CA3102223A1 - Procede de valorisation du co2 par reduction biologique - Google Patents

Abstract

L'invention a trait à un procédé de valorisation du C02 par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d'une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du CO2 dans des conditions permettant la production de formiate et/ou méthane à partir dudit CO2. Le procédé selon l'invention peut notamment être mis en uvre dans un réacteur fermé ou un réacteur semi fermé ou un réacteur continu, assisté par voie électrochimique ou non.

Description

Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique L'invention a trait à un procédé microbiologique de réduction du CO2 en formiate et/ou méthane, catalysé par Stenotrophomonas maltophilia. Selon l'invention, ce procédé de réduction du CO2 peut être intensifié par l'apport d'électrons et de protons exogènes. Cet apport peut être réalisé par la mise en oeuvre de la bactérie dans un dispositif électrolytique (bio-électrolyseur). Le procédé selon l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre pour traiter des fumées industrielles ou agricoles riches en CO2 ou du biogaz contenant principalement un mélange de méthane et de CO2, afin de réduire la teneur en CO2 desdits fumées ou biogaz.
Arrière-plan technologique Le dioxyde de carbone (CO2) compte pour plus de 75 % des émissions globales de gaz à effet de serre (GES), avec des émissions anthropogéniques annuelles d'environ 25 à
35 Gt. Ces émissions proviennent surtout des industries lourdes et de production d'énergie, telles que les cimenteries, sites de production d'aluminium et d'acier, centrale à charbon ou à fuel, etc., ainsi que du transport routier.
L'utilisation du CO2 comme matière première au niveau industriel est actuellement envisagée comme une des solutions possibles pour diminuer les émissions de ce gaz à
l'atmosphère.
Dans ce cadre, la conversion directe du CO2 anthropique en carburants alternatifs (tels que le méthane, les alcools C1-05 ou l'acide formique) est devenue un sujet de recherche majeur depuis cinquante ans. Cependant, la molécule de CO2 a une forte stabilité chimique et l'activation du CO2 nécessite donc des températures et pressions relativement élevées ainsi que des catalyseurs efficaces et sélectifs.
Des catalyseurs homogènes ou hétérogènes ont été développés, qui catalysent des réactions d'hydrogénation, de photosynthèse artificielle ou de réduction électrochimique pour obtenir des carburants à partir de CO2. Néanmoins, ces voies de conversion chimique présentent encore de faibles rendement, durabilité et/ou sélectivité.
Des processus biologiques d'activation du CO2 ont également été développés.
Ces processus biologiques sont particulièrement intéressants car ils consomment peu d'énergie et ils évitent en général les réactifs et/ou les sous-produits qui pourraient avoir un impact négatif sur l'environnement. A ce jour, cependant, seuls des procédés mettant en oeuvre des

2 microorganismes photosynthétiques de type microalgues ou cyanobactéries ont atteint une échelle industrielle. Les produits principaux de la valorisation du CO2 par ces procédés sont des lipides ou des sucres qui peuvent ensuite être transformés en biodiesel ou biocarburant. La technologie en bassin ouvert a permis le changement d'échelle dans la valorisation du CO2 par des micro-algues. Cependant, le développement de ce procédé reste encore limité à cause (i) du besoin d'ensoleillement qui implique de faibles profondeurs de photo-bioréacteurs (et donc de grandes surfaces), (ii) des problèmes de transfert de masse en nutriments, (iii) d'un besoin important en eau, (iv) de la nécessité de maintenir un pH basique (8-10) et (v) de la nécessité
de récolter les microorganismes pour leur extraire les composés d'intérêt.
Toutes ces contraintes se traduisent par de faibles productivités et des coûts relativement élevés.
A l'échelle laboratoire, des cyanobactéries ont été modifiées génétiquement pour produire directement des alcools à partir de CO2. Très récemment, la voie métabolique d'assimilation du carbone de la cyanobactérie Synechococcus elongatus PCC 7942 a été dirigée vers la production de 2,3-butanediol à partir de CO2 et de glucose dans l'obscurité. Une telle avancée permet de surmonter les limitations liées au besoin d'ensoleillement. Néanmoins, le besoin d'ajouter du glucose rend ce bioprocédé inintéressant du point de vue économique. De plus, la stabilité
biologique des cyanobactéries modifiées est encore insuffisante pour permettre son utilisation à l'échelle industrielle.
Une voie de synthèse enzymatique du formiate (forme basique de l'acide formique) à partir de dioxyde de carbone (CO2) a également été étudiée. Plus précisément, des enzymes de type formiate déshydrogénase (FDH) extraites de microorganismes, ont été purifiées et modifiées pour améliorer leurs performances de catalyse, et utilisées pour réduire le CO2 en formiate (Alissandratos et al. 2013, Appl Environ Microbiol., 79(2), 741-4; Spinner et al., 2012 Catal.
Sci. Technol., 2, 19-28). Récemment, les enzymes de type nitrogénase ont également été
reportées comme capable de catalyser la réduction du CO2 en formiate, en monoxyde carbone, en acétate ou en méthane, en plus de leur activité de réduction de l'azote N2 (Khadka et al.
2016, Inorg. Chem., 55, 8321-8330; Zheng et al. 2018, Nature Microbiology, 3, 281-286).
Néanmoins, l'addition d'un cofacteur onéreux est nécessaire pour réaliser la réaction de bioconversion, rendant ces alternatives incompatibles avec une application industrielle.
Des réacteurs assistés électrochimiquement (dits aussi bio-électrolyseurs) qui sont inoculés avec des bactéries litho-autotrophes électro-actives constituent une autre voie biologique pour la conversion du CO2. Divers produits tels que du formiate, de l'acétate, des alcools C3-05, du polyhydroxybutyrate (PHB) ou de la biomasse ont pu être obtenus. Dans ces systèmes, deux configurations ont été implémentées : (1) les électrons nécessaires à la réduction du CO2 sont

3 directement fournis par la cathode polarisée et les protons proviennent quant à eux de l'oxydation de l'eau à l'anode ou (2) les électrons de la cathode sont transportés jusqu'aux bactéries par des médiateurs électrochimiques (tels que le dihydrogène ou le formiate) qui peuvent être ajoutés au milieu ou générés in situ à la cathode polarisée.
Cependant, jusqu'à
.. maintenant, la faisabilité de la configuration (1) n'a été démontrée que dans le cas où un donneur d'électrons organique est également présent dans le milieu, ce qui diminue l'attractivité
économique de ce système. Par ailleurs, l'utilisation ou la production in situ de formiate ou d'un vecteur énergétique propre et coûteux tel que le dihydrogène (H2) reste problématique dans la configuration (2).
Résumé de l'invention En travaillant sur la valorisation du CO2, les inventeurs ont découvert que la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, connue pour sa capacité à fixer le CO2 par ses enzymes carboxylases, est également apte à réduire le CO2 en formiate et/ou méthane.
Le méthane est particulièrement intéressant car il est un combustible dont la combustion produit peu de polluants atmosphériques (de type NO x ou SOI) et libère moins de CO2 par unité d'énergie (près de 30% moins) que la combustion d'énergie fossile telle que le pétrole ou le charbon. Le méthane est aussi un précurseur aux gaz de synthèse (mélanges H2/CO/CO2) qui servent actuellement à la production industrielle de méthanol, d'ammoniac et d'hydrocarbures (Société
Chimique de France, 2013). L'acide formique, ou acide méthanoïque, qui est la forme acide du .. formiate, est quant à lui un acide carboxylique aliphatique d'origine naturelle, qui se présente sous la forme d'un liquide incolore à odeur persistante. L'acide formique trouve de nombreuses applications dans l'industrie du cuir et du textile, dans la composition des teintures et produits de traitement, les insecticides, les solvants, les fumigènes, les produits de traitement anti-moisissures, etc., mais également dans la parfumerie et l'industrie agro-alimentaire en tant que molécule aromatique. Récemment, il a été montré que l'acide formique peut être utilisé comme carburant dans des piles à combustibles (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182(1), 124-132) ou pour stocker de l'hydrogène qui peut ensuite être libéré par déshydrogénation de l'acide formique (Fellay et al. 2008, Angewandte Chemie, 120(21), 4030-4032).
La possibilité
d'utiliser l'acide formique en tant que vecteur énergétique laisse présager que les besoins en .. acide formique vont s'accroitre dans les prochaines années. En outre, le formiate peut être utilisé dans des bioprocédés secondaires pour obtenir des sources d'énergie telles que du méthane (Conrad, Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments, FEMS Microbiology Ecology, 28(3) (1999) 193-202) ou des alcools (Li et al., Integrated electromicrobial conversion of CO2 to

4 PCT/FR2019/051316 higher alcohols, Science, 335 (2012) 1596 ; Pen et al., An innovative membrane bioreactor for methane biohydroxylation. Bioresource Technology, 174 (2014) 42-52).
Cette nouvelle voie de réduction par S. maltophilia présente de nombreux atouts par rapport aux bioprocédés existants. En effet, ce biocatalyseur est une cellule native.
Par comparaison à
.. des enzymes, il n'est donc pas nécessaire de procéder à des extractions protéiques ni d'ajouter des cofacteurs en conditions stoechiométriques, car les cellules en possèdent déjà leur propre stock. Cette cellule ne requiert pas non plus de modifications génétiques, qui sont mal supportées à l'échelle industrielle. Par ailleurs, aucun apport en dihydrogène (H2) ou photons (lumière) n'est nécessaire à la réaction de réduction du CO2 car la cellule possède un stock .. intracellulaire de donneur de protons et d'électrons, qu'elle accumule lors de la phase de pré-culture (par exemple sur de l'acétate issu de l'oxydation méthane ou sur un mélange de peptone et d'extrait de levure).
L'invention a donc pour objet un procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d'une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du CO2 dans des conditions permettant la réduction dudit CO2, notamment en formiate et/ou méthane.
Notamment, l'étape de mise en contact peut être réalisée à 30 C, +/- 10 C, notamment à 30 C
+/- 5 C, sous pression atmosphérique ou légère surpression (jusqu'à 0,5 bars).
La phase liquide comprend avantageusement des sels minéraux utiles à la maintenance ou survie des bactéries lors de la réaction de réduction du CO2. L'homme du métier saura adapter la composition en sels minéraux. Par exemple, la phase liquide contient de l'eau et des phosphates et/ou du MgCl2, etc.
Avantageusement, l'étape de mise en contact entre la phase liquide aqueuse et le CO2 est réalisée dans un réacteur fermé, ou dans un réacteur semi-fermé.
L'invention a également pour objet l'intensification dudit procédé de réduction biologique du CO2. Le stock intracellulaire de donneur de protons et d'électrons étant limité, les inventeurs ont démontré qu'il est possible d'apporter des protons et électrons exogènes, ou extracellulaires, c'est-à-dire autres que les protons et électrons intracellulaires de Stenotrophomonas maltophilia afin que la réaction de réduction du CO2 perdure dans le temps. Par exemple, il est possible d'introduire dans le réacteur un donneur d'électrons et de protons, tel qu'un bio-polymère et notamment du polyhydroxybutyrate (PHB) et/ou une assistance électrochimique de type bio-électrolyse. En effet, les inventeurs ont montré que Stenotrophomonas maltophilia est capable d'utiliser les électrons d'une cathode faiblement polarisée et les protons issus de l'oxydation de l'eau à l'anode. Dans un mode de réalisation, l'énergie apportée à la bio-électrolyse est d'origine verte, solaire notamment, ce qui rend ce procédé autonome du point de vue énergétique.

5 Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé d'intensification de la réduction du CO2 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia comprenant une étape selon laquelle on ajoute du PHB exogène ou une assistance électrochimique (bio-électrolyse) dans le réacteur.
Selon l'invention, des produits identifiés de la réduction du CO2 sont le formiate et/ou le méthane. Il est possible également de coupler l'utilisation de Stenotrophomonas maltophilia à
un autre microorganisme, notamment un microorganisme apte à utiliser le formiate contenu dans le liquide pour produire d'autres molécules d'intérêt, telles que du méthane, du lactate ou des alcools, notamment en Ci-05 (tels que le méthanol, l'isobutanol ou le méthyl- 1 -butanol).
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une bactérie Stenotrophomonas maltophilia pour la production de formiate et/ou méthane et/ou plus généralement tout produit dont le nombre d'oxydation du carbone est inférieur à celui du CO2, par réduction de CO2.
L'invention a également pour objet un procédé de traitement d'un biogaz ou de fumées industrielles riches en CO2 ou de fumées agricoles riches en CO2 comprenant une étape de réduction du CO2 par réduction biologique comprenant une étape selon laquelle on met en contact lesdits biogaz ou fumées industrielles ou fumées agricoles avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du CO2.
L'invention a également pour objet un procédé de production de formiate à
partir de CO2, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du CO2 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du CO2 en formiate.
L'invention a aussi pour objet un procédé de production de méthane à partir de CO2, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du CO2 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du CO2 en méthane.

