FR3014903A1 - Procede d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes genetiquement modifies (mgm) et non mgm - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique de matériaux ligno-cellulosiques, dans lequel le milieu réactionnel produit sur site comprend un mélange de champignon Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) et des enzymes qu'il sécrète, complémenté d'enzymes purifiées sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM), lesdites enzymes ayant été séparées dudit microorganisme MGM, et la proportion desdites enzymes sécrétées par le microorganisme MGM et séparées dudit microorganisme est de 1% à 20% par rapport à la quantité totale d'enzymes.

Description

La présente invention concerne la production d'enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques et/ou lignolytiques, notamment dans le cadre de la production d'éthanol à partir de matériaux ligno-cellulosiques dans lequel les enzymes sont produites sur site.

Art antérieur La biomasse ligno-cellulosique se caractérise par une structure complexe constituée de trois principales fractions: la cellulose, les hémicelluloses et les lignines. De façon classique, le procédé de transformation de cette biomasse en éthanol comprend plusieurs étapes. Le prétraitement permet de rendre la cellulose accessible aux cellulases. L'étape d'hydrolyse enzymatique permet la transformation de la cellulose en glucose . Le glucose est ensuite transformé en éthanol lors de l'étape de fermentation par , en général, la levure Saccharomyces cerevisiae. Enfin l'étape de distillation va permettre de séparer et récupérer l'éthanol du moût de fermentation.

Les différentes études technico-économiques démontrent que la réduction du coût des cellulases est un des points-clés des procédés de production biologique d'éthanol à partir des matières premières lignocellulosiques. A l'heure actuelle, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion. GB1489145 enseigne la culture du microorganisme cellulolytique et d'enzymes à partir de résidus de cellulose, ainsi que l'utilisation de l'ensemble du milieu de culture/production des enzymes sans séparation d'aucun constituant pour l'hydrolyse enzymatique Le champignon est choisi dans le groupe formé par Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Fusarium javanicum. Ils affirment que l'utilisation de l'ensemble du milieu « selon l'invention », sans traitement (filtration, concentration ou autre) autre qu'un éventuel ajustement de pH, permet d'améliorer l'hydrolyse de la cellulose en terme de vitesse et de rendement.

L'hydrolyse enzymatique est réalisée à 25-50°C ,et de préférence à des températures qui empêchent la croissance du champignon (entre 45°C et 55°C), à pH=4,8-5,2, avec une concentration en enzymes de 0,01 à 5%pds dans le milieu réactionnel et une concentration en substrat de 1-30%pds.

Barta et al. (« Process Design and Economics of On-Site Cellulase Production on Various Carbon Sources in a Softwood-Based Ethanol Plant », Enzyme Research, Vol.2010) font une évaluation technico-économique à partir de plusieurs scénarios. L'un inclut l'addition de la totalité du milieu contenant le microorganisme cellulolytique à l'étape de SSF. Selon les auteurs, ceci ne pose pas de problème car la SSF est conduite à 37°C, alors que la croissance du champignon est totalement inhibée lorsque la température dépasse 35°C. Néanmoins, aucun champignon n'est cité, l'aspect fermentation est le seul concerné par cette étude technico-économique. L'art antérieur montre que l'utilisation du moût entier (enzymes+champignon) est possible en hydrolyse et en SSF.

Toutefois, cela peut poser des problèmes de législation si le microorganisme utilisé est MGM et que l'on souhaite valoriser les co-produits en alimentation animale (par exemple les drêches de blé). Les cocktails enzymatiques produits par des microorganismes non MGM ne vont pas poser ce genre de problèmes. Par contre, les enzymes produites par les souches Trichoderma reesei non MGM sont limitées en activité P-glucosidase ainsi qu'en activités auxiliaires type xylanases. L'invention propose un procédé permettant de résoudre les inconvénients de l'art antérieur. Elle permet de valoriser au mieux les produits et sous-produits. Elle permet également d'avoir un procédé flexible où plusieurs types de microorganismes MGM (Trichoderma, Pichia, Clostridium,...) peuvent être utilisés selon l'enzyme auxiliaire choisie pour complémenter le cocktail de base de Trichoderma reesei. Le procédé selon l'invention peut s'analyser comme un bon compromis entre la production d'enzymes élevée obtenue via Trichoderma reesei non OGM et l'efficacité enzymatique élevée des enzymes sécrétées par le microorganisme MGM.

