BR112019012259A2

BR112019012259A2 - métodos para produzir fitoeno

Info

Publication number: BR112019012259A2
Application number: BR112019012259A
Authority: BR
Inventors: Leonetti Jean-Paul
Original assignee: Deinove
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-12-03
Also published as: EA201991474A1; WO2018109194A1; EP3555302A1; KR20190097093A; JP2020513747A; AU2017378178A1; CA3046436A1; CN110168096A; US20190345520A1; IL267285A; MX2019007025A; PH12019501325A1

Abstract

a presente invenção se refere a uma bactéria deinococcus recombinante geneticamente modificada para produzir e acumular fitoeno e ao seu uso para produzir o fitoeno. em particular, a presente invenção se refere a um método para produzir fitoeno com o uso de uma bactéria deinococcus geneticamente modificada.

Description

MÉTODOS PARA PRODUZIR FITOENO

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção se refere ao campo de microbiologia e em particular, ao campo de engenharia de via biossintética. Mais especificamente, a presente invenção se refere ao campo de produção de fitoeno com o uso de bactérias geneticamente modificadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Carotenoides são uma classe de pigmentos naturais que são sintetizado por todos os organismos fotossintéticos e em algumas bactérias e fungos com crescimento heterotrófico. Já que os animais são incapazes de sintetizar de novo essas moléculas, carotenoides têm sido amplamente usados comercialmente como suplementos alimentares, aditivos de ração animal ou nutracêuticos. Também foram encontradas várias aplicações como corantes ou com propósitos cosméticos e farmacêuticos.

[0003] Embora os carotenoides coloridos sejam estudados mais amplamente, o carotenoide incolor, como fitoeno e fitoflueno, mostrou atividades similarmente eficazes e benéficas. Esses carotenoides são encontrados na maioria das frutas e vegetais e podem agir como absorventes de UV, antioxidantes e agentes anti-inflamatórios. Como consequência, foram considerados úteis em cosmética, nutrição e terapêutica, em particular, no tratamento de transtornos da pele.

[0004] 0 fitoeno (7,8,11,12,7',8',11',12'-octa-hidro-ψ, ψ-caroteno) é o primeiro carotenoide na via de biossintese de carotenoide e é produzido pela dimerização de um precursor

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2/44 de 20 átomos de carbono, geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Essa reação é catalisada pela enzima fitoeno sintase. Como precursor, o fitoeno é, então dessaturado para formar sucessivamente fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno e por fim licopeno.

[0005] Já que são precursores de todos os outros carotenoides, fitoflueno e fitoeno foram estudados extensivamente em investigações que abordam a biossíntese desses compostos. No entanto, esses foram bastante negligenciados em outros tipos de estudos. Como consequência, até a presente data, nenhum método atual está disponível para produzir fitoeno por meio de nenhum processo biológico e, em particular, para produzir fitoeno livre de fitoflueno.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] A presente invenção se refere a uma bactéria Deinococcus recombinante que é geneticamente modificada para produzir e acumular uma quantidade substancial de fitoeno, preferencialmente livre de fitoflueno, e ao uso da dita bactéria recombinante para produzir fitoeno.

[0007] Consequentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para produzir fitoeno que compreende cultivar uma bactéria Deinococcus recombinante sob condições adequadas para produzir fitoeno, e recuperar opcionalmente o dito fitoeno, em que a dita bactéria Deinococcus recombinante é geneticamente modificada para exibir atividade aumentada de fitoeno sintase e atividade diminuída de fitoeno desaturase.

[0008] Preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante não exibe nenhuma atividade de fitoeno

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3/44 desaturase. A bactéria Deinococcus recombinante pode ser geneticamente modificada inativando-se urn gene que codifica uma fitoeno desaturase, preferencialmente deletando todo ou parte do dito gene ou introduzindo um códon sem sentido, urn cassete, urn gene ou uma mutação que induz um deslocamento de quadro. Preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante é geneticamente modificada deletando todo ou parte de urn gene que codifica uma fitoeno desaturase.

[0009] A bactéria Deinococcus recombinante também pode ser geneticamente modificada para superexpressar urn gene nativo que codifica fitoeno sintase, para expressar urn gene heterólogo que codifica fitoeno sintase, para expressar urn gene nativo que codifica fitoeno sintase e que compreende uma mutação que melhora a atividade de fitoeno sintase da enzima codificada ou para expressar um gene que codifica uma fitoeno sintase resistente à realimentação.

[0010] Em algumas modalidades, a bactéria Deinococcus recombinante pode exibir ainda uma atividade aumentada de FPP sintase, atividades aumentadas de DXP sintase e/ou IPP isomerase, preferencialmente atividades aumentadas de FPP sintase, DXP sintase e IPP isomerase.

[0011] Preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante é uma bactéria Deinococcus selecionada a partir do grupo que consiste em D. geothermalis, D. murrayi, D. grandis, D. aquaticus, D. indicus, D. cellulosilyticus, D. depolymerans e D. maricopensis. Mais preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante é uma bactéria Deinococcus geothermalis.

[0012] A bactéria Deinococcus recombinante é preferencialmente capaz de produzir pelo menos 20 mg/g de

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DCW (peso seco celular) de fitoeno, em particular, quando cultivada em aerobiose e na presença de glicose como fonte de carbono .

[0013] Preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante produz apenas um isômero de fitoeno que é 15cis fitoeno e não produz fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

[0014] Em algumas modalidades, a bactéria Deinococcus recombinante é uma Deinococcus termofilica, preferencialmente D. geothermalis, e a cultura da bactéria Deinococcus recombinante sob condições adequadas para produzir fitoeno é realizada a uma temperatura compreendida entre 40 e 50 °C, preferencialmente entre 45 e 48 °C.

[0015] Em um segundo aspecto, a presente invenção também se refere à bactéria Deinococcus recombinante usada no método da invenção, ou a um extrato celular da mesma, preferencialmente uma fração que compreende membranas celulares. Preferencialmente, o dito extrato celular compreende fitoeno e não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno. Preferencialmente, o extrato celular da invenção compreende apenas um isômero de fitoeno que é 15-cis fitoeno.

[0016] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso da bactéria Deinococcus recombinante da invenção para produzir fitoeno.

[0017] Em um aspecto adicional, a presente invenção também se refere a uma composição que compreende fitoeno obtido pelo método da invenção, preferencialmente apenas 15cis fitoeno, em que a dita composição não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ- caroteno,

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5/44 neurosporeno ou licopeno. Preferencialmente, a dita composição é uma composição cosmética, farmacêutica ou nutracêutica, nutricosmética ou um aditivo de alimento ou ração.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0018] As bactérias Deinococcus são bactérias não patogênicas que foram primeiramente isoladas em 1956 por Anderson e colaboradores. Esses organismos extremófilos foram propostos para uso em processos ou reações industriais com o uso de biomassa (consultar, por exemplo, documentos W02009/063079; W02010/094665 ou W02010/081899). Com base em seu conhecimento profundo de metabolismo e genética de Deinococcus, os inventores constataram que as bactérias Deinococcus podem ser geneticamente modificadas para produzir quantidades substanciais de fitoeno sob condições compatíveis com produção em larga escala. Além disso, mostraram que essa bactéria recombinante é capaz de produzir fitoeno livre de fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno, suprimindo, desse modo, a necessidade de etapas de purificação adicionais.

Definições [0019] No contexto da invenção, o termo Deinococcus inclui cepas de variante natural ou do tipo selvagem de Deinococcus, por exemplo, cepas obtidas através de evolução acelerada, mutagênese, por tecnologias de embaralhamento de DNA, ou cepas recombinantes obtidas por inserção de ácido nucleico (ou ácidos nucleicos) eucariótico, procariótico e/ou sintético. As bactérias Deinococcus podem designar qualquer bactéria do gênero Deinococcus, como sem limitação, bactéria D. actinosclerus, D. aerius, D. aerolatus, D.

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6/44 aerophilus, D. aetherius, D. alpinitundrae, D. altitudinis, D. antarcticus, D. apachensis, D. aquaticus, D. aquaticus, D. aquatilis, D. aquiradiocola, D. caeni, D. carri, D. cellulosilyticus, D. citri, D. claudionis, D. daejeonensis , D. depolymerans, D. desertii, D. enclensis, D. ficus, D. frigens, D. geothermalis, D. gobiensis, D. grandis, D. guangriensis, D. guilhemensis, D. hohokamensis, D. hopiensis, D. humi , D. indicus, D. maricopensis, D. marmoris, D. metalli, D. metallilatus, D. misasensis, D. murrayi, D. navajonensis, D. papagonensis, D. peraridilitoris, D. phoenicis, D. pimensis, D. piseis, D. proteolyticus, D. puniceus, D. radiodurans, D. radiomollis, D. radiophilus, D. radiopugnans, D. radioresistens, D. radiotolerans, D. reticulitermitis, D. roseus, D. sahariens, D. saxicola, D. soli, D. sonorensis, D. swuensis, D. wulumuqiensis, D. xinj iangensis, D. xibeiensis e D. yavapaiensis ou quaisquer combinações dos mesmos. Preferencialmente, o termo Deinococcus se refere a D. geothermalis, D. murrayi, D. grandis, D. aquaticus, D. indicus, D. cellulosilyticus, D. depolymerans ou D. maricopensis. Mais preferencialmente, o termo Deinococcus se refere a D. geothermalis, D. murrayi ou D. maricopensis. Ainda mais preferencialmente, o termo Deinococcus se refere a D. geothermalis.