6 Brève description des figures Figure 1. Spectres RMN d'une suspension de Stenotrophomonas maltophilia mise en oeuvre pour les essais de réduction du 13CO2 en réacteur fermé et en conditions de référence : (a) à t =
0 jour, (b) à t = 8 jours et (c) à t = 35 jours.
Figure 2. Cinétiques de production en 13C-formiate, obtenues au cours d'essais de réduction du 13CO2 conduits en réacteur fermé et en conditions de référence avec la bactérie Stenotrophomonas maltophilia. Chaque couleur représente un essai indépendant.
Figure 3. Tests de réduction du 13CO2 en réacteur fermé avec une suspension de S. maltophilia préparée dans un milieu de réaction enrichi en ammonium (MREA); les autres paramètres de réaction étant inchangés par comparaison aux conditions de référence. Un test de réduction du 13CO2 est également conduit simultanément en conditions de référence. (A) Evolution de la concentration en ions ammonium (NH4) : dans le MREA (0) et dans le milieu de réaction de référence (e). (B) Evolution de la concentration en 13C-formiate (H13C00-):
dans le MREA
(A) et dans le milieu de réaction de référence (A).
Figure 4. Spectre RMN d'une suspension de S. maltophilia enrichie initialement avec 1,5 mM
de 13C-formiate (H13C00).
Figure 5. Spectres RMN du milieu de réaction contenant le consortium S.
maltophilia/
trichosporium OB3b obtenus en présence de 13CO2 à (a) t = 0 jour, où le 13CO2 et sa forme basique Ell3CO3- sont présents et (b) t = 8 jours montrant l'apparition d'un pic de 13C-formiate.
Figure 6. Spectres RMN du milieu de réaction contenant le consortium S.
maltophilia/
oxydans obtenus en présence de 13CO2 à (a) t = 5 jours; (b) t = 8 jours et (c) t= 12 jours.
Figure 7. Schéma et principe d'un exemple de réalisation d'un réacteur semi-fermé, assisté par électrolyse (ou bio-électrolyseur) pour la réaction de réduction du CO2 selon le procédé de l'invention.
Figure 8. Evolution de la densité de courant cathodique mesurée au cours du temps dans un bio-électrolyseur inoculé avec Stenotrophomonas maltophilia, selon un mode de réalisation du procédé de l'invention. La tension de polarisation est fixée à -0,7 V vs Ag/AgCl. Six phases sont distinguées, correspondant aux différentes conditions opératoires mises en oeuvre : (a) bullage de CO2 (25 mL.min-1); (b) bullage d'argon, noté Ar (10 mL.min-1) ; (c) arrêt du bullage d'argon ; (d) bullage de CO2 (5 mL.min-1); (e) bullage d'argon (100 mL.min-1) et (f) bullage de

7 CO2 (25 mL.min-1). Le symbole (#) indique les interruptions de polarisation pour l'acquisition des voltamétries cycliques réalisées à 10 mV.s-1.
Description détaillée de l'invention Les inventeurs ont découvert que Stenotrophomonas maltophilia est capable de produire du .. formiate et du méthane (CH4) par réduction directe du CO2 dans des conditions opératoires douces. De manière particulièrement intéressante, les inventeurs ont mis en évidence que Stenotrophomonas maltophilia est apte à produire du formiate et du méthane (CH4) en utilisant comme seule source de carbone le CO2, et cela sans apport de cofacteurs, de molécules organiques, de dihydrogène (H2) ou facteurs de croissance coûteux.
Dans le contexte de l'invention, on entend par réduction du CO2, toute réaction permettant le passage du nombre d'oxydation du carbone du CO2, à un degré plus bas que dans le CO2.
La bactérie Stenotrophomonas maltophilia est une bactérie aérobie à Gram négatif, de la famille des Pseudomonailaceac. Elle n'a jusqu'à présent jamais été utilisée à des fins industrielles. Or, les inventeurs ont découvert que cette bactérie est particulièrement intéressante pour la production de molécules d'intérêt à partir de CO2. En effet, les inventeurs ont découvert que cette bactérie présente la capacité de produire du formiate et/ou du méthane à
partir de CO2 comme seule source de carbone, après avoir été avantageusement mise préalablement en culture dans des conditions autotrophes, c'est-à-dire en culture pure aérobie sur un milieu organique usuel de type Lysogeny Broth Miller, ou en co-culture avec une bactérie méthanotrophe, telle que Methylosinus trichosporium OB3b, sur un milieu minéral mis en contact avec un mélange méthane/air (1 :1 v/v). La voie en co-culture est particulièrement avantageuse car elle permet de garantir un bilan carbone optimal ; en effet, le méthane, d'origine renouvelable, est la seule source de carbone nécessaire à la culture.
Avantageusement, la phase liquide comprend au moins 3 g de cellules sechea de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, au moins 10 g de cellules sèches/L, au moins 20 g de cellules sèches/L, 30 g de cellules sèches/L, 40 g de cellules sèches/L, 50 g de cellules sèches/L, 60 g de cellules sèches/L, 70 g de cellules sèches/L, 80 g de cellules sèches/L, 90 g de cellules sèches/L, 100 g de cellules sèches/L.
Avantageusement, et quel que soit le mode de culture, les cultures sont réalisées à 30 C, +/-10 C et à pression atmosphérique ou légère surpression (jusqu'à 0,5 bars).
Selon l'invention, la phase gazeuse contenant du CO2 mise en contact avec le milieu de réaction liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia peut être de l'air atmosphérique.

8 La phase gazeuse peut autrement être du CO2 pur ou un mélange gazeux, tel qu'un mélange CO2-air, CO2-N2, CO2-02, CO2-CH4, CO2-H2, CO2-N2-H2, CO2-CH4-H2, CO2-CH4-air, CH4-N2 ou CO2-CH4-02. Dans un mode de réalisation, la phase gazeuse contient ou est constituée de biogaz. Dans un autre mode de réalisation, la phase gazeuse contient ou est constituée de fumées industrielles ou agricoles riches en CO2. Dans un mode de réalisation particulier, la phase gazeuse comprend au moins 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de CO2. Avantageusement, la phase gazeuse comprend au moins 30% de CO2. Il est également possible d'utiliser une phase gazeuse comprenant 100% de CO2. Dans un mode de réalisation, la phase gazeuse comprend entre 30 et 100% de CO2.
Dans un mode de réaction, le milieu de réaction contient 20 mM de tampon phosphate à pH 7,0 0,1 et 5,0 mM de MgCl2. Dans un autre mode de réalisation, le milieu de réaction contient 1,3 mM de KC1, 28,0 mM de NH4C1, 29,8 mM de NaHCO3 et 5,0 mM de NaH2PO4.
L'homme du métier est à même de choisir le milieu de réaction approprié pour la réduction du CO2 en formiate par Stenotrophomonas maltophilia.
.. Le formiate et/ou le méthane et/ou tout autre produit dont le nombre d'oxydation du carbone est inférieur à celui du CO2 étant obtenu directement par réduction du CO2, le rendement en formiate et/ou méthane et/ou tout autre produit dont le nombre d'oxydation du carbone est inférieur à celui du CO2 du procédé selon l'invention dépend directement de l'apport en CO2.
L'homme du métier saura adapter les concentrations en CO2 aux rendements souhaités.
Selon l'invention, l'apport en CO2 peut être réalisé par tout moyen connu et notamment par des contacteurs membranaires (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), un fritté
poreux de distribution de gaz (Kim et al. 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15(3), 476-480; Duan et al. Bioresource Technology, 102(15), 7349-7353) ou un simple contact gaz-liquide dans un réacteur fermé (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52).
Dans un mode de réalisation, le procédé de valorisation du CO2 est mis en oeuvre dans un réacteur fermé ( batch ). Alternativement, le procédé peut être mis en oeuvre dans un réacteur semi-fermé ( fed-batch ).
Selon l'invention, la phase gazeuse contenant le CO2 peut être injectée dans l'espace de tête du réacteur fermé. Dans un mode de réalisation, il est possible de supprimer l'air présent dans l'espace de tête du réacteur fermé préalablement à l'injection de la phase gazeuse, de manière à placer la réaction sous une atmosphère constituée uniquement de la phase gazeuse.

9 De manière alternative ou complémentaire, la phase gazeuse peut être injectée au centre du réacteur fermé ou semi-fermé, au coeur de la phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, au moyen notamment d'un distributeur à gaz.
Dans le cas d'un réacteur semi-fermé ( fed-batch ), la phase gazeuse contenant du CO2 est apportée en continu, préférentiellement par bullage, à l'intérieur du réacteur.
Dans un exemple de réalisation, le pH dans le milieu de réaction, c'est-à-dire la phase liquide, est maintenu entre 5 et 8, préférentiellement à pH 6,5, +/- 0,5.
Avantageusement, le CO2 dissous dans l'eau forme un tampon suffisant pour permettre le maintien du pH, sans régulation externe.
De même la température dans le milieu de réaction est préférentiellement maintenue entre 20 C
et 50 C, de manière préférée entre 25 C et 35 C, et de manière encore préférée à 30 C, +/- 1.
Selon l'invention, il est possible, préalablement à l'étape de réaction, c'est-à-dire préalablement à la mise en contact de la bactérie avec le CO2 pour produire le formiate et/ou le méthane, de placer la bactérie dans un milieu de culture dans des conditions de température et de pH
favorables à sa croissance.
Par milieu de culture , on entend le milieu dans lequel les bactéries sont mises à croître, pour produire de la biomasse bactérienne. Le milieu de culture comprend de manière classique les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne sous une forme utilisable par les bactéries, à savoir une source de carbone, des sels minéraux et de l'eau. Des milieux standards sont disponibles dans le commerce, décrits dans la littérature scientifique ou dans les catalogues des fournisseurs de souches bactériennes. L'homme du métier sait quels sont les composants minimums requis en l'absence desquels les Stenotrophomonas maltophilia ne peuvent se développer, et peut sans difficulté cultiver une telle bactérie.
Les conditions générales de culture (température, composition du milieu, agitation, etc.) permettant la croissance ou le maintien des Stenotrophomonas maltophilia, sont aisément définies par l'homme du métier.
Cette étape de culture préalable peut par exemple permettre à la bactérie d'accumuler des donneurs de protons et d'électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2 en formiate et/ou méthane selon les équations (1) et (2) et/ou (1) et (3) :
CO2 + H+ + 2e- ¨> HC00- (équation 1) CO2 + 8H+ + 8e- ¨> CH4 + 2 H20 (équation 2) HC00- + 7ft + 6e- ¨> CH4 +2 H20 (équation 3) De manière alternative ou complémentaire, il est possible d'ajouter dans le réacteur un donneur d'électrons et de protons exogènes, tel qu'un bio-polymère, de manière à
fournir à la bactérie les électrons et protons nécessaires à la réaction, même en l'absence ou après épuisement de 5 donneurs intracellulaires. Notamment, il est possible d'ajouter du polyhydroxybutyrate (PHB) dans le réacteur. Dans un mode de réalisation, le PHB est préalablement produit par des bactéries méthanotrophes à partir de méthane, notamment renouvelable (Pieja et al., Distribution and selection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria, Microbial. Ecology, 62(3) (2011) 564-573). Un tel mode de réalisation est

10 particulièrement avantageux d'un point de vue économique.
Dans un mode de réalisation, on ajoute du PHB exogène dans le réacteur.
Préférentiellement on ajoute entre 30 mg/L et 3 g/L, de PHB exogène dans la phase liquide, notamment environ 0,3 g/L.
De manière alternative ou complémentaire, et notamment dans le cas d'un réacteur semi-fermé, il peut être particulièrement avantageux d'utiliser un dispositif d'assistance électrochimique.
Un tel dispositif, logé à l'intérieur du réacteur et en contact avec la bactérie, permet de fournir des électrons et des protons à la bactérie. L'assistance électrochimique peut notamment être de type bio-électrolyse (figure 7). Avantageusement, l'énergie utilisée pour faire fonctionner le bio-électrolyseur est une énergie solaire.
Différents matériaux peuvent être utilisés pour l'anode et la cathode, dès lors qu'ils sont conducteurs d'électrons. Par exemple, la cathode peut être en acier inoxydable, en graphite ou en feutre. L'anode peut être en platine, acier inoxydable, graphite ou feutre.
Avantageusement, le rapport surface active de cathode / volume du réacteur est compris entre 1 et 100 m2/m3, préférentiellement environ 10 m2/m3. Par surface active , on entend la surface géométrique exposée à l'anode. Le rapport surface géométrique projetée d'anode /
surface géométrique projetée de cathode est préférentiellement compris entre 1 et 10, plus préférentiellement environ égal à 2. La gamme de potentiel de polarisation peut par exemple aller de -1,5 V à 0 V vs Ag/AgC1, notamment -1 V à -0,5 V, par exemple -0,7 V
ou -0,8 V.
De manière à optimiser la réaction de réduction du CO2, il est possible d'ajouter de l'ammonium et/ou ammoniaque dans la phase liquide et/ou de l'ammoniac dans la phase gazeuse, notamment entre 5 mmol/L et 100 mmol/L, préférentiellement entre 20 et 30 mmol/L.