Elle a d'autres avantages: -faire baisser le prix des enzymes en les produisant sur site avec les co-produits du procédé -ne pas séparer les enzymes du champignon, ce qui réduit les pertes en enzymes -ne nécessite pas de concentrer les enzymes -ne nécessite pas le transport des enzymes -choisir un microorganisme MGM en fonction de l'efficacité de ses enzymes sécrétées et moduler la quantité de ce microorganisme (ou de ces enzymes) en fonction de la productivité recherchée .35 Le principal effet de l'invention est d'augmenter considérablement l'activité des enzymes présentes dans le milieu réactionnel. 11 est donc proposé un procédé dans lequel la majorité des enzymes est produite avec un microorganisme non MGM et des enzymes complémentaires efficaces produites par un microorganisme MGM sont ajoutées, microorganisme MGM qui est séparé des enzymes, et lesdites enzymes sont utilisées en hydrolyse enzymatique. Résumé de l'invention L'invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes génétiquement modifiés (MGM) et non MGM. Cette invention décrit un procédé de production d'éthanol de deuxième génération comprenant deux unités de production d'enzymes: une unité principale où un micro-organisme non MGM est utilisé,de préférence Trichoderma reesei une unité secondaire où un micro-organisme MGM est utilisé. Les enzymes produites dans l'unité principale ne sont pas séparées. Elles sont utilisées avec le moût entier lors de l'étape d'hydrolyse enzymatique, qu'elle soit réalisée séparément ou non de la fermentation. Les enzymes produites dans l'unité secondaire sont séparées du microorganisme puis ajoutées aux enzymes produites dans l'unité principale pour augmenter leur efficacité.

Plus précisément, l'invention concerne un procédé d'hydrolyse enzymatique de matériaux ligno-cellulosiques, dans lequel le milieu réactionnel comprend un mélange de champignon Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) et des enzymes qu'il sécrète, complémenté d'enzymes purifiées sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM) , lesdites enzymes ayant été séparées dudit microorganisme MGM, et la proportion desdites enzymes sécrétées par le microorganisme MGM et séparées dudit microorganisme est de 1% à 20% par rapport à la quantité totale d'enzymes. De préférence, le microorganisme MGM est choisi dans le groupe formé par Trichoderma, Aspergillus, Penicillium et Schizophyllum, Clostridium, Pichia, Saccharomyces, Escherichia coli. Le microorganisme MGM préféré est Trichoderma ou Pichia, et de préférence Trichoderma .

Le procédé opère en batch , fed-batch ou en continu , et de préférence en continu. L'hydrolyse a lieu à une température de 45-50°C, un pH de 4.5-5.5, avec une MS (Matière sèche) comprise entre 5% et 25% (MS du milieu réactionnel, y compris le substrat à traiter).

L'invention peut opérer en mode SHF (Hydrolyse et fermentation séparées) ou SSF. L'invention s'applique particulièrement bien dans les procédés où l'hydrolyse enzymatique et la fermentation sont réalisées simultanément (procédé SSF), notamment lorsque la fermentation est réalisée en présence de la levure Saccharomyces cerevisiae .

