材料与方法
菌株在不同pH下的PGY培养基中在45℃下培养。pH使用NH310％(v/v)或HCl10N调整。通过使用spectrostar微孔板读板器OMEGA，BMGLabtech，在600nm处测量光密度，来追踪生长。
结果
四株菌株(D.geothermalis)能够在5到8之间的pH范围内繁殖(参见图6A、6B、6C和6D)。
实施例8：从自然环境分离UV抗性嗜热细菌
热水样品的处理
将热水样品通过经0.22μm硝酸纤维素滤器(Millipore，France)过滤来进行浓缩，然后悬浮在10ml无菌水中。然后将过滤过的溶液超声大约60秒，以重新悬浮细菌。
木材和卵石样品的处理
将木材和卵石样品浸泡在无菌水中，然后涡旋并超声大约60秒。
石头、苔藓、地衣、泥、沉积物、生物膜、土壤和动物排泄物样品的处理
将苔藓、地衣、泥、土壤和动物排泄物样品在无菌水中悬浮(V/V)，然后涡旋。然后将样品超声大约60秒。
分离UV抗性嗜热细菌
在超声后，将500μl到2ml之间的悬液铺于高温高压灭菌(120℃20分钟)的固体PGY琼脂富集培养基上，培养基含有葡萄糖(Sigma-Aldrich，France)1g/l，蛋白胨(Fluka，France)10g/l和酵母提取物(Fluka，France)5g/l。然后将接种的培养基使用4mJ/cm2的BLX-E254biolink(Vilber-Lourmat，France)进行3次UV处理，每次进行的时间间隔为4小时。在45℃温育3到4天后，可以看见目的嗜热菌落。
实施例9：通过Deinococcuscellulosilyticus消化纤维素
材料与方法
D.cellulosilyticus菌株的预培养在富集培养基(组成参见下文)中进行。该预培养物用于将10ml富集培养基接种(1％v/v)到含有羧甲基纤维素(CM-纤维素)的基本培养基，或不含碳源的该同样的培养基中。
细菌的生长在30℃下，在50mlFalcon管中，在搅拌下(110rpm)进行，通过使用分光光度计(WPABiowave，细胞密度计)在600nm处测量光密度来跟踪。
富集培养基：蛋白胨2g/l；酵母提取物5g/l；葡萄糖10g/l；含有下列物质的溶液(pH7)：酸MOPS40mM，NH4Cl20mM，KOH10mM，NaOH10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM；微量营养物溶液(pH5)：(NH4)6(Mo7)O243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM；维生素溶液，pH4(各1μg/l)：D-生物素，烟酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl，维生素B12；磷酸源：K2HPO45.7mM；FeCl320μM。
基本培养基：含有下列物质的溶液(pH7)：MOPS酸40mM，NH4Cl20mM，KOH10mM，NaOH10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM；微量营养物溶液(pH5)：(NH4)6(Mo7)O243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM；维生素溶液，pH4(各1μg/l)：D-生物素，烟酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl，维生素B12；磷酸源：K2HPO45.7mM；FeCl320μM。
结果
证明了DSMZ引用号为DSM18568T(Weon等，2007)的D.cellulosilyticus菌株具有CM-纤维素活性(Weon等，2007，internationaljournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology，57，1685-1688.)。
如图7中所示，D.cellulosilyticus能够在含有CM-纤维素作为唯一碳源的培养基中繁殖；在该培养基中生长10天后，600nm处光密度的变化(ΔDO600nm＝0.5)与对照培养物(不含碳源的培养基；(ΔDO600nm＝0.18))相比是显著的。该结果表明，D.cellulosilyticus不仅能够降解(解聚)CM-纤维素，而且能够同化从该降解产生的产物(纤维二糖和葡萄糖)。

Claims (11)

1.生产乙醇的方法，包括在适于生产乙醇的条件下，将包含葡萄糖的底物接触Deinococcusgeothermalis细菌，以及收集所述乙醇。
2.权利要求1的方法，包括下列步骤：
a)在好氧和/或厌氧条件下培养和/或生长所述细菌，
b)使用含有所述细菌的组合物，将包含葡萄糖的底物修饰成乙醇，以及
c)收集从所述修饰产生的乙醇。
3.权利要求2的方法，其中步骤a)、b)和c)同时或相继进行。
4.权利要求1的方法，其中所述细菌在存在乙醇的情况下是可存活的。
5.权利要求1的方法，其中所述细菌在从40到70℃的温度范围内生长。
6.权利要求1的方法，其中所述细菌在3到9.5之间的pH范围内是能存活的或使用。
7.权利要求1的方法，其中所述细菌选自保藏号为DSM11300、DSM11301、DSM11302、HAMBI2480、HAMBI2481、HAMBI2411的Deinococcusgeothermalis菌株。
8.权利要求2的方法，其中所述组合物还包含一种或多种消泡剂和/或营养剂。
9.权利要求1的方法，其中所述细菌通过加速进化，或通过DNA改组技术，或通过插入真核生物、原核生物或合成的非奇球菌DNA，或通过插入另一种奇球菌菌株DNA而进行修饰，所述修饰影响所述细菌的存活力、生长或功能，以便促进生物质的修饰。
10.权利要求1的方法，其中使用转化生物质的反应器。
11.Deinococcusgeothermalis细菌在从包含葡萄糖的底物生产乙醇中的应用。
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