[0020] Os termos bactéria recombinante e bactéria geneticamente modificada ou bactéria modificada são usados no presente documento de modo alternado e designam uma bactéria que não é encontrada na natureza e que contém um genoma modificado como resultado de uma deleção, inserção ou modificação de um ou diversos elementos genéticos.

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7/44 [0021] Um ácido nucleico recombinante designa um ácido nucleico que foi modificado e não é encontrado como tal em bactérias do tipo selvagem. Em algumas modalidades particulares, esse termo pode se referir a um gene operacionalmente ligado a um promotor que é diferente de seu promotor de ocorrência natural.

[0022] 0 termo grene designa qualquer ácido nucleico que codifica uma proteína. O termo gene abrange DNA, como cDNA ou gDNA, bem como RNA. O gene pode ser primeiramente preparado por, por exemplo, técnicas recombinantes, enzimáticas e/ou químicas, e subsequentemente replicado em uma célula hospedeira ou um sistema in vitro. O gene compreende tipicamente um quadro de leitura aberta que codifica uma proteína desejada. O gene pode conter sequências adicionais, como um terminador de transcrição ou um peptideo de sinal.

[0023] 0 termo operacionalmente ligado significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação a uma sequência de codificação, de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência de codificação.

[0024] 0 termo sequências de controle significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um gene. As sequências de controle podem ser nativas ou heterólogas. As sequências de controle bem conhecidas e atualmente usadas pelo elemento versado na técnica serão preferenciais. Tais sequências de controle incluem, porém sem limitação, um lider, sequência de poliadenilação, sequência de propeptideo, promotor, sequência de peptideo de sinal e terminador de transcrição. Preferencialmente, as

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8/44 sequências de controle incluem um promotor e um terminador de transcrição.

[0025] 0 termo cassete de expressão denota um construto de ácido nucleico que compreende uma região codificadora, isto é, um gene, e uma região reguladora, isto é, que compreende uma ou mais sequências de controle, operacionalmente ligadas. Preferencialmente, as sequências de controle são adequadas para células hospedeiras de Deinococcus.

[0026] Como usado no presente documento, o termo vetor de expressão significa uma molécula de DNA ou RNA que compreende um cassete de expressão. Preferencialmente, o vetor de expressão é uma molécula de DNA de fita dupla linear ou circular.

[0027] Como usado no presente documento, o termo nativa ou endógena, em relação a uma bactéria, se refere a um elemento genético ou uma proteína naturalmente presente na dita bactéria. O termo heteróloga, em relação a uma bactéria, se refere a um elemento genético ou uma proteína que não está naturalmente presente na dita bactéria.

[0028] Os termos superexpressão” e expressão aumentada como usado no presente documento são usados de modo alternado e significam que a expressão de um gene ou uma enzima é aumentada em comparação a uma bactéria não modificada, por exemplo, a bactéria do tipo selvagem ou a bactéria correspondente que não foi geneticamente modificada para produzir fitoeno. A expressão aumentada de uma enzima é usualmente obtida aumentando a expressão do gene que codifica a dita enzima. Em modalidades em que o gene ou a enzima não está naturalmente presente na bactéria da invenção, isto é,

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9/44 gene ou enzima heteróloga, os termos superexpressão e expressão podem ser usados de modo alternado. Para aumentar a expressão de um gene, a pessoa versada na técnica pode usar quaisquer técnicas conhecidas, como aumentar o número de cópias do gene na bactéria, usar um promotor que induz um alto nível de expressão do gene, isto é, um promotor forte, usar elementos que estabilizam o RNA mensageiro correspondente ou modificar sequências de Sítio de Ligação ao Ribossomo (RBS) e sequências ao redor das mesmas. Em particular, a superexpressão pode ser obtida aumentando o número de cópias do gene na bactéria. Uma ou diversas cópias do gene podem ser introduzidas no genoma por métodos de recombinação, conhecidos pelo especialista no campo, incluindo substituição de gene ou inserção de multicópia em sequências de IS (consultar, por exemplo, o pedido de patente internacional WO 2015/092013) . Preferencialmente, um cassete de expressão que compreende o gene, preferencialmente colocado sob o controle de um promotor forte, é integrado ao genoma. Alternativamente, o gene pode ser transportado por um vetor de expressão, preferencialmente um plasmídeo, que compreende um cassete de expressão com o gene de interesse preferencialmente colocado sob o controle de um promotor forte. O vetor de expressão pode estar presente na bactéria em uma ou diversas cópias, dependendo da natureza da origem de replicação. A superexpressão do gene também pode ser obtida com o uso de um promotor que induz um alto nível de expressão do gene. Por exemplo, o promotor de um gene endógeno pode ser substituído por um promotor mais forte, isto é, um promotor que induz um nível maior de expressão. Os promotores adequados para serem usados na presente

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10/44 invenção são conhecidos pela pessoa versada na técnica e podem ser constitutivos ou induziveis e nativos ou heterólogos.

[0029] Como usado no presente documento, o termo atividade aumentada se refere a uma atividade enzimática que é aumentada em comparação a uma bactéria não modificada, por exemplo, a bactéria do tipo selvagem ou a bactéria correspondente que não foi geneticamente modificada para produzir ou acumular fitoeno. Esse aumento pode ser obtido, por exemplo, por superexpressão de um gene nativo ou expressão de um gene heterólogo.

[0030] Como usado no presente documento, o termo atividade diminuída se refere a uma atividade enzimática que é diminuída em comparação a uma bactéria não modificada, por exemplo, a bactéria do tipo selvagem ou a bactéria correspondente que não foi geneticamente modificada para produzir ou acumular fitoeno. Essa diminuição pode ser obtida, por exemplo, inativando o gene que codifica a enzima responsável por tal atividade.

[0031] Como usado no presente documento, o termo identidade de sequência ou identidade se refere ao número (%) de correspondências (residues de aminoácidos idênticos) em posições de um alinhamento de duas sequências de polipeptideo. A identidade de sequência é determinada pela comparação das sequências quando alinhadas com a finalidade de maximizar a sobreposição e a identidade enquanto minimiza as lacunas de sequência. Em particular, a identidade de sequência pode ser determinada com o uso de qualquer um dentre inúmeros de algoritmos de alinhamento local ou global matemáticos, dependendo do comprimento das duas sequências.

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As sequências de extensões similares são, de preferência, alinhadas com o uso de algoritmos de alinhamento global (por exemplo, algoritmo Needleman e Wunsch; Needleman e Wunsch, 1970) que alinha as sequências de forma ideal por toda a extensão, enquanto as sequências de extensões substancialmente diferentes são, de preferência, alinhadas com o uso de um algoritmo de alinhamento local (por exemplo, algoritmo Smith e Waterman (Smith e Waterman, 1981) ou algoritmo Altschul (Altschul et al., 1997; Altschul et al. , 2005)). O alinhamento para propósitos de determinação de percentual de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão incluídas na habilidade do elemento versado na técnica, por exemplo, com o uso de software de computado disponível para o público em sites da web da Internet como http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Os elementos versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir alinhamento, que inclui quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo por toda a extensão das sequências que são comparadas. Para propósitos do presente documento, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos se referem a valores gerados com o uso do programa de alinhamento de sequências de pares EMBOSS Needle que cria um alinhamento global ideal de duas sequências com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch, em que todos os parâmetros de pesquisa são definidos para valores padrão, isto é, Matriz de classificação = BLOSUM62, Abertura de lacuna = 10, Extensão de lacuna = 0,5, Penalidade de lacuna de extremidade = falsa, Abertura de lacuna de extremidade = 10 e Extensão de lacuna de extremidade = 0,5.

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12/44 [0032] Os termos estringência baixa, estringência média, estringência média/alta, estringência alta e estringência muito alta se referem a condições de hibridização. Condições experimentais adequadas para determinar a hibridização entre uma sonda de nucleotideo e uma sequência de DNA ou RNA homóloga envolve pré-embebição do filtro contendo os fragmentos de DNA ou RNA para hibridizar em 5xSSC (Cloreto de sódio/Citrato de sódio por 10 min, e pré-hibridização do filtro em uma solução de 5xSSC, solução de 5xDenhardt, 0,5 % de SDS e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão sonicado desnaturado, sucedida por hibridização na mesma solução contendo uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda primada aleatoriamente com marcação de ³²P-dCTP (atividade especifica de >lxl0⁹ cpm/pg) por 12 horas a cerca de 45° C (Feinberg e Vogelstein, 1983). Para várias condições de estringência, o filtro é, então, lavado duas vezes por 30 minutos em 2xSSC, 0,5 % de SDS e pelo menos 55 °C (estringência baixa), mais preferencialmente pelo menos 60 °C (estringência média), ainda mais preferencialmente pelo menos 65 °C (estringência média/alta), ainda mais preferencialmente pelo menos 70 °C (estringência alta) e ainda mais preferencialmente pelo menos 75 °C (estringência mu i t o alta).