En présence de levure, la température est comprise entre 30 et 37°C et la concentration de la levure est comprise entre 0,25 et 1 g/Kg. Description détaillée de l'invention Les souches industrielles utilisées dans l'unité principale appartiennent à l'espèce Trichoderma reesei. De préférence, elles ont été modifiées pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par les procédés de mutation-sélection (mutagénèse aléatoire), comme par exemple la souche CL847 (brevet français FR-B-2555803). Ces souches sont cultivées en fermenteurs agités et aérés dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes, selon les méthodes connues de l'homme du métier. La conduite de la production d'enzymes par Trichoderma reesei non MGM est réalisée en deux étapes : -une première étape de 30 à 50h en mode « batch » de 5 à 60 g/L de substrat carboné permettant de produire entre 2,5 et 30 g/L de biomasse cellulaire -une étape en mode fed-batch de 100 à 200 h avec un flux limitant de source de carbone de 35 à 45 mg par gramme de biomasse et par heure Les conditions sont telles que le pH est ajusté entre 3.5 et 6 et la température entre 20 et 35 °C. On choisira de préférence un pH de 4,8 et une température de 27°C durant la phase de croissance et un pH de 3.5 et une température de 25°C durant la phase de production en mode fed-batch. La vvm (taux d'aération exprimé en volume d'air par volume de milieu réactionnel et par minute) appliquée durant le procédé est comprise entre 0.3 et 1.5 min-1 et la rpm (vitesse de rotation) doit permettre de réguler la pression en oxygène entre 20% et 60% . On choisira de préférence une aération de 0.4 à 1 et de préférence voisine de 0.5 min-1 et une agitation permettant de réguler la pression en oxygène de 25% à 40% et de préférence voisine de 30 % (%d'oxygène dissous par rapport à la saturation. La source de carbone principale (présente pour la croissance du champignon et la production d'enzymes) est un sucre (tel que le glucose, le lactose ou le xylose) utilisé tel que (un sucre soluble industriel par ex) ou il peut être présent dans une matière ou être issu du traitement d'une matière (résidu d'hydrolyse de biomasse). Cette source de carbone pourra être utilisée également par les souches améliorées génétiquement. Ce peut être par exemple un extrait de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de la biomasse prétraitée. Une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement par hydrolyse acide ou explosion à la vapeur après imprégnation à l'H2SO4 peut être utilisée pour la phase de production. Avantageusement, elle est en mélange avec d'autres substrats carbonés. Dans le cas où les substrats carbonés utilisés sont le lactose ou le glucose, ils seront dissous dans cette solution. Celle-ci aura une concentration de 200 à 600 g/L selon le degré de solubilité des substrats carbonés utilisés. Ce peut être aussi un marc (résidu solide) provenant du prétraitement de la biomasse qui contient de la cellulose. Un substrat inducteur, le plus souvent le lactose, est ajouté pour la production d'enzymes. Le marc décrit précédemment peut aussi être utilisé aussi comme source de carbone totale, c'est- à-dire pour la croissance du microorganisme et l'induction de la production de protéines. Selon sa nature, le substrat carboné choisi pour l'obtention de la biomasse est introduit dans le fermenteur avant stérilisation ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation. La source inductrice peut ne pas être ajoutée dans cette phase mais ultérieurement.

A l'issue de l'unité de production , il est obtenu un flux de Trichoderma reesei non MGM avec ses enzymes produites. Ce flux peut être utilisé tel que de préférence. 11 peut aussi subir une séparation partielle, du champignon.

Le microorganisme MGM est choisi parmi les champignons cellulolytiques ou d'autres microorganismes modifiés (levures, bactéries). De façon préférée, le microorganisme cellulolytique appartient aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Schizophyllum, Pichia , Saccharomyces, E. coli,... ou il est choisi parmi les bactéries anaérobies appartenant par exemple au genre Clostridium. De préférence , le microorganisme MGM est Trichoderma ou Pichia.

Le choix du microorganisme MGM se porte sur ceux qui produisent des enzymes (glycosides hydrolases et notamment cellulases et hémicellulases) adaptées à l'hydrolyse de la cellulose et des hémicelluloses.

