PT2209900E - Utilização de bactérias para a produção de bioenergia - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PARA A PRODUÇÃO DE BIOENERGIA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção revela composições e métodos para produção de bioenergia. Mais especificamente, a invenção revela a utilização de bactérias do género Deinococcus e/ou géneros relacionados para a modificação de biomassa ou derivados de biomassa tendo em vista a produção de produtos e metabólitos de bioenergia.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO É conhecida a utilização de microrganismos para conduzir a modificação de biomassa, essencialmente biomassa vegetal, para produzir produtos de bioenergia, por exemplo, etanol.

Processos industriais atuais, apenas permitem que a cultura e o crescimento de microorganismos para a fermentação e extração de etanol a temperaturas na região de 300 °C, devido à fragilidade dos microorganismos industriais (leveduras) utilizados. Eles também implicam custos maiores de bioenergia para concentrar o etanol depois da fermentação, uma vez que as leveduras utilizadas ΡΕ2209900 atualmente para esta fermentação pode não suportar concentrações superiores a 100 g/1. Além disso, a fermentação destas leveduras praticamente só utiliza açúcares de C6, do tipo glicose.

Ele também é conhecido por tratar o material biológico, as estirpes de bactérias, inter alia, para dar propriedades melhoradas ao mesmo.

Por exemplo, a Patente U.S. N ° 6,716,631 de S. Del Cardayre et al. descreve um método baseado em ciclos iterativos de recombinação e seleção/triagem para conferir as propriedades desejadas às células inteiras e aos organismos inteiros. As propriedades adicionadas são, por exemplo, o aumento da aptidão para a recombinação genética, o aumento do número de cópias do genoma, o aumento da capacidade de expressar e/ou secretar proteínas e metabólitos secundários.

Através de uma abordagem genética molecular, os autores propõem técnicas para modificar adequadamente os genomas das células e organismos para dar propriedades novas, aperfeiçoadas às suas melhoradas. O método descrito em US 6,716.631 utiliza uma população de células diferentes, o cultivo dessas células para formar células híbridas através de fusão de proto-plastos, a seguir a triagem ou seleção de células, que evoluiu para adquirir uma propriedade desejada, e a ΡΕ2209900 repetição destas etapas até pelo menos uma célula ser obtida que possua a modificação desejada. Este método é apresentado como sendo uma alternativa vantajosa para os métodos conhecidos com base em um programa de aperfeiçoamento da estirpe.

Os protoplastos submetidos à referida fusão podem derivar a partir de organismos procarióticos.

Uma das aplicações previstas nesta Patente U.S. é a fermentação para a produção, por exemplo, de etanol, cujo rendimento e custo são propostos para melhorar a utilização do dito método de recombinação misturando o DNA dos microrganismos utilizados. A titulo de exemplo, é feita menção da recombinação homóloga de Rhodococcus, conhecido como catalisador de reações em duas fases. 0 Pedido de Patente Internacional No. WO 01/023526 descreve a produção e utilização de bactérias resistentes à radiação e capaz de operar de biorremediação, em especial do género Deinococcus (nomeadamente D. radio-durans e D. geothermalis), modificado de modo mais eficaz para a metabolização, degradação ou desintoxicação de con-taminantes orgânicos e inorgânicos, tais como radionu-clídeos, metais pesados e solventes orgânicos. Recomenda-se que estas bactérias devam ser manipuladas para expressar enzimas heterólogas capazes de desintoxicar tais elementos. As estirpes bacterianas são manipuladas para combinar uma variedade de funções codificadas por diferentes genes em um único hospedeiro. 4 ΡΕ2209900 0 Pedido de Patente de U.S. de I. Narumi et al., publicado em 18 de setembro, 2003 sob o n ° 2003/0175977, descreve um plasmideo endógeno derivado a partir de uma estirpe de D. radiopugnans, pUE30, que pode ser utilizado como vetor capaz de se replicar autonomamente em bactérias do género Deinococcus, e que pode ser utilizado para construir um vetor transportador também contendo um plasmideo capaz de se replicar de forma autónoma em E. coli e seus derivados, e capaz de se replicar em uma bactéria de ambos os géneros Deinococcus e E. coli. A Patente No. 7,160,715 de C.B. Fliermans descreve os meios para medir a distribuição e frequência de geração in vivo de quebras de cordões do DNA. Esses meios compreendem o uso de uma proteína derivada PprA proveniente de Deinococcus radiodurans. O Pedido de Patente Publicado sob o No. 2004/0224320, em nome de K. Satoh et al descreve uma bactéria Gram-positiva (Access No. ATCC BAA-149 ou um mutante do mesmo) que é isolada e purificada. O isolado é capaz de degradar uma grande variedade de contaminantes orgânicos e está apto para a biorremediação de uma variedade de contaminações orgânicas, na presença de radiação ionizante.

Além disso, uma recente monografia sobre a produção de etanol utilizando fermentação com as estirpes de microrganismos foi publicada sob o título "Ethanol ΡΕ2209900

Fermentation Strains", de JR Hettenhaus, sob a égide do Departamento de Energia dos Estados Unidos e do Laboratório de Energia Renovável Nacional (16 de dezembro, 1998). Neste documento, que resume as contribuições feitas pelos participantes do estudo em questão, é apontado que: - as únicas estirpes de microrganismos que podem ser utilizadas em equipamentos existentes devem ser semelhantes àquelas já utilizadas, nomeadamente Saccharomyces, Zymomonas e E. coli; - a curto prazo, o aumento da fermentação de xilose e arabinose poderia ser o objetivo almejado, sendo especificado, no entanto, que é de pouco interesse aumentar a eficácia de conversão dos outros açúcares do tipo hexose ou oligômero; - a longo prazo, os ganhos podem ser alcançados em relação às altas temperaturas de funcionamento e de combinação das etapas de produção de enzimas, sacarificação e hidrólise.

Houve, portanto, a necessidade de um método para fermentar biomassa e obter etanol e opcionalmente outros metabólitos, que poderiam ser implementados em condições de funcionamento significativamente melhor do que aquelas dos métodos atuais, e que ao mesmo tempo poderiam ser mais facilmente pilotadas que os métodos conhecidos e capazes de conduzir a produtos de fermentação que são mais económicos e mais fáceis de atualizar. 6 ΡΕ2209900 A invenção é capaz de trazer soluções a essas expectativas e fornecer métodos aperfeiçoados para tirar proveito a partir de biomassa, produzindo produtos bioenergéticos alternativos, que estão se tornando cada vez mais necessários devido à redução significativa das fontes de energia de origem fóssil.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos e composições para a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos. Mais especificamente, a invenção se refere ao uso de microorganismos particulares para a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos a partir da biomassa ou derivados da mesma. A invenção deriva inter alia da descoberta de que microorganismos do género Deinococcus possuem propriedades inesperadas e vantajosas para a modificação ou conversão de biomassa ou de derivados de biomassa com uma visão à obtenção de compostos que podem ser utilizados para produzir bioenergia, etanol, em particular, em uma escala industrial e ambos económico e confiável. 0 objeto da invenção é tal como definido nas reivindicações. A invenção atual revela um método para a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos compreendendo colocar em contacto uma biomassa ou derivados de biomassa 7 ΡΕ2209900 com uma bactéria nativa ou modificada possuindo capacidade para remontar o seu genoma, no todo ou em parte, quando interrompida por um stresse, de preferência uma bactéria nativa ou modificada do género Deinococcus, ou um extrato do mesmo. A invenção revela também um método para a conversão de biomassa ou derivados de biomassa em produtos de bioenergia ou metabólitos compreendendo tratar a dita biomassa ou derivados de biomassa na presença de uma bactéria do género Deinococcus ou uma bactéria possuindo a capacidade de remontar o seu genoma, no todo ou em parte, quando interrompida por um stresse ou um extrato do mesmo.