11 De manière alternative ou complémentaire, la phase liquide comprend, en plus de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, un autre micro-organisme apte à utiliser le formiate issu de la réduction du CO2 pour former des métabolites plus complexes, tels que du méthane, du lactate ou des alcools. Les inventeurs ont montré qu'un tel consortium peut conduire à
une synergie apte à intensifier le flux de CO2 réduit par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia.
Tout ou partie du procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à
l'échelle du laboratoire ou à l'échelle industrielle, c'est-à-dire sur des fermenteurs, ou réacteurs, de moyenne capacité
(environ 0,1 L à 100 L) ou de grande capacité (100 L à plusieurs centaines de m3).
L'invention a également pour objet l'intensification du procédé de réduction du CO2 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia au moyen d'un ajout de PHB exogène ou d'une assistance électrochimique (bio-électrolyse) comme décrit ci-dessus.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, la réaction de réduction du CO2 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia peut être favorisée en éliminant en continu le formiate produit dans la phase liquide du réacteur sous forme de formiate et/ou d'acide formique. L'Homme du métier connaît les techniques possibles pour éliminer en continu le formiate produit.
Dans un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le milieu liquide et minéral de réaction enrichi en formiate peut être utilisé tel que récupéré dans un procédé ou bioprocédé
secondaire visant à valoriser le formiate produit en des molécules à plus forte valeur ajoutée.
L'Homme du métier connaît les techniques possibles pour valoriser le formiate produit.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé de production de formiate selon l'invention comprend les étapes consistant à :
Introduire Stenotrophomonas maltophilia dans un réacteur contenant un milieu de réaction ;
Approvisionner le milieu de réaction, ou phase liquide, en une phase gazeuse contenant du CO2; et optionnellement Récupérer le formiate produit dans le réacteur par réduction du CO2, sous forme de formiate et/ou d'acide formique.
Dans un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le milieu de réaction minéral enrichi en formiate peut être utilisé tel que récupéré dans un procédé
secondaire visant à valoriser le formiate produit en des molécules à plus forte valeur ajoutée.

12 Dans un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le formiate produit est récupéré sous forme d'acide formique à partir du milieu de réaction.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de récupération de l'acide formique à partir du milieu de réaction est réalisée par électrodialyse ou par extraction liquide-liquide avec un co-solvant. Ces dispositifs de récupération permettent de récupérer en continu l'acide formique et éviter ainsi l'éventuelle inhibition des bactéries par un excédent de produit, tout en obtenant un acide formique exempt d'impuretés (comme les sels du milieu de réaction).
Dans le cas d'une récupération en continu du produit, un apport continu en milieu de réaction peut être réalisé dans le bioréacteur. Dans le cas d'un procédé de récupération par électrodialyse, un module d'électrodialyse bipolaire est avantageusement couplé avec un module de microfiltration pour séparer et récupérer en continu le formiate produit sous sa forme acide (acide formique). En particulier, l'électrodialyse bipolaire peut être réalisée sur un milieu de réaction sans biocatalyseurs, obtenu en continu après avoir séparé les bactéries du milieu par un module de microfiltration tangentielle. L'électrodialyse bipolaire consiste à combiner une membrane bipolaire pour acidifier le formiate en acide formique et des membranes monopolaires pour extraire les sels du milieu de réaction.
Le formiate et/ou l'acide formique obtenu(s) à partir d'un tel procédé
microbiologique peut être avantageusement utilisé dans toute industrie susceptible d'en avoir besoin, et notamment dans l'industrie du cuir et du textile, dans la parfumerie, dans l'industrie agro-alimentaire, etc.
Préférentiellement, le formiate et/ou l'acide formique obtenu(s) à partir d'un tel procédé
microbiologique est utilisé dans un procédé biologique secondaire (in situ ou ex situ) pour obtenir des composés organiques de plus forte valeur ajoutée, et notamment du méthane, du lactate ou des alcools C1-05. De manière alternative, il est possible d'utiliser directement le milieu de réaction contenant le formiate et/ou l'acide formique obtenu(s) pour la mise en oeuvre du procédé biologique secondaire. Si les composés obtenus sont des alcools, un procédé de stripping réalisé par un bullage de gaz contenant du CO2 peut être mis en oeuvre pour récupérer en continu les alcools produits.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, il est possible, préalablement à
l'étape de réaction, de co-cultiver Stenotrophomonas maltophilia avec une ou plusieurs autres espèces bactériennes méthanotrophes. Il est ainsi possible de produire des nutriments organiques à
partir de méthane, lesdits nutriments étant ensuite utilisés par Stenotrophomonas maltophilia comme source de carbone et d'énergie. Par exemple, les inventeurs ont mis en évidence que la co-culture sous un mélange méthane/air et sur milieu minéral de Stenotrophomonas maltophilia avec une bactérie

13 méthanotrophe, telle que Methylosinus trichosporium OB3b, permet la production d'acétate utilisable par Stenotrophomonas maltophilia pour sa croissance. Les inventeurs ont par ailleurs montré que la présence d'une telle bactérie méthanotrophe dans la phase liquide lors de l'étape de réaction ultérieure ne perturbe pas la réduction du CO2 ni la production de formiate et/ou méthane par Stenotrophomonas maltophilia.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible lors de l'étape de réaction (c'est-à-dire de mise en contact de Stenotrophomonas maltophilia avec la phase gazeuse contenant le CO2) d'ajouter à la phase liquide un ou plusieurs autres microorganismes, et notamment des bactéries, archées et/ou levures, aptes à utiliser le formiate pour produire des molécules à plus forte valeur ajoutée. Il est également possible de co-cultiver Stenotrophomonas maltophilia avec un ou plusieurs de ces microorganismes préalablement à l'étape de réaction, puis d'ajouter l'ensemble des microorganismes obtenus dans le milieu de réaction liquide pour l'étape de réaction. Dans un mode de réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia la bactérie Microbacterium oxydans. Dans un mode de réalisation, on ajoute des archées méthanogènes hydrogénotrophes, afin d'obtenir du méthane. Dans un mode de réalisation, on ajoute à
Stenotrophomonas maltophilia la bactérie Ralstonia eutropha H16 (LH74D), afin d'obtenir notamment des alcools en C4-05. Dans un mode de réalisation, on ajoute à
Stenotrophomonas maltophilia une bactérie méthanotrophe ainsi qu'un inhibiteur de la méthanol déshydrogénase, afin d'obtenir du méthanol.
De manière alternative, l'étape de réaction de réduction du CO2 en formiate par Stenotrophomonas maltophilia est réalisée dans un premier réacteur, et le formiate produit est récupéré pour alimenter un second réacteur dans lequel se trouve le ou les microorganismes aptes à utiliser le formiate pour produire des molécules à plus forte valeur ajoutée. Le second réacteur peut être alimenté directement avec le milieu de réaction du premier réacteur, contenant le formiate produit, ou au contraire contenir un milieu auquel est ajouté le formiate extrait du milieu de réaction du premier réacteur.
L'invention a également pour objet l'utilisation de Stenotrophomonas maltophilia, pour la production de formiate et/ou méthane et/ou tout autre produit dont le nombre d'oxydation du carbone est inférieur à celui du CO2 par réduction de CO2 comme exposé ci-dessus. L'utilisation de Stenotrophomonas maltophilia permet de consommer des quantités de CO2 significatives et de répondre ainsi aux problèmes environnementaux liés à l'accumulation de CO2 dans l'atmosphère tout en valorisant le CO2 consommé.

14 D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée.
Exemples .. A] Matériels et méthodes 1. Culture de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia Deux voies de culture de S. maltophilia ont été mises en oeuvre :
(i) Co-culture aérobie avec la bactérie méthanotrophe Methylosinus trichosporium OB3b Dans ce cas, la source de carbone et d'énergie utilisée est le méthane qui est converti par la bactérie méthanotrophe en nutriments organiques assimilables par la bactérie S. maltophilia pour sa croissance. En particulier, de l'acétate, à une concentration de l'ordre de 35 mg.L-1, est mesurée dans le réacteur de culture en fin de croissance. Une telle synergie entre ces deux types de bactéries a déjà été reportée dans la nature et pour un consortium les impliquant, la production d'acétate par des méthanotrophes a déjà été mise en évidence dans des conditions limitantes en oxygène (C. Costa et al., Denitrification with methane as electron donor in oxygen-limited bioreactors, Appt. Micro biol. Biotechnol., 53(6) (2000) 754-762).
Le milieu de culture est un milieu minéral enrichi en cuivre et en fer. Le milieu de base est composé de: 1,06 g/L KH2PO4, 4,34 g/L Na2HPO4.12H20, 1,7 g/L NaNO3, 0,34 g/L
K2SO4 et 0,074 g/L MgSO4.7H20. Une fois préparé, le pH de ce milieu de base est ajusté
à 7,0 0,1 avec NaOH, 0,1 M ou HC1, 0,1 M puis autoclavé. Les solutions de minéraux, de cuivre et de fer sont préparées indépendamment et stérilisées par filtration sur filtres en acétate de cellulose de diamètre de pores 0,2 ium avant d'être ajoutés au milieu de base. Les concentrations finales en minéraux sont : 0,57 mg/L ZnSO4.7H20, 0,446 mg/L MnSO4.H20, 0,124 mg/L H3B03, 0,096 mg/L Na2Mo04.2H20, 0,096 mg/L KI et 7,00 mg/L CaC12.2H20. Les concentrations finales en cuivre et en fer sont : 0,798 mg/L CuSO4 and 11,20 mg/L FeSO4.7H20.
Les cultures sont conduites dans des réacteurs fermés étanches, incubés à 30 C
et sous rotation constante (160 rpm). L'espace de tête des réacteurs est rempli par un mélange d'air et de méthane (1 :1 v/v) ; le volume de gaz est trois fois plus grand que celui du liquide. Les pourcentages d'inoculation en S. maltophilia peuvent varier de 10 à 50 % v/v.
Les cultures sont arrêtées lorsque la densité optique à 600 nm (DO600nni) est constante.

Deux cultures successives sont conduites avant de mettre en oeuvre le consortium pour la réaction de réduction du CO2.
(ii) Culture pure aérobie du biocatalyseur La bactérie S. maltophilia a tout d'abord été isolée d'un consortium formé
avec la bactérie M.
5 trichosporium OB3b (obtenu selon le protocole décrit précédemment).
L'isolement a été réalisé
par repiquage successifs de colonies de S. maltophilia sur des géloses de milieu Lysogeny Broth (LB) Miller (Sigma Aldrich, France). La pureté et l'identification de la bactérie isolée sont confirmées par des analyses biochimiques (voir point 2 ci-dessous). La souche est conservée d'une part sur géloses LB stockées à 4 C, et d'autre part, au congélateur à -20 C dans son milieu 10 liquide natif de culture auquel est ajouté du glycérol (20 % v/v). Le réacteur de culture est un réacteur fermé avec un bouchon perméable à l'air qui est dédié aux cultures stériles. Un milieu de culture liquide LB est ensemencé avec la bactérie S. maltophilia, 5 % v/v à
partir d'un aliquote congelé ou avec l'intégralité des colonies d'une gélose, puis incubé
24 h incubés à
30 C et sous rotation constante (160 rpm). Les cultures sont arrêtées lorsque la phase

15 stationnaire débute (DO600n. est constante).
Deux cultures successives sont conduites avant de mettre en oeuvre le biocatalyseur pour la réaction de réduction du CO2.
Une corrélation entre la DO600n. (-) et la concentration massique [X] en bactérie S. maltophilia (g de cellules sechesi 1) est établie pour déterminer les productivités en formiate ; la corrélation est obtenue sur la base de cinq points répliqués indépendamment :
[X] (g de cellules seches.L-1) = 0,3035 x DO600n. (R2 = 0,995) 2. Analyses biochimiques L'isolat de Stenotrophomonas maltophilia issu de la co-culture a d'abord été
caractérisé avec une coloration Gram et par spectrométrie de masse. La coloration Gram a mis en évidence que l'isolat est un bacille à Gram négatif. L'analyse par spectrométrie de masse a permis de confirmer que l'isolat est bien pur et d'identifier la bactérie S. maltophilia qui est en effet un bacille à Gram négatif. En spectrométrie de masse, il est à noter qu'un score supérieur à 1,90 indique une identification fiable et que le score obtenu pour S. maltophilia est de 2,18. Avant chaque culture, une analyse qualitative des colonies de S. maltophilia étalées sur géloses est réalisée afin de déceler une éventuelle contamination. Par ailleurs, un séquençage de l'ARN