La conduite de la production d'enzymes par le microorganisme MGM, et notamment Pichia et Trichoderma , est réalisée dans les conditions connues de l'homme du métier et fonction des souches utilisées de façon à maximiser le rendement de production des enzymes auxiliaires. La conduite de la production d'enzymes par la souche de Trichoderma MGM est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites pour la souche de Trichoderma non MGM.

A la fin de l'expérience les enzymes sont séparées du moût par les technologies de séparation connues de l'homme du métier. Un autre moyen préféré est une centrifugation et/ou une microfiltration (filtre de 0,81..tm par ex). Les enzymes sont ensuite avantageusement concentrées par ultrafiltration.

Tous les moûts MGM (champignons récupérés lors des étapes de séparation) peuvent être ensuite détruits par exemple par ajout de NaOH à 0,2 mol/L et chauffage à 80°C pendant une heure. On vérifiera par étalement sur milieu PDA et incubation durant 72h à 30°C l'absence de croissance de ces microorganismes.

Il est ainsi obtenu d'une part un flux de Trichoderma reesei non MGM avec ses enzymes produites et d'autre part un flux d'enzymes produites par le microorganisme MGM et séparées dudit microorganisme. Ces flux peuvent être combinés (cocktail enzymatique) pour l'hydrolyse enzymatique.

Ils peuvent être envoyés séparément à l'hydrolyse enzymatique. Les introductions ou ajouts en hydrolyse enzymatique peuvent être faits en continu. De préférence, ils sont faits périodiquement. Ceci présente l'avantage de mieux contrôler l'activité enzymatique en adaptant éventuellement les quantités ajoutées. L'alimentation séparée avec contrôle du débit d'au moins un flux permet d'apporter une flexibilité importante et un contrôle fin de l'activité enzymatique. Avantageusement, les flux sont le plus concentrés possible en enzymes pour éviter un effet de dilution. L'hydrolyse enzymatique a lieu avec une proportion de 1% à 20% d'enzymes sécrétées par le microorganisme MGM par rapport à la quantité totale d'enzymes. On entend par quantité totale d'enzymes, la quantité de champignon Trichoderma reesei non MGM avec ses enzymes produites plus la quantité d'enzymes produites par le microorganisme MGM qui sont ajoutées, les quantités étant exprimées en MS (matière sèche). De préférence, la quantité totale d'enzymes est comprise entre 1 et 50mg/g de MS dans le milieu réactionnel, de façon encore plus préféré de 10 à 20mg/g et encore plus avantageusement de 5 à 30mg/g.L'hydrolyse enzymatique est réalisée dans les conditions connues de l'homme du métier. Généralement, l'hydrolyse a lieu à une température de 45-50°C un pH de 4.5-5.5, avec une MS (Matière sèche) comprise entre 5% et 25%. L'hydrolyse peut être conduite simultanément avec la fermentation (SSF). De façon avantageuse, la levure est ajoutée en même temps que les enzymes (issues du microorganisme MGM) dans le même réacteur. Une autre façon préférée est d'ajouter la levure après le démarrage de l'hydrolyse ; ainsi les produits de l'hydrolyse commencent à être présents dans le milieu et peuvent être fermentés. En présence de levure, la température est alors abaissée entre 30 et 37°C , de préférence 33-37°C, et la levure est ajoutée à une concentration généralement comprise entre 0,25 et 1 g/Kg. La biomasse ligno-cellulosique à traiter a été avantageusement prétraitée de façon à améliorer l'accessibilité de la cellulose aux enzymes. De tels procédés de prétraitement sont connus. Un procédé préféré est l'explosion à la vapeur en condition acide.

L'hydrolyse enzymatique est conduite en mode SHF c'est-à-dire séparément de la fermentation (2 unités séparées) ou en mode SSF c'est-à-dire simultanément à la fermentation (1 unité). De préférence, on opère en mode SSF, qui est plus économique et limite les contaminations.

