FR2923491A1

FR2923491A1 - Utilisation de bacteries pour la production de sources de bioenergie

Info

Publication number: FR2923491A1
Application number: FR0708005A
Authority: FR
Inventors: Jean Paul Leonetti; Ivan Matic; Miroslav Radman
Original assignee: Deinove SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Deinove SA
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2009-05-15
Anticipated expiration: 2027-11-14
Also published as: CN101861395B; AU2008322867B2; EP2209900B1; UA103467C2; BRPI0820054B1; PT2209900E; ZA201004217B; FR2923491B1; EA019338B1; PL2209900T3; WO2009063079A1; US9181564B2; US20110104766A1; CN101861395A; EA201070605A8; BRPI0820054A2; EP2209900B8; HRP20130784T1; CA2704429A1; CA2704429C

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de bactéries ou d'extraits de bactéries, notamment du genre Deinococcus geothermalis ou D. murrayi, pour le traitement ou modification de biomasse ou de dérivés de biomasse, pour la production de sources de bioénergie ou pour la production de métabolites.Application notamment à la production d'éthanol.

Description

UTILISATION DE BACTERIES POUR LA PRODUCTION DE SOURCES DE BIOENERGIE La présente invention concerne l'utilisation de micro-organismes pour la production de sources de bioénergie. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation de bactéries ayant des propriétés définies, et notamment de bactéries du genre Deinococcus et/ou de genres apparentés pour la modification de biomasse ou de dérivés de biomasse, en vue de la production de sources de bioénergie, et notamment d'éthanol. Il est connu de pratiquer la modification d'une biomasse, essentiellement végétale, pour produire des sources de bioénergie, en particulier de l'éthanol. Par "modification", on entend ici la conversion ou traitement d'une biomasse ou de dérivés d'une biomasse. Mais les procédés industriels actuels ne permettent d'effectuer les fermentations et l'extraction de l'éthanol qu'à des températures de l'ordre de 35°C, en raison de la fragilité des levures industrielles employées. Ils exigent en outre une dépense énergétique importante pour la concentration de l'éthanol après fermentation, car les levures actuellement employées pour cette fermentation ne tolèrent pas des concentrations de plus de 100 g/L. Ces levures induisent en outre pratiquement uniquement une fermentation conduisant à des sucres en C6, de type glucose. Il est également connu de traiter des matériels biologiques, entre autres des souches bactériennes, pour leur conférer des propriétés améliorées. Ainsi, le brevet US 6.716.631 au nom de S. delCardayre et al. décrit un procédé reposant sur des cycles itératifs de recombinaison et de sélection/criblage pour conférer des propriétés souhaitées à des cellules entières et à des organismes entiers. Les propriétés ainsi ajoutées sont, par exemple, une aptitude accrue à la recombinaison génétique, un nombre accru de copies du génome, l'aptitude à l'expression et/ou à la sécrétion de protéines et de métabolites secondaires. En se plaçant dans le champ de la génétique moléculaire, les auteurs proposent des techniques pour faire évoluer à convenance les génomes des cellules et des organismes pour leur procurer des propriétés nouvelles et améliorées.

Le procédé décrit utilise une population de cellules différentes, la culture de celles-ci de manière à former des cellules hybrides par fusion des protoplastes, puis le criblage ou la sélection des cellules qui ont évolué vers l'acquisition d'une propriété souhaitée, et la réitération de ces étapes jusqu'à obtention d'au moins une cellule modifiée comme souhaité. Ce procédé est présenté comme une alternative avantageuse aux procédés connus reposant sur un Programme d'amélioration de souches. Les protoplastes soumis à une telle fusion peuvent provenir d'organismes procaryotes.