16 16S de l'isolat a permis de confirmer que la bactérie identifiée est bien Stenotrophomonas maltophilia.
3. Préparation de la suspension bactérienne mise en oeuvre dans les essais de réduction du CO2 A la fin de la culture, les cellules sont collectées par centrifugation à 4 C
et 4000 g pendant 20 min. Elles sont alors remises en suspension dans un tampon phosphate 20 mM à
pH 7.0 puis centrifugées à nouveau dans les mêmes conditions que précédemment et le culot bactérien est récupéré. Un milieu de réaction contenant 20 mM de tampon phosphate à pH 7.0 et 5 mM de MgCl2 est utilisé pour re-suspendre le culot bactérien et obtenir une DO600n.
de (i) 10,3 0,5 (soit 3,1 0,2 g de cellule sèche/L) pour les essais en réacteurs fermés et (ii) 6,6 0,3 (soit 2,0 0,1 g de cellule sèche/L) pour les essais avec assistance par électrolyse. Un échantillon de la suspension préparée est toujours stocké à -20 C avec du glycérol (20 % v/v) pour d'éventuelles analyses biochimiques ultérieures. Le reste de la suspension est utilisé immédiatement pour les essais de réduction du CO2. Le milieu de réaction ne contient pas de nutriments organiques permettant la croissance du biocatalyseur, celui-ci est donc utilisé comme une cellule au repos.
4. Essais de réduction du 13CO2 en réacteur fermé
La suspension bactérienne obtenue à l'étape précédente est distribuée dans des réacteurs fermés étanches de 60 mL en ajoutant 6 mL de suspension à chaque réacteur. Afin d'évaluer la capacité
du biocatalyseur à réduire le CO2, l'espace de tête est rempli avec un mélange gazeux contenant du 13CO2 qui est stérilisé par filtration sur des filtres en téflon de diamètre de pores 0,2 lm.
Différents mélanges gazeux ont été testés : 13CO2:air atmosphérique (3 :7 v/v), 13CO2: N2 (3 :7 v/v) et du 13CO2 pur. Pour chaque expérience, un set de plusieurs réacteurs est préparé dans des conditions identiques et incubé à 30 C sous agitation constante (160 rpm).
Chaque cinétique est suivie pendant plus de 20 jours et jusqu'à 35 jours; pour cela, à chaque temps d'échantillonnage, un réacteur est sacrifié pour les analyses. Différentes mesures sont réalisées :
densité optique à 600 nm (DO600nni), pH, dosage du formiate par Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (GC-MS), caractérisation de la composition gazeuse de l'espace de tête par GC-MS, dosage du poly-3-hydroxybutyrate (PHB) intracellulaire par GC-MS et dosage des ions ammonium (NH4) par chromatographie ionique (CI). Les produits issus du 13CO2 sont mis en évidence dans le milieu de réaction et dans l'espace de tête par GC-MS et RMN. Des dénombrements des bactéries viables sont également réalisés au début et à la fin des cinétiques ; pour cela, les échantillons sont cultivés en conditions autotrophes aérobies. Enfin, des blancs réalisés avec le milieu de réaction seul (sans bactéries) sous mélange 13CO2:air

17 atmosphérique (3 :7 v/v) n'ont montré aucune contamination sur la durée des essais, confirmant la stérilité des essais en réacteur fermé.
5. Essais de réduction du CO2 en réacteur semi-fermé, assisté par électrolyse Un réacteur en verre est utilisé. Son volume liquide utile est de 60 mL et son espace de tête représente environ 40 % de son volume total. Un couvercle est vissé sur le réacteur et l'étanchéité de la jonction couvercle-réacteur est garantie par un joint. Ce couvercle présente un port d'entrée pour l'alimentation du gaz (12CO2 100 %) qui est réalisée au coeur de la solution par un distributeur à gaz, un port pour la sortie du gaz et 3 ports pour le positionnement des électrodes. Le réacteur est thermostaté à 30 C sous agitation constante (300 rpm).
Le système électrochimique est un dispositif classique à 3 électrodes (électrode de travail, électrode de référence et contre-électrode). L'électrode de travail (ou cathode) est un coupon de graphite de surface 2,5 cm x 2,5 cm et d'épaisseur 0,5 cm (Goodfellow), connecté
électriquement avec une tige de titane (Goodfellow). Avant chaque expérience, le coupon de graphite est lavé pendant 1 h dans une solution d'HC11 N pour dissoudre les éventuelles espèces adsorbées puis dans une solution de NaOH 1 N pour neutraliser l'acidité et finalement rincé
avec de l'eau stérile ultrapure avant d'être laissé une nuit dans 1 L d'eau ultrapure stérile pour chasser les éventuels résidus de soude inclus dans les pores du graphite. La tige en titane est quant à elle nettoyée à l'acétone puis autoclavée. Dans ce dispositif, le rapport de la surface active de la cathode par le volume du réacteur est donc de 10,4 m2/m3 ; où la surface active est définie comme la surface géométrique étant exposée à la contre-électrode.
La contre-électrode (ou anode) est une grille de platine, préalablement nettoyée et désinfectée à la flamme. Dans ce dispositif, le rapport de la surface géométrique projetée de l'anode sur celle de la cathode est d'environ 1,5 pour ne pas limiter les phénomènes cathodiques.
Les potentiels sont contrôlés et exprimés par rapport à une électrode de référence Ag/AgC1 (potentiel de 0,240 V/ESH, Radiometer analytical).
Le potentiel de polarisation de l'électrode de travail est appliqué avec un potentiostat une voie (Ametek VersaSTAT3) et le courant est enregistré toutes les 900 s. La chronoampérométrie (CA) est périodiquement arrêtée pour acquérir des voltamétries cycliques (CVs) entre -1,2 et 1,0 V vs Ag/AgC1, à une vitesse de balayage comprise entre 1 et 10 mV.s-1.
Pour rappel, une voltamétrie cyclique (ou voltampérométrie cyclique) consiste à réaliser un balayage en potentiel à l'électrode de travail et à mesurer le courant circulant dans le système électrochimique. Cette technique permet : (i) de contrôler la cohérence de la CA avec la CV, (ii) acquérir des

18 informations cinétiques sur le système et (iii) mettre en évidence de composés redox dans la suspension.
Dans un premier temps, le réacteur est rempli avec une suspension bactérienne de S. maltophilia dans du milieu de réaction (préparée selon 2.c), dans laquelle un bullage continu de CO2 100 %
ou d'un mélange gazeux CO2:CH4 (1:1 ou 1:2 v/v) est réalisé à un débit compris entre 2 ou 25 ml.min-1. Puis une polarisation allant de -0,7 V à -1,0 V vs Ag/AgC1 est appliquée. La polarisation est débutée en même temps que la chronoampérométrie. En parallèle, un réacteur témoin sans électrodes (et donc sans polarisation) est mis en oeuvre de la même manière que le réacteur électrochimique. Des prélèvements sont effectués au cours du temps, sous hotte microbiologique, pour mesurer la densité optique à 600 nm (D0600.) et le pH du milieu liquide ; le pH s'est révélé être constant et égal à 6,4 0,2 (correspondant au pKa du couple CO2,H20/HCO3-). La composition du gaz est analysée en entrée et en sortie de réacteur par Chromatographie Gazeuse couplée à un catharomètre (GC-TCD) pour déterminer le flux expérimental de CO2 réduit.
6. Analyses physico-chimiques = Traitement des échantillons liquides Le milieu de réaction complet (avec bactéries) et le surnageant (sans bactéries) sont analysés.
Le milieu de réaction complet est soit directement analysé soit congelé à -20 C dès collecte pour analyse ultérieure. Le surnageant est obtenu par centrifugation du milieu complet venant d'être prélevé ; la centrifugation est conduite pendant 10 min à 10 000 g et 10 C et le surnageant est collecté dès la fin de la centrifugation pour analyse immédiate ou congélation à -20 C. Le culot est conservé à -20 C pour analyse ultérieure.
= Analyses réalisées par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) :
Pour ces analyses, 500 g d'échantillon liquide (réaction menée avec du 13CO2, 2.d) sont introduits dans un tube RMN de 5 mm de diamètre avec 50 g de D20 puis analysés par un RMN BRUKER Avance III ¨ 500MHz ¨ CryoProbe Helium pendant 4 h. Différents standards (formiate de sodium marqué et non marqué, acétate de sodium, méthanol, éthanol, formaldéhyde, acétaldéhyde, lactate de sodium, glycérol, isobutanol, succinate de sodium, fumarate de sodium, pyruvate de sodium, oxaloacétate de sodium) préparés dans du milieu de réaction ont été préalablement analysés par RMN pour obtenir les empreintes de ces molécules.
Sur cet appareillage, le seuil de détection de molécules marquées au 13C est de 6 mg.L-1. Or, les analyses RMN peuvent seulement détecter les isotopes 13C qui ont une abondance relative de 1,1 % au regard de leur isotope 12C dans la nature [W. Mook and P. Grootes, International

19 Journal of mass Spectrometry and ion Physics, 1973, 12(3): p. 273-298]. Par conséquent, une concentration de produit non marqué au 13C d'environ 600 mg.L-1 est nécessaire pour mettre en évidence ces composés.
= Analyses réalisées par Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (GC-MS) :
- Matériel La chromatographie gazeuse (Clams 580, Perkin Elmer) est conduite avec une colonne capillaire (30 m x 0,25 mm ID, épaisseur de film 8 lm, Rt-Q-Bond Plot, Restek), couplée à la spectrométrie de masse (Clams SQ-8-MS, Perkin Elmer) équipée d'un détecteur quadripolaire sélectif de masse sur impact électronique (El) opéré à 70 eV. Un passeur d'échantillons (Turbomatrix Headspace 16S, Perkin Elmer) est mis en en oeuvre pour l'injection des espaces de tête obtenus après chauffage à 100 C des échantillons liquides. Pour l'analyse de la composition de l'espace de tête du réacteur fermé maintenu à 30 C, les échantillons sont directement prélevés dans le réacteur avec une seringue étanche aux gaz et injectés manuellement dans la GC-MS. L'hélium est utilisé comme gaz vecteur au débit de 1,5 ml / min.
- Dosage du '2C-formiate et '3C-formiate dans les échantillons liquides Une méthode d'estérification basée sur le protocole décrit par Wallage et al (2008) (Formic acid and methanol concentrations in death investigations, Journal of Analytical Toxicology, 32 (2008) 241-248) a été utilisée pour la quantification du formiate. La réaction d'estérification est réalisée entre l' acide organique présent dans l'échantillon liquide et le méthanol ajouté dans des conditions acides. Dans un flacon d'analyse GC-MS (22 mL), 600 iaL
d'échantillon, 100 lut d'acétonitrile (157,2 mg.L-1) en tant qu'étalon interne, 100 lut d'acide sulfurique concentré
et 100 lut de méthanol en tant qu'agent de dérivation sont introduits dans cet ordre. Le flacon d'analyse est alors placé dans le passeur d'échantillons et chauffé à 100 C
pendant 15 minutes afin de terminer la réaction d'estérification. Dans le cas de l'analyse du milieu complet (avec bactéries), un étalement du mélange sur gélose a permis de vérifier que ces conditions permettent la lyse des bactéries car aucune re-croissance n'a été mise en évidence. La température de l'injecteur est fixée à 200 C et le split à 1:16. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 40 à 150 C, à la vitesse de 10 C / min. Les ions détectés, en mode d'enregistrement à un seul ion (SIR), correspondent à un des rapports masse/charge m / z de 60 pour le 12C-formiate de méthyle et de 41 pour l'acétonitrile. Afin de déterminer si le carbone est 12C ou 13C, [M + 1] a également été évalué pour le 13C-formiate de méthyle (m / z de 61). La présence d'espèces marquées n'est considérée que pour des teneurs significativement supérieures à 1 %, qui dépassent donc le pourcentage lié à l'abondance isotopique naturelle.

Des courbes d'étalonnage ont été établies préalablement avec des standards de formiate et d'acétate : Na(HCOO) et Na(H13C00)obtenus chez Sigma-Aldrich.
- Analyse des gaz dans l'espace de tête du réacteur fermé
L'espace de tête du réacteur fermé est analysé pour déterminer les espèces gazeuses, marquées 5 au 13C ou non, présentes au cours du temps. Pour chaque analyse, 250 iaL
d'espace de tête sont prélevés dans le réacteur incubé à 30 C à l'aide d'une seringue étanche aux gaz et 50 iaL sont injectés dans la GC-MS. La température de l'injecteur est fixée à 200 C et le split à 1:16. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 100 à 150 C, à la vitesse de 10 C / min. En mode SIR, les ions détectés sont m / z 28 (N2), m / z 44 (CO2), m / z 45 (13CO2), m / z 16 10 (12CH4) et m / z 17 (13CH4).
= Dosage des ions ammonium (NH4) par chromatographie ionique (CI) Les ions NH4 + sont dosés dans les surnageants. L'analyse est réalisée en injectant 25 ILLL
d'échantillon dans un dispositif chromatographique Dionex ICS-1000 (Thermo Scientific) équipée d'une colonne capillaire IonPAc AS19 (0.4 x 250 mm). Le programme d' élution est le 15 suivant : 10mM KOH (de 0 à 10 min), puis 10-45 mM KOH (de 10 à 30 min).
= Analyses réalisées par Chromatographie Gazeuse couplée à un catharomètre (GC-TCD) - Matériel La chromatographie gazeuse (Clams 580, Perkin Elmer) est conduite avec une colonne PE-Q
(Perkin Elmer, 30m) en série avec une colonne tamis moléculaire PE-MOLESIEVE
(Perkin

20 .. Elmer, 30 m) couplée à un détecteur de conductivité thermique, encore appelé catharomètre (Perkin Elmer). Une vanne à boucle 10 voies est utilisée pour charger et injecter les échantillons gazeux.
- Analyse de la composition des gaz, marqués ou non Pour chaque analyse, 20 mL minimum de gaz à analyser sont envoyés dans la vanne à boucle et 20 ILLL d'échantillon sont injectés dans les colonnes. L'hélium est le gaz vecteur à un débit 10 mL.min-1. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 40 C à
120 C à une vitesse de 10 C.min-1. Un étalonnage est effectué pour doser le CO2.