La proportion selon l'invention permet de maintenir une activité enzymatique suffisante. En effet, on a pu constater que si la présence de beta-glucosidase permet d'élever l'activité en hydrolyse enzymatique, elle réduit par contre le rendement de la fermentation dans certains cas .

L'invention permet de conduire le procédé en mode SSF. D'une part , les levures utilisées en fermentation (et en particulier Saccharomyces cerevisiae et Kluyveromyces) sont compatibles avec les enzymes sécrétées par les microorganismes ici décrits. D'autre part, la proportion des enzymes selon l'invention permet de maintenir un bon niveau d'hydrolyse enzymatique.

Quel que soit le mode de conduite adopté (SSF ou SHF), l'invention permet d'améliorer notablement le rendement final de conversion de cellulose et d'hémicellulose par rapport aux procédés opérant sans enzymes provenant de microorganisme MGM.

Le milieu réactionnel d'hydrolyse enzymatique comprend donc la biomasse ligno-cellulosique, Trichoderma reesei non MGM, les enzymes sécrétées par Trichoderma reesei non MGM et les enzymes sécrétées par le microorganisme génétiquement modifié (MGM) et séparées dudit microorganisme.

Le procédé peut opérer en batch, fed-batch ou continu. On ajoute au milieu réactionnel les enzymes sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM) et séparées dudit microorganisme. En début de réaction, le milieu réactionnel comprend comme flux d'enzymes , seulement le flux contenant Trichoderma reesei non MGM avec les enzymes sécrétées par Trichoderma reesei non MGM . On ajoute ensuite le flux des enzymes sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié et séparées duduit microorganisme. En mode continu, on peut opérer de la même façon, avec en plus un ajout périodique ou continu, et selon les besoins, du flux contenant Trichoderma reesei non MGM avec les enzymes sécrétées par Trichoderma reesei non MGM.

L'invention propose donc d'incorporer dans l'usine de production de biocarburant de deuxième génération, deux unités de production d'enzymes: -une unité principale où un organisme non MGM est utilisé -une unité secondaire où un organisme MGM est utilisé. L'unité secondaire sera plus petite en taille que l'unité principale , généralement d'un facteur 5 à 10. Elle sera confinée du reste de l'usine de façon à pouvoir gérer les déchets MGM. La figure 1 permet d'illustrer l'invention . La biomasse ligno-cellulosique est amenée par la conduite (1) dans le réacteur d'hydrolyse enzymatique (2). Cette biomasse a été avantageusement prétraitée . Une unité de production d'enzymes par Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) , dite unité principale (3) fournit au réacteur (2) un flux (4) dudit champignon et desdites enzymes. On a représenté des canalisations (3bis, 3ter) permettant d'ensemencer ladite unité avec le champignon et les substrats, nutriments...nécessaires. Éventuellement, une unité de séparation champignon/enzymes peut être placée après l'unité (3).

Dans une unité de production d'enzymes par un microorganisme génétiquement modifié (MGM), dite unité secondaire (5), est produit un flux (6) dudit microorganisme et desdites enzymes. On a représenté des canalisations (5bis, 5ter) permettant d'ensemencer ladite unité avec le microorganisme et les substrats, nutriments...nécessaires. Le réacteur de production devra être équipé de filtre d'air en sortie de 0.41m pour éviter la dissémination de spores dans l'environnement. Le flux (6) est envoyé dans une unité de séparation (7) pour séparer les enzymes dudit microorganisme MGM. Cette unité peut être une centrifugation et/ou une microfiltration (filtre 0,21..tm par ex) . De préférence , les enzymes (conduite 8) sont concentrées dans l'unité d'ultrafiltration (9).

Les enzymes sécrétées par le microorganisme génétiquement modifié (MGM) et séparées dudit microorganisme sont envoyées au réacteur (2) par la conduite (10). Les conduites (4) et (10) d'introduction des enzymes sont munies d'un moyen de contrôle du débit qui peut être simplement une vanne , respectivement les vannes (11) et (12).

