JP2020513747A - フィトエンを産生する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、フィトエンを産生及び蓄積するように遺伝子改変した組換えデイノコッカス細菌と、フィトエンを産生するためのその使用とに関する。特に、本発明は、遺伝子改変デイノコッカス細菌を使用してフィトエンを産出する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、微生物学の分野、特に生合成経路エンジニアリングの分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子改変細菌を使用するフィトエン産生の分野に関する。
カロテノイドは、すべての光合成生体によって及び一部の従属栄養成長細菌や真菌において合成される天然色素の類である。動物はこれらの分子を新しく合成することができないことから、カロテノイドは、食品サプリメント、動物用飼料添加剤、又はニュートラシューティカルズとして広く市販されている。また、カロテノイドは、着色剤として又は化粧料や医薬の目的での多様な用途がある。
有色カロテノイドが最も広く研究されているものの、フィトエン及びフィトフルエンなどの無色カロテノイドは同様の有効で有益な活性を示している。これらのカロテノイドは、大多数の果物や野菜に見受けられ、ＵＶ吸収剤、抗酸化剤、及び抗炎症剤として作用し得る。つまり、カロテノイドは化粧料、栄養摂取、及び治療学において、特に皮膚障害の処置に有効であることが分かっている。
フィトエン（7,8,11,12,7’,8’,11’,12’-オクタヒドロ-ψ、ψ-カロチン）は、カロテノイド生合成経路における最初のカロテノイドであり、２０個の炭素原子の前駆物質であるゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）の二量体化によって産生される。この反応は酵素のフィトエンシンターゼによって触媒される。そして前駆物質として、フィトエンは不飽和化され、その後にフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、最後にリコピンを形成する。
フィトフルエンとフィトエンとは、他のカロテノイドすべての前駆物質であるので、これらの化合物の生合成を扱う調査において広く研究されている。しかしながら、これらは他の分野の研究においては大きく見過ごされている。結果として、現在のところ、任意の生物学的プロセスを介してフィトエンを産生するため、特にフィトフルエンを除くフィトエンを産生するために利用可能な現行の方法は存在しない。
本発明は、好ましくはフィトフルエンを除く相当量のフィトエンを産生及び蓄積ように遺伝子改変された組換えデイノコッカス（Deinococcus）細菌と、フィトエンを産生するための該組換え細菌の使用に関する。
したがって、第１の態様において、本発明はフィトエンを産生する方法に関し、該方法は、フィトエンを産生するために適切な条件下で組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に該フィトエンを回収するステップとを含み、該組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンシンターゼ活性の増大とフィトエンデサチュラーゼ活性の低下とを示すように遺伝子改変される。
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌はいずれのフィトエンデサチュラーゼ活性も示さない。組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子を不活性化することで、好ましくは該遺伝子のすべて若しくは一部を欠失すること又はナンセンスコドン、カセット、遺伝子若しくはフレームシフトを誘発する突然変異を導入することで、遺伝子改変することができる。好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子のすべて又は一部を欠失することで遺伝子改変される。
また、組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンシンターゼをコードするネイティブ遺伝子を過剰発現するように、フィトエンシンターゼをコードする異種遺伝子を発現するように、フィトエンシンターゼをコードするとともにコードした酵素のフィトエンシンターゼ活性を向上させる突然変異を含むネイティブ遺伝子を発現するように、又はフィードバック耐性フィトエンシンターゼをコードする遺伝子を発現するように、遺伝子改変することができる。
一部の実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、さらに、ＦＰＰシンターゼ活性の増大、ＤＸＰシンターゼ活性及び／又はＩＰＰイソメラーゼ活性の増大、好ましくはＦＰＰシンターゼ活性、ＤＸＰシンターゼ活性、及びＩＰＰイソメラーゼ活性の増大をさらに示すことができる。
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、Ｄ．ジオサーマリス（D.geothermalis）、Ｄ．ムライ（D.murrayi）、Ｄ．グランディス（D.grandis）、Ｄ．アクアティカス（D.aquaticus）、Ｄ．インディカス（D.indicus）、Ｄ．セルロシリティカス（D.cellulosilyticus）、Ｄ．デポリメランス（D.depolymerans）、及びＤ．マリコペンシス（D.maricopensis）よりなる群から選択されるデイノコッカス細菌である。より好ましくは、組換えデイノコッカス細菌はデイノコッカスジオサーマリス細菌である。
組換えデイノコッカス細菌は、特に好気状態及び炭素源としてのグルコースの存在下で培養するとき、好ましくは、少なくとも２０ｍｇ／ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）のフィトエンを産生することができる。
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、１５−ｃｉｓフィトエンであるフィトエンの一異性体のみを産生し、フィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産生しない。
一部の実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、高温性のデイノコッカス、好ましくはＤ．ジオサーマリスであり、フィトエンを産生するために適切な条件下における組換えデイノコッカス細菌の培養は、４０℃〜５０℃、好ましくは４５℃〜４８℃に含まれる温度で行われる。
第２の態様において、本発明はまた、本発明の方法に使用される組換えデイノコッカス細菌、又はその細胞抽出物、好ましくは細胞膜を含む画分にも関する。好ましくは、該細胞抽出物はフィトエンを含み、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを含まない。好ましくは、本発明の細胞抽出物は、１５−ｃｉｓフィトエンであるフィトエンの一異性体のみを含む。
他の態様において、本発明はまた、フィトエンを産生するための本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用にも関する。
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の方法によって取得したフィトエン、好ましくは１５−ｃｉｓフィトエンのみを含む組成物にも関し、該組成物は任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを含まない。好ましくは、組成物は、化粧料組成物、医薬組成物若しくはニュートラシューティカルズ組成物、ニュートリコスメティクス組成物、又は食品添加剤若しくは飼料添加剤である。
デイノコッカス細菌は、１９５６年にＡｎｄｅｒｓｏｎとその協働者によって最初に単離された非病原細菌である。これらの好極限性生体は、バイオマスを用いる工業プロセス又は反応における使用に提案されている（例えば国際公開第WO2009/063079号、国際公開第WO2010/094665号又は国際公開第WO2010/081899号参照）。発明者らは、デイノコッカスの代謝及び遺伝学についてのその確かな知識に基づき、デイノコッカス細菌が、大量生産に対応する条件下で相当量のフィトエンを産生するように遺伝子改変可能であることを見いだした。さらに、発明者らは、この組換え細菌がフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを除くフィトエンを産生し、それによってさらなる精製ステップの必要性を少なくできることを示した。
［定義］
本発明の文脈において、「デイノコッカス（Deinococcus）」という用語は、デイノコッカスの野生型株又は自然変異株、例えば進化促進、突然変異誘発や、ＤＮＡシャフリング技術によって取得した株、又は真核生物性核酸、原核生物性核酸、及び／若しくは合成性核酸の挿入により取得した組換え株を含む。デイノコッカス細菌は、限定ではなく、Ｄ．アクチノスクレラス（D.actinosclerus）、Ｄ．アエリウス（D.aerius）、Ｄ．ａｅｒｏｌａｔｕｓ、Ｄ．アエロフィルス（D.aerophilus）、Ｄ．アエセリウス（D.aetherius）、Ｄ．ａｌｐｉｎｉｔｕｎｄｒａｅ、Ｄ．アルティトゥディニス（D.altitudinis）、Ｄ．アンタルクティカス（D.antarticus）、Ｄ．アパチェンシス（D.apachensis）、Ｄ．アクアティカス（D.aquaticus）、Ｄ．アクアティカス、Ｄ．アクアティリス（D.aquatilis）、Ｄ．ａｑｕｉｒａｄｉｏｃｏｌａ、Ｄ．カエニ（D.caeni）、Ｄ．カリ（D.carri）、Ｄ．セルロシリティカス（D.cellulosilyticus）、Ｄ．シトリ（D.citri）、Ｄ．ｃｌａｕｄｉｏｎｉｓ、Ｄ．テジョネンシス（D.daejeonensis）、Ｄ．デポリメランス（D.depolymerans）、Ｄ．デゼルティ（D.desertii）、Ｄ．ｅｎｃｌｅｎｓｉｓ、Ｄ．フィカス（D.ficus）、Ｄ．フリゲンス（D.frigens）、Ｄ．ジオサーマリス（D.geothermalis）、Ｄ．ゴビエンシス（D.gobiensis）、Ｄ．グランディス（D.grandis）、Ｄ．ｇｕａｎｇｒｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｇｕｉｌｈｅｍｅｎｓｉｓ、Ｄ．ホホカメンシス（D.hohokamensis）、Ｄ．ホピエンシス（D.hopiensis）、Ｄ．ヒュミ（D.humi）、Ｄ．インディカス（D.indicus）、Ｄ．マリコペンシス（D.maricopensis）、Ｄ．マルモリス（D.marmoris）、Ｄ．メタリ（D.metalli）、Ｄ．ｍｅｔａｌｌｉｌａｔｕｓ、Ｄ．ミサセンシス（D.misasensis）、Ｄ．ムライ（D.murrayi）、Ｄ．ナヴァホネンシス（D.navajonensis）、Ｄ．パパゴネンシス（D.papagonensis）、Ｄ．ペラリディリトリス（D.peraridilitoris）、Ｄ．フォエニシス（D.phoenicis）、Ｄ．