21 = Dosage du % massique de PHB intracellulaire La méthode basée sur la digestion du PHB et l'analyse de son monomère (3-hydroxybutyrate) par GC-MS (A.J. Pieja et al., Applied and environmental microbiology, 2011: p.
AEM.00509-11; G. Braunegg et al., European journal of applied microbiology and biotechnology, 1978, 6(1) : p. 29-37) a été mise en oeuvre, à la différence que les culots bactériens ont été congelés au lieu d'être lyophilisés avant l'étape de digestion du PHB.
Les culots bactériens conservés à -20 C sont décongelés à température ambiante puis digérés pendant 3 h à 100 C dans 2 mL de méthanol contenant 3% d'acide sulfurique concentré et 0,1%
d'acide benzoïque additionné de 2 mL de chloroforme. Des tests de re-croissance sur milieu LB ont montré que les bactéries contenus dans les culots et traitées par cette digestion acide étaient totalement désactivées. Une fois que l'échantillon est refroidi, 1 mL
d'eau déminéralisée est ajouté pour induire une séparation de phase. La phase aqueuse est alors retirée et 2 lut de phase organique sont injectés dans la GC-MS. Les analyses sont conduites avec le même appareillage GC-MS que celui utilisé pour les analyses de formiate. Une colonne DB-1 (Agilent J&W) est utilisée pour la séparation. Le gaz vecteur est l'hélium à un débit de 32 mL.min-1. La température du four est programmée à 80 C pour 1 min, jusqu'à 120 C à un taux de 10 C/min, puis la température est augmentée jusqu'à 270 C à un taux de 45 C/min. La température de l'injecteur est fixée à 200 C et le split à 30 mL/min.
L'utilisation d'un standard de PHB (Sigma Aldrich) a permis d'établir une courbe de calibration donnant le ratio des aires des pics de 3-hydroxybutyrate et de benzoate en fonction de la masse de PHB introduite.
Ratio des aires de pics (3-hydroxybutyrate/benzoate) = 0,1675 x mpuB (R2 =
0,9865) Pour déterminer le % massique de PHB intracellulaire par unité de masse de cellules sèches (wpnB/wcenuie sèche) dans les échantillons, la masse de PHB mesuré dans l'échantillon par la méthode décrite ci-dessus est divisée par la masse sèche de bactéries en présence qui est connue à partir de mesure de D0600.
B] Résultats I. Essais de réduction du 13CO2 en réacteur fermé
Afin d'évaluer la capacité du biocatalyseur à réduire le CO2, du CO2 marqué au 13C est utilisé.
Le marquage du CO2 a pour but de mettre en évidence les produits marqués issus du 13CO2 et de les distinguer de ceux issus d'un simple relargage cellulaire. Pour identifier ces produits, la technique RMN est utilisée pour analyser la suspension bactérienne et son surnageant alors que

22 la technique GC-MS est utilisée pour caractériser l'espace de tête du réacteur. De plus, ce marquage permet d'observer les empreintes RMN et GC-MS de l'ensemble des produits présentant un ou plusieurs 13C qui peuvent résulter (i) de la réduction du 13CO2 et/ou (ii) de la fixation du 13CO2 par la cellule. La densité optique à 600 nm (DO600nni) est mesurée au cours du temps pour suivre l'évolution de la concentration massique bactérienne (en gcellule sèche/L). Des dénombrements des cellules viables sont aussi réalisés pour accéder à la concentration cellulaire en bactéries (en CFU/mL) et le pH est mesuré en cours de réaction. La teneur en ions ammonium (NH4) dans le milieu de réaction est suivie pour étudier l'influence de la présence d'ammonium sur les performances du bioprocédé de réduction du CO2.
1. Suivi du métabolisme d'assimilation du 13CO2 par RMN et GC-MS
La suspension bactérienne de Stenotrophomonas maltophilia est mise en contact d'une atmosphère gazeuse 13CO2:air atmosphérique (1:1 v/v). La Figure 1 présente les spectres RMN
obtenus sur la suspension bactérienne complète (a) initialement (début de réaction), (b) après 8 jours de réaction et (c) après 35 jours de réaction.
Dès le début de la réaction, deux pics sont visibles : celui du 13CO2 (de déplacement chimique O = 124,6 ppm) et celui du H13CO3- (de déplacement chimique O = 160,2 ppm).
Après 8 jours de réaction, un pic avec un déplacement chimique correspondant à celui du 13C-formiate (O =
171,0 ppm) apparaît.
Afin de vérifier que ce pic correspond bien au 13C-formiate (H13C00-) marqué, une petite quantité de standard 13C-formiate est ajouté à l'échantillon (à une concentration finale de 10 mg/L). L'amplitude du pic a augmenté lorsque le standard a été ajouté, ce qui confirme que ce pic est bien attribuable au 13C-formiate. Aucun autre composé que le 13C-formiate n'est détecté
par RMN, ce qui suggère que ce 13C-formiate résulte d'une réduction directe du 13CO2. En effet, le 13C-formiate a un seul carbone, à un degré d'oxydation plus faible que celui du 13CO2. Des blancs réalisés sans bactéries dans les mêmes conditions (c'est-à-dire sous mélange 13CO2/air atmosphérique) ne montrent aucun composé marqué, hormis 13CO2 et H13CO3-, confirmant ainsi le rôle des bactéries sur la réduction du 13CO2 en 13C-formiate.
La cinétique de réduction du 13CO2 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia est reproduite et le milieu liquide du réacteur est aussi analysé à 35 jours (Fig 1.c). Les pics correspondants au 13CO2 et H13CO3- sont toujours visibles à 35 jours, ce qui révèle qu'il n'y a pas de limitation en CO2. Seul le pic correspondant au 13C-formiate (O = 171,0 ppm) est encore mis en évidence.
Ceci signifie que le 13C-formiate produit n'est pas utilisé par la bactérie pour former de nouveaux composés et que le 13CO2 est probablement accepteur final d'électrons. Ces nouveaux

23 essais ont confirmé que la présence de la bactérie S. maltophilia permet de catalyser la réaction de réduction du 13CO2 en 13C-formiate en phase liquide.
Par ailleurs, l'analyse GC-MS de l'espace de tête de plusieurs réacteurs fermés révèle la présence de méthane marqué (13CH4) en quantité significative au bout de 34 jours. Dans les conditions testées, la teneur de ce gaz reste néanmoins inférieure à 1 % v/v.
Comme le 13C-formiate, le 13CH4 est un composé à un seul carbone, à un degré d'oxydation plus faible que celui du 13CO2. Ce 13CH4 est donc issu de la réduction du 13CO2, soit directe (13CO2 ¨> 13CH4) soit indirecte (13CO2 ¨> 13C-formiate ¨> 13CH4). Le méthane est un produit particulièrement intéressant car il peut être récupéré facilement par stripping et servir de combustible.
En conclusion, la bactérie S. maltophilia est capable de réduire le CO2 en formiate et en méthane. Afin de quantifier la production en 13C-formiate dans le milieu de réaction liquide, des essais de réduction du 13CO2 sont reproduits dans des conditions similaires, considérées comme des conditions de référence. La concentration en 13C-formiate est cette fois-ci dosée par GC-MS ; de plus, la densité optique à 600 nm (D0600) et le pH sont aussi monitorés.
2. Essais de réduction du 13CO2 en réacteur fermé en conditions de référence a. Définition des conditions de référence Les conditions de référence sont définies comme suit : concentration initiale en bactéries de 3,1 0,2 g de cellule sèche/L, atmosphère gazeuse initiale composée d'un mélange gazeux 13CO2 :air atmosphérique (3:7 v/v), milieu de réaction aqueux composée de 20 mM de phosphates et 5 mM de MgCl2. Trois cinétiques indépendantes sont conduites en parallèle dans ces conditions de référence.
b. Suivis de la concentration en biomasse et du pH
La concentration massique en bactéries, notée [X], est monitorée en mesurant D0600. La .. corrélation donnant la D0600 en fonction de la concentration massique en bactéries est donnée en section A.1]. Pour l'ensemble des trois cinétiques suivies, une diminution de la concentration en biomasse est observée (données non montrées). La raison la plus probable pour expliquer ce phénomène est la lyse cellulaire. En effet, un manque de nutriments naturels et une atmosphère riche en CO2 expose les cellules bactériennes à des conditions stressantes, qui sont susceptibles d'entraîner la mort et donc la lyse cellulaire d'une partie de la population bactérienne. Tout du long des cinétiques, aucun essai ne montre cependant une lyse totale. En effet, pour toutes les expériences, la concentration massique cellulaire, initialement de 3,1 0,2 g de cellule sechei 1,

24 chute sur les 10 premiers jours puis se stabilise à une valeur moyenne de 0,5 0,1 g de cellule sèche/L. Ceci signifie donc qu'une partie seulement de la suspension de biocatalyseur se lyse sur les 10 premiers jours de la cinétique puis que la concentration massique reste stable.
De plus, le dénombrement de cellules viables dans la suspension bactérienne au bout de 35 jours confirme d'une part que de la lyse cellulaire se produit et d'autre part que 15 4 x 104 CFU/mL sont toujours viables ; la concentration initiale étant de 60 x 107 CFU/mL. La concentration en cellules viables a donc diminuée significativement mais reste tout de même élevée (de l'ordre de 105 CFU/mL). Il est supposé que cette lyse cellulaire peut être un moyen pour la bactérie de s'adapter à ses nouvelles conditions grâce aux composés organiques relargués dans le milieu par la lyse des cellules (J.M. Navarro Llorens et al., FEMS
microbiology reviews, 2010, 34(4): p. 476-495).
Au cours de ces cinétiques, le pH est également suivi (données non montrées).
Quelle que soit l'expérience, l'évolution du pH est très similaire. En effet, le pH initial est fixé à 7,0 0,1 et pour tous les essais, le pH diminue à une valeur moyenne de 6,4 0,2 sur les 5 premiers jours puis reste constant à cette valeur qui correspond au pKa du couple acido-basique CO2,H20/HCO3- induit par la dissolution de CO2 dans le milieu de réaction. Le pH du milieu est donc tamponné tout au long de la cinétique.
c. Suivi de la production en 13C-formiate dans le liquide La production en 13C-formiate issu de la réduction du 13CO2 est quantifiée par GC-MS et son évolution au cours des trois différentes cinétiques est présentée en Figure 2.
Quelle que soit la cinétique, du 13C-formiate est produit en quantité
significative. De plus, l'analyse GC-MS a mis en évidence que le 13C-formiate se retrouve dans les suspensions complètes (c'est-à-dire en présence des bactéries) mais pas dans les surnageants respectifs. Ceci montre que la production de ce 13C-formiate est réalisée par les bactéries intègres restant dans le milieu de réaction et non pas par des enzymes libres issues de la lyse cellulaire. Le 13C-formiate apparaît au bout de 8 à 10 jours seulement, période qui peut correspondre à une phase de latence au cours de laquelle la bactérie s'adapte à son nouveau substrat 13CO2. Le fait qu'une concentration importante en bactéries (proche de 105 CFU/mL) soit toujours viable à la fin des cinétiques confirme la présence de bactéries maintenant une activité
métabolique.
Le 13CO2 entre donc dans les cellules, soit sous la forme 13CO2 ou sous la forme Hi3CO3-; en effet, le pH se stabilise autour du pKa du couple CO2,H20/HCO3- et les deux formes coexistent donc dans de proches proportions. Puis les cellules ayant survécu aux conditions de réaction et à la lyse utilisent donc un de leur système enzymatique intracellulaire pour catalyser la réaction de réduction de ce 13CO2 en 13C-formiate. Deux familles d'enzymes, potentiellement présentes à l'intérieur de la bactérie S. maltophilia, sont susceptibles de catalyser cette réaction de réduction du CO2 en formiate : les Formiate DésHydrogénases (FDHs) et les nitrogénases. A
5 l'heure actuelle, ces enzymes sont d'abord isolées de leur microorganisme natif puis purifiées avant d'être mises en oeuvre (L.B. Maia et al., Inorganica Chimica Acta, 2017, 455 :
p. 350-363 ; Khadka et al. 2016, Inorg. Chem., 55, 8321-8330).
Il est à souligner que les concentrations maximales en formiate produites (10 -20 mg.L-1, Figure 2) sont inférieures à la concentration maximale théorique en 13C-formiate qui aurait pu être 10 atteinte si tout le 13CO2 présent dans le réacteur avait été réduit (soit 4,6 g.L-1). Ce calcul se base (i) sur le nombre de moles de 13CO2 introduites dans l'espace de tête (obtenu par la loi des gaz parfaits) et (ii) sur une stoechiométrie 1:1 vis-à-vis du 13CO2 et du formiate (c'est-à-dire en supposant qu'une mole de 13CO2 donne une mole de 13C-formiate). Ceci suggère donc qu'il n'y a pas de limitation macroscopique au transfert de 13CO2 dans la phase liquide contenant les 15 bactéries. Cependant, une limitation microscopique du transport de 13CO2 du coeur du liquide vers le biocatalyseur n'est pas exclue. En effet, la présence d'ADN libre provenant de la lyse cellulaire observée pourrait créer des résistances importantes au transfert de masse dans les cellules. Une étude a en effet déjà reporté ce type de phénomène pour la bactérie E. cou, (Castan et al., John Wiler & Sons, Inc. Biotechnol. Bioeng. 77 (2002) 324-328), qui présente des 20 similitudes avec la bactérie S. maltophilia, car elle est aussi une bactérie aérobie de type bacille à Gram négatif. Dans l'étude de Castan et al., la présence d'ADN libre limiterait le transfert de masse en oxygène (02) dissous vers les cellules. Dans le cas présent, une telle limitation pourrait aussi se produire pour le 13CO2 dissous. Une solution pour augmenter la production de formiate serait d'apporter le CO2 au coeur de la solution par un distributeur à gaz.
Par ailleurs, la