[0033] Como usado no relatório descritivo, o termo cerca de se refere a uma faixa de valores ± 10 % do valor especificado. Por exemplo, cerca de 20 inclui ± 10 % de 20, ou de 18 a 22. Preferencialmente, o termo cerca de se refere a uma faixa de valores ± 5 % do valor especificado.

[0034] Como usado no presente documento, o termo CrtB ou fitoeno sintase se refere a uma enzima fitoeno sintase

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13/44 (EC 2.5.1.32) codificada por um gene crtB que catalisa a condensação de duas moléculas de geranilgeranil difosfato (GGPP) para produzir fitoeno.

[0035] 0 termo CrtI ou fitoeno desaturase ou fitoeno desidrogenase se refere a uma enzima fitoeno desaturase (EC 1.3.99.31) codificada por um gene crtl que catalisa até quatro etapas de desnaturação (EC 1.3.99.28 [fitoeno desaturase (formadora de neurosporeno)] , EC 1.3.99.29 [fitoeno desaturase (formadora de zeta-caroteno)] e EC 1.3.99.30 [fitoeno desaturase (formadora de 3,4didesidrolicopeno)]). Em modalidades preferidas, a enzima fitoeno desaturase converte fitoeno em neurosporeno e licopeno por meio do intermediário de fitoflueno e zetacaroteno .

[0036] De acordo com o organismo, a nomenclatura das enzimas identificadas acima e que codificam genes pode variar. No entanto, com fins de clareza, no presente relatório descritivo, esses termos são usados independentemente da origem das enzimas ou genes.

[0037] Como usado no presente documento, o termo fitoeno se refere a qualquer isômero de fitoeno e preferencialmente a 15-cis fitoeno.

[0038] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma bactéria Deinococcus recombinante que é geneticamente modificada para exibir atividade aumentada de fitoeno sintase e atividade diminuida de fitoeno desaturase. Os inventores mostraram, de fato, que tal bactéria pode produzir e acumular uma quantidade substancial de fitoeno, livre de fitoflueno, sem alterar a viabilidade ou crescimento bacteriano.

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14/44 [0039] A bactéria Deinococcus recombinante da invenção é uma bactéria Deinococcus que foi geneticamente modificada para aumentar sua produção e acúmulo de fitoeno. Em comparação com uma bactéria do tipo selvagem, essa bactéria recombinante pode compreender modificações genéticas como descrito acima, porém também outras modificações que não são diretamente ligadas à produção de fitoeno, mas fornecem vantagens para a produção industrial de fitoeno, como resistência a antibiótico ou atividades enzimáticas para aumentar a gama de substrato.

[0040] Na bactéria Deinococcus recombinante da invenção, a atividade de fitoeno sintase é aumentada em comparação com a bactéria não modificada.

[0041] A atividade de fitoeno sintase pode ser determinada por qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica. Por exemplo, a dita atividade pode ser avaliada incubando fitoeno sintase com GGPP, recuperando o fitoeno e quantificando o fitoeno por contagem de cintilação liquida (consultar, por exemplo, Welsch et al., The Plant Cell, Vol. 22: 3348-3356, 2010).

[0042] Preferencialmente, a atividade aumentada de fitoeno sintase é obtida modificando geneticamente a bactéria Deinococcus para superexpressar um gene CrtB endógeno, para expressar um gene CrtB heterólogo e/ou para expressar uma variante melhorada da fitoeno sintase endógena.

[0043] Em particular, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção pode compreender um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase e/ou pode superexpressar um ácido nucleico endógeno

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15/44 que codifica um polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase.

[0044] Para aumentar a expressão de um gene (isto é, para superexpressar um gene), a pessoa versada na técnica pode usar quaisquer técnicas conhecidas, como aumentar o número de cópias do gene na bactéria, usar um promotor que induz um alto nivel de expressão do gene, isto é, um promotor forte, usar elementos que estabilizam o RNA mensageiro correspondente ou modificar sequências de Sitio de Ligação ao Ribossomo (RBS) e sequências ao redor das mesmas.

[0045] Em uma modalidade particular, a superexpressão é obtida aumentando o número de cópias do gene na bactéria. Uma ou diversas cópias do gene podem ser introduzidas no genoma por métodos de recombinação, conhecidos pelo especialista no campo, incluindo substituição de gene. Preferencialmente, um cassete de expressão que compreende o gene é integrado no genoma.

[0046] Alternativamente, o gene pode ser transportado por um vetor de expressão, preferencialmente um plasmideo, que compreende um cassete de expressão com o gene de interesse. O vetor de expressão pode estar presente na bactéria em 1 a 5, 20, 100 ou 500 cópias, dependendo da natureza da origem de replicação.

[0047] Em outra modalidade particular, a superexpressão do gene é obtida com o uso de um promotor que induz um alto nivel de expressão do gene. Por exemplo, o promotor de um gene endógeno pode ser substituído por um promotor mais forte, isto é, um promotor que induz um nivel maior de expressão. Os promotores adequados para serem usados na presente invenção são conhecidos pela pessoa versada na

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16/44 técnica e podem ser constitutivos ou induziveis e nativos ou heterólogos.

[0048] Os cassetes de expressão úteis na presente invenção gue compreendem pelo menos um gene CrtB operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle, que compreende tipicamente um promotor transcricional e um terminador de transcrição, que direciona a expressão do dito gene.

[0049] Uma sequência de controle pode incluir um promotor que é reconhecido pela célula hospedeira. O promotor contém sequências de controle transcricionais que mediam a expressão da enzima. O promotor pode ser qualquer polinucleotideo que mostra atividade transcricional na bactéria Deinococcus. O promotor pode ser um promotor nativo ou heterólogo. Os promotores preferidos são nativos e promotores de Deinococcus. Nesse sentido, vários promotores foram estudados e usados para expressão genética em bactérias Deinococcus. Exemplos de promotores adequados incluem promotores PtufA e PtufB dos genes Tu de fatores de alongamento e tradução tufA (por exemplo, D. radiodurans: DR_0309) e tufB (por exemplo, D. radiodurans: DR_2050), o promotor do gene resU localizado em pI3, a região de promotor PgroESL do operon groESL (Lecointe, et ai. 2004. Mol Microbiol 53: 1721-1730 ; Meima et al. 2001. J Bacteriol 183: 3169-3175) ou derivados de tais promotores. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo forte.

[0050] Uma sequência de controle também pode compreender um terminador de transcrição, o qual é reconhecido por bactérias Deinococcus por terminar a transcrição. O

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17/44 terminador é operacionalmente ligado ao 3'-terminal do gene. Qualquer terminador que é funcional em bactérias Deinococcus pode ser usado na presente invenção como, por exemplo, o terminador termll6 descrito em Lecointe, et ai. 2004. Mol Microbiol 53: 1721-1730.

[0051] Opc ionalmente, o cassete de expressão também pode compreender um marcador selecionável que permite fácil seleção de bactérias recombinantes. Tipicamente, o marcador selecionável é um gene que codifica resistência a antibiótico ou confere autotrofia.

[0052] Em uma modalidade particular, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção compreende um cassete de expressão que compreende um gene CrtB operacionalmente ligado a um promotor constitutivo forte.

[0053] 0 cassete de expressão pode ser integrado no genoma da bactéria e/ou pode ser mantido em uma forma epissomal em um vetor de expressão.

[0054] Preferencialmente, o cassete de expressão é integrado no genoma da bactéria. Uma ou diversas cópias do cassete de expressão podem ser introduzidas no genoma por métodos de recombinação, conhecidos pelo especialista no campo, incluindo substituição de gene. O cassete de expressão pode substituir o gene CrtB endógeno ou pode ser integrado em outro lugar do genoma.

[0055] 0 cassete de expressão também pode ser integrado no genoma para inativar genes-alvo. Em uma modalidade particular, o cassete de expressão é integrado no genoma para inativar um gene CrtI. Em outra modalidade, o cassete de expressão é integrado no genoma para inativar o gene de fosfotransacetilase (pta). Os genes alvejados podem ser

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18/44 substituídos ou inativados pela inserção do cassete.

[0056] Alternativamente, ou além disso, o cassete de expressão pode ser integrado no genoma em uma sequência não codificadora, por exemplo, uma sequência de inserção (IS) (consultar, por exemplo, o pedido de patente internacional WO 2015/092013).

[0057] Em modalidades em que o cassete de expressão é mantido em uma forma epissomal, o vetor de expressão pode estar presente na bactéria em uma ou diversas cópias, dependendo da natureza da origem de replicação.

[0058] A célula hospedeira de Deinococcus pode ser transformada, transfectada ou transduzida de uma maneira transiente ou estável. A bactéria Deinococcus recombinante da invenção pode ser obtida por qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica, como eletroporação, conjugação, transdução, transformação de célula competente, transformação de protoplasto, fusão de protoplasto, transformação por biolística pistola de gene, transformação mediada por PEG, transformação ou transfecção assistida por lipídio, transfecção quimicamente mediada, transformação mediada por acetato de lítio ou transformação mediada por lipossomo.

[0059] 0 termo bactéria Deinococcus recombinante também abrange a célula hospedeira geneticamente modificada, bem como qualquer progênie que não é idêntica à célula hospedeira parental, em particular, devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0060] 0 gene CrtB expresso ou superexpresso na bactéria recombinante da invenção pode codificar uma fitoeno sintase endógena, uma fitoeno sintase heteróloga ou uma variante

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19/44 melhorada da fitoeno sintase endógena.