ピメンシス（D.pimensis）、Ｄ．ピシス（D.piscis）、Ｄ．プロテオライティカス（D.proteolyticus）、Ｄ．プニセウス（D.puniceus）、Ｄ．ラディオデュランス（D.radiodurans）、Ｄ．ｒａｄｉｏｍｏｌｌｉｓ、Ｄ．ラディオフィルス（D.radiophilus）、Ｄ．ラディオピュグナンス（D.radiopugnans）、Ｄ．ラディオレジステンス（D.radioresistens）、Ｄ．ラディオトレランス（D.radiotolerans）、Ｄ．ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｉｔｉｓ、Ｄ．ロゼウス（D.roseus）、Ｄ．ｓａｈａｒｉｅｎｓ、Ｄ．サキシコーラ（D.saxicola）、Ｄ．ソリ（D.soli）、Ｄ．ソノレンシス（D.sonorensis）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．シンジャンゲンシス（D.xinjiangensis）、Ｄ．ｘｉｂｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ヤバパイエンシス（D.yavapaiensis）細菌、又はそれらの任意の組合せ、などの任意のデイノコッカス属細菌を指すことができる。好ましくは、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリス（D.geothermalis）、Ｄ．ムライ（D.murrayi）、Ｄ．グランディス（D.grandis）、Ｄ．アクアティカス（D.aquaticus）、Ｄ．インディカス（D.indicus）、Ｄ．セルロシリティカス（D.cellulosilyticus）、Ｄ．デポリメランス（D.depolymerans）、又はＤ．マリコペンシス（D.maricopensis）を指す。より好ましくは、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ムライ、又はＤ．マリコペンシスを指す。さらにより好ましくは、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリスを指す。
「組換え細菌」及び「遺伝子改変細菌」又は「操作細菌」という用語は、本明細書において互換的に使用され、自然には見受けられないとともに１つ以上の遺伝要素の欠失、挿入、又は改変のいずれかの結果としての改変ゲノムを含む細菌を指す。
「組換え核酸」とは、操作されているとともに、それ自体野生型細菌には見受けられない核酸を指す。一部の特定の実施形態において、この用語は、自然起源のプロモーターとは異なるプロモーターに作動可能に連結された遺伝子に関し得る。
「遺伝子」という用語は、タンパク質をコードする任意の核酸を指す。遺伝子という用語には、ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡなどのＤＮＡやＲＮＡが含まれる。遺伝子は、まず、例えば組換え技術、酵素技術、及び／又は化学技術により調製され、その後宿主細胞又はインビトロ系において複製され得る。遺伝子は、通常、所望のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含する。遺伝子は、転写ターミネーター又はシグナルペプチドなどのさらなる配列を含み得る。
「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列による発現を制御するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
「制御配列」という用語は、遺伝子の発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列はネイティブ又は異種であり得る。既知であり当業者が現在使用している制御配列が好ましい。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを含むがこれらに限定されない。好ましくは、制御配列はプロモーターと転写ターミネーターとを含む。
「発現カセット」という用語は、コード領域、すなわち遺伝子と、調節領域、すなわち作動可能に連結された１つ以上の制御配列を含むものとを包含する核酸構築物を指す。好ましくは、制御配列はデイノコッカス宿主細胞に適切である。
本明細書に使用するとき、「発現ベクター」という用語は、発現カセットを包含するＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、発現ベクターは直線状又は環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。
本明細書に使用するとき、「ネイティブ」又は「内在性」という用語は、細菌に関して、該細菌に自然に存在する遺伝要素又はタンパク質に関する。「異種」という用語は、細菌に関して、該細菌に自然に存在しない遺伝要素又はタンパク質に関する。
本明細書に使用するとき「過剰発現」及び「発現の増大」という用語は互換的に用いられ、例えば野生型細菌、又はフィトエンを産生するために遺伝子的に改変されていないとされる細菌などの非改変細菌と比較して遺伝子又は酵素の発現が増大することを意味する。酵素発現は、通常、該酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることによって増大される。遺伝子又は酵素が本発明の細菌に自然には存在しない、つまり異種の遺伝子又は酵素の実施形態において、「過剰発現」及び「発現」という用語は互換的に用いられ得る。遺伝子発現を増大するために、当業者は、細菌における遺伝子コピー数の増加、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーター、つまり強力なプロモーターの使用、対応するメッセンジャーＲＮＡを安定化させるか又はリボソーム結合部位（RBS）配列やその周囲配列を改変する要素の使用など、任意の既知の技術を使用可能である。特に、過剰発現は、細菌における遺伝子コピー数を増加させることで得られる。遺伝子置換又はＩＳ配列における多コピー挿入を含む、当業者に既知の組換え法によって、遺伝子の１以上のコピーがゲノムに導入され得る（例えば国際公開第WO2015/092013号参照）。好ましくは強力なプロモーターの制御下におかれた遺伝子を含む発現カセットが、好ましくは、ゲノムに組み込まれる。あるいは、遺伝子は、好ましくは強力なプロモーターの制御下におかれた目的の遺伝子を有する発現カセットを含む発現ベクター、好ましくはプラスミドに保持され得る。発現ベクターは、複製起点の性質に応じて、細菌内に１つ以上のコピーを存在させることができる。また、遺伝子は、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーターの使用により過剰発現することができる。例として、内在性遺伝子のプロモーターは強力なプロモーター、すなわち高レベル発現を誘導するプロモーターにより置換することができる。本発明での使用に適するプロモーターは当業者に既知であり、構成的又は誘導的、及びネイティブ又は異種であり得る。
本明細書に使用するとき、「活性の増大」という用語は、例えば野生型細菌、又はフィトエンを産生又は蓄積するために遺伝子的に改変されていないとされる細菌などの非改変細菌と比較して増大した酵素活性を指す。これは、例えばネイティブ遺伝子の過剰発現又は異種遺伝子の発現によって増大するものであり得る。
本明細書に使用するとき、「活性の低下」という用語は、例えば野生型細菌、又はフィトエンを産生又は蓄積するために遺伝子的に改変されていないとされる細菌などの非改変細菌と比較して低下した酵素活性を指す。これは、例えばそうした活性の原因となる酵素をコードする遺伝子の不活性化によって低下するものであり得る。
本明細書に使用するとき、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列のアライメントにおける位置の整合数（％）（同一のアミノ酸残基）を指す。配列同一性は、配列のギャップを最小化しながら重複と同一性とを最大化するようにアライメントされるときに配列を比較することで決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、多くの数学的グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムの任意のものを使用して決定することができる。類似する長さの配列は、配列を全長にわたり最適にアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン・ウンシュアルゴリズム、Needleman及びWunsch、1970）を使用して好ましくはアライメントされる一方で、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例として、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（Smith及びWaterman、1981）又はアルトシュル（Altschul）アルゴリズム（Altschul他、1997；Altschul他、2005）を使用して好ましくはアライメントされる。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアライメントは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネット上のウェブサイトにおいて公的に利用可能なコンピュータソフトウエアを使用して、当該技術の範囲内である種々の方法で行うことができる。当業者は、比較される配列全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のため、アミノ酸配列同一性率値は、ニードルマン・ウンシュアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアライメントを行う、ペアワイズシーケンスアライメントプログラムであるＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、全ての検索パラメータはデフォルト値、即ち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップエクステンド＝０．５に設定される。
「低厳密性」、「中厳密性」、「中・高厳密性」、「高厳密性」、及び「超高厳密性」という用語は、ハイブリダイゼーションの条件を指す。オリゴヌクレオチドプローブと同種のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを測定するための適切な実験条件は、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片又はＲＮＡを含むフィルタを、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）において１０分間予浸すること、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの超音波処理及び変性されたサケ精子ＤＮＡの溶液においてフィルタをプレハイブリダイゼーションすること、次に、１０ｎｇ／ｍｌ濃度の、ランダムプライムによる３２Ｐ−ｄＣＴＰ−標識（比活性>1×109cpm/μg）プローブを含有する同じ溶液において、約４５℃で１２時間ハイブリダイゼーションすること（Feinberg及びVogelstein、1983）、に関する。種々の厳密性条件用に、フィルタは、少なくとも５５℃（低厳密性）、より好ましくは少なくとも６０℃（中厳密性）、なおより好ましくは少なくとも６５℃（中・高厳密性）、さらにより好ましくは少なくとも７０℃（高厳密性）、及びさらにより好ましくは少なくとも７５℃（超高厳密性）で、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおいて、３０分間、２回洗浄される。