L'une des applications envisagées est la fermentation, par exemple de l'éthanol, dont il est proposé d'améliorer le rendement et le coût par un tel procédé de recombinaison par réarrangement (shuffling) de l'ADN des micro-organismes employés. Il est mentionné à titre d'exemple la recombinaison homologue de Rhodococcus, connue comme catalysant des réactions à deux phases. La demande internationale de brevets publiée sous le No. WO-01/023526 décrit la production et l'utilisation de bactéries aptes à opérer une bioremédiation et résistantes aux radiations, notamment du genre Deinococcus (notamment D. radiodurans et D. geothermalis), modifiées pour être plus efficaces dans la métabolisation, la dégradation ou la détoxification de contaminants inorganiques et organiques, tels que des radionucléides, des métaux lourds et des solvants organiques. Il est préconisé que ces bactéries soient manipulées pour exprimer des enzymes hétérologues capables de détoxifier de tels éléments. Les souches bactériennes sont manipulées pour combiner une variété de fonctions codées par différents gènes dans un hôte unique. La demande de brevet US publiée sous le No. 2003/0175977 du 18 septembre 2003 au nom de I. Narumi et al. décrit un plasmide endogène issu d'une souche de D. radiopugnans, pUE30 utile comme vecteur pouvant se répliquer de manière autonome dans des bactéries du genre Deinococcus, et utile pour la construction d'un vecteur navette contenant également un plasmide apte à se répliquer de manière autonome dans E. coli et ses dérivés, et pouvant se répliquer dans une bactérie aussi bien du genre Deinococcus que E. coli.

Le brevet US 7.160.715 au nom de C. B. Fliermans décrit un moyen pour la mesure de la distribution et de la fréquence de génération in vivo de coupures de brins d'ADN. Ce moyen comporte l'utilisation d'une protéine PprA dérivée de Deinococcus radiodurans.

La demande de brevet US publiée sous le No. 2004/0224320 au nom de K. Satoh et al. décrit une bactérie Gram-positive (No. d'accès ATCC BAA-149 ou un mutant de celle-ci) isolée et purifiée. L'isolat est apte à dégrader une large variété de contaminants organiques et convient pour la bioremédiation d'une variété de contaminants organiques, en présence de radiation ionisante. Par ailleurs, une monographie récente sur la production d'éthanol à l'aide d'une fermentation avec des souches de micro-organismes a été publiée sous le titre "Ethanol Fermentation Strains" par J.R. Hettenhaus, sous l'égide de l'United States Department of Energy et du National Renewable Energy Laboratory (16 décembre 1998). Dans ce document, qui fait la synthèse des contributions des participants à l'étude concernée, il est souligné que: - les seules souches de micro-organismes utilisables dans les équipements existants devraient être semblables à celles déjà utilisées, à 20 savoir rSaccharomyces, rZymomonas et rE. coli; - à court terme, l'augmentation de la fermentation du xylose et de l'arabinose pourrait être l'objectif visé, avec cette précision qu'il serait en revanche de peu d'importance d'accroître l'efficacité de conversion des autres sucres de type hexose ou oligomères; 25 - à plus long terme, les gains pourraient venir d'un fonctionnement à plus haute température, ainsi que d'une combinaison des étapes de production d'enzyme, de saccharification et d'hydrolyse. Il existait donc un besoin pour un procédé de fermentation de la biomasse et d'obtention d'éthanol, et éventuellement d'autres métabolites, 30 qui puisse être mis en oeuvre dans des conditions opératoires significativement meilleures que celles des procédés actuels, et qui puisse en même temps être plus aisément pilotable que les procédés connus et puisse conduire à des produits de fermentation meilleur marché et plus facilement valorisables.

L'invention permet d'apporter des solutions à ces attentes et de procurer des procédés améliorés de valorisation de la biomasse par production de sources d'énergie alternatives, qui tendent à s'imposer du fait de la réduction significative des sources d'énergie d'origine fossile.