[0061] Em particular, o polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase pode ser qualquer fitoeno sintase conhecida, como selecionada a partir de fitoeno sintases bacterianas, algais ou vegetais conhecidas.

[0062] 0 polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase pode ser selecionado a partir de fitoeno sintases que não são de Deinococcus, como CrtB de Pantoea agglomerans (número de acesso GenBank: AFZ89043.1, SEQ ID NO: 1) ou CrtB de Paracoccus sp_N81106 (número de acesso GenBank: BAE47469.1; SEQ ID NO: 2).

[0063] Preferencialmente, o polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase pode ser selecionado a partir de qualquer fitoeno sintase de bactérias Deinococcus.

[0064] Exemplos de fitoeno sintases de Deinococcus (CrtB) incluem, porém sem limitação, fitoeno sintases de D. geothermalis (número de acesso de Uniprot: Q1J109; SEQ ID NO: 3), D. actinosclerus (número de acesso de Uniprot: A0A0U3KC93; SEQ ID NO: 4), D. deserti (número de acesso de Uniprot: C1D2Z3; SEQ ID NO: 5), D. gobiensis (número de acesso de Uniprot: H8GYF6; SEQ ID NO: 6), D. maricopensis (número de acesso de Uniprot: E8UAM8; SEQ ID NO: 7), D. peraridilitoris (número de acesso de Uniprot: L0A567; SEQ ID NO: 8), D. puniceus (número de acesso de Uniprot: A0A172TDE8; SEQ ID NO: 9), D. radiodurans (número de acesso de Uniprot: Q9RW07; SEQ ID NO: 10), D. soli (número de acesso de Uniprot: A0A0F7JV05; SEQ ID NO: 11) e D. swuensis (número de acesso de Uniprot: A0A0A7KGT0; SEQ ID NO: 12).

[0065] O polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase também pode ser qualquer polipeptideo que exibe

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20/44 atividade de fitoeno sintase e que tem pelo menos 60 %, preferencialmente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade com qualquer fitoeno sintase listada acima.

[0066] Em uma modalidade particular, o polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em

a) um polipeptideo que compreende, ou consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a 12, preferencialmente a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 a 12, mais preferencialmente SEQ ID NO: 3; e

b) um polipeptideo que exibe atividade de fitoeno sintase e que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60 %, preferencialmente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade a qualquer sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a 12, preferencialmente a qualquer sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 a 12, mais preferencialmente a SEQ ID NO: 3.

[0067] O gene CrtB usado na presente invenção também pode codificar uma fitoeno sintase melhorada, isto é, uma enzima que possui pelo menos uma mutação em sua sequência, em comparação com a sequência de aminoácidos da enzima do tipo selvagem, sendo que a dita mutação leva a um aumento de sua atividade, uma atividade catalítica especifica aumentada, uma especificidade aumentada para o substrato, uma estabilidade aumentada de proteína ou RNA e/ou uma concentração intracelular aumentada da enzima ou leva a um mutante resistente à realimentação.

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21/44 [0068] Em uma modalidade, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção expressa um gene CrtB que codifica uma fitoeno sintase melhorada e, em particular, uma fitoeno sintase de Deinococcus melhorada. Preferencialmente, a fitoeno sintase de Deinococcus melhorada exibe uma atividade catalítica aumentada.

[0069] Além disso, na bactéria Deinococcus recombinante da invenção, a atividade de fitoeno desaturase endógena é reduzida em comparação com a bactéria não modificada, preferencialmente essa atividade é suprimida.

[0070] A atividade de fitoeno desaturase pode ser determinada por qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica. Por exemplo, a dita atividade pode ser avaliada incubando fitoeno desaturase com fitoeno na presença de catalase e glicose oxidase, adicionando uma mistura de metanol e KOH e aquecendo a 60 °C por 15 min para terminar a reação, extraindo os produtos da mistura de incubação com éter dietilico/petróleo leve, evaporando a fase de solvente e redissolvendo o residue em acetona fria/metanol e identificando produtos por HPLC (consultar, por exemplo, Xu et al., Microbiology, 153, 1642-1652, 2007).

[0071] Em modalidades preferidas, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção não produz quantidades significativas ou detectáveis de fitoflueno ou quaisquer outras moléculas intermediárias de fitoeno em licopeno.

[0072] Preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção é geneticamente modificada para inativar um gene que codifica uma fitoeno desaturase, um gene CrtI. Essa inativação impede a conversão de fitoeno em licopeno e leva, então, ao acúmulo de fitoeno.

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22/44 [0073] O gene CrtI pode ser inativado por qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica, por exemplo, por deleção de todo ou parte desse gene, introduzindo um códon sem sentido ou uma mutação que induz um deslocamento de quadro, ou por inserção de um gene ou um cassete de expressão, por exemplo, um gene CrtB ou um cassete de expressão que compreende um gene CrtB.

[0074] Alternativamente, a expressão do gene CrtI endógeno pode ser reduzida. Essa redução pode ser obtida, por exemplo, substituindo promotores endógenos por promotores mais fracos, como promotores PlexA ou PamyE (Meima et al. 2001. J Bacteriol 183:3169- 3175).

[0075] Em modalidades preferidas, o gene CrtI é inativado, preferencialmente deletando todo ou parte do dito gene, por exemplo, por substituição de gene.

[0076] Exemplos de fitoeno desaturases incluem, porém sem limitação, fitoeno desaturases de D. geothermalis (número de acesso de Uniprot: Q1J108; SEQ ID NO: 13), D. actinosclerus (número de acesso de Uniprot: A0A0U4CEJ5; SEQ ID NO: 14), D. desert! (número de acesso de Uniprot: C1D2Z4; SEQ ID NO: 15), D. gobiensis (número de acesso de Uniprot: H8GYF5; SEQ ID NO: 16), D. maricopensis (número de acesso de Uniprot: E8UAM7; SEQ ID NO: 17), D. peraridilitoris (número de acesso de Uniprot: L0A6E5; SEQ ID NO: 18), D. proteolyticus (número de acesso de Uniprot: F0RJ97; SEQ ID NO: 19), D. puniceus (número de acesso de Uniprot: A0A172TAT8; SEQ ID NO: 20), D. radiodurans (número de acesso de Uniprot: Q9RW08; SEQ ID NO: 21), D. soli (número de acesso de Uniprot: A0A0F7JTT9; SEQ ID NO: 22) e D. swuensis (número de acesso de Uniprot: A0A0A7KJM4; SEQ ID NO: 23) .

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23/44 [0077] O gene que codifica a fitoeno desaturase na bactéria Deinococcus recombinante da invenção pode ser facilmente identificado com o uso de métodos comuns, por exemplo, baseados em homologia com o ácido nucleico que codifica qualquer uma das fitoeno desaturases identificadas acima.

[0078] Para melhorar a produção de fitoeno, a bactéria recombinante da invenção também pode ser geneticamente modificada para aumentar a produção de geranilgeranil difosfato (GGPP).

[0079] Em particular, a bactéria recombinante da invenção pode ser geneticamente modificada para aumentar o fluxo de carbono para isopentenil pirofosfato (IPP) e dimetilalil opirofosfato (DMAPP) e/ou para aumentar a conversão de IPP e DMAPP em geranilgeranil difosfato (GGPP).

[0080] 0 fluxo de carbono para IPP e DMAPP pode ser aumentado melhorando a via de 2-C-metil-D-eritritol 4fosfato/l-desoxi-D-xilulose 5-fosfato (MEP/DXP). Como usado no presente documento, o termo via de MEP ou via de MEP/DXP se refere ao fato de que a via biossintética leva à formação de IPP e DMAPP a partir da condensação de piruvato e D-gliceraldeido 3-fosfato em 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato (DXP) . Essa via envolve as seguintes enzimas: 1-desoxi-Dxilulose 5-fosfato sintase (EC 2.2.1.7), 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato redutoisomerase (EC 1.1.1.267), 2-C-metil-Deritritol 4-fosfato citidililtransferase (EC 2.7.7.60), 4difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (EC 2.7.1.148), 2-C-metil-D- eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (EC 4.6.1.12), 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-l-il difosfato sintase (EC 1.17.7.1), 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil

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24/44 difosfato redutase (EC 1.17.1.2), e isopentenil-difosfato delta-isomerase (EC 5.3.3.2).

[0081] Essa via pode ser melhorada por qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica, por exemplo, por um método descrito no pedido de patente WO 2015/189428. Em particular, essa via pode ser melhorada aumentando pelo menos uma atividade enzimática selecionada a partir do grupo que consiste em atividades de DXP sintase (DXS), DXP redutoisomerase (DXR), IspD, IspE, IspF, IspG, IspH e IPP isomerase (IDI), preferencialmente aumentando pelo menos atividades de DXP sintase e IPP isomerase.

[0082] Uma atividade enzimática (por exemplo, atividade de DXS, DXR, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH, IDI ou FPPS) pode ser aumentada como detalhado acima para a atividade de fitoeno sintase, isto é, por superexpressão de um gene endógeno ou expressão de um gene heterólogo e/ou expressão de uma variante melhorada da enzima endógena.