本明細書に使用するとき、「約」という用語は、特定値の±１０％である値の範囲を指す。例として、「約２０」は、２０の±１０％、又は１８〜２２を含む。好ましくは、「約」という用語は、特定値の±５％である値の範囲を指す。
本明細書に使用するとき、「ＣｒｔＢ」又は「フィトエンシンターゼ」という用語は、フィトエンシを得るために２分子のゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）の縮合を触媒するｃｒｔＢ遺伝子によってコードされるフィトエンシンターゼ酵素（EC2.5.1.32）を指す。
「ＣｒｔＩ」又は「フィトエンデサチュラーゼ」又は「フィトエンデヒドロゲナーゼ」という用語は、最大４つの不飽和化段階を触媒する（EC1.3.99.28［フィトエンデサチュラーゼ（ニューロスポレン形成）］、EC1.3.99.29［フィトエンデサチュラーゼ（ζ−カロチン形成）］、及びEC1.3.99.30［フィトエンデサチュラーゼ］（3,4-ジデヒドロリコピン形成））ｃｒｔＩ遺伝子によってコードされるフィトエンデサチュラーゼ酵素（EC1.3.99.31）を指す。好ましい実施形態において、フィトエンデサチュラーゼ酵素は、フィトエンを、フィトフルエン及びζ−カロチンを介して、ニューロスポレン及びリコピンに変換する。
生体に応じて、上述の酵素及びコードする遺伝子の名称は変わり得る。しかしながら、明確にするため、本明細書において、これらの用語は酵素又は遺伝子の由来とは関係なく使用される。
本明細書に使用するとき、「フィトエン」という用語は、任意のフィトエン異性体、好ましくは１５−ｃｉｓフィトエンを指す。
第１の態様において、本発明は、フィトエンシンターゼ活性の増大とフィトエンデサチュラーゼ活性の低下とを示すように遺伝子改変した組換えデイノコッカス細菌に関する。本発明者らは、そうした細菌が、細菌生存性又は成長性を変えることなく、フィトフルエンを除く相当量のフィトエンを産生及び蓄積することができるということを実際に示した。
本発明の組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンの産生及び蓄積を増大させるように遺伝子改変したデイノコッカス細菌である。野生型細菌と比較して、この組換え細菌は、上述のような遺伝子改変だけでなく、フィトエン産生に直接的につながらないが抗生物質耐性又は基質範囲を拡大する酵素活性などのフィトエンの工業的製造に有利性を得るさらなる改変を含み得る。
本発明の組換えデイノコッカス細菌において、フィトエンシンターゼ活性は、非改変細菌と比較して増大する。
フィトエンシンターゼ活性は、当業者に既知の任意の方法によって測定することができる。例として、該活性は、フィトエンシンターゼをＧＧＰＰとともにインキュベートし、フィトエンを回収し、フィトエンを液体シンチレーションカウントによって定量化することで評価することができる（例えばWelsch他、The Plant Cell、Vol.22:3348-3356、2010参照）。
好ましくは、フィトエンシンターゼ活性の増大は、内在性ＣｒｔＢ遺伝子を過剰発現させるように、異種ＣｒｔＢ遺伝子を発現させるように、及び／又は内在性フィトエンシンターゼの改良変異体を発現させるようにデイノコッカス細菌を遺伝子改変することで得られる。
特に、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする異種核酸を含むことができる、及び／又はフィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする内在性核酸を過剰発現することができる。
遺伝子発現を増大させるために（すなわち遺伝子を過剰発現させるために）、当業者は、細菌における遺伝子コピー数の増加、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーター、つまり強力なプロモーターの使用、対応するメッセンジャーＲＮＡを安定化させるか又はリボソーム結合部位（RBS）配列やその周囲配列を改変する要素の使用など、任意の既知の技術を使用可能である。
特定の実施形態において、過剰発現は、細菌における遺伝子コピー数を増加させることで得られる。遺伝子置換を含む、当業者に既知の組換え法によって、遺伝子の１以上のコピーがゲノムに導入され得る。好ましくは、遺伝子を含む発現カセットがゲノムに組み込まれる。
あるいは、遺伝子は、目的の遺伝子を有する発現カセットを含む発現ベクター、好ましくはプラスミドに保持され得る。発現ベクターは、複製起点の性質に応じて、細菌内に１〜５、２０、１００又は５００のコピーを存在させることができる。
他の特定の実施形態において、遺伝子の過剰発現は、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモーターの使用により得られる。例として、内在性遺伝子のプロモーターを強力なプロモーター、すなわち高レベル発現を誘導するプロモーターにより置換することができる。本発明での使用に適するプロモーターは当業者に既知であり、構成的又は誘導的、及びネイティブ又は異種であり得る。
本発明の有用な発現カセットは、ＣｒｔＢ遺伝子の発現をもたらす転写プロモーター及び転写ターミネーターを通常は含む１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、少なくともＣｒｔＢ遺伝子を含む。
制御配列は、宿主細胞によって認識されるプロモーターを含むことができる。プロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、デイノコッカス細菌において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得る。プロモーターはネイティブ又は異種のプロモーターであり得る。好ましいプロモーターはネイティブ及びデイノコッカスプロモーターである。これに関して、種々のプロモーターが研究されており、デイノコッカス細菌における遺伝子発現に使用されている。適切なプロモーターの例は、翻訳伸張因子Ｔｕ遺伝子のｔｕｆＡ（例えばＤ．ラディオデュランス：DR_0309）及びｔｕｆＢ（例えばＤ．ラディオデュランス：DR_2050）からのＰｔｕｆＡ及びＰｔｕｆＢプロモーター、ｐＩ３に位置するｒｅｓＵ遺伝子のプロモーター、ｇｒｏＥＳＬオペロンのＰｇｒｏＥＳＬプロモーター領域（Lecointe他、2004、Mol Microbiol53:1721-1730、Meima他、2001、J Bacteriol183:3169-3175）、又はそのようなプロモーターの誘導体を含む。好ましくは、プロモーターは強力な構成的プロモーターである。
また、制御配列は、転写を終結するためにデイノコッカス細菌により認識される転写ターミネーターを含むことができる。ターミネーターは、遺伝子の３’末端に作動可能に連結される。例としてＬｅｃｏｉｎｔｅ他（2004、Mol Microbiol53:1721-1730）によって記載されるターミネーターであるターム１１６（term116）など、デイノコッカス細菌において機能する任意のターミネーターを本発明において使用することができる。
任意的に、発現カセットはまた、組換え細菌の選択を容易にする選択マーカーを含むことができる。通常、選択マーカーは、抗生物質耐性をコードするか又は独立栄養性を与える遺伝子である。
特定の実施形態において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、強力な構成的プロモーターと作動可能に連結したＣｒｔＢ遺伝子を含む発現カセットを含む。
発現カセットは、細菌のゲノムに組み込まれることができる、及び／又は発現ベクターにエピソーム形態で保持することができる。
好ましくは、発現カセットは、細菌のゲノムに組み込まれる。遺伝子置換を含む、当業者に既知の組換え法によって、発現カセットの１以上のコピーがゲノムに導入され得る。発現カセットは、内在性ＣｒｔＢ遺伝子を置換可能である、又は他の場所でゲノムに組み込むことができる。
また、発現カセットは、標的遺伝子を不活性化するためにゲノムに組み込むことができる。特定の実施形態において、発現カセットは、ＣｒｔＩ遺伝子を不活性化するためにゲノムに組み込まれる。他の実施形態において、発現カセットは、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）遺伝子を不活性化するためにゲノムに組み込まれる。標的遺伝子は、カセットの挿入によって置換される又は不活性化することができる。
あるいは又はさらに、発現カセットは、例えば挿入配列（IS）など、非コード配列でゲノムに組み込むことができる（例えば国際公開第WO2015/092013号参照）。
発現カセットがエピソーム形態に保持される実施形態において、発現ベクターは、複製起点の性質に応じて細菌に１つ以上のコピーを存在させることができる。
デイノコッカス宿主細胞は、一時的又は安定的な方法で形質転換、遺伝子導入、又は形質導入することができる。本発明の組換えデイノコッカス細菌は、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、形質導入、コンピテント細胞形質転換、プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、遺伝子銃「ジーンガン」形質転換、ＰＥＧ媒介形質転換、脂質性形質転換又は遺伝子導入、化学的媒介遺伝子導入、酢酸リチウム媒介形質転換、又はリポソーム媒介形質転換などの当業者に既知の任意の方法によって取得することができる。
また、「組換えデイノコッカス細菌」という用語は、遺伝子改変した宿主細胞だけでなく、特に複製時に発生した突然変異により、親宿主細胞とは同じではない任意の子孫も含む。
本発明の組換え細菌において発現又は過剰発現されるＣｒｔＢ遺伝子は、内在性フィトエンシンターゼ、異種フィトエンシンターゼ、又は内在性フィトエンシンターゼの改良変異体をコードすることができる。
特に、フィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、既知の細菌、藻類、又は植物のフィトエンシンターゼから選択されるような、任意の既知のフィトエンシンターゼであってもよい。
フィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、パントエアアグロメランス（Pantoeaagglomerans）のＣｒｔＢ（GenBankアクセション番号：AFZ89043.1、配列番号１）又はパラコッカス菌種（Paracoccus sp）＿Ｎ８１１０６（GenBankアクセション番号：BAE47469.1、配列番号２）のＣｒｔＢなどの非デイノコッカスのフィトエンシンターゼから選択することができる。