Em um aspecto particular, a presente invenção descreve um método compreendendo as seguintes etapas: a) cultivar e/ou crescer as ditas bactéria em condições aeróbica e/ou anaeróbicas, b) modificar uma biomassa ou derivados de biomassa em produtos de bioenergia ou metabólitos de interesse industrial (por exemplo, fontes de bioenergia, tais como etanol, blocos de construção química, tais como ácido succínico) utilizando uma composição que compreende a dita bactéria ou um extrato da mesma, e c) coletar pelo menos um produto de bioenergia ou metabólito resultante de tal modificação de biomassa ou derivados de biomassa. ΡΕ2209900

Esta invenção também revela o uso de uma bactéria do género Deinococcus ou um extrato da mesma para a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos a partir da biomassa ou derivados de biomassa. A invenção também revela uma composição que compreende uma bactéria Deinococcus e uma biomassa ou derivados de biomassa. A invenção também revela produtos de bioenergia produzidos utilizando um método como descrito acima. 0 método ou utilização da invenção pode ser realizado utilizando várias espécies de Deinococcus nativas ou modificadas, tais como, sem limitação, Deinococcus geothermalis, Deinococcus radiodurans, Deinococcus murrayi ou Deinococcus cellulosilyticus. A presente invenção mostra que a bactéria Deinococcus pode promover eficazmente a produção de biocombustiveis, tais como etanol, propanol, butanol glicerol, butanodiol, propanodiol, ou ácidos orgânicos de interesse químico e seus sais, tais como o ácido acético, ácido propiónico, ácido pirúvico, butírico, ácido lático e/ou ácido succínico ou ésteres, em particular ésteres formados entre os alcoóis e ácidos acima mencionados. A invenção também mostra inesperadamente que Deinococcus que pode ser operado em condições, tais como temperaturas elevadas, uma ampla faixa de pH, presença de 9 ΡΕ2209900 solventes, presença de substratos brutos, que servem para produzir grandes quantidades de produtos de bioenergia ou metabólitos de vários substratos. A invenção revela, desse modo, novos métodos e composições para a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos de uma maneira muito eficiente.

LEGENDA PARA AS FIGURAS

Figura 1: efeito bactericida do etanol sobre Deino-coccus geothermalis DSM 11301 em fase de crescimento exponencial: o potencial bactericida do etanol é significativo para o conteúdo superior a 8,2 % em fase de crescimento exponencial.

Figura 2: efeito bactericida do etanol sobre Deino-coccus geothermalis DSM 11301 em fase estacionária: o potencial bactericida do álcool é significativo para o conteúdo superior a 11,7 % em fase estacionária.

Figura 3: Efeito Bactericida de butanol sobre Deino-coccus geothermalis DSM 11300 em fase de crescimento exponencial: o potencial bactericida de butanol é significativo para o conteúdo superior a 1,5 % em fase exponencial.

Figura 4: Efeito Bactericida de butanol sobre Deino-coccus geothermalis DSM 11300 em fase estacionária: o 10 ΡΕ2209900 potencial bactericida de butanol é significativo para o conteúdo superior a 2 % em fase estacionária.

Figura 5: Efeito de etanol sobre o crescimento de Deinococcus geothermalis DSM 11300: quadrado preto, 0 % de etanol; quadrado branco, 0,8 % de etanol; circulo preto, 1,2% de etanol; circulo branco, 2,4% de etanol; triângulo preto, 3,1 % de etanol.

Figura 6A: Efeito do pH sobre o crescimento de D. geothermalis DSM 113000 (DRH05): quadrado preto, pH8; circulo preto, pH 7; quadrado branco, pH6; circulo branco, pH5; diamante preto, pH4.

Figura 6B: Efeito do pH sobre o crescimento de D. geothermalis HAMBI 2481 (DRH37): quadrado preto, pH8; círculo preto, pH 7; quadrado branco, pH6; círculo branco, pH5; diamante preto, pH4.

Figura 6C: Efeito do pH sobre o crescimento de D. geothermalis HAMBI 2480 (DRH38): quadrado preto, pH8; círculo preto, pH 7; quadrado branco, pH6; círculo branco, pH5; diamante preto, pH4.

Figura 6D: Efeito do pH sobre o crescimento de D. geothermalis HAMBI 2411 (DRH39): quadrado preto, pH8; círculo preto, pH 7; quadrado branco, pH6; círculo branco, pH5, diamante negro, pH4. 11 ΡΕ2209900

Figura 7: Crescimento de D. cellulosilyticus em diferentes meios liquidos. A bactéria foi cultivada como descrito no material e métodos do exemplo 9. Circulo preto, crescimento em meio rico; quadrado preto, o crescimento em meio minimo contendo CM -celulose; quadrado branco, crescimento em meio minimo desprovido de fonte de carbono.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção revela métodos para a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos utilizando bactérias Deinococcus. A invenção de facto mostra que as bactérias Deinococcus podem produzir produtos de bioenergia ou metabólitos a partir de biomassa, de uma maneira muito eficiente.

Definições

No contexto do presente pedido, o termo "bactérias do género Deinococcus" inclui estirpes variantes naturais ou do tipo selvagem de Deinococcus, bem como estirpes recombinantes, estirpes obtidas através de tecnologias de mistura de DNA ou através de tecnologias de evolução direcionada. celulares, paredes

Um "extrato de uma bactéria" designa qualquer fração obtida a partir de uma bactéria, tal como um sobrenadante de célula, detritos 12 ΡΕ2209900 celulares, extrato de DNA, enzimas ou preparação enzimática ou qualquer preparação derivada de bactérias por tratamento quimico, fisico e/ou enzimático, que é essencialmente livre de bactérias vivas.

Dentro do contexto da presente invenção, o termo "bioenergia" designa uma energia renovável proveniente de biomassa. Mais especificamente, o termo "produtos de bioenergia" designa "biocombustiveis" e todos os produtos finais de modificação de biomassa ou de derivados de biomassa que podem ser utilizados como combustiveis, tal como o etanol. 0 termo "metabólitos" designa todas as moléculas possíveis intermediárias geradas durante a modificação de biomassa ou de derivados de biomassa em produtos de bioenergia, incluindo, mas não limitado a vários produtos químicos de interesse industrial, tais como ácidos orgânicos e blocos de construção.

Dentro do contexto da presente invenção, o termo "biomassa" refere-se ao material biológico recentemente morto ou vivo que pode ser utilizado como combustível ou para a produção industrial. Mais comumente, a biomassa se refere ao crescimento da matéria vegetal para gerar eletricidade ou produzir biocombustiveis, mas também inclui matéria vegetal ou animal utilizada para a produção de fibras, químicos ou calor. Biomassa pode também incluir os resíduos biodegradáveis que podem ser queimados como combustível. 0 termo biomassa não inclui o material 13 ΡΕ2209900 orgânico que foi transformado por processos geológicos em substâncias tais como o carvão ou o petróleo. A biomassa industrial pode ser produzida a partir de vários tipos de plantas, incluindo miscanto, painço (Panicum virgatum), cânhamo, beterraba, trigo, milho, choupo, salgueiro, sorgo, cana de açúcar, e uma variedade de espécies de árvores, que vão desde eucalipto à palma de óleo. A biomassa, de acordo com a invenção, compreende biomassa bruta e/ou biomassa secundária. A biomassa bruta é material não-processado proveniente de matéria biológica. Exemplos incluem produtos florestais, tais como árvores maduras inadequadas para produção de papel ou madeira, produtos agrícolas, tais como gramineas, culturas e estrume animal, e produtos aquáticos, tais como algas e erva marinha. A biomassa secundária é qualquer material inicialmente derivado de biomassa bruta, que passou por mudanças por quimicas e fisicas significativas. Exemplos incluem papel, couro, algodão, cânhamo, produtos de borracha natural, processamento de alimentos por produtos, e óleos de cozinha utilizados.

Como utilizado aqui, o termo "derivados de biomassa" significa todas as moléculas derivadas a partir de biomassa bruta e/ou a partir de biomassa secundária, conforme acima definido, e em particular qualquer material inicialmente derivado a partir de biomassa bruta, que 14 ΡΕ2209900 passou por modificações quimicas e físicas significativas, tais como por exemplo, amido, celulose, hemicelulose e lignina.

Como utilizado aqui, "plataformas intermediárias" são moléculas obtidas através de transformação físico-química ou bioquímica de derivados de biomassa, tais como açúcares, amidos, e gás sintético baseado em bio (gás de síntese).

Descrição Detalhada A presente invenção propõe a utilização de bactéria Deinococcus para produzir produtos de bioenergia ou metabólitos a partir de biomassa. A presente invenção de facto mostra que as bactérias do género Deinococcus exibem propriedades inesperadas que lhes permitem cooperar na produção de produtos de bioenergia ou metabólito, através da biomassa de fermentação ou derivados de biomassa.