[0083] 0 termo DXS ou DXP sintase se refere à enzima 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (EC 2.2.1.7) codificada pelo gene dxs que catalisa a condensação de piruvato e D-gliceraldeído 3-fosfato em 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato (DXP). Os nomes de produto genético, DXP sintase, DXS ou DXPS, são usados de modo alternado neste pedido. A atividade de DXP sintase pode ser determinada com o uso de um substrato radiomarcado como descrito por Lois et ai. (1998) ou qualquer outro método conhecido pela pessoa versada na técnica. O termo DXP redutoisomerase ou DXR se refere à enzima 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato redutoisomerase (EC 1.1.1.267) codificada pelo gene dxr. O termo IspD se refere à enzima 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato

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25/44 citidililtransferase (EC 2.7.7.60) codificada pelo gene ispD. O termo IspE se refere à enzima 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol quinase, (EC 2.7.1.148) codificada pelo gene ispE. O termo IspF se refere à enzima 2-C-metil-Deritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (EC 4.6.1.12) codificada pelo gene ispF. O termo IspG se refere à enzima 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-l-il difosfato sintase (EC 1.17.7.1) codificada pela gene ispG. O termo IspH se refere à enzima 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato redutase, também denominada hidroximetilbutenil pirofosfato redutase, (EC 1.17.1.2) codificada pelo gene ispH. O termo IDI, IPP isomerase ou isopentenil pirofosfato isomerase se refere à enzima isopentenil-difosfato delta-isomerase (EC 5.3.3.2) codificada pelo gene idi que catalisa a disposição 1,3alilica do substrato homoalilico isopentenil (IPP) em seu isômero alilico, dimetilalil difosfato (DMAPP). De acordo como organismo, a nomenclatura das enzimas identificadas acima e que codificam genes pode variar. No entanto, com fins de clareza, no presente relatório descritivo, esses termos são usados independentemente da origem das enzimas ou genes.

[0084] Preferencialmente, pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste em genes dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH e idi é superexpresso, mais preferencialmente pelo menos genes dxs e/ou idi e ainda mais preferencialmente pelo menos genes dxs e idi são superexpressos. Esses genes podem ser endógenos ou heterólogos, preferencialmente endógenos. Os genes dxs, dxr, ispD, ispE, ispF, ispG, ispH e idi da bactéria Deinococcus recombinante da invenção podem ser facilmente identificados

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26/44 como descrito no pedido de patente WO 2015/189428.

[0085] Em uma modalidade particular, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção é geneticamente modificada para superexpressar um gene dxs endógeno ou para expressar um gene dxs heterólogo e para superexpressar um gene idi endógeno ou para expressar um gene idi heterólogo. [0086] Em uma modalidade preferida, o gene dxs endógeno superexpresso ou heterólogo expresso é de uma bactéria Deinococcus. Exemplos de genes dxs de bactérias Deinococcus incluem, porém sem limitação, os genes dxs de D. geothermalis (SEQ ID NO: 24; número de acesso de UniProt: Q1IZP0), D. yunweiensis (SEQ ID NO: 25), D. deserti (número de Acesso de NCBI: WP_012692944.1; GenBank: AC045821.1; número de acesso de UniProt: C1D1U7), D. radiodurans (número de acesso de UniProt: Q9RUB5; número de Acesso de NCBI: WP_010888114.1) e D. radiopugnans (SEQ ID NO: 26). Preferencialmente, o gene dxs é selecionado a partir do grupo que consiste nos genes dxs de D. geothermalis, D. yunweiensis e D. radiopugnans. Mais preferencialmente, o gene dxs é de D. yunweiensis ou D. radiopugnans. Qualquer polipeptideo, preferencialmente de uma bactéria Deinococcus, que tem pelo menos 70 %, preferencialmente 80 %, mais preferencialmente 90 %, de identidade de sequência a qualquer um dos polipeptideos codificados por aqueles genes, preferencialmente ao polipeptideo codificado por SEQ ID NO: 24, 25 ou 26, e que tem uma atividade de DXS também pode ser usado na presente invenção.

[0087] Em uma modalidade preferida, o gene idi endógeno superexpresso ou heterólogo expresso é de uma bactéria Deinococcus. Exemplos de genes idi de bactérias Deinococcus

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27/44 incluem, porém sem limitação, os genes idi de D. geothermalis (SEQ ID NO: 27), D. yunweiensis (SEQ ID NO: 28), D. deserti (número de Acesso de NCBI: WP_012692934.1), D. radiodurans (número de acesso de UniProt: Q9RVE2.3) ou D. radiopugnans (SEQ ID NO: 29). Preferencialmente, o gene idi é selecionado a partir do grupo que consiste nos genes idi de D. geothermalis e D. yunweiensis. Mais preferencialmente, o gene idi é de D. yunweiensis. Qualquer polipeptideo, preferencialmente de uma bactéria Deinococcus, que tem pelo menos 70 %, preferencialmente 80 %, mais preferencialmente 90 %, de identidade de sequência a qualquer um dos polipeptideos codificados por aqueles genes, preferencialmente ao polipeptideo codificado por SEQ ID NO: 27, 28 ou 29, e que tem uma atividade de IDI também pode ser usado na presente invenção.

[0088] Além disso, ou alternativamente, a bactéria recombinante da invenção também pode expressar uma variante de uma DXP sintase de Deinococcus que exibe atividade aumentada em comparação com a enzima do tipo selvagem. Tais DXP sintases melhoradas são descritas nos pedidos de patente internacional WO 2015/189428 e WO 2012/052171.

[0089] Em particular, a bactéria recombinante da invenção pode expressar um gene que codifica mutante de R244C da DXP sintase de D. radiopugnans (SEQ ID NO: 30), um gene que codifica mutante de R238C da DXP sintase de D. yunweiensis (SEQ ID NO: 31) e/ou um gene que codifica mutante de R241C da DXP sintase de D. geothermalis (SEQ ID NO: 32).

[0090] Além disso, ou alternativamente, a produção de fitoeno também pode ser melhorada aumentando a conversão de IPP e DMAPP em GGPP. Preferencialmente, na bactéria

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28/44 recombinante da invenção, a atividade de FPP sintase é aumentada em comparação com a bactéria do tipo selvagem.

[0091] Como usado no presente documento, o termo IspA, FDPS, FPPS ou FPP sintase se refere a uma enzima codificada pelo gene fdps (ou crtE) e que exibe atividade de farnesil difosfato sintase (EC 2.5.1.10), atividade de dimetilaliltranstransferase (EC 2.5.1.1) e atividade de geranilgeranil difosfato sintase (EC 2.5.1.29).

[0092] Preferencialmente, a atividade de FPP sintase é aumentada por superexpressão de um gene endógeno ou expressão de um gene fdps heterólogo. Em particular, a bactéria Deinococcus recombinante da invenção pode compreender um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptideo que exibe atividade de FPP sintase e/ou pode superexpressar um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptideo que exibe atividade de FPP sintase.

[0093] 0 polipeptideo que exibe atividade de FPP sintase pode ser qualquer FPP sintase conhecida, preferencialmente qualquer FPP sintase de bactérias Deinococcus.

[0094] Exemplos de FPP sintases de Deinococcus incluem, porém sem limitação, FPP sintases de D. geothermalis (número de Acesso de NCBI: ABF45913; SEQ ID NO: 33), D. radiodurans (número de Acesso de NCBI: NP_295118; SEQ ID NO: 34) e D. deserti (número de Acesso de NCBI: AC046371; SEQ ID NO: 35). O polipeptideo que exibe atividade de FPP sintase também pode ser qualquer polipeptideo que exibe atividade de FPP sintase e que tem pelo menos 60 %, preferencialmente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade com qualquer FPP sintase listada acima.

[0095] Em uma modalidade particular, o polipeptideo que

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29/44 exibe atividade de FPP sintase é selecionado a partir do grupo que consiste em

a) um polipeptideo que compreende, ou consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 33 a 35; e

b) um polipeptideo que exibe atividade de FPP sintase e que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60 %, preferencialmente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade com SEQ ID NO: 33, 34 ou 35.

[0096] Em uma modalidade particular, a bactéria recombinante da invenção é geneticamente modificada para aumentar o fluxo de carbono para isopentenil pirofosfato (IPP) e dimetilalil opirofosfato (DMAPP) e para aumentar a conversão de IPP e DMAPP em geranilgeranil difosfato (GGPP).

[0097] Preferencialmente, a bactéria recombinante da invenção exibe atividades aumentadas de FPP sintase, DXP sintase e/ou IPP isomerase em comparação com a bactéria do tipo selvagem. Mais preferencialmente, a bactéria recombinante da invenção exibe atividades aumentadas de FPP sintase, DXP sintase e IPP isomerase em comparação com a bactéria do tipo selvagem.

[0098] Em uma modalidade mais particular, a bactéria recombinante da invenção, preferencialmente uma bactéria D. geothermalis, é geneticamente modificada

- para exibir atividade aumentada de fitoeno sintase, preferencialmente superexpressando um gene CrtB nativo,

- para exibir atividade diminuída de fitoeno desaturase, preferencialmente deletando todo ou parte do gene CrtI que codifica uma fitoeno desaturase, exibir atividade aumentada de FPP sintase,

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30/44 preferencialmente superexpressando um gene de FPP sintase nativo;

para exibir atividade aumentada de DXP sintase, preferencialmente expressando uma variante de uma DXP sintase de Deinococcus, mais preferencialmente a variante codificada por SEQ ID NO: 31, e para exibir atividade aumentada de IPP isomerase, preferencialmente superexpressando um gene idi nativo ou expressando um gene idi heterólogo, mais preferencialmente expressando a enzima codificada por SEQ ID NO: 28.