好ましくは、フィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、デイノコッカス細菌由来の任意のフィトエンシンターゼから選択することができる。
デイノコッカスフィトエンシンターゼ（CrtB）の例は、Ｄ．ジオサーマリス（Uniprotアクセション番号：Q1J109、配列番号３）、Ｄ．アクチノスクレラス（Uniprotアクセション番号：A0A0U3KC93、配列番号４）、Ｄ．デゼルティ（Uniprotアクセション番号：C1D2Z3、配列番号５）、Ｄ．ゴビエンシス（Uniprotアクセション番号：H8GYF6、配列番号６）、Ｄ．マリコペンシス（Uniprotアクセション番号：E8UAM8、配列番号７）、Ｄ．ペラリディリトリス（Uniprotアクセション番号：L0A567、配列番号８）、Ｄ．プニセウス（Uniprotアクセション番号：A0A172TDE8、配列番号９）、Ｄ．ラディオデュランス（Uniprotアクセション番号：Q9RW07、配列番号１０)、Ｄ．ソリ（Uniprotアクセション番号：A0A0F7JV05、配列番号１１）及び、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（Uniprotアクセション番号：A0A0A7KGT0、配列番号１２）のフィトエンシンターゼを含むがこれらに限定されない。
フィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドはまた、フィトエンシンターゼ活性を示すとともに、上述の任意のフィトエンシンターゼに対して少なくとも６０％、好ましくは６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する任意のポリペプチドであってもよい。
特定の実施形態において、フィトエンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、
ａ） 配列番号１〜１２よりなる群から選択される、好ましくは配列番号３〜１２よりなる群から選択される、より好ましくは配列番号３であるアミノ酸配列を含む、又はそれからなるポリペプチド、及び、
ｂ） フィトエンシンターゼ活性を示すとともに、配列番号１〜１２よりなる群から選択される任意の配列、好ましくは配列番号３〜１２よりなる群から選択される任意の配列、より好ましくは配列番号３に対して少なくとも６０％、好ましくは６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、よりなる群から選択される。
本発明に使用されるＣｒｔＢ遺伝子はまた、改良フィトエンシンターゼ、すなわち、野生型酵素のアミノ酸配列と比較して配列に少なくとも１つの突然変異を有する酵素であって、該突然変異はその活性の増大、特異的触媒活性の増大、基質に対する特異性の増大、タンパク質若しくはＲＮＡの安定性の増大、及び／又は酵素の細胞内濃度の増大をもたらす、あるいはフィードバック耐性突然変異体をもたらすものであるもの、をコードすることができる。
実施形態において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、改良フィトエンシンターゼ、特に改良デイノコッカスフィトエンシンターゼをコードするＣｒｔＢ遺伝子を発現する。好ましくは、改良デイノコッカスフィトエンシンターゼは触媒活性の増大を示す。
さらに、本発明の組換えデイノコッカス細菌において、内在性フィトエンデサチュラーゼ活性が改変細菌と比較して低下し、好ましくはこの活性が抑制される。
フィトエンデサチュラーゼ活性は、当業者に既知の任意の方法によって測定することができる。例として、該活性は、カタラーゼ及びグルコースオキシダーゼの存在下でフィトエンとともにフィトエンデサチュラーゼをインキュベートし、メタノール及びＫＯＨの混合物を添加するとともに６０℃で１５分間加熱して反応を停止し、ジエチルエーテル／軽質石油でインキュベーション混合物から生成物を抽出し、溶媒相を蒸発させるとともに残留物を冷アセトン／メタノールに溶解して、ＨＰＬＣで生成物を同定することによって評価することができる（例えばXu他、Microbiology、153、1642-1652、2007参照）。
好ましい実施形態において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、相当量又は検出可能量のフィトフルエン又はフィトエンからリコピンまでの任意の他の中間分子を産生しない。
好ましくは、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、ＣｒｔＩ遺伝子であるフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子を不活性化するように遺伝子改変される。この不活性化により、フィトエンがリコピンに変換されず、ゆえにフィトエン蓄積をもたらす。
ＣｒｔＩ遺伝子は、例えば、この遺伝子のすべて若しくは一部を欠失する、ナンセンスコドン若しくはフレームシフトを誘発する突然変異を導入する、又は例えばＣｒｔＢ遺伝子若しくはＣｒｔＢ遺伝子を含む発現カセットなどの遺伝子若しくは発現カセットを挿入することで、当業者に既知の任意の方法によって不活性化することができる。
あるいは、内在性ＣｒｔＩ遺伝子の発現を低下させることができる。この低下は、例えば内在性プロモーターをＰｌｅｘＡ又はＰａｍｙＥプロモーターなどのより弱いプロモーターで置換することで、なすことができる（Meima他、2001、J Bacteriol 183：3169-3175）。
好ましい実施形態において、ＣｒｔＩ遺伝子は、例えば遺伝子置換によって、好ましくは該遺伝子のすべて又は一部を欠失することで、不活性化される。
フィトエンデサチュラーゼの例は、Ｄ．ジオサーマリス（Uniprotアクセション番号：Q1J108、配列番号１３）、Ｄ．アクチノスクレラス（Uniprotアクセション番号：A0A0U4CEJ5、配列番号１４）、Ｄ．デゼルティ（Uniprotアクセション番号：C1D2Z4、配列番号１５）、Ｄ．ゴビエンシス（Uniprotアクセション番号：H8GYF5、配列番号１６）、Ｄ．マリコペンシス（Uniprotアクセション番号：E8UAM7、配列番号１７）、Ｄ．ペラリディリトリス（Uniprotアクセション番号：L0A6E5、配列番号１８）、Ｄ．プロテオライティカス（Uniprotアクセション番号：F0RJ97、配列番号１９）、Ｄ．プニセウス（Uniprotアクセション番号：A0A172TAT8、配列番号２０）、Ｄ．ラディオデュランス（Uniprotアクセション番号：Q9RW08、配列番号２１)、Ｄ．ソリ（Uniprotアクセション番号：A0A0F7JTT9、配列番号２２）及び、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（Uniprotアクセション番号：A0A0A7KJM4、配列番号２３）のフィトエンデサチュラーゼを含むがこれらに限定されない。
本発明の組換えデイノコッカス細菌においてフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子は、例えば、上述のフィトエンデサチュラーゼのいずれかをコードする核酸との相同性に基づく、慣例的な方法を使用して容易に同定することができる。
フィトエン産生を向上させるために、本発明の組換え細菌はまた、ゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）の産生を増大するように遺伝子改変することができる。
特に、本発明の組換え細菌は、イソペンテニルピロリン酸（IPP）及びジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）への炭素フラックスを増大させるように、並びに／又はＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）への変換を増大させるように遺伝子改変することができる。
ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの炭素フラックスは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（MEP/DXP）経路を増強することで増大させることができる。本明細書に記載するとき、「ＭＥＰ経路」又は「ＭＥＰ／ＤＸＰ経路」という用語は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸との縮合から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（DXP）へとＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの形成をもたらす生合成経路を指す。この経路は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（EC2.2.1.7）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（EC1.1.1.267）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ（EC2.7.7.60）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（EC2.7.1.148）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（EC4.6.1.12）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（EC1.17.7.1）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸レダクターゼ（EC1.17.1.2）、及びイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）である酵素に関する。
この経路は、例えば国際公開第ＷＯ２０１５／１８９４２８号に記載の方法によって、当業者に既知の任意の方法で増強することができる。特に、この経路は、ＤＸＰシンターゼ（DXS）、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ（DXR）、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ、及びＩＰＰイソメラーゼ（IDI）の活性よりなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性を増大させることで、好ましくは少なくともＤＸＰシンターゼ及びＩＰＰイソメラーゼの活性を増大させることで増強することができる。
酵素活性（例えばDXS、DXR、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH、IDI又はFPPSの活性）は、フィトエンシンターゼ活性について上記で詳述したように、すなわち内在性遺伝子の過剰発現又は異種遺伝子の発現、及び／又は内在性酵素の改良変異体の発現によって、増大させることができる。