25 concentration en bactéries et l'activité spécifique CO2-réductrice des cellules peuvent être aussi des éléments limitants à la réaction de réduction. Il est donc possible de jouer sur ces paramètres pour optimiser le flux de CO2 réduit.
d. Production Pformiate en 13C-formiate et flux volumique FCO2,vol de 13CO2 réduit Quelle que soit la cinétique considérée (Fig. 2), la production en 13C-formiate Pformiate, en mg '3C-formiate.(g celluk sèche)-1 11 ou clumol "C-formiate.(g cellule sèche71 j-1 , est définie comme étant :
Pformiate ¨ AC / At / Cbactérte (Equation 4) avec At : période de production (jour),

26 AC : différence de concentration en "C-formiate sur la période de production (mg.L-1 ou nmol.L-1), Cbactérte : concentration bactérienne initialement introduite (Cbactérie = 3,1 0,2 g cellule sèche.L 1) pour tenir compte de l'apport en bactéries qu'il a été nécessaire de mettre en oeuvre.
De la même manière, si l'on considère qu'une mole de "C-formiate produite correspond à une mole de "CO2 réduite, alors le flux Fc02 de "CO2 réduit en clumol I3CO2.(g cellule sèche) I I sera donc égal à la production en formiate Pformiate exprimée en clumol '3C-formiate.(g cellule sèche) I I .
Le flux volumique Fco2,v0i de "CO2 réduit exprimé en mL I3CO2.(g celluiesèche)-1 1 sera calculé
selon l'équation suivante :
FCO2,v0l = FCO2 . vin (Equation 5) où vni est le volume molaire à 30 C du "CO2 supposé gaz parfait (25,19 10-3 mL.nmo1-1) Le tableau 1 détaille les valeurs de AC et At pour chacune des trois cinétiques présentées précédemment, ainsi que les productions en "C-formiate (Pformiate) et les flux de "CO2 réduit (Fc02,,01)=
Tableau 1. Production en "C-formiate (Pformiate) et flux de "CO2 réduit (Fco2,,01) obtenus en réacteur fermé
Cinétique AC (mg.L-1) At (j) Pformiate Pformiate FCO2,v0l (mg 13C- (111,M01 13C- (mL "CO2.(g formiate.(g cellule formiate.(g cellule cellule sèche) 1.j 1) sèche)' j') sèche' J') 1 (bleue) 9,4 7 0,5 10,0 0,3 2 (rouge) 18,8 7 0,9 20,0 0,5 3 (verte) 7,7 7 0,4 8,2 0,2 Moyenne 11,8 5,6 7 0,6 0,3 12,7 6,3 0,3 0,2 e. Production de 13C-formiate à partir de 13CO2: étude de reproductibilité
Afin d'étudier la reproductibilité de ce bioprocédé, six autres essais indépendants de réduction du "CO2 ont été conduits en conditions de référence, avec des suspensions bactériennes préparées à partir de différentes cultures de S. maltophilia. Pour chacun de ces essais, une production significative en "C-formiate a été mise en évidence. En appliquant les calculs de la section précédente (Eq. 4 et 5) aux résultats obtenus au cours de ces cinétiques (6 au total), il ressort une production Pformiate moyenne de 9,1 clumol 13C-formiate.(g celluk sèche) I I (soit 0,4 mg

27 formiate. (g cellule sèche)-'.f'), avec un minimum et maximum respectivement de 2,3 et 30 clumol "C-formiate.(g celluk sèche) I ..l I (soit 0,1 et 1,4 mg '3C-formiate.(g cellulesèche,r1 j-1).
De la même manière, un flux volumique moyen Eco2,v01 de 13CO2 réduit de 0,24 mL '3CO2. (g cellule sèche) Ill a été obtenu, avec un minimum et maximum respectivement de 0,06 et 0,76 mL
'3CO2. (g cellule sèche)-I 11 ; ces différences de flux étant certainement liées aux différences d'état physiologique des bactéries utilisées pour les essais de réduction du 13CO2.
f. Production de 13CH4 à partir de 13CO2: étude de reproductibilité
La production de 13CH4 à partir de 13CO2 a été évaluée à 34 jours lors de 4 essais indépendants de réduction du 13CO2, conduits en conditions de référence, avec des suspensions bactériennes préparées à partir de différentes cultures de S. maltophilia. Dans tous les cas, une production significative en 13CH4 a été obtenue, avec des teneurs en 13CH4 dans l'espace de tête du réacteur variant entre 1 à 3 % v/v.
3. Effet de divers paramètres sur les performances en réduction du "CO2 Divers paramètres qui peuvent potentiellement influencer les performances de la réaction de réduction du CO2 sont étudiés. Pour cela, des essais sont conduits dans des conditions de réaction modifiées, par comparaison aux conditions de référence. Un test en conditions de référence est toujours réalisé simultanément à l'étude de l'influence d'un paramètre pour déterminer l'impact du paramètre modifié.
a. Effet de la concentration en biomasse La concentration massique initiale de la suspension bactérienne utilisée pour les essais de réduction du 13CO2 est fixée à 3,1 0,2 g de cellule seche/L. En effet, dans les conditions de culture mises en oeuvre, cette concentration est actuellement la plus forte possible permettant de lancer différent réacteurs fermés et différentes séries de réacteurs fermés. A terme, les volumes et concentrations de bactéries produites pourront être augmentés. Une concentration plus faible (1,6 0,1 g de cellule sèche/L) est testée pour vérifier que la quantité de 13C-formiate produite est corrélée à la quantité de cellules ; les autres paramètres de réaction restant inchangés. La cinétique est suivie sur 25 jours.
Le tableau 2 résume les résultats obtenus.

28 Tableau 2. Concentrations massiques en biomasse initiale [Xo] et finale [Xf]
(en g de cellule sèche/L), perte en biomasse A[X] en fin de réaction (en %) et concentrations finales accumulées en 13C-formiate issu de la réduction du 13CO2 (en mmol/L et mg/L).
[Xo] [Xf] A[X] [13C-formiate] [13C-formiate]
(g de cellule sèche/L) (g de cellule sèche/L) (%) (mmol/L) (mg/L) 3 , 1 1 , 1 65 0,65 29,3 1,6 0,7 56 0,03 1,4 Le Tableau 2 montre que la concentration en 13C-formiate est près de 20 fois supérieure lorsque la concentration initiale en bactéries est doublée. Contrairement à ce qui pouvait être attendu, la concentration finale accumulée en 13C-formiate n'est donc pas corrélée aux quantités de cellules introduites initialement. Par contre, il est intéressant de noter qu'en doublant la quantité
de bactéries initiale, la quantité de cellules lysées finale est également doublée (Tableau 2, différence entre [Xo] et [Xf]). Il est donc possible que les composés relargués dans le milieu de réaction par lyse cellulaire puissent être utilisés par les cellules survivantes pour produire une quantité plus importante d'enzyme intracellulaire réductrice du CO2, ce qui conduirait donc à
une augmentation de la production en 13C-formiate.
En conclusion, la disponibilité de composés intracellulaires dans le milieu de réaction semble être un facteur limitant pour les performances de réduction en CO2 quand la concentration bactérienne initiale est trop faible (1,6 g de cellule sèche/L).
b. Influence de la nature du mélange gazeux Des essais avec différents mélanges gazeux sont réalisés pour étudier l'influence de la présence d'oxygène (02) et d'azote (N2) sur la réaction de réduction du CO2. La concentration en 13C-formiate est monitorée.
Différents mélanges gazeux initiaux contenant du 13CO2 ont été testés : (i) le mélange de référence composé de 13CO2:air atmosphérique (3:7 v/v), (ii) un mélange 13CO2:N2 (3:7 v/v) pour étudier l'influence de l'oxygène et (iii) du 13CO2 pur pour étudier l'effet de l'azote. Ces essais ont tous été reproduits deux fois.
Les résultats, montrent que l'absence d'oxygène et la présence d'azote accélèrent l'apparition de 13C-formiate dans le milieu. En effet, la production en 13C-formiate survient en moyenne 14 2 jours plus tôt sous mélange 13CO2:N2 (3:7 v/v), par comparaison au mélange 13CO2:air atmosphérique (3:7 v/v) et au 13CO2 pur. Par contre, quel que soit le ciel gazeux mis en oeuvre,

29 la concentration maximale en 13C-formiate accumulée dans le milieu sur un temps de réaction de 31 jours reste du même ordre de grandeur (autour de 0,1 mmol/L). L'oxygène est reporté
pour être un inhibiteur potentiel des activités de la nitrogénase et de la FDH
car il peut servir d'accepteur d'électrons et conduire à la formation d'espèces réactives de l'oxygène (J. Gallon, Trends in Biochemical Sciences, 1981, 6: p. 19-23) mais il peut aussi affecter la synthèse de la nitrogénase (Q.Liu et al., Nature communications, 2015, 6 : p. 5933). La baisse de performances observées en présence d'02 n'est donc pas surprenante.
En conclusion, utiliser un mélange 13CO2:N2 est favorable à la cinétique de réaction de réduction du 13CO2.
C. Influence de la composition du milieu de réaction De nouveaux essais de réduction du 13CO2 sont réalisés avec un milieu de réaction enrichi en ions ammonium (MREA). Le MREA contient 2 mmol/L de KC1, 28 mmol/L de NH4C1, 30 mmol/L de NaHCO3 et 5 mmol/L de NaH2PO4. Les concentrations en 13C-formiate et ions ammonium (NH4) sont monitorées tout au long de la réaction (Figure 3).
Quand des ions ammonium sont initialement présents en grande quantité, près de la moitié de la quantité initiale est consommée sur les 8 premiers jours, puis la concentration semble se stabiliser (Fig. 3.A). En conditions de référence, des ions ammonium apparaissent en suspension (Fig. 3.A). Cette apparition en ions ammonium peut être liée à deux productions :
la réduction du N2 par la nitrogénase et la désamination des protéines relarguées dans le milieu après lyse cellulaire. De plus, ces ions NH4 + ne sont pas oxydés en nitrates ou nitrites, ce qui implique que ces ions NH4 + peuvent servir de source d'azote assimilable pour la synthèse d'enzymes par les bactéries survivantes.
En ce qui concerne la production de 13C-formiate, elle est près de 2,5 fois plus importante à 24 jours (soit une concentration de 1,45 mmol/L, c'est-à-dire environ 65 mg/L) et se produit .. environ 7 jours plus tôt (Fig. 3.B) quand le milieu de réaction est enrichi en ammonium. Ceci pourrait notamment être expliqué par le fait que la présence excédentaire d'une source d'azote assimilable par la bactérie (c'est-à-dire les ions NH4) en début de réaction pourrait avoir aidé
la bactérie à sur-exprimer son système enzymatique réducteur du CO2.
Il est donc aussi possible de jouer en amont sur les conditions de culture de la bactérie S.
maltophilia et/ou sur des modifications génétiques de la bactérie pour sur-exprimer la quantité
de son système enzymatique CO2-réducteur et bénéficier d'une activité
spécifique intrinsèque de réduction du CO2 plus importante.

d. Etude de la réversibilité de la réaction de réduction du CO2 Cette étude a montré que la bactérie S. maltophilia est capable de réduire le CO2 en formiate.
Jusqu'à présent, la concentration maximale accumulée en formiate est d'environ 1,5 mmol/L
(soit 67,5 mg/L). De manière à étudier la réversibilité de la réaction de ce système catalytique, 5 .. c'est-à-dire sa capacité à oxyder le formiate en CO2, une concentration en 13C-formiate de sodium de 1,5 mmol/L est introduite dans une suspension de S. maltophilia préparée comme pour un test de réduction du CO2 (section A] 3). Cette suspension est alors introduite dans un tube RMN et analysée par RMN (section A] 6). Si l'équilibre de réduction du 13CO2 est réversible, alors l'oxydation du 13C-formiate (H13C00-) en 13CO2 devrait pouvoir se produire 10 car le 13CO2 est initialement minoritaire :
H13C00- <¨> 13CO2 (Equation 6) Le spectre RMN obtenu au bout de 4 h est présenté en Figure 4.
Seulement deux pics sont visibles, correspondant respectivement aux ions 13C-formiate (O =
171,0 ppm) et 13C-hydrogénocarbonate (O = 160,2 ppm). Ce résultat confirme que quand le 13C-15 formiate est prédominant devant le 13CO2, alors le 13C-formiate peut être oxydé en 13CO2, qui se solubilise sous la forme hydrogénocarbonate (H13CO3-). En effet, dans le cas de cet essai, le pH du milieu de réaction (7,0 0,1) est supérieur au pKa du couple CO2,H20/HCO3- (6,4) car le milieu n'est pas tamponné par la présence de 13CO2. Comme on pouvait s'y attendre, la réaction catalysée par la bactérie S. maltophilia semble donc être régulée par la concentration 20 en substrat le plus abondant (CO2 dans le sens de la réduction et formiate dans le sens opposé).
De plus, il est intéressant de noter que la présence de ces deux pics RMN
seulement, et donc l'absence d'autres pics, confirme que le formiate produit dans ces conditions de réaction n'est pas utilisé par la bactérie pour former de la biomasse ou des enzymes (section B] 1.1). Eliminer le formiate en continu est donc une option envisageable pour favoriser la réaction de réduction 25 du CO2.
e. Influence de l'ajout de PHB au milieu de réaction La réduction enzymatique du CO2 requiert une source de protons et d'électrons.
Les ions ammonium (NH4-') n'étant pas oxydés en ions nitrates ou nitrites, il est donc improbable qu'ils servent de donneur d'électrons et de protons à la réaction de réduction du CO2. La source de