Un objectif de la présente invention est alors de procurer un micro-organisme pouvant fonctionner efficacement dans la modification ou conversion par traitement de biomasse ou de dérivés de biomasse en vue de l'obtention de composés utiles pour la production de bioénergie, notamment de l'éthanol, à l'échelle industrielle et de manière économique et fiable, ainsi que des moyens pour la mise en oeuvre d'un tel micro-organisme. L'invention a ainsi pour premier objet une bactérie apte à réaliser ces objectifs. Sous un premier aspect de cet objet de la présente invention, le micro-organisme est une bactérie, apte à coopérer à la production d'une source de bioénergie, notamment d'éthanol, ou de métabolites par fermentation d'une biomasse ou de dérivés de biomasse, ladite bactérie répondant à l'une et/ou à l'autre des dispositions suivantes:: - elle est apte à réassembler en totalité ou partiellement son génome cassé par un stress, notamment par irradiation, en particulier par des rayonnements UV ou gamma, par dessiccation, par voie enzymatique, par ultrasons ou par stress chimique; elle est viable ou fonctionnelle à des températures élevées; elle est viable ou fonctionnelle en présence d'agents toxiques, notamment de solvants organiques, par exemple l'éthanol; - elle est apte à modifier les sucres en C6 et C5; - elle est apte à favoriser la digestion de la cellulose pour donner du glucose; - elle est apte à favoriser la digestion de l'hémicellulose pour donner du xylose; - elle est apte à favoriser la digestion de lignine. elle est choisie parmi le, ou dérivée du, genre Deinococcus se développant à température élevée, notamment parmi Deinococcus geothermalis, D. radiodurans ou D. murrayi; - elle est choisie parmi le, ou dérivée du, genre Deinococcus se développant sous concentration élevée en éthanol, notamment parmi Deinococcus geothermalis ou murrayi; - elle est utilisée pour la production d'éthanol ou de métabolites, notamment choisis dans le groupe consistant en glycérol, butanediol, propanediol et acides acétique, propionique, pyruvique et butylique, à partir de biomasse ou de dérivés de biomasse. - elle est apte à se développer à des températures d'environ 40-70°C, et à être opérationnelle dans un intervalle de pH se situant entre environ 3 et environ 9,5, de préférence entre environ 4 et environ 8. Avantageusement, ladite bactérie est dénuée de toute pathogénicité. Dans une forme de réalisation préférée du premier aspect de la présente invention, on a trouvé qu'un micro-organisme particulièrement efficace dans l'application considérée peut être choisi dans le groupe des bactéries du genre Deinococcus, en particulier l'espèce Deinococcus geothermalis ou Deinococcus murrayi, ou des bactéries apparentées ou équivalentes, naturelles ou recombinantes, pour autant qu'elles soient aptes à se développer à des températures élevées, notamment à environ 40-70°C, de préférence à environ 50-60°C, et à être opérationnelles dans un intervalle de pH se situant entre environ 3 et environ 9,5, de préférence entre environ 4 et 8, et en option dans des conditions de concentration de NaCl ou de sels équivalents pouvant atteindre environ 5% en poids/volume. Le genre Deinococcus comporte 25 espèces identifiées à ce jour. Parmi celles-ci, mais sans que cela soit limitatif, on utilise avantageusement selon l'invention l'espèce D. geothermalis ou l'espèce D. murrayi, qui présente à un niveau tout particulièrement remarquable les propriétés susdites. Dans une variante de réalisation, on peut utiliser une bactérie ou un extrait de bactérie isolée à partir d'un environnement naturel ou industriel à température élevée ou à concentration de solvants ou d'éthanol ou de sucres élevée. Dans une autre forme de réalisation de l'invention, la bactérie utilisée peut être une souche bactérienne recombinée ou manipulée, avantageusement par un procédé tel que décrit dans la demande de brevets internationale No. PCT/EP2006/005826, ou par tout autre procédé connu de l'homme du métier qui peut alors se référer à ses connaissances propres en la matière. Ladite bactérie peut ainsi, en option, présenter un génome modifié par introduction d'au moins un gène procaryote ou eucaryote ou synthétique non-Deinococcus ou d'ADN étranger, ou par introduction d'au moins un gène ou d'ADN de Deinococcus différent, pour affecter sa viabilité, sa croissance, ou ses fonctions en vue de faciliter la conversion de biomasse ou de dérivés de biomasse. L'invention a également pour objet une composition utilisable dans la conversion de biomasse, comportant au moins une telle bactérie ou un tel extrait de bactérie et au moins un agent choisi dans le groupe consistant en les agents anti-mousse et les agents nutritifs. Des agents anti-mousse appropriés sont notamment des dispersants, des détergents et des agents tensioactifs, et plus généralement des composés amphiphiles. Dans une forme de mise en oeuvre avantageuse, ladite composition bactérienne est conçue pour être utile dans la conversion d'une biomasse ou de dérivés de biomasse en vue de l'obtention de sources de bioénergie, tandis que la composition bactérienne comprend au moins une bactérie telle que définie plus haut, dans un milieu approprié et éventuellement en mélange avec des agents anti-mousse et/ou nutritifs.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un tel micro-organisme, en particulier d'une telle bactérie ou extrait de bactérie, pour la conversion de biomasse dans des conditions appropriées pour la production de sources de bioénergie, en particulier d'éthanol, ou pour la production de métabolites.