「ＤＸＳ」又は「ＤＸＰシンターゼ」という用語は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）へのピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸との縮合を触媒するｄｘｓ遺伝子によってコードされる、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（EC2.2.1.7）酵素に関する。「ＤＸＰシンターゼ」、「ＤＸＳ」、又は「ＤＸＰＳ」という遺伝子生成物の名称は本願では互換的に使用される。ＤＸＰシンターゼ活性は、Ｌｏｉｓ他（1998）が記載するような放射能標識基質を使用して、又は当業者に既知の他の任意の方法によって測定可能である。「ＤＸＰレダクトイソメラーゼ」又は「ＤＸＲ」という用語は、ｄｘｓ遺伝子によってコードされる、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（EC1.1.1.267）酵素に関する。「ＩｓｐＤ」という用語は、ｉｓｐＤ遺伝子によってコードされる、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ（EC2.7.7.60）酵素に関する。「ＩｓｐＥ」という用語は、ＩｓｐＥ遺伝子によってコードされる、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（EC2.7.1.148）酵素に関する。「ＩｓｐＦ」という用語は、ＩｓｐＦ遺伝子によってコードされる、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（EC4.6.1.12）酵素に関する。「ＩｓｐＧ」という用語は、ＩｓｐＧ遺伝子によってコードされる、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（EC1.17.7.1）酵素に関する。「ＩｓｐＨ」という用語は、ＩｓｐＨ遺伝子によってコードされる、ヒドロキシメチルブテニルピロリン酸レダクターゼとも呼称される、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸レダクターゼ（EC1.17.1.2）酵素に関する。「ＩＤＩ」、「ＩＰＰイソメラーゼ」又は「イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ」という用語は、ホモアリル性基質イソペンテニル（IPP）の、そのアリル異性体であるジメチルアリル二リン酸（DMAPP）への１，３−アリル転位を触媒するｉｄｉ遺伝子によってコードされる、イソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）酵素に関する。生体に応じて、上述の酵素及びコードする遺伝子の名称は変わり得る。しかしながら、明確にするため、本明細書において、これらの用語は酵素又は遺伝子の由来とは関係なく使用される。
好ましくは、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が過剰発現され、より好ましくは、少なくともｄｘｓ遺伝子及び／又はｉｄｉ遺伝子、並びにさらにより好ましくはｄｘｓ遺伝子及びｉｄｉ遺伝子が過剰発現される。これらの遺伝子は、内在性又は異種であり、好ましくは内在性であり得る。本発明の組換えデイノコッカス細菌のｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子は、国際公開第ＷＯ２０１５／１８９４２８号に記載されるように容易に同定することができる。
特定の実施形態において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、内在性ｄｘｓ遺伝子を過剰発現する、又は異種ｄｘｓ遺伝子を発現する、及び内在性ｉｄｉ遺伝子を過剰発現する、又は異種ｉｄｉ遺伝子を発現するように遺伝子改変される。
好ましい実施形態において、過剰発現した内在性又は発現した異種のｄｘｓ遺伝子は、デイノコッカス細菌由来である。デイノコッカス細菌由来のｄｘｓ遺伝子の例は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号２４；UniProtアクセション番号：Q1IZP0）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号２５）、Ｄ．デゼルティ（NCBIアクセション番号：WP_012692944.1；GenBank：ACO45821.1；UniProtアクセション番号：C1D1U7）、Ｄ．ラディオデュランス（UniProtアクセション番号：Q9RUB5；NCBIアクセション番号：WP_010888114.1）、及びＤ．ラディオピュグナンス（配列番号２６）由来のｄｘｓ遺伝子を含むがこれらに限定されない。好ましくは、ｄｘｓ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、及びＤ．ラディオピュグナンス由来のｄｘｓ遺伝子よりなる群から選択される。より好ましくは、ｄｘｓ遺伝子は、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ又はＤ．ラディオピュグナンス由来である。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号２４、２５、又は２６によってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有するとともに、ＤＸＳ活性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌由来の任意のポリペプチドを本発明において使用することができる。
好ましい実施形態において、過剰発現した内在性又は発現した異種のｉｄｉ遺伝子は、デイノコッカス細菌由来である。デイノコッカス細菌由来のｉｄｉ遺伝子の例は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号２７）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号２８）、Ｄ．デゼルティ（NCBIアクセション番号：WP_012692934.1）、Ｄ．ラディオデュランス（UniProtアクセション番号：Q9RVE2.3）、又はＤ．ラディオピュグナンス（配列番号２９）由来のｉｄｉ遺伝子を含むがこれらに限定されない。好ましくは、ｉｄｉ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス及びＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ由来のｉｄｉ遺伝子よりなる群から選択される。より好ましくは、ｉｄｉ遺伝子は、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ由来である。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号２７、２８、又は２９によってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有するとともに、ＩＤＩ活性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌由来の任意のポリペプチドを本発明において使用することができる。
さらに、又はあるいは、本発明の組換え細菌はまた、野生型酵素と比較して活性の増大を示すデイノコッカスＤＸＰシンターゼの変異体を発現することができる。そうした改良ＤＸＰシンターゼは、国際公開第ＷＯ２０１５／１８９４２８号及び国際公開第ＷＯ２０１２／０５２１７１号に記載されている。
特に、本発明の組換え細菌は、Ｄ．ラディオピュグナンス由来のＤＸＰシンターゼのＲ２４４Ｃ突然変異体（配列番号３０）をコードする遺伝子、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ由来のＤＸＰシンターゼのＲ２３８Ｃ突然変異体（配列番号３１）をコードする遺伝子、及び／又はＤ．ジオサーマリスのＤＸＰシンターゼのＲ２４１Ｃ突然変異体（配列番号３２）をコードする遺伝子を発現することができる。
さらに、又はあるいは、フィトエン産生はまた、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのＧＧＰＰへの変換を増加させることで向上することができる。好ましくは、本発明の組換え細菌において、ＦＰＰシンターゼ活性は、野生型細菌と比較して増大する。
本明細書に使用するとき、「ｉｓｐＡ」、「ＦＤＰＳ」、「ＦＰＰＳ」又は「ＦＰＰシンターゼ」という用語は、ｆｄｐｓ（又はcrtE）遺伝子によってコードされ、ファルネシル二リン酸シンターゼ活性（EC2.5.1.10）、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ活性（EC2.5.1.1）、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性（EC2.5.1.29）を示す酵素を指す。
好ましくは、ＦＰＰシンターゼ活性は、内在性遺伝子の過剰発現又は異種ｆｄｐｓ遺伝子の発現によって増大する。特に、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、ＦＰＰシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする異種核酸を含むことができる、及び／又はＦＰＰシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードする内在性核酸を過剰発現することができる。
ＦＰＰシンターゼ活性を示すポリペプチドは、任意の既知のＦＰＰシンターゼ、好ましくはデイノコッカス細菌由来の任意のＦＰＰシンターゼであり得る。
デイノコッカスＦＰＰシンターゼの例は、Ｄ．ジオサーマリス（ＮＣＢＩアクセション番号：ABF45913、配列番号３３）、Ｄ．ラディオデュランス（ＮＣＢＩアクセション番号：NP_295118、配列番号３４）、及びＤ．デゼルティ（ＮＣＢＩアクセション番号：ACO46371、配列番号３５）由来のＦＰＰシンターゼを含むがこれらに限定されない。ＦＰＰシンターゼ活性を示すポリペプチドはまた、ＦＰＰシンターゼ活性を示すとともに、上述の任意のＦＰＰシンターゼに対して少なくとも６０％、好ましくは６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する任意のポリペプチドであってもよい。
特定の実施形態において、ＦＰＰシンターゼ活性を示すポリペプチドは、
ａ） 配列番号３３〜３５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなるポリペプチド、及び、
ｂ） ＦＰＰシンターゼ活性を示すとともに、配列番号３３、３４、又は３５に対して少なくとも６０％、好ましくは６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、よりなる群から選択される。