As bactérias Deinococcus tem mostrado ter a capacidade de remontar o seu genoma, no todo ou em parte, quando interrompida por um stresse (PCT/EP2006/005826 Radman Zahradka). Como mencionado anteriormente, estas bactérias, especialmente D. radiodurans, têm sido propostas para biorremediação. No entanto, nunca foi descrito ou sugerido que a bactéria Deinococcus seria capaz de produzir produtos de bioenergia e metabólitos a partir de biomassa. Além disso, nunca tinha sido sugerido que a bactéria 15 ΡΕ2209900

Deinococcus possuindo as propriedades biológicas necessárias poderiam ser isoladas e cultivadas. A invenção mostra agora, pela primeira vez, que é possível isolar ou cultivar bactérias Deinococcus possuindo pelo menos uma das seguintes propriedades, e que as ditas bactérias são capazes de produzir produtos de bioenergia ou metabólitos: - É viável ou funcional em altas temperaturas (por exemplo, cerca de 40 a 70 °C); - É viável ou funcional dentro de uma faixa de pH de cerca de 3 a cerca de 9,5, de preferência entre cerca de 4 e cerca de 8; - É viável e funcional na presença de agentes tóxicos, em particular solventes orgânicos, por exemplo, o etanol; - É capaz de converter açúcares C6 e C5; - É capaz de promover a digestão celulose para produzir glicose; - É capaz de promover digestão hemicelulose para produzir x i 1 o s e; É capaz de crescer em condições aeróbicas e/ou anaeróbicas na presença de uma fonte de carbono adequada.

Além disso, a bactéria Deinococcus é geralmente desprovida de patogenicidade, e pode ser utilizada, por conseguinte, sem confinamento específico. A invenção, desse modo descreve, pela primeira 16 ΡΕ2209900 vez, a capacidade da bactéria Deinococcus fazer produtos de bioenergia ou metabólito a partir de biomassa, bem como a sua capacidade inesperada de ser cultivada e crescida sob condições especificas adaptadas a tal utilização. A invenção também propõe a utilização, para produção de produtos de bioenergia ou metabólito, qualquer bactéria possuindo a capacidade para remontar o seu genoma, no todo ou em parte, quando interrompida por um stresse.

Em uma modalidade preferida, o método desta invenção utiliza uma espécie Deinococcus termofilica, preferencialmente selecionada a partir Deinococcus geother-malis, Deinococcus radiodurans e Deinococcus murrayi.

Em uma modalidade preferida da invenção, o método utiliza uma bactéria Deinococcus viável na presença de agentes tóxicos, em particular na presença de solventes orgânicos, por exemplo, etanol. 0 presente pedido de facto mostra que as estirpes de Deinococcus podem ser cultivadas na presença de altos niveis de solventes, tais como etanol ou butanol, permitindo a produção de biocombustiveis de uma maneira mais eficiente.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, a invenção utiliza uma bactéria que pode ser cultivada em uma faixa de temperatura de aproximadamente 40 a 70 °C, preferencialmente de 50 °C a 60 °C. Em uma modalidade mais preferida, o método utiliza uma bactéria que pode tanto ser cultivada sob temperatura elevada (acima de 40 °C) e na ΡΕ2209900 presença de um agente tóxico ou solvente orgânico, como descrito acima.

Em uma modalidade mais particular da invenção, a invenção utiliza uma bactéria Deinococcus que pode ser viável ou funcional sob condições de concentração de NaCl ou sais equivalente possivelmente atingindo cerca de 5 % em peso/volume.

Em outra modalidade preferida da invenção, o método utiliza uma bactéria que é viável em um intervalo de pH entre aproximadamente 3 e 9,5, preferencialmente entre 4 e 8. Na verdade, os inventores descobriram que as estirpes de Deinococcus podem ser mantidas em condições muito severas, as quais são particularmente vantajosas para a conversão de biomassa.

Em uma modalidade preferida, a invenção utiliza uma bactéria Deinococcus que é capaz de converter os açúcares C6 e/ou C5 e/ou promover a digestão de celulose para gerar glicose e/ou promover a digestão de hemicelulose para gerar xilose.

Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um método, no qual a dita bactéria Deinococcus é capaz de crescer na presença de xilano e promover a digestão de xilano.

Tais atividades enzimáticas, combinadas com uma 18 ΡΕ2209900 elevada termo-resistência, uma ampla faixa de tolerância de pH e de tolerância de agentes tóxicos, nunca foram registadas antes e são notáveis Como mostrado nos exemplos, as bactérias Deinococcus possuindo as propriedades acima podem ser isoladas, cultivadas e produzem quantidades substanciais de produtos de bioenergia ou metabólitos a partir de biomassa. A este respeito, outra vantagem da invenção reside numa utilização, em que a dita bactéria Deinococcus é cultivada em um meio minimo contendo açúcares C6, preferencialmente glicose, ou mais açúcares complexos, preferencialmente, sacarose, celobiose ou amido, ou açúcares C5, preferencialmente, xilose, como fonte de carbono. Uma vantagem adicional da presente invenção reside no facto de que a dita bactéria Deinococcus pode ser cultivada na presença de hidratos de carbono C3, preferencialmente, glicerol ou piruvato de sódio.

Os exemplos específicos de bactérias adequadas para uso na presente invenção são estirpes de Deinococcus geothermalis com números de depósito DSM 11300, DSM 11301, DSM 11302, HAMBI2480, HAMBI2481 e HAMBI2411; estirpes de Deinococcus murrayi com números de depósito DSM 11303 e DSM 11305, ou estirpe de Deinococcus cellulosilyticus números de depósito DSM18568T (listados no respectivo quadro 1), ou estirpes substancialmente similares a mesma ou mutantes da mesma. 19 ΡΕ2209900

Tabela 1: Lista de estirpes de Deinococcus

Designação Género Espécies Ref. Código Tenp. °C Referência Bibliográfica DRH 05 Deinococcus geothermalis DSM 11300 45 a 50 Ferreira et al., 1997 Int J. Syst. Bacteriol,47(4): 939-47 DRH 06 Deinococcus geothermalis DSM 11301 45 a 50 Ferreira et al., 1997 Int J. Syst. Bacteriol,47(4): 939 DFH 07 Deinococcus geothermalis DSM 11302 45 a 50 Ferreira et al., 1997 Int J. Syst. Bacteriol,47(4): 939 DRH 37 Deinococcus geothermalis HAMBI 2481 45 a 50 Kolari et al., 2003 J. Ind. Microbiol Biothecnol, 30: 225-238 DRH 38 Deinococcus geothermalis HAMBI 2480 45 a 50 Kolari et al., 2003 J. Ind. Microbiol Biothecnol, 30: 225-238 DRH 39 Deinococcus geothermalis HAMBI 2411 45 a 50 Vaisánen et al.,1997, Applied Microbiology 84: 1069-1084 DRH 08 Deinococcus rrurrayi DSM 11303 45 a 50 Ferreira et al., 1997 Int J. Syst. Bacteriol,47(4): 939 DRH 10 Deinococcus rcurrayi DSM 11305 45 a 50 Ferreira et al., 1997 Int J. Syst. Bacteriol,47(4): 939 DRH 46 Deinococcus cellulo- silyticus DSM 18568T 45 Weon et al., 2007, Int J of Syst & Evolutionary Microbiol, 57, 1685-1688

Todas as estirpes listadas na tabela acima são capazes de crescer em meio de cultura do tipo PGY em pH7. Outros meios de cultura adequados estão descritos na secção experimental.

Deve ser entendido que as estirpes de Deinococcus adicionais possuindo as propriedades como atualmente demonstradas e descobertas podem agora ser rastreadas e 20 ΡΕ2209900 identificadas pelos versados na técnica, com base nos ensinamentos do presente pedido, por exemplo, seguindo orientação e testes, conforme descrito na secção experimental.

Como mencionado acima, as estirpes de Deino-coccus, utilizadas no presente pedido podem ser utilizadas tanto na forma nativa, ou modificada (por exemplo, quimicamente ou geneticamente) para adquirir propriedades melhoradas. A este respeito, em uma modalidade particular, o método utiliza uma bactéria Deinococcus que é modificada pela evolução acelerada ou pelas tecnologias de mistura de DNA ou pela inserção de eucariontes, procariontes ou DNA de Deinococcus não-sintéticos ou pela inserção de outro DNA de estirpe de Deinococcus, a dita modificação afetando a viabilidade, o crescimento ou as funções da referida bactéria, a fim de promover a modificação de biomassa.

Em outra modalidade da invenção, a bactéria utilizada pode ser uma estirpe bacteriana recombinante ou modificada, vantajosamente utilizando um método tal como descrito no pedido de patente internacional No. PCT/EP2006/005826.