Dans une forme de réalisation du procédé d'utilisation selon l'invention, on fait croître la bactérie séparément de la conversion de biomasse. Dans une autre forme de réalisation du procédé d'utilisation selon l'invention, on fait croître la bactérie dans un réacteur, pendant la conversion de biomasse ou de dérivés de biomasse, tandis que sont établies et maintenues des conditions physico-chimiques appropriées pour que cette croissance bactérienne soit possible, et de préférence favorisée. A titre d'exemple, on peut opérer dans un Erlenmeyer de 500 ml en présence de 100 ml de milieu 167 Thermus ou de milieu minimum décrits plus loin, à une température de 50°C, avantageusement sous agitation pour favoriser l'oxygénation. Dans des formes de réalisation alternatives de l'utilisation selon l'invention, la conversion de biomasse ou de dérivés de biomasse est 5 conduite en aérobiose, en anaérobiose, ou en microaérobiose. D'après les premiers essais entrepris, une bactérie du genre Deinococcus geothermalis utilisée est également apte à produire, par le processus de conversion qu'elle induit, d'autres métabolites que l'éthanol, notamment: glycérol, butanediol, propanediol, ainsi que les acides acétique, 10 propionique, pyruvique et butylique. Sous un autre aspect, l'invention a ainsi également pour objet un procédé pour la conversion de biomasse ou de dérivés de biomasse utilisant au moins une bactérie ou un extrait de bactérie telle que définie plus haut ou une composition telle que susdite, ledit procédé comprenant une 15 combinaison de: • au moins une opération de mise en culture et de développement d'une telle souche bactérienne ou d'un tel extrait de souche bactérienne dans des conditions de croissance et de développement appropriées, • au moins une opération de conversion de biomasse ou de dérivé de 20 biomasse, sous l'action de quantités appropriées de ladite souche bactérienne ou du dit extrait de souche bactérienne, dans des conditions convenant pour ladite conversion de biomasse ou de dérivé de biomasse, et • la collecte d'au moins une source de bioénergie ou d'au moins un métabolite issus de ladite conversion de biomasse ou de dérivé de biomasse, 25 en particulier la collecte de l'éthanol ainsi produit. Sous encore un autre aspect, l'invention a pour objet un réacteur pour la conversion de biomasse ou de dérivés de biomasse, mettant en oeuvre au moins une bactérie ou au moins un extrait de bactérie telle que définie plus haut ou une composition telle que définie ci-dessus. 30 L'invention sera mieux comprise, et d'autres objectifs, avantages et caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement, à la lumière de la description ci-après de formes de réalisation préférées, données à titre purement illustratif et nullement limitatif. Pour déterminer si un micro-organisme est doté des propriétés 35 requises selon l'invention, l'homme du métier peut ainsi faire appel à ses connaissances propres, et peut effectuer des essais de routine qui, aux erreurs d'expérience près, lui permettent de déterminer si un genre, une espèce et/ou une souche bactérienne est apte à présenter les propriétés requises et à fonctionner dans un procédé de conversion de biomasse ou de dérivés de biomasse, par ailleurs similaire à ceux connus et employés par l'homme du métier, et quelles améliorations significatives on peut ainsi obtenir. Pour l'utilisation d'un tel micro-organisme selon la présente invention, l'homme du métier peut procéder à des tests et essais de routine sur des souches, naturelles ou génétiquement modifiées, de micro-organismes à évaluer, puis mettre en oeuvre les souches dans l'application selon l'invention, avantageusement selon un processus de sélection itératif des conditions optimales de fonctionnement du réacteur, en utilisant ses connaissances en matière de conduite des appareils de fermentation et/ou de conversion de biomasse, aussi bien en aérobiose qu'en anaérobiose, ou même en microaérobiose. A titre d'exemples non limitatifs de conditions sur lesquelles il convient de faire porter les méthodes d'essai de préparation, de détermination et/ou d'évaluation que l'homme du métier peut ainsi mettre en oeuvre, on peut citer les conditions suivantes.