特定の実施形態において、本発明の組換え細菌は、イソペンテニルピロリン酸（IPP）及びジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）への炭素フラックスを増大させるように、並びにＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）への変換を増大させるように遺伝子改変される。
好ましくは、本発明の組換え細菌は、野生型細菌と比較して、ＦＰＰシンターゼ、ＤＸＰシンターゼ、及び／又はＩＰＰイソメラーゼの活性の増大を示す。より好ましくは、本発明の組換え細菌は、野生型細菌と比較して、ＦＰＰシンターゼ、ＤＸＰシンターゼ、及びＩＰＰイソメラーゼの活性の増大を示す。
さらに特定の実施形態において、本発明の組換え細菌、好ましくはＤ．ジオサーマリス細菌は、
好ましくはネイティブＣｒｔＢ遺伝子を過剰発現することで、フィトエンシンターゼ活性の増大を示すため、
好ましくはフィトエンデサチュラーゼをコードするＣｒｔＩ遺伝子のすべて又は一部を欠失することで、フィトエンデサチュラーゼ活性の低下を示すため、
好ましくはネイティブＦＰＰシンターゼ遺伝子を過剰発現することで、ＦＰＰシンターゼ活性の増大を示すため、
好ましくはデイノコッカスＤＸＰシンターゼの変異体、より好ましくは配列番号３１によってコードされる変異体を発現することで、ＤＸＰシンターゼ活性の増大を示すため、及び、
ネイティブｉｄｉ遺伝子を過剰発現する、又は異種ｉｄｉ遺伝子を発現する、より好ましくは配列番号２８によってコードされる酵素を発現することで、ＩＰＰイソメラーゼ活性の増大を示すため、遺伝子改変されている。
好ましい実施形態において、本発明の組換え細菌、好ましくはデイノコッカスジオサーマリス細菌、より好ましくは前段落において規定するような組換え細菌は、好気状態及び炭素源としてのグルコースの存在下において培養するとき、少なくとも５ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエン、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエン、より好ましくは少なくとも１５ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエン、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエンを産生可能である。好ましくは、本発明の組換え細菌は、フィトエンの一異性体、すなわち１５−ｃｉｓフィトエンのみを産生し、フィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産生しない。
他の態様において、本発明はまた、本発明の組換えデイノコッカス細菌の細胞抽出物にも関する。本明細書に使用するとき、「細胞抽出物」という用語は、細胞上清、細胞砕片、細胞壁、ＤＮＡ抽出物若しくはＲＮＡ抽出物、酵素若しくは酵素調製物、又は、実質的に若しくは主に生存細胞を含まない化学的、物理的、及び／若しくは酵素的処理による宿主細胞に由来する任意の調製物などの、宿主細胞から取得した任意の画分を指す。
特定の実施形態において、細胞抽出物はフィトエンを含み、好ましくは細胞膜を含む画分である。特に、細胞抽出物はフィトエンと膜脂質などの脂質とを含むことができる。
好ましい実施形態において、細胞抽出物はフィトエンを含み、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを含まない。
さらに特定の実施形態において、細胞抽出物は、一カロテノイド化合物のみを含み、該化合物はフィトエンである。
好ましい実施形態において、抽出物は、フィトエンの一異性体、すなわち１５−ｃｉｓフィトエンのみを含み、フィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを含まない。
本発明は、フィトエンを産生するための細胞抽出物の使用にさらに関する。
さらなる態様において、本発明は、フィトエンを産生するための本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。
特に、本発明はフィトエン、好ましくは１５−ｃｉｓフィトエンを産生する方法に関し、該方法は、（ｉ）フィトエンを産生するために適切な条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）該フィトエンを回収するステップとを含む。
方法には、該フィトエンを単離又は精製することをさらに含むことができる。
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、相当量又は検出可能量の、フィトフルエン又はフィトエンからリコピンまでの任意の他の中間分子を産生しない。
したがって、特定の実施形態において、本発明の方法又は本発明の使用によって産生されたフィトエンは、フィトフルエン、又はフィトエンからリコピンまで任意の他の中間分子（すなわちζ−カロチン、ニューロスポレン）、又はリコピンを除くものである。
本明細書に使用するときは、「除く」という用語は、フィトエンが、任意の検出可能量のフィトフルエン又はフィトエンからリコピンまでの任意の他の中間分子、好ましくはフィトフルエンを含まないということを意味する。フィトフルエン又は任意の他の中間分子の存在は、ＨＰＬＣ分析などの当業者に既知の任意の方法によって評価することができる。
また、本発明の組換えデイノコッカス細菌について上述されたすべての実施形態は、この態様においても考慮される。
フィトエンを産生するために適切な条件は、使用される組換えデイノコッカス細菌に応じて当業者によって容易に決定することができる。
特に、炭素源は、キシロース及びアラビノースなどのＣ５糖、グルコース、セロビオース、ショ糖、及びデンプンなどのＣ６糖よりなる群から選択することができる。好ましい実施形態において、炭素源はグルコースである。
好ましくは、本発明の組換え細菌は、好気状態及び炭素源としてのグルコースの存在下で培養される。
あるいは、フィトエンは、セルロース系バイオマスなどの、再生可能な生体由来の炭素源から産生される。本明細書に使用するとき、セルロース系バイオマスという用語は、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグノセルロースを含む、好ましくはセルロース及びヘミセルロースを含む、任意のバイオマス材料、好ましくは植物性バイオマスを指す。セルロース系バイオマスは、植物材料（林業製品、木質原料（軟木及び硬木）など）、農業廃棄物及び植物残分（トウモロコシ茎葉部、モロコシ、サトウキビバガス、草、イネわら、コムギわら、アブラヤシやナツメヤシの空果房、テキーラ製造業のアガベバガス）、多年生草（スイッチグラス、ススキ、カナリーグラス、エリアンサス、ネピアグラス、ダンチク、及びアルファルファ）、一般固形廃棄物（municipal solidwaste、MSW）、水産製品（藻類及び海藻など）、古紙、皮革、木綿、麻、天然ゴム製品、並びに食品加工副産物を含むがこれらに限定されない。
好ましくは、セルロース系バイオマスがリグノセルロースを含む場合、該バイオマスは加水分解前に前処理される。この前処理は、セルロース及びヘミセルロースのポリマー鎖にアクセスする目的でリグノセルロース束を開くために用いられる。前処理方法は当業者に既知であり、物理的前処理（例えば高圧蒸気処理、押出、熱分解、若しくは照射）、物理化学的及び化学的前処理（例えば、アンモニア線維爆砕処理、アルカリ性溶媒、酸性溶媒、若しくは酸化剤での処理）、並びに／又は生物学的前処理を含むことができる。
また、温度条件は、中温性デイノコッカス細菌又は高温性デイノコッカス細菌の使用に応じて構成可能である。
実施形態において、デイノコッカス細菌は、例えばＤ．ジオサーマリス又はＤ．ムライなどの高温性のデイノコッカスであり、フィトエンを産生するために適切な条件下における組換えデイノコッカス細菌の培養は、３０℃〜５５℃、好ましくは３５℃〜５０℃、より好ましくは４０℃〜５０℃、さらにより好ましくは４５℃〜４８℃に含まれる温度で行われる。
他の実施形態において、デイノコッカス細菌は、例えばＤ．グランディス、Ｄ．アクアティカス、Ｄ．インディカス、Ｄ．セルロシリティカス、又はＤ．デポリメランスなどの中温性のデイノコッカスであり、フィトエンを産生するために適切な条件下における組換えデイノコッカス細菌の培養は、２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３５℃に含まれる温度、より好ましくは約３０℃で行われる。
好ましい実施形態において、本発明の方法で、少なくとも５ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエン、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエン、より好ましくは少なくとも１５ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエン、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエンが産生及び／又は回収される。
任意的に、方法には、産生又は回収したフィトエンを、例えばイソメラーゼを使用して異性化反応させて、他のフィトエン異性体を産生することをさらに含むことができる。
本発明の方法は、リアクターにおいて、特にバイオマス変換のリアクターにおいて行うことができる。「リアクター」とは、通常、バイオリアクター、バイオフィルター、回転生体コンタクター、並びに他のガス相及び／又は液相のバイオリアクターから選択される、従来の発酵タンク又はバイオマス変換用の任意の装置若しくはシステムを意味する。本発明において使用可能な装置は、連続的に又はバッチ添加で使用することができるものである。使用する細胞に応じて、方法は、好気状態、嫌気状態、又は微好気状態で行うことができる。
本発明は、本発明の組換えデイノコッカス細菌、又はその細胞抽出物を含むリアクターにさらに関する。好ましくは、リアクターは、炭素源、より好ましくはセルロース系バイオマスなどの生体由来の炭素源をさらに含む。本発明は、フィトエンを産生するためのリアクターの使用にさらに関する。
本発明はまた、本発明の組換えデイノコッカス細菌又はその抽出物を含む組成物、及びフィトエンを産生するための該組成物の使用にも関する。好ましくは、組成物は、炭素源、より好ましくはセルロース系バイオマスなどの生体由来の炭素源をさらに含む。
本発明はまた、本発明の方法によって取得したフィトエン、好ましくは単離又は精製したフィトエンに関する。単離したフィトエンは、典型的には、通常は関連している、又は通常はともに混合されている若しくは溶液内にある、少なくとも一部のタンパク質又は他の細胞構成物質を含まない。精製したフィトエンは、典型的には、他の細胞構成物質を実質的に含まない。
本発明は、本発明の方法によって取得したフィトエンを含む組成物にもさらに関する。
実施形態において、組成物は、化粧料組成物又は医薬組成物である。
他の実施形態において、組成物は、ニュートラシューティカルズ組成物若しくはニュートリコスメティクス組成物、又は食品添加剤若しくは飼料添加剤である。