[0099] Em uma modalidade preferida, a bactéria recombinante da invenção, preferencialmente uma Deinococcus geothermalis, e mais preferencialmente uma bactéria recombinante como definido no parágrafo anterior, é capaz de produzir pelo menos 5 mg/g de DCW de fitoeno, preferencialmente pelo menos 10 mg/g de DCW de fitoeno, mais preferencialmente pelo menos 15 mg/g de DCW de fitoeno, e ainda mais preferencialmente pelo menos 20 mg/g de DCW de fitoeno, quando cultivada em aerobiose e na presença de glicose como fonte de carbono. Preferencialmente, a bactéria recombinante da invenção produz apenas um isômero de fitoeno, isto é, 15-cis fitoeno, e não produz fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

[0100] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um extrato celular da bactéria Deinococcus recombinante da invenção. Como usado no presente documento, o termo extrato celular se refere a qualquer fração obtida de uma célula hospedeira, como um sobrenadante celular, um residue celular, paredes celulares, extrato de DNA ou RNA, preparação de enzimas ou enzima ou qualquer preparação

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31/44 derivada de células hospedeiras por tratamento químico, fisico e/ou enzimático, o qual é essencial ou principalmente livre de células vivas.

[0101] Em uma modalidade particular, o extrato celular compreende fitoeno e é preferencialmente uma fração que compreende membranas celulares. Em particular, o extrato celular pode compreender fitoeno e lipidios, como lipidios membranares.

[0102] Em uma modalidade preferida, o extrato celular compreende fitoeno e não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

[0103] Em uma modalidade mais particular, o extrato celular compreende apenas um composto carotenoide, sendo que o dito composto é fitoeno.

[0104] Em modalidades preferidas, o extrato compreende apenas um isômero de fitoeno, isto é, 15-cis fitoeno, e não compreende fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

[0105] A invenção se refere adicionalmente ao uso do dito extrato celular para produzir fitoeno.

[0106] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um uso de uma bactéria Deinococcus recombinante da invenção para produzir fitoeno.

[0107] Em particular, a presente invenção se refere a um método para produzir fitoeno, preferencialmente 15-cis fitoeno, que compreende (i) cultivar uma bactéria Deinococcus recombinante de acordo com a invenção sob condições adequadas para produzir fitoeno e opcionalmente (ii) recuperar o dito fitoeno.

[0108] 0 método pode compreender adicionalmente isolar ou

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32/44 purificar o dito fitoeno.

[0109] Preferencialmente, a bactéria Deinococcus recombinante não produz quantidade significativa ou detectável de fitoflueno ou de quaisquer outras moléculas intermediárias de fitoeno em licopeno.

[0110] Então, em uma modalidade particular, o fitoeno produzido pelo método da invenção ou de acordo com o uso da invenção é livre de fitoflueno ou de quaisquer outras moléculas intermediárias de fitoeno em licopeno (isto é, ζcaroteno, neurosporeno), ou licopeno.

[0111] Como usado no presente documento, o termo livre de significa que o fitoeno não contém nenhuma quantidade detectável de fitoflueno ou de quaisquer outras moléculas intermediárias de fitoeno em licopeno, preferencialmente de fitoflueno. A presença de fitoflueno ou de quaisquer outras moléculas intermediárias pode ser avaliada por qualquer método conhecido pela pessoa versada na técnica, como análise por HPLC.

[0112] Todas as modalidades descritas acima para a bactéria Deinococcus recombinante da invenção também são contempladas nesse aspecto.

[0113] As condições adequadas para produzir fitoeno podem ser facilmente determinadas pela pessoa versada na técnica de acordo com a bactéria Deinococcus recombinante usada.

[0114] Em particular, a fonte de carbono pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em C5 açúcares, como xilose e arabinose, C6 açúcares, como glicose, celobiose, sacarose e amido. Em uma modalidade preferida, a fonte de carbono é glicose.

[0115] Preferencialmente, a bactéria recombinante da

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33/44 invenção é cultivada em aerobiose e na presença de glicose como fonte de carbono.

[0116] Alternativamente, o fitoeno é produzido a partir de fontes de carbono renováveis biologicamente derivadas, como biomassa celulósica. Como usado no presente documento, o termo biomassa celulósica se refere a qualquer material de biomassa, preferencialmente biomassa vegetal, que compreende celulose, hemicelulose e/ou lignocelulose, preferencialmente que compreende celulose e hemicelulose. A biomassa celulósica inclui, porém sem limitação, material vegetal, como produtos florestais, matéria-prima lenhosa (madeiras macias e madeiras densas), refugos agrícolas e residues vegetais (como palha de milho, sorgo, bagaço de cana-de-açúcar, gramineas, palha de arroz, palha de trigo, cachos sem frutos de óleo de palma e tamareira, bagaço de agave, da indústria de tequila), gramas perenes (switchgrass, miscanthus, alpista, erianthus, capim napier, cana-de-gigante e alfalfa); refugo sólido urbano (MSW), produtos aquáticos, como algas e macroalga, residues de papel, couro, algodão, cânhamo, produtos de borracha natural e subprodutos de processamento de alimentos.

[0117] Preferencialmente, se a biomassa celulósica compreender lignocelulose, essa biomassa é pré-tratada antes de hidrólise. Esse pré-tratamento é destinado a abrir os feixes de lignoceluloses para acessar as cadeias de polimero de celulose e hemicelulose. Os métodos de pré-tratamento são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica e podem incluir pré-tratamentos (por exemplo, vaporização de alta pressão, extrusão, pirólise ou irradiação), pré-tratamentos fisicoquimicos e quimicos (por exemplo, explosão de fibra de

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34/44 amônia, tratamentos com agentes alcalinos, ácidos, solventes ou oxidantes) e/ou pré-tratamentos biológicos.

[0118] As condições de temperatura também podem ser adaptadas dependendo do uso de bactérias Deinococcus mesofilicas ou termofilicas.

[0119] Em uma modalidade, a bactéria Deinococcus é uma Deinococcus termofilica, como, por exemplo, D. geothermalis ou D. murrayi, e a cultura da bactéria Deinococcus recombinante sob condições adequadas para produzir fitoeno é realizada a uma temperatura compreendida entre 30 °C e 55 °C, preferencialmente entre 35 e 50 °C, mais preferencialmente entre 40 °C e 50 °C e ainda mais preferencialmente entre 45 e 48 °C.

[0120] Em outra modalidade, a bactéria Deinococcus é uma Deinococcus mesofilica, como, por exemplo, D. grandis, D. aguaticus, D. indicus, D. cellulosilyticus ou D. depolymerans, e a cultura da bactéria Deinococcus recombinante sob condições adequadas para produzir fitoeno é realizada a uma temperatura compreendida entre 20 °C e 40 °C, preferencialmente entre 28 e 35 °C, mais preferencialmente a cerca de 30 °C.

[0121] Em uma modalidade preferida, pelo menos 5 mg/g de DCW de fitoeno, preferencialmente pelo menos 10 mg/g de DCW de fitoeno, mais preferencialmente pelo menos 15 mg/g de DCW de fitoeno e ainda mais preferencialmente pelo menos 20 mg/g de DCW de fitoeno são produzidos e/ou recuperados com o método da invenção.

[0122] Opcionalmente, o método pode compreender ainda submeter o fitoeno produzido ou recuperado a uma etapa de isomerização, por exemplo, com o uso de uma isomerase, para

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35/44 produzir outro isômero de fitoeno.

[0123] Os métodos da invenção podem ser realizados em um reator, em particular, um reator de conversão de biomassa. Por reator quer-se dizer um tanque de fermentação convencional ou qualquer aparelho ou sistema para conversão de biomassa, tipicamente selecionada a partir de biorreatores, biofiltros, contatores biológicos rotatórios e outros biorreatores de fase gasosa e/ou liquida. O aparelho que pode ser usado de acordo com a invenção pode ser usado continuamente ou em cargas de batelada. Dependendo nas células usadas, o método pode ser conduzido sob aerobiose, anaerobiose ou microaerobiose.

[0124] A presente invenção também se refere a um reator que compreende uma bactéria Deinococcus recombinante da invenção ou um extrato celular da mesma. Preferencialmente, o reator também compreende uma fonte de carbono, mais preferencialmente uma fonte de carbono biologicamente derivada como biomassa celulósica. A invenção também se refere ao uso do dito reator para produzir o fitoeno.

[0125] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende uma bactéria Deinococcus recombinante da invenção ou um extrato da mesma e ao uso da dita composição para produzir o fitoeno. Preferencialmente, a composição também compreende uma fonte de carbono, mais preferencialmente uma fonte de carbono biologicamente derivada como biomassa celulósica.