Lorsque le réacteur (2) opère en mode SSF, des levures sont introduites également. par une conduite supplémentaire non représentée. 11 sort du réacteur (2) un flux (13). Ce flux est l'hydrolysat contenant des sucres et notamment du glucose, lorsque le réacteur (2) opère en mode SHF. C'est un flux contenant de l'éthanol lorsque le réacteur (2) opère en mode SSF. De l'unité de séparation (7), il sort également par la conduite (14) un moût du microorganisme MGM qui est traité selon la réglementation en vigueur. Par exemple, il est détruit dans une unité (15) de destruction du microorganisme MGM. Une technique connue de l'homme du métier est la destruction par ajout de NaOH avec chauffage à 80°C pendant une heure. Exemples L'exemple 1 montre qu'il est possible de réaliser une SSF enzymatique sans séparer les enzymes du moût de champignon. L'exemple 2 montre le gain obtenu en terme d'efficacité de SSF en ajoutant 1/10 ème d'enzymes améliorées issues d'un MGM à un moût non MGM. Exemple 1 (non-conforme) La production de cellulases est effectuée en bioréacteur agité mécaniquement avec la souche CL847. Le milieu minéral a la composition suivante : KOH 1,66 g./L, H3PO4 85 % 2 mL/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/L, CaC12 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/L, CoC12 10 4,0 mg/L, FeSO4, 7 H2O 10 mg/L, Corn Steep 1,2 g/L, anti-mousse 0,5 mL/L. Le bioréacteur contenant le milieu minéral est stérilisé à 120 °C pendant 20 minutes , la source carbonée glucose est stérilisée à part à 120°C pendant 20 minutes puis ajoutée stérilement dans le bioréacteur de façon à avoir une concentration finale de 30 g/L. Le bioréacteur est ensemencé à 10% (v/v) avec une préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847 (qui est non MGM). Le milieu minéral de la préculture, est identique à celui du bioréacteur mis à part l'addition de phtalate de potassium à 5 g.L-1 pour tamponner le pH. La croissance du champignon en préculture est faite en utilisant le glucose comme substrat carboné, à la concentration de 30 g/L. La croissance de l'inoculum dure de 2 à 3 jours et est effectuée à 28 °C dans un incubateur agité. Le transfert vers le bioréacteur est réalisé si la concentration résiduelle en glucose est inférieure à 15 g/L L'expérience effectuée en bioréacteur comporte deux phases : - Une phase de croissance sur substrat carboné glucose (concentration initiale = 30 g/L) à une température de 27 °C et un pH de 4,8 (régulé par de l'ammoniaque 5.5 M). L'aération est de 0,5 vvm et l'agitation est augmentée entre 200 et 800 rpm en fonction de la p02 (pression en oxygène dissous), qui est maintenue supérieure à 30 %. -Une phase de production d'enzymes. Lorsque le substrat initial du fermenteur est épuisé et la solution de lactose à 250 g/L est injectée en continu au débit de 35 à 45 mg par g de cellules et par heure jusqu'à 164 heures. La température est baissé à 25 °C et le pH à 4 jusqu'à la fin de la culture. Le pH est régulé par addition d'une solution d'ammoniaque à 5.5 N qui apporte l'azote nécessaire à la synthèse des protéines excrétées. La teneur en oxygène dissous est maintenue au-dessus de 15 à 20 % par action sur l'aération et l'agitation. La production d'enzymes est suivie par le dosage des protéines extracellulaires par la méthode de Lowry et standard BSA, après séparation du mycélium par filtration ou de cellules formées). La concentration finale en protéines obtenue à l'exemple 1 est égale à 38 g/L.

Le moût obtenu est séparé en deux: un litre est transféré stérilement dans un récipient préalablement stérilisé . le reste de la culture est séparée par une série de filtrations frontales ( 2,71..tm, 0,8 !lm et 0,41m). Les enzymes obtenues sont donc débarrassées de toute trace de champignon par une filtration finale stérilisante.