本明細書に使用するとき、「ニュートラシューティカルズ組成物」という用語は、食品から単離又は精製した栄養素を含むとともに、消費者の健康に有益な効果をなす組成物に関する。本明細書に使用するとき、「ニュートリコスメティクス組成物」という用語は、経口用栄養性成分を含み、特に美容目的で製剤化及び販売される組成物に関する。
特定の実施形態において、化粧料組成物又は医薬組成物は、皮膚の美白組成物、美白化組成物、若しくは漂白組成物、又は老化、酸化、若しくは光酸化による損傷を防ぐ組成物である。
フィトエンはまた、抗腫瘍形成特性及び抗炎症特性を示すことが知られている。したがって、実施形態において、組成物はがんの処置又は炎症性障害の処置に使用される医薬組成物である。
好ましくは、本発明の組成物は局所経路又は経口経路で投与されるものである。
好ましくは、組成物は、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、及び／又はリコピンを含まない。より好ましくは、組成物は、任意の検出可能な量のフィトフルエンを含まない。
好ましくは、組成物は、１５−ｃｉｓフィトエンであるフィトエンの一異性体のみを含む。
組成物にはまた、本発明の組換えデイノコッカス細菌又はその抽出物をさらに含むことができる。
本発明の組成物はまた、明らかに、その使用に応じて、化粧料又は医薬の許容される担体、保存剤、カロテノイドなどの抗酸化剤などの他の成分、並びに医薬的又は化粧料的有効成分をも含むことができる。
好ましい実施形態において、組成物は、植物油、鉱物油、又は合成油などの、化粧料製造業、医薬製造業、又は食品製造業で通常使用される油から選択され得る疎水性担体をさらに含む。
本発明はまた、本発明の組成物、特に化粧料組成物、医薬組成物、ニュートラシューティカルズ組成物、ニュートリコスメティクス組成物、又は食品添加剤若しくは飼料添加剤を製造する方法に関し、該方法は、（ｉ）フィトエンを産生するために適切な条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、（ｉｉ）該フィトエンを回収するステップと、（ｉｉｉ）該フィトエンを、少なくとも１つの担体、又は化粧料組成物、医薬組成物、ニュートラシューティカルズ組成物、ニュートリコスメティクス組成物、又は食品添加剤若しくは飼料添加剤の少なくとも１つの他の成分と混合させるステップとを含む。
また、本発明の組換えデイノコッカス細菌について上述されたすべての実施形態、フィトエンを産生する方法、及び組成物は、この態様においても考慮される。
本発明のさらなる態様及び利点は、例示と考えられ限定するものとされるべきではない以下の実施例に記載される。
〔実施例１〕
デイノコッカスジオサーマリス（Deinococcusgeothermalis）株は、フィトエンを産生するように遺伝子学的に操作された。フィトエンを産生する組換えＤ．ジオサーマリスを、カロテノイド経路の一部を妨害することによって取得した、すなわちフィトエンデサチュラーゼ（E.C.1.3.99.26、E.C.1.3.99.28、E.C.1.3.99.29、E.C.1.3.99.31）（crtl）遺伝子をノックアウトした。得られた構築物をシーケンシングによって確認した。
シード培養物を作製するために、個々のコロニーが採取され、主炭素源として２％グルコース又はデキストロースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン 2g/L; 酵母抽出物 5g/L; グルコース 55mM(20g/L);MOPS酸 40mM ;NH4Cl20mM ;NaOH 10mM ;KOH 10mM ; CaCl2.2H2O0,5μM ; Na2SO4.10H2O 0.276mM ; MgCl2.6H2O0.528mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O3nM ; H3BO3 0.4μM ; CoCl2.6H2O30nM ; CuSO4.5H2O 10nM ; MnCl20.25μM ; ZnSO4.7H2O 10nM ; D-ビオチン 1μg/L ; ナイアシン(ニコチン酸) 1μg/L ; B6ビタミン 1μg/L ; B1ビタミン ; FeCl320μM ; クエン酸ナトリウム.2H2O20μM ; K2HPO4 5.7mM）に播種し、４５℃及び２５０ｒｐｍにおいて一晩培養した。そして、対数増殖期のシードを、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、同様の２５ｍｌの新しい培地に播種した。この第２のシード培養物を４５℃及び２５０ｒｐｍで一晩培養した。フィトエン産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、２５ｍｌのミネラル合成培地（(NH4)2SO4< 100mM; NaH2PO4.H2O < 10mM; KCl < 10mM; Na2SO4 < 10mM; クエン酸 < 30mM; MgCl2.6H2O<10 mM; CaCl2.2H2O <10 mM; ZnCl2 <50mg/L; FeSO4.7H2O <50mg/L; MnCl2.4H2O<50mg/L; CuSO4 <50 mg/L; CoCl2.6H2O <50mg/L; H3BO3 < 5mg/L; MES <200 mM; (NH4)6Mo7O24.4H2O< 0,5mM; グルコース又はデキストロース <30 g/L (166mM)）に播種した対数増殖期から、４５℃及び２５０ｒｐｍにおいて、２４時間行った。
２４時間の培養後、１ｍＬの培養物を遠心分離し、１ｍＬのエタノールをペレットに混合してカロテノイド抽出を行った。エタノール相をＯＤ２８５ｎｍでの吸光度によって分析し、ＨＰＬＣによって分析した（カラムc18 poroshell、アジレント、150mm*2.1mm*2.7um、移動相アセトニトリル/メタノール/エチルアセテート）。
最後に、ｍｇ／ｇの乾燥細胞重量（DCW）におけるフィトエン産生量を、フィトエンの標品の希釈によって測定した。組換えＤ．ジオサーマリスは、０．４ｍｇ／ｇＤＣＷのフィトエンを産生し、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産出しなかった。
組換えＤ．ジオサーマリスによって産生されたフィトエン異性体をＲＭＮによって分析し、１５−ｃｉｓフィトエンと同定した。
〔実施例２〕
実施例１の組換えデイノコッカスジオサーマリス株は、
（ｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（E.C.2.2.1.7）（DXS）のＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子と、
（ｉｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来のイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）（IDI）をコードする遺伝子とを含む発現カセットを、染色体に挿入することでさらに改変した。
これらの遺伝子は構成的プロモーターの制御下におかれ、発現カセットはアミラーゼ（amy）遺伝子を置換して染色体に挿入された。得られた構築物をシーケンシングによって確認した。
シード培養及びフィトエン産生のための培養を実施例１に記載されるように行った。
２４時間の培養後、１ｍＬの培養物を遠心分離し、１ｍＬのエタノールをペレットに混合してカロテノイド抽出を行った。エタノール相をＯＤ２８５ｎｍでの吸光度によって分析し、ＨＰＬＣによって分析した（カラムc18 poroshell、アジレント、150mm*2.1mm*2.7um、移動相アセトニトリル/メタノール/エチルアセテート）。
このように、組換えＤ．ジオサーマリスは、約１ｍｇ／ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）のフィトエンを産生し、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産出しなかったということが測定された。
〔実施例３〕
実施例１の組換えデイノコッカスジオサーマリス株は、
（ｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（E.C.2.2.1.7）（DXS）のＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子と、
（ｉｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来のイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）（IDI）をコードする遺伝子と、
（ｉｉｉ） デイノコッカスジオサーマリス由来のファルネシルピロリン酸シンターゼ（E.C.2.5.1.1,E.C.2.5.1.10, E.C.2.5.1.29）（FPPS）をコードする遺伝子と、
（ｉｖ） デイノコッカスジオサーマリス由来のフィトエンシンターゼ（EC2.5.1.32）（CrtB）をコードする遺伝子とを含む発現カセットを、染色体に挿入することでさらに改変した。
これらの遺伝子は構成的プロモーターの制御下におかれ、発現カセットはアミラーゼ（amy）遺伝子を置換して染色体に挿入された。得られた構築物をシーケンシングによって確認した。
シード培養及びフィトエン産生のための培養を実施例１に記載されるように行った。
２４時間の培養後、１ｍＬの培養物を遠心分離し、１ｍＬのエタノールをペレットに混合してカロテノイド抽出を行った。エタノール相をＯＤ２８５ｎｍでの吸光度によって分析し、ＨＰＬＣによって分析した（カラムc18 poroshell、アジレント、150mm*2.1mm*2.7um、移動相アセトニトリル/メタノール/エチルアセテート）。
このように、組換えＤ．ジオサーマリスは、約２２ｍｇ／ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）のフィトエンを産生し、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産出しなかったということが測定された。
〔実施例４〕
実施例１の組換えデイノコッカスジオサーマリス株は、
（ｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（E.C.2.2.1.7）（DXS）のＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子と、
（ｉｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来のイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）（IDI）をコードする遺伝子とを含む第１発現カセットと、
（ｉｉｉ） デイノコッカスジオサーマリス由来のファルネシルピロリン酸シンターゼ（E.C.2.5.1.1,E.C.2.5.1.10, E.C.2.5.1.29）（FPPS）をコードする遺伝子と、