[0126] A invenção também se refere a fitoeno, preferencialmente fitoeno isolado ou purificado, obtido por um método da invenção. O fitoeno isolado é tipicamente desprovido de pelo menos algumas proteínas ou outros

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36/44 constituintes das células às quais é normalmente associado ou com as quais é normalmente misturado por adição ou em solução. 0 fitoeno purificado é tipicamente substancialmente desprovido de outros constituintes das células.

[0127] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende o fitoeno obtido por um método da invenção.

[0128] Em uma modalidade, a dita composição é uma composição cosmética ou farmacêutica.

[0129] Em outra modalidade, a dita composição é uma composição nutracêutica ou nutricosmética ou um aditivo de alimento ou ração.

[0130] Como usado no presente documento, o termo composição nutracêutica se refere a uma composição que compreende nutrientes isolados ou purificados de alimentos e que tem um efeito benéfico na saúde do consumidor. Como usado no presente documento, o termo composição nutricosmética se refere a uma composição que compreende ingredientes orais nutricionais e que é formulada e comercializada especificamente para propósitos de beleza.

[0131] Em uma modalidade particular, a composição cosmética ou farmacêutica é uma composição de branqueamento, clareamento ou descoloração da pele ou uma composição para prevenir envelhecimento, danos oxidativos ou fotooxidativos.

[0132] 0 fitoeno também foi conhecido por mostrar propriedades anticarcinogênicas e anti-inflamatórias. Então, em uma modalidade, a composição é uma composição farmacêutica a ser usada no tratamento de câncer ou no tratamento de transtornos inflamatórios.

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37/44 [0133] Preferencialmente, a composição da invenção deve ser administrada por via tópica ou oral.

[0134] Preferencialmente, a dita composição não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζcaroteno, neurosporeno e/ou licopeno. Mais preferencialmente, a dita composição não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno.

[0135] Preferencialmente, a composição compreende apenas um isômero de fitoeno que é 15-cis fitoeno.

[0136] A composição também pode compreender uma bactéria Deinococcus recombinante da invenção ou um extrato da mesma. [0137] A composição da invenção também pode compreender evidentemente, dependendo de seu uso, outros ingredientes, como carreadores aceitáveis cosméticos ou farmacêuticos, conservantes, antioxidantes como carotenoides, bem como ingredientes farmacêutica ou cosmeticamente ativos.

[0138] Em uma modalidade preferida, a composição também compreende um carreador hidrofóbico, que pode ser selecionado a partir de óleos tipicamente usados na indústria cosmética, farmacêutica ou de alimentos, como óleos vegetais, minerais ou sintéticos.

[0139] A presente invenção também se refere a um método para produzir uma composição da invenção, em particular, uma composição cosmética, farmacêutica, nutracêutica, nutricosmética ou um aditivo de alimento ou ração, que compreende (i) cultivar uma bactéria Deinococcus recombinante de acordo com a invenção sob condições adequadas para produzir fitoeno, (ii) recuperar o dito fitoeno e (iii) misturar o dito fitoeno com pelo menos um carreador ou pelo menos um outro ingrediente da composição cosmética,

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38/44 farmacêutica, nutracêutica, nutricosmética ou aditivo de alimento ou ração.

[0140] Todas as modalidades descritas acima para a bactéria Deinococcus recombinante, o método para produzir o fitoeno e a composição da invenção também são contemplados nesse aspecto.

[0141] Os aspectos e as vantagens adicionais da presente

invenção serão	descritos	nos exemplos a	seguir, que	devem
ser considerados como ilustrativos, e não	limitantes.
EXEMPLOS
Exemplo 1
[0142] Uma	cepa de	Deinococcus	geothermalis	foi
geneticamente	modificada	para produzir	o fitoeno.	A D.

geothermalis recombinante que produz fitoeno foi obtida interrompendo uma parte da vida de carotenoide, isto é, o gene de fitoeno desaturase (E.C. 1.3.99.26, 1.3.99.28, 1.3.99.29, 1.3.99.31) (crtl) foi submetido a knockout. Os construtos resultantes foram verificados por sequenciamento. [0143] Para produzir culturas de sementes, colônias individuais foram escolhidas para inocular 25 ml de meio de CMG2 % (Peptona 2 g/1; Extrato de Levedura 5 g/1 ; Glicose 55 mM (20 g/1); Ácido MOPS 40 mM; NH₄C1 20 mM; NaOH 10 mM; KOH 10 mM; CaC12.2H₂O 0,5 μΜ; Na₂SO₄.10H₂O 0,276 mM; MgCl₂.6H₂O 0,528 mM; (NH₄) ₆ (Mo₇) O₂₄.4H₂O 3 nM; H3BO3 0,4 μΜ; CoC1₂.6H₂0 30 nM; CuSO₄.5H₂O 10 nM; MnCl₂ 0,25 μΜ; ZnSO₄.7H₂O 10 nM; D-Biotina 1 μg/l; Niacina (ácido nicotinico) 1 μμ/1; Vitamina B6 1 μg/l; Vitamina Bl; FeCls 20 μΜ; Citrato de sódio. 2H₂O 20 μΜ; K₂HPO₄ 5,7 mM) contendo 2 % de glicose ou dextrose como a principal fonte de carbono e cultivadas a 45 °C e 250 rpm de um dia para o outro. A semente da fase de

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39/44 log de crescimento foi então inoculada em 25 ml do mesmo meio fresco a uma densidade óptica inicial a 600 nm (OD600) de 0,4. Essa segunda cultura de semente foi cultivada a 45 °C e 250 rpm de um dia para o outro. As culturas para produção de fitoeno foram realizadas a 45 °C e 250 rpm por 24 h de fase de log de crescimento inoculadas em 25 ml de meio definido mineral (NfUHSCg <100 mM; NatRPCg.l^O < 10 mM; KC1 < 10 mM; Na2SO₄ < 10 mM; Ácido cítrico < 30 mM; MgC12.6H2O < 10 mM; CaCl₂.2H₂O < 10 mM; ZnCl₂ < 50 mg/1; FeSO₄.7H20 <50 mg/1; MnC12.4H2O <50 mg/1; CuSO₄ < 50 mg/1; COCI2.6H2O < 50 mg/1; H3BO3 < 5 mg/1; MES < 200 mM; (NH₄) 6M07O24 · 4H₂O < 0,5 mM; Glicose ou dextrose < 30 g/1 (166 mM) a uma densidade óptica inicial a 600 nm (GD600) de 0,4.

[0144] Após 24 h de cultura, 1 ml de cultura foi centrifugada e a extração de carotenoide foi feita misturando 1 ml de etanol com pélete. A fase de etanol foi analisada por absorbância a OD 285 nm e analisada por HPLC (Coluna cl8 Poroshell da Agilent 150 mm*2,l mm*2,7um, acetonitrila/metanol/acetato de etila de fase móvel).

[0145] Finalmente, o rendimento de fitoeno em mg/g de peso seco celular (DCW) foi determinado pela diluição de fitoeno padrão. A D. geothermalis recombinante produziu 0,4 mg/g de DCW de fitoeno e não produziu nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

[0146] O isômero de fitoeno produzido pela D.geothermalis recombinante foi analisado por RMN e identificado como 15cis fitoeno.

Exemplo 2 [0147] A cepa de Deinococcus geothermalis recombinante do exemplo 1 foi adicionalmente modificada inserindo no

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40/44 cromossomo um cassete de expressão que compreende (i) um gene que codifica o mutante de R238C de 1-desoxi-

D-xilulose 5- fosfato sintase (E.C. 2.2.1.7) (DXS) de

Deinococcus yunweinensis e (ii) um gene que codifica a isopentenil-difosfato deltaisomerase (EC 5.3.3.2) (IDI) de Deinococcus yunweinensis. [0148] Esses genes foram colocados sob o controle de um promotor constitutivo e o cassete de expressão foi inserido no cromossomo substituindo o gene de amilase (any) . Os construtos resultantes foram verificados por sequenciamento. [0149] As culturas de sementes e culturas para a produção de fitoeno foram realizadas como descrito no exemplo 1.

[0150] Após 24 h de cultura, 1 ml de cultura foi centrifugada e a extração de carotenoide foi feita misturando 1 ml de etanol com pélete. A fase de etanol foi analisada por absorbância a OD 285 nm e analisada por HPLC (Coluna c!8 Poroshell da Agilent 150 mm*2,l mm*2,7um, acetonitrila/metanol/acetato de etila de fase móvel).

[0151] Foi determinado então que a D. geothermalis recombinante produziu cerca de 1 mg/g de DCW (peso seco celular) de fitoeno e não produziu nenhuma quantidade

detectável	de	fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno	ou
licopeno.
Exemplo 3
[0152] A	cepa	de Deinococcus geothermalis recombinante	do
exemplo 1	foi	adicionalmente modificada inserindo	no

cromossomo um cassete de expressão que compreende (i) um gene que codifica o mutante de R238C de 1-desoxi-

D-xilulose 5- fosfato sintase (E.C. 2.2.1.7) (DXS) de

Deinococcus yunweinensis,

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41/44 (ii) um gene que codifica a isopentenil-difosfato deltaisomerase (EC 5.3.3.2) (IDI) de Deinococcus yunweinensis, (iii) um gene que codifica a farnesil opirofosfato sintase (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) de Deinococcus geothermalis, e (iv) um gene que codifica a fitoeno sintase (EC 2.5.1.32) (CrtB) de Deinococcus geothermalis.