Les deux solutions obtenues sont utilisées pour réaliser une SSF (hydrolyse et fermentation séparées) sur une paille de blé prétraitée par explosion à la vapeur en conditions acide. Les SSF sont réalisées en duplicate à 10% de MS et 10 mg d'enzymes par g de MS. La température est de 37°C et la levure est ajoutée à lg par kg de produit. Le milieu est tamponné à 4,8 grâce à du tampon acétate 50mM. Les cinétiques de SSF sont représentées sur la figure 1. On voit qu'il n'y a pas d'écart significatif entre les enzymes séparées et les enzymes non séparées du moût.

Exemple 2 (conforme):ajout d'enzymes améliorées produites par un MGM Pour l'exemple 2 une souche génétiquement modifiée (issue de la CL847) est utilisée pour produire un cocktail enzymatique amélioré en activité xylanases et P-glucosidase. Les enzymes sont produites dans les mêmes conditions que l'exemple 1 avec un filtre de 0,2 !lm en sortie du fermenteur. Une concentration finale en protéine de 30 g/L est obtenue. Les enzymes sont séparées par une série de filtrations frontales avec une filtration finale à 0,41m. Le moût de champignon est détruit par ajout de NaOH à 0,2 mol/L (concentration finale) et chauffage à 80°C pendant lh.

Deux SSF comparatives sont réalisés: une SSF témoin à 10 mg d'enzymes par gramme de MS: 9 mg/ g de MS (moût +enzymes de l'exemple 1) + lmg /g de MS d'enzymes séparées issues de l'exemple 1) Les enzymes utilisées sont toutes issues de l'exemple 1 produites par la CL847. une SSF à 10 mg d'enzymes par gramme de MS: 9 mg/ g de MS (moût +enzymes) issues de l'exemplel + lmg /g de MS d'enzymes séparées issues de l'exemple2 Les résultats sont montrés figure 2. 11 a suffit d'ajouter 10% (par rapport à la quantité totale d'enzymes) d'enzymes issues de la souche génétiquement modifiée (issue de la CL847) pour augmenter les performances des enzymes produites par le microorganisme non MGM .

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1.Procédé d'hydrolyse enzymatique de matériaux ligno-cellulosiques, dans lequel le milieu réactionnel comprend un mélange de champignon Trichoderma reesei non génétiquement modifié (non MGM) et des enzymes qu'il sécrète, complémenté d'enzymes purifiées sécrétées par au moins un microorganisme génétiquement modifié (MGM) , lesdites enzymes ayant été séparées dudit micro-organisme MGM, et la proportion desdites enzymes sécrétées par le micro-organisme MGM et séparées dudit micro-organisme est de 1% à 20% par rapport à la quantité totale d'enzymes.
2. 2.Procédé selon la revendication 1 dans lequel le microorganisme MGM est choisi dans le groupe formé par Trichoderma, Aspergillus, Penicillium et Schizophyllum, Clostridium, Pichia, Saccahromyces, Escherichia coll.
3. 3.Procédé selon la revendication 1 dans lequel le microorganisme MGM est Trichoderma ou Pichia.
4. 4.Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le procédé opère en batch , fed-batch ou en continu , et de préférence en continu.
5. 5.Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'hydrolyse ayant lieu à une température de 45-50°C, un pH de 4.5-5.5, avec une MS (Matière sèche) comprise entre 5% et 25% .
6. 6.Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'hydrolyse enzymatique et la fermentation sont réalisées simultanément (procédé SSF).
7. 7.Procédé selon la revendication 6 dans lequel la fermentation est réalisée en présence de la levure Saccharomyces cerevisiae.
8. 8.Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7 dans lequel , en présence de levure, la température est comprise entre 30 et 37°C et la concentration de la levure est comprise entre 0,25 et 1 g/Kg.