30 protons et d'électrons est très certainement accumulée dans la cellule pendant la phase de culture de la bactérie en tant que réserve énergétique. A l'heure actuelle, deux types de molécules ont été identifiées comme pouvant jouer ce rôle : le Poly-3-HydroxyButyrate (PHB)

31 qui est un polymère naturel et les lipides. En ce qui concerne le PHB, les cellules bactériennes sont en effet capables de dépolymériser le PHB en son monomère (3-Hydroxybutyrate) et d'oxyder ce monomère en acétoacétate de manière à récupérer des électrons et des protons mais aussi une source de carbone (S. Obruca et al., PLoS One, 2016, 11(6):
e0157778).
Pour vérifier le rôle du PHB, celui-ci est ajouté initialement à la suspension bactérienne et la réaction de réduction du CO2 est ensuite opérée dans les conditions de référence (décrites en section B] 1.2). Or, le PHB est un polymère à haut poids moléculaire et insoluble dans l'eau, ce qui rend impossible son transport et son assimilation dans la cellule sous sa forme polymérisée.
Cependant, la bactérie S. maltophilia est capable d'excréter des dépolymérases pouvant dépolymériser le PHB en son monomère 3- HydroxyButyrate assimilable par la bactérie (S.
Wani et al., 3 Biotech, 2016, 6(2): p. 179-184 ; B. Tiwari et al., Bioresource technology, 2016, 216: p. 1102-1105).
Pour déterminer la quantité de PHB à ajouter, les teneurs en PHB
intracellulaire des suspensions bactériennes utilisées pour les essais sont d'abord mesurées par la méthode détaillée en section A] 6. Une teneur massique moyenne en PHB intracellulaire de 1,0 0,1 % w/w est obtenue, correspondant à une concentration en PHB de 30 2 mg/L, ce qui est assez usuel pour les espèces de type S. maltophilia (B. Iqbal et al., Annual Research & Review in Biology, 2016, 9(5): p.1). Une concentration 10 fois plus importante (300 mg/L, soit 0,3 g/L) est alors utilisée pour les essais pour éviter une limitation en PHB.
Deux séries indépendantes de réacteurs fermés sont réalisées, à partir de deux cultures bactériennes différentes. Pour chaque test, une cinétique est conduite en parallèle dans les conditions de référence (c'est-à-dire sans ajout de PHB). Dans tous les essais, l'atmosphère gazeuse des réacteurs est donc composée initialement d'un mélange 13CO2,:air atmosphérique (3 :7 v/v). Pour la première série, le suivi est réalisé sur 20 jours et jusqu'à 40 jours pour la seconde série. Les concentrations en 13C-formiate ainsi que les concentrations en PHB
intracellulaire, sont mesurées au cours des cinétiques.
Le Tableau 3 présente les résultats obtenus initialement puis à 20, 30 et 35 jours. Il est important de signaler que les mesures en PHB pour les cinétiques dans lesquelles le PHB
est ajouté ne sont pas indiquées car elles ne sont pas reproductibles, à cause probablement d'un manque d'homogénéité dans les échantillons prélevés des réacteurs (en effet, le PHB
n'est pas soluble dans l'eau).
Tableau 3. Concentrations en 13C-formiate ([13C-formiate] en nmol/L) et en PHB
intra-cellulaire ([PHBiiitra] en mg/L). NM signifie Non Mesurable et (-) signifie Non Mesuré.

32 Temps (jours) 0 20 30 35 Série 1 [13C-formiate] (limon) 0 103 Référence Sans ajout de PHB [PHBintra] (mg/L) 31 13 [13C-formiate] (umol /L) 0 298 Série 1 Avec ajout PHB [PHBintra] (mg/L) NM NM
Série 2 [13C-formiate] (limon) 0 46 7 7 Référence Sans ajout de PHB [PHBintra] (mg/L) 28 13 12 13 [13C-formiate] (limon) 0 4 249 Série 2 Avec ajout PHB [PHBintra] (mg/L) NM NM NM NM
En ce qui concerne la production en 13C-formiate, la production est beaucoup plus importante quand du PHB est ajouté initialement au milieu de réaction. Par comparaison aux conditions de référence (sans ajout de PHB), la concentration de 13C-formiate produite en présence de PHB
est en effet augmentée par un facteur compris entre 3 et 95 (Tableau 3, séries 1 et 2 respectivement). Ce résultat montre que l'ajout de PHB permet d'améliorer les performances de la réaction de réduction du CO2 et suggère qu'il pourrait être un donneur d'électrons et de protons pour cette réaction.
Une limitation en PHB en conditions de référence pourrait expliquer pourquoi la production de 13C-formiate est améliorée quand le milieu est enrichi en PHB. En effet, en conditions de référence (sans ajout de PHB), la concentration en PHB intracellulaire décroît de 30 2 à 13 1 mg/L quelle que soit la cinétique puis reste constante (Tableau 3, séries 1 et 2). Pour les deux séries, il apparaît donc que près de 20 mg/L de PHB intracellulaire est consommé par les cellules au cours de la réaction. De plus, la limitation en PHB n'est probablement pas le seul paramètre à impacter la production en 13C-formiate. En effet, dans les conditions de référence et pour une même quantité de PHB consommée après 20 jours de réaction, la concentration en 13C-formiate obtenue à 20 jours est près de deux fois plus importante pour la série 1 que pour la série 2 (Tableau 3). Ceci peut être expliqué par le fait que ces séries ont été
réalisées à partir de deux cultures différentes et que l'état physiologique des bactéries n'était pas le même. Or, l'état .. physiologique peut jouer un rôle sur l'activité CO2-réductrice intrinsèque de la bactérie mais aussi sur sa capacité d'adaptation à son nouveau substrat CO2.

33 En conclusion, la quantité de PHB intracellulaire est un facteur limitant pour la réaction de réduction du CO2 et pour la production de 13C-formiate. Le PHB est donc probablement une source d'électrons et de protons pour la réaction de réduction du CO2.
4. Etude d'effets synergiques avec d'autres bactéries La bactérie S. maltophilia a été mise en consortium avec des bactéries susceptibles d'utiliser du formiate pour étudier leurs synergies éventuelles.
Dans un premier temps, un consortium formé par la bactérie S. maltophilia et la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b, obtenu après culture sur méthane (selon le protocole décrit en section A] 1), a été mis en oeuvre dans les conditions de réaction de réduction du CO2 détaillées en section A] 4. Une analyse RMN du milieu de réaction a été
conduite initialement et au bout de 8 jours. Les spectres RMN obtenus sont présentés en Figure 5.
Depuis le début (t =0 jour) et tout au long de la réaction, les pics de résonnance du 13CO2 (O =
124.6 ppm) et de sa forme ionique Ell3CO3- (O = 160.2 ppm) sont jours visibles (Figure 5.a).
Après 8 jours de cinétique, un nouveau pic apparaît (O = 171.0 ppm, Figure 5.b), correspondant à l'empreinte du standard réalisé avec du formiate marqué au 13C. Ceci démontre la production de 13C-formiate dans ces conditions, à une concentration supérieure ou égale à
la limite de détection de formiate marqué par analyse RMN, soit 6 mg.L-1. L'analyse RMN du surnageant n'a révélé aucun 13C-formiate marqué, ce qui signifie que le formiate marqué
produit est intracellulaire, comme observé dans les cinétiques avec S. maltophilia seule.
Aucun autre produit marqué n'a été mis en évidence dans le spectre RMN (Figure 5.b). Des essais conduits sur 8 jours avec la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b seule, dont la pureté a été vérifiée au préalable, ont montré que cette bactérie ne catalyse pas la réduction du CO2. Par ailleurs, cette bactérie est capable de former des spores qui limitent les interactions de la bactérie avec son environnement, ce qui peut expliquer qu'aucune synergie entre S.
maltophilia et M. trichosporium OB3b n'ait été observée. .
Ce résultat suggère donc que la présence de cette bactérie méthanotrophe dans le milieu de réaction ne perturbe pas la réduction du CO2 et la production de formiate par S. maltophilia.
Pour certaines applications, co-cultiver le biocatalyseur S. maltophilia avec la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b peut donc être envisagé pour garantir un bilan carbone optimal car le méthane, d'origine renouvelable, serait la seule source de carbone nécessaire à
la culture.

34 Dans un second temps, un consortium formé par la bactérie S. maltophilia et la bactérie de type bacille à Gram positif Microbacterium oxydans, obtenu après culture sur milieu LB (selon un protocole similaire à celui décrit en section A] 1), a été mis en oeuvre dans les conditions de réaction de réduction du CO2 détaillées en section A] 4. Une analyse RMN du milieu de réaction a été réalisée à 5, 8 et 12 jours (Figure 6).
Tout comme le spectre initial obtenu avec le consortium S. maltophilia/ M.
trichosporium OB3b, seuls les pics des substrats (13CO2 et Ell3CO3-) sont visibles à t = 0 jour.
Après 5 jours de réaction, un pic de formiate apparaît (O = 170.9 ppm, Figure 6.a), correspondant à une concentration supérieure ou égale à 6 mg.L-1. Par comparaison aux cinétiques réalisées en culture pure avec S. maltophilia, le temps de latence apparaît réduit de deux jours au minimum (Figures 1 et 6). De plus, l'analyse RMN du surnageant n'ayant pas révélé la présence de produits marqués, ceci montre donc que le formiate marqué est aussi produit intra cellulairement.
Au bout de 8 jours de réaction, l'amplitude du pic de formiate augmente significativement (par un facteur 10 environ), ce qui signifie que la concentration en formiate produit est plus importante qu'à 5 jours (Figures 6.a et 6.b). Par ailleurs, de nouveaux pics intracellulaires marqués au 13C apparaissent dont un pic (O = 182.2 ppm) pouvant correspondre à
l'empreinte d'un des trois carbones contenus dans le lactate, ainsi qu'une forêt de pics dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 15 - 65 ppm (Figure 6.b).
Après 12 jours de cinétique, l'amplitude du pic RMN relatif au formiate diminue significativement (par un facteur 10 environ) par rapport au pic obtenu à 8 jours (Figure 6.b et 6.c). Le composé qui semble être du lactate est toujours présent, dans des proportions comparables à celles obtenues à 8 jours. Par contre, la forêt de pics visible dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 15 - 65 ppm estplus intense (Figures 6.b et 6.c) et de nouveaux composés marqués au 13C apparaissent aussi dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 125 - 140 ppm (Figure 6.c). Ce phénomène est caractéristique d'une activité
métabolique des cellules. Comme les trois carbones du lactate ne sont pas marqués, il est important de souligner que ce lactate marqué ne peut donc pas provenir d'une réduction directe du 13CO2. Cette production de lactate marqué peut néanmoins résulter d'une fixation de 13CO2 et/ou de 13C-formiate sur des molécules organiques déjà présentes initialement dans les cellules, tout comme les composés marqués relatifs aux nouveaux pics (O = 125 - 140 ppm).