Como discutido acima, a invenção mostra que a bactéria do género Deinococcus, ou os derivados da mesma, selecionada, por exemplo, entre D. geothermalis, D. radio-durans ou D. murrayi, apresentam propriedades vantajosas e são capazes de produzir produtos de bioenergia ou meta-bólitos provenientes de vários substratos brutos. A 21 ΡΕ2209900 presente invenção, portanto, refere-se ao uso de bactérias do género Deinococcus para a produção de bioenergia ou metabólitos a partir de biomassa ou os derivados de biomassa. A presente invenção também se refere a um método para produzir produtos de bioenergia a partir de biomassa e metabólitos ou derivados de biomassa, expondo ou cultivando a dita biomassa na presença de bactérias do género Deinococcus, ou um extrato da mesma e recuperando o produto de bioenergia ou metabolito produzido. A cultura ou exposição podem ser feita em qualquer condição ou ambiente adequado que permita a modificação da biomassa ou derivado para produzir produto de bioenergia. Neste sentido, o método pode ser realizado em um reator, em um fermentador, ao ar livre, na presença de nutrientes ou aditivos adequados, se necessário. 0 método é geralmente conduzido sob condições de pH, temperatura acima de 40 °C, e na presença de substratos adequados.

Um objeto especifico da presente invenção reside em um método compreendendo as seguintes etapas: a) cultura e/ou o cultivo da dita bactéria em condições aeróbias e/ou anaeróbias, b) modificar (por exemplo, conversão ou tratamento) a biomassa ou derivados de biomassa em produtos de bioenergia ou metabólitos utilizando uma composição que compreende a dita bactéria ou um extrato do mesmo, e 22 ΡΕ2209900 c) coletar pelo menos um produto de bioenergia ou metabólito resultante a partir da dita modificação de biomassa ou derivados de biomassa.

Outro objeto da invenção reside em um método para converter a biomassa ou derivados de biomassa utilizando pelo menos uma bactéria ou extrato bacteriano, tal como definido acima ou uma composição tal como acima descrito, compreendendo uma combinação de: • pelo menos uma operação de colocar em cultura e desenvolvimento a dita estirpe bacteriana ou o dito extrato de levedura bacteriana sob condições de crescimento e desenvolvimento adequado, • pelo menos uma operação para converter a biomassa ou um derivado de biomassa sob a ação de quantidades adequadas da dita estirpe bacteriana ou dito extrato de levedura bacteriana, sob condições adequadas para a referida conversão da biomassa, ou derivados da biomassa, e • coletar pelo menos um produto de bioenergia ou metabólito derivado a partir da dita conversão da biomassa ou de derivados de biomassa, em particular coletar o etanol dessa forma produzido.

Nos métodos acima, a primeira etapa de cultura e/ou cultivo da dita bactéria e a segunda etapa de modificação de biomassa ou derivados de biomassa em produtos de bioenergia ou metabólitos utilizando uma 23 ΡΕ2209900 composição que compreende a dita bactéria ou um extrato da mesma, pode ser realizada simultaneamente, ou sequencialmente; a terceira etapa da coleta de produtos de bioenergia ou de metabólitos pode ser realizada simultaneamente com a primeira e/ou a segunda etapa, ou sequencialmente. Neste contexto, a biomassa pode ser entrar em contacto com a bactéria sob condições adequadas para permitir a expansão da referida bactéria, aumentando assim a eficiência do processo. Alternativamente, as estirpes bacterianas podem ser expandidas separadamente, sob condições de cultivo adequado, e posteriormente adicionadas à biomassa. Deve ser entendido que as quantidades exatas de bactérias utilizadas inicialmente para transformar de modo eficaz a biomassa em produtos de bioenergia ou metabólitos substanciais podem ser ajustadas pelo versado na técnica dependendo do tipo de bactéria, o tipo de biomassa ou derivados, e as condições de cultura.

Em uma modalidade particular, do método de acordo com a invenção, a bactéria Deinococcus é cultivada separadamente a partir da conversão de biomassa.

Em outra modalidade particular, o método utiliza uma composição que compreende uma bactéria Deinococcus ou um extrato do mesmo e pelo menos um aditivo ou excipiente adequado, preferencialmente pelo menos um agente escolhido a partir do grupo consistindo em agentes antiespumantes e agentes nutrientes. Os agentes antiespumantes apropriados são dispersantes, detergentes e tensoativos em particular, e mais geralmente compostos anfifilicos. 24 ΡΕ2209900

Em uma modalidade particular, o método aqui descrito é desempenhado em um reator de conversão de biomassa. Por "reator" é entendido um tanque de fermentação convencional ou qualquer aparelho ou sistema de conversão de biomassa, especialmente designados para implementar a invenção e, portanto, consistindo em biorreatores, biofiltros, contatores biológicos rotativos, e outros gasosos e/ou biorreatores fase liquida para o tratamento de biomassa ou produtos derivados de biomassa. 0 aparelho, que pode ser utilizado de acordo com a invenção pode ser utilizada de forma continua ou em cargas continuas.

No reator, para implementar a utilização da invenção, pelo menos uma bactéria ou extrato bacteriano da invenção é utilizado, e/ou pelo menos uma composição, tal como definido anteriormente, enquanto o dito reator é disposto e fornecido de modo que as condições físico-químicas são definidas e mantidas de modo que a dita bactéria seja operacional para a aplicação sob consideração e de modo que, eventualmente, o crescimento bacteriano é possível e preferencialmente aí promovido.

Em outra modalidade aqui descrita, as bactérias são cultivadas em um reator, durante a conversão de biomassa ou de derivados de biomassa, enquanto as condições físico-químicas adequadas são ajustadas e mantidas para esse crescimento bacteriano a ser possível, e preferencialmente promovida. Por exemplo, um Erlenmeyer de 500 ml ΡΕ2209900 pode ser utilizado na presença de 100 ml de 167 meio Thermus ou meio minimo descrito abaixo, a uma temperatura de 50 °C.

Em modalidades alternativas da invenção, a conversão de biomassa ou de derivados de biomassa é conduzida sob aerobiose, anaerobiose ou sob microaerobiose.

De acordo com um outro aspecto, o objeto da invenção é um reator para a conversão de biomassa ou de derivados de biomassa, utilizando pelo menos uma bactéria Deinococcus ou extrato bacteriano, tal como definido acima, ou uma composição, tal como acima definido. O processo aqui revelado pode ser utilizado para produzir bioenergia a partir de vários tipos de biomassa. Em uma modalidade preferida, a biomassa inclui madeira e residuos de madeira, residuos florestais, residuos de rolamento de papel, culturas agrícolas, residuos agrícolas, alimentares e/ou plantas não-comestiveis ou partes dos mesmos, palha, residuos de jardim, plantas aquáticas, residuos animais, residuos de operação de gados, esterco, residuos municipais orgânicos e/ou residuos orgânicos industriais. A biomassa pode também incluir os residuos biodegradáveis.

Em uma modalidade particular, um método para modificar a biomassa ou os derivados de biomassa ou plataformas intermediárias em produtos de bioenergia ou meta- 26 ΡΕ2209900 bólitos, em que os derivados de biomassa são preferencialmente a lignina, celulose, hemicelulose, amido, e em que as plataformas intermediárias são preferencialmente hidratos de carbono, tais como xilana, glucuronoxilana, arabinoxilana, glucomanano, xiloglucano, amido, sacarose, lactose, maltose, trealose, glicose, xilose, manose, arabinose, ramnose, galactose e/ou frutose.

Um objeto particular da invenção reside em um método para a produção dos biocombustiveis. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "biocombustivel" designa um combustível derivado a partir de uma fonte de carbono biológico ou morto. 0 biocombustivel pode ser produzido a partir de recursos renováveis, especialmente a biomassa vegetal ou animal, ou a partir de residuos urbanos e industriais. 0 biocombustivel de acordo com a invenção compreende "biocombustiveis de primeira geração" e/ou "biocombustiveis de segunda geração".

Os biocombustiveis de primeira geração são obtidos a partir de material orgânico vegetal ou animal, de preferência a partir de açúcar, amido, óleo vegetal ou gordura animal. A principal fonte para a produção de biocombustiveis de primeira geração são as plantas comestíveis ou partes das mesmas. Os biocombustiveis de primeira geração incluem o óleo vegetal, biodiesel, bioalcoóis, biogás, gás de sintese e de biocombustiveis sólidos. Os bioalcoóis incluem etanol, propanol e butanol. Mais preferencialmente, o método da invenção é utilizado 27 ΡΕ2209900 para a produção de etanol, propanol, butanol. 0 bio-combustível mais preferido é o etanol.