Milieu de culture: On cultive D. geothermalis (DG) à 50 °C sous agitation, en milieu aérobie. Le milieu de culture 167 est utilisé pour le maintien des souches. Le milieu minimum est utilisé dans les expériences de fermentation, notamment pour caractériser les métabolites. Dans ce cas, 500 ml de milieu de culture sont incubés de 1 à 7 jours sous agitation dans un Erlenmeyer de 1 1, après avoir été ensemencés avec 5m1 de culture confluente de DG.

Milieu 167 Thermus Tryptone 1 g Extrait de levure 1 g Agar 28 g Acide nitrilotriacétique 100 mg CaSO4 x 2 H2O 40 mg MgC12 x 6 H2O 200 mg Citrate de Fe 0,01 M 0,5 ml 5 Solution d'éléments trace 0,5 ml (voir ci dessous) Tampon phosphate (voir ci 100 ml dessous) H2O 900 ml Ajuster à pH 7,2 avec NaOH, autoclaver à 121°C pendant 15 min. autoclaver le tampon phosphate séparemment et ajouter au milieu Tampon Phosphate KH2PO4 5,44 g Na2HPO4 x 12 H2O 43 g H2O 1000 ml ajuster à pH 7,2 Solution d'éléments trace: H2SO4 0,5 ml MnSO4 x H2O 2,28 g ZnSO4 x 7 H2O 0,5 g H3BO3 0,5 g CuSO4 x 5 H2O 25 mg Na2MoO4 x 2 H2O 25 mg CoC12 x 6 H2O 45,00 mg H2O 1000 ml Milieu Minimum Tampon MOPS Acide MOPS 400 mM; NH4C1 200 mM NaOH 100 mM KOH 100 mM CaC12 5 M K2SO4 2,76 mM MgC12 5,28 mM pH 7, filtré, stérilisé 10 Source de Carbone Glucose 160 mM Filtré, stérilisé Phosphate K2HPO4 12,3 mM KH2PO4 7,7 mM Filtré, stérilisé Vitamines D-biotine 10 PM Niacine 10 PM Pyridoxal-HC1 10 PM Thiamine-HC1 10 PM Stock à pH 4, filtré, stérilisé Solution d'éléments trace: H2SO4 5 ml MnSO4 x H2O 22,8 g ZnSO4 x 7 H2O 5 g H3BO3 5 g CuSO4 x 5 H2O 250 mg Na2MoO4 x 2 H2O 250 mg CoC12 x 6 H2O 450 mg H2O 1000 ml Filtré, stérilisé Source de Fer FeC13 200 M Citrate de sodium 200 M Filtré, stérilisé Acides aminés Ser 100 mM Gin 100 mM Filtré, stérilisé Ces solutions de stockage à l'état concentré par 10X sont diluées extemporanément. 15 Détection de l'activité laccase de la bactérie:

Principe: Syringaldazine + 02 ---->Syringaldazine oxydée + 2H20 Laccase

Reactifs: A. Tampon 100 mM Potassium Phosphate, pH 6,5 à 30°C B. Syringaldazine 0,216 mM (on prépare 3 ml dans de l'éthanol absolu, à partir de Syringaldazine obtenue auprès de Sigma Prod., No. S-7896.) C. Enzyme test blanc H2O 0,50 ml Milieu non fermenté, 0,5m1 ou dilution Réactif A 2,20 ml 2,20 ml Réactif B 0,3 ml 0,3 ml Réactif C Milieu fermenté, 0 0,5 ml ou dilution On enregistre l'augmentation de densité optique à 530nm Dans ces conditions, une unité d'enzyme produit une augmentation de densité optique de 0,001 par minute à pH 6,5 et à 30°C

20 Détection de l'activité cellulase de la bactérie: Principe:

Le test est basé sur le suivi de la conversion du NAD en NADH au cours de 25 la dégradation de la cellulose. On suit alors une augmentation de l'absorbance à 340nm en se conformant aux recommandations du fournisseur, disponibles sur le lien Internet: (http:/ /www.sigmaaldrich.com/img/assets/18160/Cellulase.pdf)15 Détection de la production d'éthanol:

L'éthanol est quantifié par deux méthodes.

Méthode enzymatique:

ADH Ethanol + NAD > Acétaldéhyde + NADH Cette méthode est basée sur le suivi de la conversion de NAD en NADH en présence d'éthanol et d'alcool déshydrogénase.

Cette réaction se traduit par une augmentation de l'absorbance à 340nm. On a utilisé pour cette mesure le kit Sigma N7160, en suivant les 15 recommandations du fabricant, disponibles sur le lien Internet: (http: / /www.sigmaaldrich.com / sigma /bulletin /N7160BUL.pdf).

Mesure par chromatographie liquide haute performance sur phase inverse. Conditions: 20 HPLC Gilson avec injecteur automatique, détection par réfractométrie, Colonne: Phenomenex Rezex ROA, 300 mm x 7.8 mm Température de la colonne: 65°C Phase mobile: acide sulfurique 0,005 N Débit: 0,600 mL/min 25 On réalise d'abord une courbe d'étalonnage en injectant sur la colonne du milieu de culture contenant des concentrations connues d'éthanol. L'aire du pic élué à 22,26 min et correspondant à l'éthanol est mesurée. Une courbe de calibrage est tracée. Par la suite, on mesure la quantité d'éthanol produit par la bactérie en 30 injectant le surnageant de culture sur la colonne. L'aire du pic élué à 22,26 min et correspondant à l'éthanol est mesurée. La concentration d'éthanol présente dans le surnageant est déduite par comparaison avec la courbe d'étalonnage.