[0153] Esses genes foram colocados sob o controle de um promotor constitutivo e o cassete de expressão foi inserido no cromossomo substituindo o gene de amilase (amy). Os construtos resultantes foram verificados por sequenciamento.

[0154] As culturas de sementes e culturas para a produção de fitoeno foram realizadas como descrito no exemplo 1.

[0155] Após 24 h de cultura, 1 ml de cultura foi centrifugada e a extração de carotenoide foi feita misturando 1 ml de etanol com pélete. A fase de etanol foi analisada por absorbância a OD 285 nm e analisada por HPLC (Coluna c!8 Poroshell da Agilent 150 mm*2,l mm*2,7um, acetonitrila/metanol/acetato de etila de fase móvel).

[0156] Foi determinado então que a D. geothermalis recombinante produziu cerca de 22 mg/g de DCW (peso seco celular) de fitoeno e não produziu nenhuma quantidade

detectável	de	fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno	ou
licopeno.
Exemplo 4
[0157] A	cepa	de Deinococcus geothermalis recombinante	do
exemplo 1	foi	adicionalmente modificada inserindo	no

cromossomo um primeiro cassete de expressão que compreende (i) um gene que codifica o mutante de R238C de 1-desoxi-

D-xilulose 5- fosfato sintase (E.C. 2.2.1.7) (DXS) de

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Deinococcus yunweinensis e (ii) um gene que codifica a isopentenil-difosfato deltaisomerase (EC 5.3.3.2) (IDI) de Deinococcus yunweinensis, e um segundo cassete de expressão que compreende (iii) um gene que codifica a farnesil opirofosfato sintase (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) de Deinococcus geothermalis, e (iv) um gene que codifica a fitoeno sintase (EC 2.5.1.32) (CrtB) de Deinococcus geothermalis.

[0158] Esses genes foram colocados sob o controle de promotores constitutivos. O primeiro e o segundo cassetes de expressão foram inseridos no cromossomo substituindo o gene de amilase (amy) e o gene fdps endógeno, respectivamente. Os construtos resultantes foram verificados por sequenciamento.

[0159] As culturas de sementes e culturas para a produção de fitoeno foram realizadas como descrito no exemplo 1.

[0160] Após 24 h de cultura, 1 ml de cultura foi centrifugada e a extração de carotenoide foi feita misturando 1 ml de etanol com pélete. A fase de etanol foi analisada por absorbância a OD 285 nm e analisada por HPLC (Coluna c!8 Poroshell da Agilent 150 mm*2,l mm*2,7um, acetonitrila/metanol/acetato de etila de fase móvel).

[0161] Foi determinado então que a D. geothermalis recombinante produziu 23 mg/g de DCW (peso seco celular) de fitoeno e não produziu nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

Exemplo 5 [0162] A cepa de Deinococcus geothermalis recombinante do exemplo 1 é adicionalmente modificada inserindo no cromossomo um cassete de expressão que compreende

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43/44 (i) um gene que codifica a 1-desoxi-D-xilulose 5- fosfato sintase (E.C. 2.2.1.7) (DXS) de Deinococcus yunweinensis ou Deinococcus geothermalis, (ii) um gene que codifica a isopentenil-difosfato deltaisomerase (EC 5.3.3.2) (IDI) de Deinococcus yunweinensis, (iii) um gene que codifica a farnesil opirofosfato sintase (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) de Deinococcus geothermalis, e (iv) um gene que codifica a fitoeno sintase (EC 2.5.1.32) (CrtB) de Deinococcus geothermalis.

[0163] Esses genes são colocados sob o controle de um promotor constitutivo e o cassete de expressão é inserido no cromossomo substituindo o gene de amilase (any). Os construtos resultantes são verificados por sequenciamento.

[0164] As culturas de sementes e culturas para a produção de fitoeno são realizadas como descrito no exemplo 1. Após 24 h de cultura, 1 ml de cultura é centrifugada e a extração de carotenoide foi feita misturando 1 ml de etanol com pélete. A fase de etanol é analisada por absorbância a OD 285 nm e analisada por HPLC (Coluna cl8 Poroshell da Agilent 150 mm*2,l mm*2,7um, acetonitrila/metanol/acetato de etila de fase móvel).

Exemplo 6 [0165] A cepa de Deinococcus geothermalis recombinante do exemplo 1 é adicionalmente modificada inserindo no cromossomo um primeiro cassete de expressão que compreende (i) um gene que codifica a 1-desoxi-D-xilulose 5- fosfato sintase (E.C. 2.2.1.7) (DXS) de Deinococcus yunweinensis ou Deinococcus geothermalis e (ii) um gene que codifica a isopentenil-difosfato delta-

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44/44 isomerase (EC 5.3.3.2) (IDI) de Deinococcus yunweinensis, e um segundo cassete de expressão que compreende (iii) um gene que codifica a farnesil opirofosfato sintase (E.C. 2.5.1.1, 2.5.1.10, 2.5.1.29) (FPPS) de Deinococcus geothermalis, e (iv) um gene que codifica a fitoeno sintase (EC 2.5.1.32) (CrtB) de Deinococcus geothermalis.

[0166] Esses genes são colocados sob o controle de promotores constitutivos. O primeiro e o segundo cassetes de expressão são inseridos no cromossomo substituindo o gene de amilase (amy) e o gene fdps endógeno, respectivamente. Os construtos resultantes são verificados por sequenciamento.

[0167] As culturas de sementes e culturas para a produção de fitoeno são realizadas como descrito no exemplo 1. Após 24 h de cultura, 1 ml de cultura é centrifugada e a extração de carotenoide foi feita misturando 1 ml de etanol com pélete. A fase de etanol é analisada por absorbância a OD 285 nm e analisada por HPLC (Coluna cl8 Poroshell da Agilent 150 mm*2,l mm*2,7um, acetonitrila/metanol/acetato de etila de fase móvel).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir fitoeno caracterizado por compreender cultivar uma bactéria Deinococcus recombinante sob condições adequadas para produzir fitoeno e recuperar opcionalmente o dito fitoeno, em que a dita bactéria Deinococcus recombinante é geneticamente modificada para exibir atividade aumentada de fitoeno sintase e atividade diminuída de fitoeno desaturase.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante não exibe nenhuma atividade de fitoeno desaturase. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus

recombinante é geneticamente modificada inativando um gene que codifica uma fitoeno desaturase, preferencialmente deletando todo ou parte de dito gene ou introduzindo um códon sem sentido, um cassete, um gene ou uma mutação que induz um deslocamento de quadro.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é geneticamente modificada deletando todo ou parte de um gene que codifica uma fitoeno desaturase.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é geneticamente modificada para superexpressar um gene nativo que codifica fitoeno sintase.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus

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2/4 recombinante é geneticamente modificada para expressar um gene heterólogo que codifica fitoeno sintase ou um gene nativo que codifica fitoeno sintase e que compreende uma mutação que melhora a atividade de fitoeno sintase da enzima codificada.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é geneticamente modificada para expressar um gene que codifica uma fitoeno sintase resistente à realimentação.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante exibe adicionalmente atividade aumentada de FPP sintase.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante exibe adicionalmente atividades aumentadas de DXP sintase e/ou IPP isomerase, preferencialmente atividades aumentadas de DXP sintase e IPP isomerase.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é uma bactéria Deinococcus selecionada a partir de D. geothermalis, D. murrayi, D. grandis, D. aguaticus, D. indicus, D. cellulosilyticus, D. depolymerans, D. maricopensis.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é uma bactéria Deinococcus geothermalis.

12. Método, de acordo com qualquer uma das

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3/4 reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é capaz de produzir pelo menos 20 mg/g de DCW (peso seco celular) de fitoeno.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é capaz de produzir pelo menos 20 mg/g de DCW (peso seco celular) de fitoeno quando cultivada em aerobiose e na presença de glicose como fonte de carbono.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante produz apenas um isômero de fitoeno que é o 15-cis fitoeno, e não produz fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a bactéria Deinococcus recombinante é uma Deinococcus termofilica, preferencialmente D. geothermalis, e a cultura da bactéria Deinococcus recombinante sob condições adequadas para produzir fitoeno é realizada a uma temperatura compreendida entre 40 e 50 °C, preferencialmente entre 45 e 48 °C.

16. Bactéria Deinococcus recombinante caracterizada por ser como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

17. Extrato celular caracterizado por ser da bactéria Deinococcus recombinante, conforme definido na reivindicação 16, preferencialmente o dito extrato celular compreende fitoeno e não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno ou licopeno.

18. Extrato celular, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por compreender apenas um isômero de fitoeno

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4/4 que é 15-cis fitoeno.

19. Extrato celular, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado por ser uma fração que compreende membranas celulares.

20. Uso de uma bactéria Deinococcus recombinante,

conforme definido na reivindicação 16, caracterizado por ser para produzir o fitoeno. 21. Composição caracterizada por compreender fitoeno obtido pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a dita composição não compreende nenhuma quantidade detectável de fitoflueno, ζ-

caroteno, neurosporeno ou licopeno.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, sendo que a dita composição é caracterizada por compreender apenas um isômero de fitoeno que é o 15-cis fitoeno.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada por ser uma composição cosmética, farmacêutica ou nutracêutica, nutricosmética ou um aditivo de alimento ou ração.