Os biocombustíveis de segunda geração são produzidos preferencialmente a partir de plantas não-comestiveis ou partes não-comestiveis das plantas. Eles incluem culturas não-alimentares, resíduos de biomassa, talos de trigo, milho e madeira. Preferencialmente, os biocombustíveis de acordo com a invenção incluem biocombustíveis celulósicos.

Dependendo da biomassa de partida, a produção de produtos de bioenergia ou metabólitos, tais como biocombustíveis, podem exigir duas etapas sucessivas: uma etapa de hidrólise, catalisada por enzimas, preferencialmente celulases ou lacases, que quebram as cadeias longas, cadeias de hidratos de carbono complexos, tais como celulose ou lignina, respectivamente, em pequenos açúcares fermentáveis, e uma etapa de fermentação, o que adicionalmente degrada os compostos orgânicos, tais como açúcares, em alcoóis. Deve ser salientado que as estirpes de Deinococcus de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para uma ou ambas as ditas reações. De facto, a invenção mostra que Deinococcus pode hidrolisar as cadeias longas de hidrato de carbono (por exemplo, xilano ou celulose) e pode também produzir metabólitos (por exemplo, etanol, glicerol, butanodiol, propanodiol, bem como ácido acético, propiónico, pirúvico e butírico) a partir dos açúcares C3, C5 ou C6. Se desejado, no entanto, deveria ser ΡΕ2209900 notado que as estirpes Deinococcus podem ser utilizadas em combinação com quaisquer outras estirpes bacterianas.

Os exemplos a sequir são dados para fins de ilustração e não por meio de limitação.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Testes de seleção

Para determinar se um microrganismo é equipado com as propriedades exigidas pela invenção, os testes específicos devem ser realizados a fim de determinar se um género, espécie e/ou uma estirpe bacteriana é capaz de ter as propriedades requeridas e em função de um método para a conversão de biomassa ou derivados de biomassa, e para determinar quais aperfeiçoamentos significativos podem assim ser obtidos.

Estes testes específicos de acordo com a invenção são realizados nas condições a seguir:

Meio de cultura: D. geothermalis (DG) é cultivado em 50 °C, sob agitação, em meio aeróbio. O meio de cultura 167 é utilizado para manter a estirpe. O meio mínimo é utilizado em experimentos de fermentação, em particular, para caracte- ΡΕ2209900 rizar os metabólitos. Neste caso, 500 ml de meio de cultura são incubados por 1 a 7 dias, sob agitação em um Erlenmeyer de 1 L, após ter sido semeado com 5 ml de cultura confluente de D.G.

Meio de cultura 167

Tryptone 1 g Extrato de levedura 1 g Agar 28 g Ácido nitrilotriacético 100 mg CaS04 X 2 H20 40 mg MgCl2 X 6 H20 200 mg Citrato de Fe 0,01 M LO O ml Solução de elementos vestigiais (ver abaixo) LO O ml Tampão fosfato (ver abaixo) 100 ml h2o 900 ml Ajustar para pH 7,2 com NaOH, autoclave a 121° C por 15 min. Autoclave o tampão fosfato separadamente e adicionar ao meio

Tampão Fosfato KH2P04 5,44 g Na2HP04 X 12 H20 43 g H2 0 1000 ml ajustar para ph 7,2 ΡΕ2209900

Solução de elementos vestigiais: h2so4 LO O ml MnS04 X H20 2,28 g ZnS04 X 7 H20 LO O g H3BO3 LO O g CuS04X 5 H20 25 mg Na2Mo04 X 2 H20 25 mg CoCl2 X 6 H20 45, 00 mg h2o 1000 ml

Meio mínimo

Tampão MOPS Ácido MOPS 400 mM NH4C1 200 mM NaOH 100 mM KOH 100 mM CaC12 5 M K2S04 276 mM MgC12 5,28 mM pH 7, filtrado, esterilizado

Fonte de carbono

Glicose 160 mM Filtrada, esterilizada ΡΕ2209900

Fosfato K2HP04 12,3 mM KH2P04 7,7 mM Filtrada, esterilizada

Vitaminas D-biotina 10 μΜ Niacine 10 μΜ Piridoxal-HCl 10 μΜ Tiamine-HCl 10 μΜ Armazenar a pH 4, filtrado, esterilizado

Solução de elementos vestigiais H2S04 5 ml MnS04 X Η20 22,8 g ZnS04 X 7 H20 5 g H3B03 5 g CuS04 X 5 H20 250 mg Na2Moo4 X 2 H20 250 mg CoC12 X 6 H20 450 mg H20 1000 ml Filtrada, esterilizada ΡΕ2209900 32

Fonte de ferro

FeCl3 200 M Citrato de Sódio 200 M Filtrada, esterilizada

Aminoácidos

Ser 100 mM Gin 100 mM Filtrada, esterilizada

Estas soluções de armazenamento em estado concentrado de 10X são diluídas de forma extemporânea.

Deteção da atividade de lacase das bactérias:

Princípio:

Seringaldazina+02 ——a seringaldazina oxidada+2H20

Lacase

Reagentes:

A. Tampão fosfato de potássio 100 mM, pH 6,5 a 30 °C B. Seringaldazina 0,216 mM (3 ml são preparadas em etanol absoluto a partir de seringaldazina obtida de Sigma Prod., N ° S-7896). C. Enzima 33 ΡΕ2209900

Teste Branco H20 0,50 ml Meio não-fermentado, 0,5 ml ou diluição Reagente A 2,20 ml 2,20 ml Reagente B 0,3 ml 0,3 ml Reagente C Meio Fermentado, 0,5 ml ou diluição 0 0 aumento na densidade óptica é registado em 530 nm.

Sob estas condições, uma unidade de enzima produz um aumento na densidade óptica de 0,001 por minuto a pH 6,5 e em 30 °C.

Deteção da atividade da celulase das bactérias:

Principio: O teste é baseado no acompanhamento da conversão de NAD em NADH durante a degradação da celulose. Um aumento na absorção é então monitorado a 340 nm, seguindo as instruções do fornecedor, disponível no endereço na internet: (http://wvvvv.sigmaaldrich.com/img/assets/18160/Cellulase.p df) .

Deteção da produção de etanol:

Etanol é quantificado utilizando dois métodos. ΡΕ2209900 Método enzimático:

ADH

Etanol+NAD. .......- —-->Acetaldeido + NADH

Este método é baseado no acompanhamento da conversão de NAD em NADH na presença de etanol e álcool desidrogenase.

Esta reação se traduz como um aumento na absorção a 340 nm. Para esta medição, o kit Sigma N7160 foi utilizado seguindo as instruções do fabricante disponíveis no link de Internet: (http:/www.sigmaaldrich.com/sigma/bulletin/N7160BUL.pdf).

Medição através de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reserva:

Condições: HPLC Gilson, com injetor automático de deteção por refratornetria,

Coluna: Rezex Phenomenex ROA, 300 mm x 7,8 mm Temperatura em coluna: 65 °C Fase móvel: ácido sulfúrico 0,005 N Caudal: 0,600 ml/min ΡΕ2209900

Primeiro, uma curva de calibração é feita pela injeção de meio de cultura contendo concentrações conhecidas de etanol na coluna. A área do pico eluido em 22,26 min correspondente ao etanol é medida. A curva de calibração é traçada.

Em seguida, a quantidade de etanol produzido pela bactéria é medido através da injeção do sobrenadante de cultura para a coluna. A área do pico eluido em 22,26 min e corresponde ao etanol é medida. A concentração de etanol presente no sobrenadante é deduzida por comparação com a curva de calibração. A deteção e quantificação dos outros metabólitos, possivelmente produzidos em diversas proporções podem ser feitas seguindo os métodos convencionais de análise e avaliação.

Bactérias são organismos haplóides que se reproduzem por divisão binária e que se alimentam de substâncias orgânicas e minerais encontradas no ambiente.

Suas exigências de gás, especialmente com relação ao oxigénio, são variadas e a cultura e as técnicas de fermentação a serem utilizadas devem ser adaptadas de acordo com se eles são microorganismos estritamente aeróbios ou facultativos, aero-anaeróbicos facultativos. A atividade de celulase, vantajosamente exigida 36 ΡΕ2209900 pela invenção, participa na degradação da celulose, enquanto a atividade de lacase permite ou facilita a degradação de lignina. A produção, proveniente da fermentação da bio-massa, dos produtos de bioenergia, tais como etanol, em particular e/ou outros metabólitos é realizada seguindo as condições de funcionamento a serem adaptadas posteriormente para testes iterativos para as condições e parâmetros da técnica da presente invenção, que são em particular, a quantidade de meio de cultura bacteriana, as condições operacionais de temperatura e/ou pressão, e as opções de fermentação aeróbia, anaeróbia ou microaerofilica.