（ｉｖ） デイノコッカスジオサーマリス由来のフィトエンシンターゼ（EC2.5.1.32）（CrtB）をコードする遺伝子とを含む発現カセットを、染色体に挿入することでさらに改変した。
これらの遺伝子は構成的プロモーターの制御下におかれた。第１発現カセットと第２発現カセットとはそれぞれ、アミラーゼ（amy）遺伝子及び内在性ｆｄｐｓ遺伝子を置換して染色体に挿入された。得られた構築物をシーケンシングによって確認した。
シード培養及びフィトエン産生のための培養を実施例１に記載されるように行った。
２４時間の培養後、１ｍＬの培養物を遠心分離し、１ｍＬのエタノールをペレットに混合してカロテノイド抽出を行った。エタノール相をＯＤ２８５ｎｍでの吸光度によって分析し、ＨＰＬＣによって分析した（カラムc18 poroshell、アジレント、150mm*2.1mm*2.7um、移動相アセトニトリル/メタノール/エチルアセテート）。
このように、組換えＤ．ジオサーマリスは、２３ｍｇ／ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）のフィトエンを産生し、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産出しなかったということが測定された。
〔実施例５〕
実施例１の組換えデイノコッカスジオサーマリス株は、
（ｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ又はデイノコッカスジオサーマリス由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（E.C.2.2.1.7）（DXS）をコードする遺伝子と、
（ｉｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来のイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）（IDI）をコードする遺伝子とを含む第１発現カセットと、
（ｉｉｉ） デイノコッカスジオサーマリス由来のファルネシルピロリン酸シンターゼ（E.C.2.5.1.1,E.C.2.5.1.10, E.C.2.5.1.29）（FPPS）をコードする遺伝子と、
（ｉｖ） デイノコッカスジオサーマリス由来のフィトエンシンターゼ（EC2.5.1.32）（CrtB）をコードする遺伝子とを含む発現カセットを、染色体に挿入することでさらに改変した。
これらの遺伝子は構成的プロモーターの制御下におかれ、発現カセットはアミラーゼ（amy）遺伝子を置換して染色体に挿入される。得られた構築物をシーケンシングによって確認する。
シード培養及びフィトエン産生のための培養を実施例１に記載されるように行う。24時間の培養後、１ｍＬの培養物を遠心分離し、１ｍＬのエタノールをペレットに混合してカロテノイド抽出を行う。エタノール相をＯＤ２８５ｎｍでの吸光度によって分析し、ＨＰＬＣによって分析する（カラムc18 poroshell、アジレント、150mm*2.1mm*2.7um、移動相アセトニトリル/メタノール/エチルアセテート）。
〔実施例６〕
実施例１の組換えデイノコッカスジオサーマリス株は、
（ｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ又はデイノコッカスジオサーマリス由来の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（E.C.2.2.1.7）（DXS）をコードする遺伝子と、
（ｉｉ） Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓ由来のイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（EC5.3.3.2）（IDI）をコードする遺伝子とを含む第１発現カセットと、
（ｉｉｉ） デイノコッカスジオサーマリス由来のファルネシルピロリン酸シンターゼ（E.C.2.5.1.1,E.C.2.5.1.10, E.C.2.5.1.29）（FPPS）をコードする遺伝子と、
（ｉｖ） デイノコッカスジオサーマリス由来のフィトエンシンターゼ（EC2.5.1.32）（CrtB）をコードする遺伝子とを含む発現カセットを、染色体に挿入することでさらに改変した。
これらの遺伝子は構成的プロモーターの制御下におかれる。第１発現カセットと第２発現カセットとはそれぞれ、アミラーゼ（amy）遺伝子及び内在性ｆｄｐｓ遺伝子を置換して染色体に挿入される。得られた構築物をシーケンシングによって確認する。
シード培養及びフィトエン産生のための培養を実施例１に記載されるように行う。24時間の培養後、１ｍＬの培養物を遠心分離し、１ｍＬのエタノールをペレットに混合してカロテノイド抽出を行う。エタノール相をＯＤ２８５ｎｍでの吸光度によって分析し、ＨＰＬＣによって分析する（カラムc18 poroshell、アジレント、150mm*2.1mm*2.7um、移動相アセトニトリル/メタノール/エチルアセテート）。

Claims (23)

  1. フィトエンを産生する方法であって、フィトエンを産生するために適切な条件下で組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に前記フィトエンを回収するステップとを含み、前記組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンシンターゼ活性の増大とフィトエンデサチュラーゼ活性の低下とを示すように遺伝子改変されている、方法。
  2. 前記組換えデイノコッカス細菌はいずれのフィトエンデサチュラーゼ活性も示さない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子を不活性化することで、好ましくは前記遺伝子のすべて若しくは一部を欠失すること、又はナンセンスコドン、カセット、遺伝子、若しくはフレームシフトを誘発する突然変異を導入することで、遺伝子改変される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子のすべて又は一部を欠失することで遺伝子改変される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンシンターゼをコードするネイティブ遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記組換えデイノコッカス細菌は、フィトエンシンターゼをコードする異種遺伝子、又はフィトエンシンターゼをコードするとともにコードした酵素のフィトエンシンターゼ活性を向上させる突然変異を含むネイティブ遺伝子を発現するように遺伝子改変される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  7. 前記組換えデイノコッカス細菌は、フィードバック耐性フィトエンシンターゼをコードする遺伝子を発現するように遺伝子改変される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記組換えデイノコッカス細菌はＦＰＰエンシンターゼ活性の増大をさらに示す、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記組換えデイノコッカス細菌は、ＤＸＰシンターゼ活性及び／又はＩＰＰイソメラーゼ活性の増大、好ましくはＤＸＰシンターゼ活性及びＩＰＰイソメラーゼ活性の増大をさらに示す、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記組換えデイノコッカス細菌は、Ｄ．ジオサーマリス（D.geothermalis）、Ｄ．ムライ（D.murrayi）、Ｄ．グランディス（D.grandis）、Ｄ．アクアティカス（D.aquaticus）、Ｄ．インディカス（D.indicus）、Ｄ．セルロシリティカス（D.cellulosilyticus）、Ｄ．デポリメランス（D.depolymerans）、Ｄ．マリコペンシス（D.maricopensis）から選択されるデイノコッカス細菌である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記組換えデイノコッカス細菌はデイノコッカスジオサーマリス細菌である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記組換えデイノコッカス細菌は、少なくとも２０ｍｇ／ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）のフィトエンを産生することができる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記組換えデイノコッカス細菌は、好気状態及び炭素源としてのグルコースの存在下で培養するとき、少なくとも２０ｍｇ／ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）のフィトエンを産生することができる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記組換えデイノコッカス細菌は、１５−ｃｉｓフィトエンであるフィトエンの一異性体のみを産生し、フィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを産生しない、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記組換えデイノコッカス細菌は高温性のデイノコッカス、好ましくはＤ．ジオサーマリスであり、フィトエンを産生するために適切な条件下における前記組換えデイノコッカス細菌の前記培養は、４０℃〜５０℃、好ましくは４５℃〜４８℃に含まれる温度で行われる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載される、組換えデイノコッカス細菌。
  17. 好ましくは、フィトエンを含み、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを含まない、請求項１６に記載の組換えデイノコッカス細菌の細胞抽出物。
  18. １５−ｃｉｓフィトエンであるフィトエンの一異性体のみを含む、請求項１７に記載の細胞抽出物。
  19. 細胞膜を含む画分である、請求項１７又は１８に記載の細胞抽出物。
  20. フィトエンを産生するための請求項１６に記載の組換えデイノコッカス細菌の使用。
  21. 請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって取得したフィトエンを含み、任意の検出可能な量のフィトフルエン、ζ−カロチン、ニューロスポレン、又はリコピンを含まない、組成物。
  22. 前記組成物は、１５−ｃｉｓフィトエンであるフィトエンの一異性体のみを含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 化粧料組成物、医薬組成物若しくはニュートラシューティカルズ組成物、ニュートリコスメティクス組成物、又は食品添加剤若しくは飼料添加剤である、請求項２１又は２２に記載の組成物。

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