L'homme du métier peut également se référer à la méthodologie générale exposée dans le document intitulé "Ethanol Fermentation Strains" (16 décembre 1998), cité plus haut. La détection et la quantification des autres métabolites éventuellement produits dans des proportions diverses peut s'effectuer conformément aux méthodes d'analyse et d'évaluation traditionnelles pour l'homme du métier de la chimie. Les bactéries sont des organismes haploïdes qui se reproduisent par division binaire et qui, pour se nourrir, utilisent des substances minérales et 10 organiques puisées dans l'environnement. Leurs exigences gazeuses, surtout vis-à-vis de l'oxygène, sont variées et les techniques de culture et de fermentation à utiliser doivent être adaptées par l'homme du métier selon qu'il s'agit de micro-organismes aérobies stricts, anaérobies stricts ou aéro-anaérobies facultatifs. 15 L'activité de cellulase avantageusement requise selon l'invention participe à la dégradation de la cellulose, tandis que l'activité de laccase permet ou facilite la dégradation de la lignine. La production, à partir de la fermentation d'une biomasse, de sources d'énergie telles que notamment l'éthanol et/ou d'autres métabolites 20 s'effectue selon des modes opératoires connus de l'homme du métier, dont les conditions de mise en oeuvre doivent cependant être adaptées, à la suite d'essais itératifs, aux conditions et paramètres de la technique selon la présente invention. En particulier, les quantités de milieu de culture bactérien, les conditions opératoires de température et/ou de pression, ainsi 25 que les options d'une fermentation aérobie, anaérobie ou microaérobie, entre autres, doivent être choisies à convenance par l'homme du métier après de simples essais de routine. Dans le réacteur pour la mise en oeuvre du procédé et de l'application selon l'invention, on met en oeuvre au moins une bactérie ou un extrait de 30 bactérie selon l'invention et/ou au moins une composition telle que définie ci-dessus, tandis que ledit réacteur est agencé et alimenté de telle manière qu'y soient établies et maintenues des conditions physico-chimiques appropriées pour que ladite bactérie soit opérationnelle dans l'application considérée et que, en option, la croissance bactérienne y soit possible et de 35 préférence favorisée.

On entend ici par "réacteur" aussi bien un fermenteur classique qu'un appareil ou un système de conversion de biomasse spécialement conçu pour la mise en oeuvre de l'invention et consistant ainsi, notamment, en des bioréacteurs, des biofiltres, des contacteurs biologiques rotatifs et autres bioréacteurs à phases gazeuses et/ou liquides pour le traitement d'une biomasse ou de dérivés de biomasse. Les appareillages utiles selon l'invention peuvent être mis en oeuvre en continu ou par charges. L'invention est également illustrée dans l'exemple ci-après, qui ne la 10 limite aucunement.

Exemple On a introduit dans un Erlenmeyer de 500 ml, contenant 100 ml de milieu minimum à 50°C, un inoculum de 1010 D. geothermalis (DG) à 50°C. La 15 culture a été mise sous agitation pour favoriser l'aération. Cette culture est alors prête pour être utilisée dans un fermenteur traditionnel de biomasse où, dans les meilleures conditions, elle permet d'obtenir de l'éthanol et d'autres métabolites avec un excellent rendement, à 55°C.

20 Après 1 à 7 jours en réacteur avec la biomasse à traiter, la présence d'éthanol et des métabolites mentionnés plus haut a été quantifiée par HPLC en phase inverse (selon le protocole décrit plus haut). On a observé une disparition du glucose, et une production concomitante d'éthanol, dont la concentration a été estimée analytiquement. D'autres métabolites d'intérêt 25 ont été détectés. Le remplacement du glucose par du xylose dans le milieu de culture permet également la croissance bactérienne et la production d'éthanol. Dans une variante de réalisation de cet exemple, on peut obtenir des résultats similaires en effectuant l'ensemble de la culture bactérienne et de la 30 fermentation dans le même récipient.

Claims

REVENDICATIONS

1. Bactérie ou extrait de bactérie pour utilisation dans la modification de biomasse ou de dérivés de biomasse en vue de produire des sources de bioénergie ou de métabolites, caractérisé en ce qu'il est apte à se développer à des températures d'environ 40-70°C et à être opérationnel dans un intervalle de pH se situant entre environ 3 et environ 9,5, et est apte à réassembler en totalité ou partiellement son génome cassé par un stress, notamment par irradiation, en particulier par des rayonnements UV ou gamma, par dessiccation, par voie enzymatique, par ultrasons ou par stress chimique.

2. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est viable ou fonctionnel à des températures d'environ 50-60°C.

3. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est viable ou fonctionnel en présence d'agents toxiques, notamment de solvants organiques, par exemple l'éthanol.

4. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est apte à modifier les sucres en C6 et C5.

5. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en 25 ce qu'il est apte à favoriser la génération de glucose à partir de cellulose.

6. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est apte à favoriser la génération de sucres en C6 et C5, 30 notamment de xylose à partir d'hémicellulose.

7. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est apte à favoriser la digestion de lignine.20

8. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le, ou dérivé du, genre Deinococcus se développant à température élevée, notamment parmi Deinococcus geothermalis, D. radiodurans ou D. murrayi.

9. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le, ou dérivé du, genre Deinococcus se développant sous concentration élevée en éthanol, notamment parmi Deinococcus geothermalis ou murrayi. 10

10. Bactérie ou extrait de bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour la production d'éthanol ou de métabolites, notamment choisis dans le groupe consistant en glycérol, butanediol, propanediol et acides 15 acétique, propionique, pyruvique et butylique, à partir de biomasse ou de dérivés de biomasse.

11. Bactérie ou extrait de bactérie selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est apte à être 20 opérationnel dans un intervalle de pH se situant entre environ 4 et environ 8.

12. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est isolé à partir d'un environnement naturel ou industriel à 25 température élevée ou à concentration de solvants ou d'éthanol ou de sucres élevée.

13. Bactérie ou extrait de bactérie selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente un génome modifié par introduction d'au moins un 30 gène procaryote ou eucaryote ou synthétique non-Deinococcus ou d'ADN étranger, ou par introduction d'au moins un gène ou d'ADN de Deinococcus différent, pour affecter sa viabilité, sa croissance, ou ses fonctions en vue de faciliter la modification de biomasse ou de dérivés de biomasse. 35

14. Composition utilisable dans la modification de biomasse ou de dérivés de biomasse, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une bactérie ou extrait de bactérie selon l'une quelconque des revendications 1-13 et au moins un agent choisi dans le groupe consistant en les agents anti-mousse et les agents nutritifs.

15. Utilisation d'au moins une bactérie ou d'au moins un extrait de bactérie selon l'une quelconque des revendications 1-13 ou d'une composition selon la revendication 14, pour la modification de biomasse ou de dérivés de biomasse pour la production de sources de bioénergie, en particulier d'éthanol, ou pour la production de métabolites.

16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'on fait croître la bactérie séparément de la modification de biomasse.

17. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'on fait croître la bactérie dans un réacteur, pendant la modification de biomasse.

18. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que la modification de biomasse est conduite en aérobiose, en anaérobiose, ou en microaérobiose. 25

19. Procédé pour la modification de biomasse ou de dérivés de biomasse utilisant au moins une bactérie ou un extrait de bactérie selon l'une quelconque des revendications 1-13 ou une composition selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison de: 30 ^ au moins une opération de mise en culture et de développement d'une telle souche bactérienne ou d'un tel extrait de souche bactérienne dans des conditions de croissance et de développement appropriées, • au moins une opération de modification de biomasse ou de 35 dérivé de biomasse, sous l'action de quantités appropriées de ladite20souche bactérienne ou du dit extrait de souche bactérienne, dans des conditions convenant pour ladite modification de biomasse ou de dérivé de biomasse, et • la collecte d'au moins une source de bioénergie ou d'au moins un métabolite issus de ladite modification de biomasse ou de dérivé de biomasse, en particulier la collecte de l'éthanol ainsi produit.

20. Réacteur pour la modification de biomasse ou de dérivé de biomasse, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 19 sur au moins une bactérie ou au moins un extrait de bactérie selon l'une quelconque des revendications 1-13 ou une composition selon la revendication 14.