Após os testes e os ensaios específicos descritos acima, as estirpes selecionadas naturais ou modificadas geneticamente são implementadas de acordo com o método da invenção.

Exemplo 2: Produção de etanol na presença de Deinococcus geothermalis

Em um Erlenmeyer de 500 ml, contendo 100 ml de meio minimo a 50 °C, um inoculo de D. geothermalis 1010 (DG) é acrescentado a 50 °C. A cultura é colocada sob agitação para promover a aeração.

Esta cultura está pronta para ser utilizada em um tanque convencional de fermentação de biomassa no qual, sob 37 ΡΕ2209900 melhores condições, etanol e outros metabólitos podem ser obtidos com um rendimento excelente em 55 °C.

Depois de 1 a 7 dias no reator com a biomassa a ser tratada, a presença do etanol e metabólitos acima mencionados foi quantificada por HPLC (seguindo o protocolo descrito acima). 0 desaparecimento de glicose foi observado e a produção concomitante de etanol, cuja concentração foi estimada analiticamente. Outros metabólitos de interesse foram detectados. A substituição da glicose por xilose no meio de cultura também permite o crescimento bacteriano e a produção de etanol.

Em uma variante de modalidade deste exemplo, resultados semelhantes podem ser obtidos através da realização de ambas as culturas bacterianas e fermentação no mesmo tanque.

Exemplo 3: Os efeitos bactericidas do etanol e butanol em geothermalis Deinococcus

Material e métodos

Este método permite a avaliação dos efeitos bactericidas de solventes orgânicos sobre bactérias no crescimento ou na fase estacionária. Os solventes testados são o etanol e butanol. As bactérias testadas pertencendo ao género Deinococcus: 38 ΡΕ2209900

desenvolver entre 40 e 70 °C estão em operação entre pH 3 e pH 9.5 são capazes de montar, no todo ou em parte, a sua separação do genoma por um stresse, nomeadamente através da irradiação, em especial por UV ou raios gama, por dessecação, pela ação da enzima, por ultra-som ou pelo stresse quimico. O teste deve ser realizado à temperatura ótima de crescimento para a estirpe testada. A partir de uma pré-cultura em fase estacionária em um meio enriquecido, 10 ml de meio de enriquecimento é semeado em 1% v/v. O meio enriquecido é composto de: 2 g/1 de peptona, 5 g/1 de extrato de levedura e 10 g de glicose/1: solução esterilizada através de autoclave (20 minutos, 120 °C) .

Para esta solução são adicionadas as seguintes soluções: tampão de MOPS (10X) pH7 [ácido MOPS 400 mm, NH4C1 200 mM, NaOH 1000 mM, KOH 100 mM, CaCl2 5 μΜ, Na2S04 2,76 mM, MgCl2 5,28 mM] ; micronutrimentos (ΙΟΟΟΟχ) [(ΝΗ4)δ (M07) 24 300 mM, H3BO3 4 mM, CoCl2 0,3 mM, CuS04 0,1 mM, MnCl2 2,5 mM, ZnS04 0, 1 mm]; FeCl3 (100X) 20 mM em C6H5Na307 20 mM; K2HP04 1 g/1: soluções esterilizadas através de filtração (45 ym) . 200 mL de cultura estão distribuídas em uma microplaca de 96 cavidades. Para evitar qualquer fenômeno da evaporação de solvente, a microplaca é coberta com uma pelicula impermeável estéril.

Uma vez concluida a fase de crescimento expo- ΡΕ2209900 nencial (densidade óptica de 0,5 a 600 nm), ou uma vez que a fase estacionária (planalto), for atingida, o solvente é adicionado. 0 conteúdo testado é de 0 a 31 % de etanol e de 0 a 2,5 % para o butanol. A cultura é então incubada sob agitação por uma hora.

Contagem: No final da incubação, e para cada concentração em solvente, 20 μΐ da cultura são transferidos para outra microplaca e são diluidos em cascata (diluições em 1/10 por 9 cavidades) . O meio de cultura de diluição é um meio enriquecido. 5 μΐ de cada diluição são colocados em repouso em meio de Agar PGY. Peptona 5 g/1, extrato de levedura 2,5 g/1, glicose 0,5 g/1, ágar 14 g/1: meio esterilizado por 20 minutos de autoclave a 120 °C. Uma vez que permite o crescimento, para cada percentual de solvente testado, uma contagem é realizada para avaliar a influência de solventes orgânicos sobre a estirpe.

Resultados: A concentração de solvente na qual se considera que haja uma perda da viabilidade bacteriana corresponde à concentração mínima de solvente na qual se observa a perda de um registro em relação ao controlo.

As estirpes testadas (Figuras 1 a 4) apresentam resistência satisfatória para os solventes provenientes da perspectiva de uma aplicação industrial de um fermentador. 40 ΡΕ2209900

Exemplo 4: o crescimento de bactéria na presença de fontes de carbono C3, C5 e C6

Material e Métodos

Pré-culturas foram realizadas, tanto em meio A contendo peptona A (2 g/1), extrato de levedura (5 g/1) , glicose (10 g/1) ou em meio PGY. Após a centrifugação do meio de cultura, o pélete bacteriano foi lavado duas vezes com meio minimo A para eliminar todas as fontes de alimento no inoculo. Este inoculo foi utilizado para semear o meio de cultura A (1/66) (200 mL) contendo uma das seguintes fontes do carbono a 1 % (P/v): D (+) glicose, D (+) celobiose, sacarose, amido, D (+) xilose, xilano proveniente de madeira de bétula, glicerol, piruvato de sódio. No caso de estirpes DRH07, DRH39, DRH08 e DRH10, o glutamato (10 mM) foi adicionado ao meio de cultura. O crescimento bacteriano foi conduzido a 45 °C em microplacas de 96 cavidades, sob agitação e seguido por medição da densidade óptica a 544 nm utilizando um espectrofotômetro (Chameleon multilabel detection Platform plate, ScienceTec) ou a 600 nm utilizando uma leitora de microplaca spectrostar OMEGA (BMG LabTech).

Referências de fontes de carbono utilizadas: Xlan proveniente de madeira de bétula (95588, Fluka), celobiose (22150, Fluka), D (+) xilose (95730, Fluka), glicose (G8270-1KG, Sigma), sacarose (S9378-1KG, Sigma), amido 41 ΡΕ2209900 (S9765-500G, Sigma), glicerol (453752, CarloErba), piruvato de sódio (Sigma).

Composição e preparação de meios de cultura

Meio PGY: Peptona (10 g/1), glicose (1 g/1), extrato de levedura (5 g/1), a mistura é autoclavada por 20 minutos a 120 °C.

Meio A: as várias soluções utilizadas para preparar o meio A foram preparadas a partir de uma solução armazenada esterilizada por filtração: A solução (pH7) contendo: tampão de ácido MOPS 40 mM, NH4CI 20 mM, KOH 10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0,5 mM, Na2S04 0,276 mM, MgCl2 0,528 mM.

Uma solução de micronutrimentos (pH5) : (NH4) 6 (MO7) 24 3 nM, H3BO3 400 nM, CoCl2 30 nM, 10 nM CuS04, MnCl2 250 nM, ZnS04 10 nM.

Solução de vitaminas, pH4 (1 mg/1 de cada) : D-biotin, niacina, piridoxina HC1, tiamina-HCl, vitamina B12. Fonte de fosfato: K2HP04 5, 7 mM.

FeCl3 20 mM (preparados em uma solução de citrato de sódio, em seguida, filtrada).

Resultados

As bactérias listadas na Tabela 2 (abaixo) são capazes de se multiplicar em meio de cultura minimo (meio 42 ΡΕ2209900 A) , contendo como única fonte de carbono, açúcar em C6, como a glicose, sacarose, celobiose e amido. É observado que as estirpes DRH37 e DRH06 também são capazes de crescer na presença de glicerol e piruvato de sódio (hidratos de carbono em C3).

As bactérias listadas na Tabela 3 também são capazes de se multiplicar em meio de cultura mínimo contendo açúcares em C5 (xilano ou xilose) como a única fonte de carbono; com exceção das estirpes DRH06 e DRH07 que não são capazes de crescer na presença de xilano e xilose, respectivamente.

Tabela 2: Testes de assimilação das diferentes fontes de carbono em C3 e C6 realizados em várias espécies de D. geothermalis e D. murrayi: - AOD <0,2; +AOD = 0,2; + + 0,3> AOD > 0,4; + + + 0,4> AOD> 0,5; + + + + AOD> 0,6. AOD corresponde à diferença entre o valor de OD em 544 nm no tempo inicial de crescimento T0 e para o tempo T 196 horas (cerca de 8 dias). D. geothermalis D. murrayi

Fonte de carbono a 1% (p/v) de DRH05 DRH06 DRH07 DRH37 DRH38 DRH39 DRH08 ΕΚΗ10 Hidrato de carbono em C6 D-(+)-glicose +++ + ++ ++ +++ +++ + + D-(+)-oelcbiose ++ - +++ +++ ++ +++ ++ - Sucrose +++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ - Amido +++ ++ ++ ++ +++ - ++ - Hidratos de carbono em C3: Glicerol - - - ++ - - - - Piruvato de sódio _ + _ _ _ _ - _ 43 ΡΕ2209900

Tabela 3: Teste de assimilação das diferentes fontes de carbono em C5 e C6 realizados em várias espécies de D. geothermalis - AOD <0,2; AOD + = 0,2; ++ 0.3> AOD> 0,4; +++ 0.4> AOD > 0,5; ++++ ΔΟΌ> 0,6. AOD corresponde à diferença entre o valor do OD a 600 nm no tempo inicial de crescimento T0 e no momento T64 horas (aproximadamente 2,5 dias).

Fonte de carbono a DRH05 DRH06 DRH07 DRH37 DRH38 DRH39 1% (p/v) D-(+)-glicose +++ ++ + ++++ +++ +++ Xilano +++ _ + ++++ ++++ ++++ Xilose +++ ++ ++ ++ +++ +++

Exemplo 5: Crescimento de bactérias em alta concentração de etanol

Material e Métodos

Este método permite a avaliação da capacidade de um microrganismo para se desenvolver na presença de uma elevada concentração de etanol. As bactérias testadas pertencentes às espécies Deinococcus geothermalis:

Desenvolver entre 40 e 70 °C,

Estão em operação entre pH3 e pH9,5 são capazes de remontar, em parte ou na integra, a sua participação do genoma por um stresse, nomeadamente 44 ΡΕ2209900 através da irradiação, em especial por UV ou raios gama, por dissecação, pela ação da enzima, por ultra-som ou pelo stresse químico. 0 teste deve ser realizado na temperatura ideal para o crescimento da estirpe testada. A partir de uma pré-cultura fase estacionária em um meio de cultura enriquecido, para cada teor de etanol a ser testado, 20 ml de meio enriquecido é semeado em 1 % v/v. O meio de cultura enriquecido é composto de: peptona 1 g/1, extrato de levedura 5 g/1 e glicose 10 g/1: solução esterilizada por autoclave (20 minutos, 120 °C). Para esta solução são adicionadas as seguintes soluções: tampão MOPS (10X) pH7 MOPS [tampão de ácido MOPS 400 mM, NH4C1 200 mM, NaOH 1000 mM, KOH 100 mM, CaCl2 5 μΜ, 2,7 6 mM Na2S04, MgCl2 5,2 8 mM] ; micronutrimentos (ΙΟΟΟΟχ) [(ΝΗ4)β (M07) 24 300 mM, H3BO3 4 mM, CoCl2 0,3 mM, CuS04 0, 1 mM, MnCl2 2,5 mM, ZnS04 0, 1 mm] ; FeCl3 (I00X) 20 mM em C6H5Na307 20 mM; K2HP04 1 g/1: soluções esterilizadas por filtração (45pm). O etanol é adicionado a T0, o conteúdo varia de 0 a 31%. Um acompanhamento de crescimento é realizado para cada conteúdo de álcool testado. OD é lido a 600 nm utilizando um espectrofotômetro (Luz UV XS5, SECOMAM). Uma alíquota de 1 ml da cultura é tomada nos momentos: ΤΟ, T0 + 1 Η, T0 + 3 Η, T0 + 18 Η, T0 + 20 Η, T0 + 22 Η, T0 + 24 H.

Quando for necessário para a leitura, a cultura é diluída a um décimo em meio enriquecido. As curvas de 45 ΡΕ2209900 crescimento podem ser extraídas para cada conteúdo de álcool testado. No final do período de incubação e para cada conteúdo de etanol testado, a contagem é necessária para acessar a influência do etanol sobre a estirpe.

Resultados

Algumas estirpes testadas, tais como Deinococcus geothermalis DSM 11300, são capazes de crescer em meio de cultura contendo etanol (ver Figura 5) . Algumas estirpes, tais como Deinococcus geothermalis DSM 11300, mostram uma resistência em meios de cultura com alto teor de etanol (Figura 6A).

Exemplo 6: Produção de metabólitos de interesse por Deinococcus murrayi

Material e Métodos

Esse método permite a avaliação da capacidade de um microrganismo para produzir metabólitos de interesse (no grupo constituído por glicerol, butanodiol, propanodiol e ácidos acético, propiónico, butírico e pirúvico) proveniente da biomassa ou de um derivado de biomassa.

As bactérias testadas pertencentes às espécies geothermalis Deinococcus: 46 ΡΕ2209900 se desenvolvem entre 40 e 70 °C, estão em operação entre pH 3 e pH 9.5, são capazes de remontar, em parte ou na íntegra, a sua separação do genoma por um stresse, nomeadamente através da irradiação, em especial por raios UV ou gama, por dissecação, pela ação da enzima, por ultra-som ou pelo stresse químico. O teste deve ser realizado à temperatura de crescimento ótima para a estirpe testada. A partir de uma pré-cultura (em fase estacionária) , preparada em meio de cultura enriquecido, 20 ml de meio enriquecido são semeados: semeadura em 1% v/v. 0 meio de cultura enriquecido é composto de: peptona 2 g/1, extrato de levedura 5 g/1 e glicose 10 g/1: solução esterilizada por autoclave (20 minutos, 120 °C) . Para esta solução são adicionadas as seguintes soluções: solução-tampão de MOPS (10X) pH 7 [ácido MOPS 400 mM, NH4C1 200 mM, NaOH 1000 mM, KOH 100 mM, CaCl2 5 μΜ, Na2S04 2,76 mM, MgCl2 5,28 mM] ; micronutrimentos (lOOOOx) [(NH4)6(Mo7) 24 300 mM, H3B03 4 mM, CoCl2 0,3 mM, CuS04 0,1 mM, MnCl2 2,5 mM, ZnS04 0,1 mm]; FeCl3 (100X) 20 mM em C6H5Na307 20 mm; K2HP04 1 g/1: soluções esterilizadas por filtração (45 ym). A cultura é deixada em uma incubadora, a 45 °C, sob agitação, até atingir a sua fase estacionária. Uma vez que a fase estacionária é alcançada, a cultura é centrifugada por 10 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante é ΡΕ2209900 derramado em outro tubo e é colocado a -80 °C. Uma análise de HPLC UV e refratometria (coluna de troca iônica (H+) Biorad, fase móvel de H2SO4 5 mM, fluxo da fase móvel 0,6 ml/min, modo isocrático) permitem que os metabólitos de interesse sejam identificados.

Resultados

Algumas estirpes testadas produzem alguns dos metabólitos de interesse procurado (Tabela 4).

Tabela 4: Os metabólitos produzidos por Deinococcus murrayi DSML 1305 (expressa em g/1). GLICOSE ÁCIDO ACÉTICO ÁCIDO PROPIÓNICO ÁCIDO PIKDVICO DRH10 CM 7,76 0,138 1,044 0,043

Exemplo 7: Crescimento do Deinococcus geother-malis em várias condições de pH

Material e Métodos

As estirpes são cultivadas a 45 °C em meio PGY em pH diferente. 0 pH foi ajustado com 10% de NH3 (v/v) ou HC1 10N. O crescimento é seguido por medição da densidade óptica a 600 nm utilizando uma leitora spectrostar OMEGA, BMG LabTech. ΡΕ2209900 48

Resultado

Quatro estirpes (D. geothermalis) foram capazes de se multiplicar em uma faixa de pH entre 5 e 8 (ver Figuras 6A, 6B, 6C e 6D).

Exemplo 8: Isolamento de bactérias termofilicas resistentes a UV proveniente de um ambiente natural

Tratamento das amostras de água quente

As amostras de água quente estão concentradas por filtração por um filtro de nitrocelulose de 0,22 pm (Millipore, França), em seguida, colocados em suspensão em 10 ml de água estéril. A solução filtrada é então sonicada por aproximadamente 60 segundos para ressuspender as bactérias.

Tratamento de amostras de madeira e pedra

As amostras de madeira e de pedra são imersas em água estéril e, em seguida, centrifugadas e sonicadas por aproximadamente 60 segundos.

Tratamento de amostras de pedras, musgos, líquenes, lama, sedimentos, biofilmes, do solo e dejetos de animais

As amostras de musgos, líquenes, lama, terra e 49 ΡΕ2209900 dejetos dos animais são colocadas em suspensão em água estéril (V/V), em seguida, centrifugadas. As amostras são então sonicadas por aproximadamente 60 segundos.

Isolamento de bactérias termofilicas resistentes

a UV

Seguinte à sonificação, entre 500 μΐ e 2 ml, as suspensões são espalhadas em um meio de cultura enriquecido de ágar PGY sólido esterilizado em autoclave (20 minutos, 120°C), que contém glicose (Sigma-Aldrich, França), 1 g/1, peptona (Fluka, França) 10 g/1 e extrato de levedura (Fluka, França), 5 g/1. Os meios de cultura semeados, em seguida, submetidos a três tratamentos de UV utilizando um Biolink BLX-E254 (Vilber-Lourmat, França) de 4 de mJ/cm2 cada, realizadas com um intervalo de 4 horas. Após incubação a 45°C por 3 a 4 dias, as colónias termofilicas de interesse são visiveis.

Exemplo 9: Digestão da celulose por cellulo-silyticus Deinococcus

Material e Métodos

Uma pré-cultura de estirpe D. cellulosilyticus foi realizada em um meio enriquecido (ver composição abaixo). A pré-cultura é utilizada para semear (1% v/v) 10 ml de meio enriquecido, de meio minimo contendo carboxime-tilcelulose (CM-celulose) , ou o mesmo meio sem fonte de carbono. 50 ΡΕ2209900

Crescimento das bactérias foi realizado no 30 °C em 50 ml de tubos Falcon sob agitação (110 rpm), e seguido pela medição da densidade óptica a 600 nm com um espectrofotômetro (WPA Biowave, Cell density Meter).

Meio enriquecido: peptona 2 g/1, extrato de levedura 5 g/1; glicose 10 g/1, uma solução (pH7) contendo: ácido MOPS 40 mM, NH4C1 20 mM, KOH 10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0,5 μΜ, Na2S04 0,276 mM, MgCl2 0,528 mM; uma solução de micronutrimentos (pH5) : (NH4)6(M07) 24 3 nM, H3BO3 400 nm, C0CI2 30 nM, 10 nM CuS04, MnCl2 250 nM, 10 nM ZnS04; uma solução de vitaminas, pH4, (1 mg/1 de cada) : D-biotin, niacina, piridoxina-HCl, tiamina-HCl, vitamina B12, uma fonte de fosfato: K2HP04 5,7 mM; FeCl3 20 mM.

Meio mínimo: uma solução (pH7) contendo: ácido MOPS 4 0 mM, NH4C1 2 0 mM, KOH 10 mM, NaOH 10 mM, 0,5 mM

CaCl2, Na2S04 0,276 mM, MgCl2 0,528 mM; uma solução de micronutrimentos (pH5) : (NH4) 6 (M07) 24 3 nM, H3BO3 400 nM,

CoCl2 30 nM, CuS04 10 nM, MnCl2 250 nM, ZnS04 10 nM; uma solução de vitaminas, pH4 (1 yg /1 de cada) : D-biotin, niacina, piridoxal-HCl, tiamina-HCl, vitamina B 12, uma fonte de fosfato: K2HP04 5, 7 mM, FeCl3 20 μΜ.

Resultado

Foi demonstrado que a estirpe D. cellulosilyticus relacionada com DSMZ sob o número DSM 18568T (Weon et al, 51 ΡΕ2209900 2007) possui uma atividade de CM-celulose (Weon et al. 2007 International journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57, 1685-1688).

Como é mostrado na Figura 7, D. cellulosilyticus é capaz de se multiplicar em um meio contendo celulose CM como a única fonte de carbono, a variação na densidade óptica a 600 nm após 10 dias de crescimento neste meio foi significativa (ΔΌΟεοοηπι = 0,5 ) em comparação com a cultura de controlo (sem meio de fonte de carbono; (AD06oonm = 0,18). Este resultado indicou que D. cellulosilyticus não só é capaz de degradar (Depolymerise) CM-celulose, mas também capaz de assimilar os produtos derivados desta degradação (celobiose e glicose).

Lisboa, 26 de agosto de 2013

Claims (15)

1. ΡΕ2209900 1 REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de uma bactéria do género Deinococcus num método de produção de um biocombustivel ou de uma molécula intermediária do mesmo a partir de material orgânico vegetal.
2. 2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o biocombustivel é um óleo vegetal, um biodiesel, um bioálcoool, tal como etanol, propanol, butanol glicerol, butanodiol ou propanodiol, um biogás, um gás de síntese, um biocombustivel sólido ou um biocombustivel celulósico.
3. 3. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula intermediária é selecionada a partir de ácidos orgânicos e seus sais, tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido butírico, ácido lático ou ácido succínico, ou ésteres, incluindo ésteres formados entre álcoois e ácidos.
4. 4. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que matéria orgânica vrgrtal é madeira, resíduos de madeira, resíduos florestais, resíduos da moagem, as culturas agrícolas, resíduos agrícolas, plantas comestíveis e/ou não-comestíveis ou partes das mesmas, palha, os resíduos de jardim, plantas aquáticas, os resíduos animais, resíduos operação de gados, esterco, resíduos orgânicos municipais e/ou resíduos orgânicos industriais. 2 ΡΕ2209900
5. 5. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a biomassa compreende lignina, celulose, hemicelulose, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano, xiloglucano, amido, sacarose, lactose, trealose, maltose, glicose, xilose, manose, arabinose, ramnose, galactose e/ou frutose.
6. 6. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita bactéria é viável na presença de agentes tóxicos, em particular na presença de solventes orgânicos, por exemplo, o etanol.
7. 7. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita bactéria é cultivada em uma faixa de temperatura de cerca de 4 0 a 7 0 °C, de preferência de 50 °C a 60 °C.
8. 8. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que dita a bactéria é viável ou utilizada em um intervalo de pH entre cerca de 3 e 9,5, de preferência, entre 4 e 8.
9. 9. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita bactéria Deinococcus é capaz de converter os açúcares C6 e/ou C5 e/ou promover a digestão da celulose para produzir glicose e/ou promover a digestão de hemicelulose para gerar xilose. 3 ΡΕ2209900
10. 10. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita bactéria Deinococcus é capaz de crescer na presnça de hidratos de carbono C3, preferencilamente glicerol e/ou piruvato de sódio.
11. 11. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita bactéria Deinococcus é selecionada a partir de Deinococcus geo-thermalis, Deinococcus radiodurans, Deinococcus murrayi e Deinococcus cellulosilyticus, e preferencialmente a partir das estirpes de Deinococcus geotermalis com números de depósito DSM 11300, DSM 11301, DSM 11302, HAMBI2480, HAMBI2481, HAMBI2411 ou das estirpes Deinococcus murrayi com números de depósito DSM 11303, DSM 11305 ou das estirpes de Deinococcus cellulosilyticus com números de depósito DSM18568T, ou estirpes substancialmente similares às mesmas ou mutantes das mesmas.
12. 12. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita bactéria é modificada através de evolução acelerada ou de tecnologias de mistura de DNA ou pela inserção de DNA não Deinocóccico eucariota, procariota ou sintético ou pela inserção de DNA de outra estirpe de Deinococcus, afetando a dita modificação a viabilidade, o crescimento ou as funções da referida bactéria, a fim de promover a modificação de biomassa. ΡΕ2209900
13. 13. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que um reator de conversão da biomassa é empreqado.
14. 14. Um método para a produção de etanol a partir de uma matéria orgânica vegetal, compreendendo as seguintes etapas: a) cultivar e/ou desenvolver uma bactéria Deino-coccus em condições aeróbicas e/ou anaeróbicas, b) expor a matéria orgânica vegetal a uma composição que compreende a dita bactéria Deinococcus ou um extrato da mesma, e c) coletar o etanol produzido.
15. 15. Um método, de acordo com a reivindicação 14, em que as etapas a), b) e c) são realizadas simultaneamente ou sequencialmente. Lisboa, 26 de agosto de 2013