Une explication possible à ces observations est l'établissement d'une synergie entre les deux bactéries en présence. En effet, S. maltophilia peut réduire le CO2 en formiate, puis excréter le formiate produit en dehors de sa cellule pour que M. oxydans puisse l'utiliser et former de nouveaux composés nécessaires à sa subsistance tels que le lactate ou d'autres produits dont les 5 empreintes sont incluses dans les forêts de pics. Néanmoins, l'analyse RMN du surnageant a mis seulement en évidence les signaux des substrats 13CO2 et Hi3CO3- mais pas celui du 13C-formiate. Une hypothèse probable est que la bactérie M. oxydans capte et introduit le formiate produit dans ses cellules dès que le formiate a été excrété par la bactérie S.
maltophilia, ce qui expliquerait la diminution significative du pic de "C-formiate observée à 12 jours (Fig. 6.c).
10 La présence de la bactérie M. oxydans boosterait donc la réduction du CO2 par S. maltophilia et donc ainsi la production de '3C-formiate; ce qui peut aussi expliquer la diminution de la phase de latence pour la production de "C-formiate. Une telle synergie entre S. maltophilia et oxydans est tout à fait réaliste dans ces conditions de réaction (c'est-à-dire sous CO2 pur) car M. oxydans est aérobie facultative (P. Schumann et al., International Journal of Systematic 15 .. and Evolutionary Microbiology, 1999, 49(1): p. 175-177) ; ce qui n'est pas le cas de M.
trichosporium OB3b qui est aérobie stricte (N. Donna et al., Applied biochemistry and microbiology, 2008, 44(2): p. 182-185).
II. Essai de réduction du CO2 en réacteur semi-fermé, assisté par électrolyse 20 1. Dispositif électrochimique et son principe Le polymère Poly-3-Hydroxybutyrate (PHB) est dépolymérisé en 3-Hydroxybutyrate qui est un donneur identifié d'électrons et de protons pour la réaction de réduction du CO2 (section B]
I.3.e]). Néanmoins, le stock intracellulaire de PHB est fini. L'idée est donc fournir sans 25 limitation et de manière continue les électrons et protons requis pour la réaction grâce un dispositif électrolytique in situ et peu cher, de sorte que les performances de la réaction de réduction du CO2 soient améliorées et perdurent dans le temps. Ce dispositif électrochimique vise donc à se substituer aux donneurs intracellulaires de protons et d'électrons. Un réacteur semi-fermé assisté par électrolyse (ou bio-électrolyseur) a ainsi été mis en oeuvre pour 30 intensifier la réaction de réduction du CO2 catalysée par la bactérie S.
maltophilia.
Dans ce dispositif à 3 électrodes (Figure 7 et section A] 5), la cathode polarisée a pour rôle de fournir les électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2 en un composé dont le degré
d'oxydation moyen du carbone est inférieur à celui du carbone dans la molécule CO2 (ce composé est noté CO2,réduit) alors que l'oxydation de l'eau à l'anode permet d'une part de fournir les protons et d'autre part de fermer le circuit électrique; l'électrode de référence permet quant à elle de maintenir une tension de polarisation (Vpolansatton) constante à la cathode.
Classiquement, une électrode de référence Ag/AgC1 est utilisée. Une condition nécessaire pour que ce dispositif fonctionne est que la bactérie S. maltophilia soit électro-active en réduction, c'est-à-dire capable d'échanger des électrons avec la cathode. Or, jusqu'à
présent, la bactérie S. maltophilia n'est connue que pour échanger des électrons en oxydation, c'est-à-dire avec une anode (K. Venkidusamy and M. Megharaj, Frontiers in microbiology, 2016, 7: p.
509-518 ; H.
Xue et al., Sensores and Actuators B: Chemical, 2017, 243: p. 303-310; J. Shen et al., Bioelectrochemistry, 2017, 114: p. 1-7).
Dans un premier temps, la tension de polarisation est choisie sur une base thermodynamique.
Le potentiel d'oxydo-réduction du couple Acétoacétate/3-Hydroxybutyrate étant de -0,53 V vs Ag/AgC1 à pH 6,4 (P.A. Loach, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 1976, 1:
p.122), il faut donc imposer initialement un potentiel plus important (par valeur absolue) que ce potentiel (comme par exemple -0,7 V vs Ag/AgC1) pour que la bactérie ait un intérêt énergétique à utiliser les électrons de l'électrode plutôt que ceux provenant de l'oxydation du 3-Hydroxybutyrate. Néanmoins, si le stock de PHB intracellulaire, source d'énergie et de 3-Hydroxybutyrate, s'épuise en cours de réaction par le métabolisme général de la bactérie, cette contrainte sur le potentiel sera levée et un potentiel plus faible (par valeur absolue) que -0,53 V
vs Ag/AgC1 à pH 6,4 pourra être mis en oeuvre. Par ailleurs, le potentiel retenu est préférentiellement choisi plus bas que ceux des couples oxydant-réducteur co /co ¨2, ¨ 2,rédult impliquant le CO2 en tant qu'oxydant de manière à favoriser la réduction du CO2 à la cathode ;
le choix du potentiel de polarisation permet aussi de favoriser la production d'un produit de réduction CO2,réduit par rapport à d'autres produits de réduction possible du CO2 (parmi le méthane et le formiate par exemple). De manière générale, un potentiel supérieur ou égal à -0,8 V vs Ag/AgC1 (par exemple -0,7 V vs Ag/AgC1) permettra (i) de limiter la réduction du proton en hydrogène (H2) et (ii) d'éviter la réduction des phosphates et ions magnésium présents dans le milieu de réaction. Les potentiels minimum en dessous desquels les réductions du proton et du CO2 se produisent pourront être déterminés précisément par voltamétrie cyclique, dans les conditions de réaction, pour tenir compte à la fois des phénomènes thermodynamique et cinétique (surtensions) ; les surtensions dépendant notamment du matériau choisi pour la cathode.
D'après la littérature, la nature du matériau peut avoir également un impact significatif sur l'établissement du transfert électronique entre la bactérie et l'électrode de travail (M.
Rosenbaum et al., Bioresource Technology, 2010, 102(1): p. 324-333). La composition chimique et la structuration de surface peuvent en effet induire différentes réponses électrochimiques. Parmi les nombreux matériaux d'électrodes disponibles, le graphite est poreux et présente une rugosité de surface. Le graphite est donc susceptible de favoriser le contact entre la bactérie et l'électrode, ce qui pourrait favoriser la conduction électronique (M.
Rosenbaum et al., Bioresource Technology, 2010, 102(1): p. 324-333). Le graphite est donc choisi comme matériau de cathode pour les essais présentés. De plus, une anode en platine est retenue pour ces essais en vue de réduire les surtensions à l'anode et ne pas limiter les phénomènes cathodiques. D'autres matériaux d'anode peuvent aussi être envisagés, tel que l'acier. Une surface d'anode plus grande que la surface de la cathode est aussi privilégiée pour ne pas limiter les réactions de réduction à la cathode.
.. Par ailleurs, un bullage continu de CO2 pur est aussi mis en oeuvre pour saturer la suspension en CO2 et désoxygéner la solution de sorte à (1) éviter la compétition avec la voie métabolique aérobie (où le 02 deviendrait accepteur d'électrons à la place du CO2) et (2) préserver l'activité
catalytique de réduction de l'enzyme réductrice du CO2 (en effet, l'oxygène semble avoir un effet inhibiteur sur cette enzyme, section B] I.3.b). Afin de garantir un transfert de masse gaz-.. liquide optimal, l'apport en CO2 est réalisé par un distributeur poreux à
gaz et un volume de liquide (permettant un fort VVM (Volume de gaz par Volume de liquide par Minute) est mis en oeuvre. Un rapport surface de cathode/volume de liquide élevé est également souhaitable pour concentrer le produit formé par réduction du CO2 à la cathode ; un rapport surface de cathode/volume de liquide de l'ordre de 10 m2/m3 est souhaitable.
2. Un premier exemple de bio-électrolyseur alimenté par du CO2 pur La Figure 8 montre l'évolution du courant mesuré au cours du temps pour le premier bio-électrolyseur implémenté avec la bactérie S. maltophilia pour la réduction du CO2. Ce courant est exprimé en densité de courant (c'est-à-dire en A/m2) ; la densité de courant correspond au courant mesuré (en A) rapporté à la surface de cathode projetée (en m2). Le test est conduit avec une tension de polarisation de -0,7 V vs Ag/AgCl.
Le courant initial nul (0,0 0,01 A/m2) correspond à la ligne de base (Fig.
8.a), ce qui est confirmé par la voltamétrie cyclique réalisée en début de cinétique (données non montrées).
Ceci montre donc qu'initialement, aucun élément présent dans la suspension bactérienne ne s'oxyde ou ne se réduit.
Puis, un petit courant de réduction est observé (jusqu'à -0,2 A/m2 à 1,2 jours). Cependant, ce courant revient à la ligne de base avant qu'un courant de réduction significatif apparaisse à
partir du deuxième jour (Fig. 8.a) ; le profil de ce courant suit une allure comparable à celle d'une cinétique de croissance microbienne (Fig. 8.a). Il n'y a cependant pas de croissance microbienne visible dans la suspension car la densité optique (D0600) de la suspension bactérienne mesurée initialement est de 5,6 alors qu'elle est de 2,2 à 5,7 jours (soit 136 h).
Néanmoins, ceci n'exclut pas la croissance d'un biofilm à la surface de la cathode ; la bactérie S. maltophilia est en effet capable de former rapidement des bio films sur différents types de surface (O. Madhi et al., Current protocols in microbiology, 2014, 32: Unit-6F.1.1-6F.1.6).
Afin de vérifier expérimentalement la dépendance de ce courant de réduction avec le CO2, des barbotages d'un gaz noble inerte (argon) ont été réalisés dans le but de chasser tout ou partie du CO2 dissous. Un premier bullage d'argon à un débit de 10 mL.min-1 est réalisé pendant 3 h et a pour conséquence de réduire quasi-instantanément le courant de réduction par un facteur 2 .. environ, de -1,4 à -0,8 A/m2 (Fig. 8.a et 8.b). Puis, tout débit de gaz est coupé et le courant de réduction demeure quasi-constant, aux alentours de -0,8 A/m2 (Fig. 8.c). La constance du courant de réduction peut s'expliquer par la présence de CO2 résiduel dans la suspension bactérienne ; en effet, le CO2 est très soluble dans l'eau et le débit d'argon imposé était probablement trop faible pour chasser tout le CO2 dissous.
.. Lorsque qu'un faible débit de CO2 est réappliqué (5 mL.min-1), alors le courant de réduction augmente à nouveau, jusqu'à retrouver sa valeur stable initiale, soit -1,4 A/m2 Fig. 8.a et 8.d).
Puis, l'application d'un fort débit d'argon (100 mL.min-1) pendant 3 h a pour conséquence de faire disparaître tout courant de réduction puisque le courant remonte à 0,0 A/m2 (Fig. 8.e). Ces conditions sont donc suffisantes pour chasser tout le CO2 dissous dans la suspension et confirment que ni la réduction des protons ni celle des phosphates ne se produit à ce potentiel de polarisation (-0,7 V vs Ag/AgC1). Enfin, le courant ré-augmente quand un flux de CO2 est réalisé à nouveau (à 25 mL.min-1) et atteint une valeur significative de -0,3 A/m2 (Fig. 8Ø
L'ensemble de ces éléments montre que le courant de réduction est bien lié à
la disponibilité du CO2 dans le milieu de réaction et que le CO2 est l'élément qui se réduit à la cathode.
La réaction qui se produit à la cathode est donc :
CO2 + ft + 2e- ¨> HC00- (Equation 7) Cette réaction de réduction résulte de l'activité enzymatique de la cellule qui ne requiert plus de donneurs d'électrons et de protons intracellulaires.
Des voltamétries cycliques (CVs) sont aussi réalisées pendant l'expérience. En particulier, une CV réalisée à 5,7 jours confirme l'adéquation du courant mesuré avec le potentiel de polarisation imposé (donnée non montrée). Cette voltamétrie montre également un palier de diffusion pour le courant de réduction allant de -0,2 V à -0,8 V vs Ag/AgC1, ce qui suggère qu'une tension de polarisation plus faible par valeur absolue (par exemple -0,2 V vs Ag/AgC1) peut être suffisante pour obtenir le même courant de réduction.
En conclusion, cette expérience démontre la capacité de ce dispositif bio-électrolytique à se substituer aux donneurs d'électrons et de protons intracellulaires nécessaires à la réduction du CO2 catalysée par la bactérie S. maltophilia.
3. Etude de reproductibilité
En plus de l'essai présenté précédemment, quatre autres essais indépendants de bio-électrolyseur selon le mode décrit par l'Invention ont permis de confirmer, par des alternances de bullage CO2 pur/argon/CO2 pur, que le CO2 est bien réduit à la cathode et qu'il génère un courant significatif de réduction CO2-dépendant (données non montrées). Au cours de ces essais, deux potentiels de polarisation ont été testés : -0,7 V et -0,8 V vs Ag/AgC1 et des densités de courant de réduction du CO2 comprises entre -0,5 et -1,5 A/m2 ont été
obtenues.
Par ailleurs, ces essais ont validé le fait que le courant de réduction du CO2 se stabilise après quelques jours de bullage sous CO2 et qu'après le bullage d'argon, un bullage de CO2 permet au courant de revenir à sa valeur stable (atteinte avant bullage d'argon).
Ceci met en évidence la robustesse de ce système de bio-électrolyse.
4. Un exemple de bio-électrolyseur alimenté par un mélange CO2/CH4 Un test complémentaire en bio-électrolyseur a permis de démontrer que la présence de méthane (CH4) dans le mélange gazeux qui contient le CO2 et qui alimente le bio-électrolyseur n'a pas d'influence sur l'activité CO2-réductrice de la bactérie S. maltophilia à la cathode (données non montrées). En effet, un bullage de CO2/CH4 (1:1 ou 1 :2 v/v)_permet de maintenir un courant de réduction équivalent à celui obtenu sous CO2 pur dans les mêmes conditions. Ce résultat est particulièrement intéressant dans le cadre du traitement du biogaz, contenant du CH4 et du CO2 en fortes teneurs.
L'analyse GC-TCD des gaz d'entrée et de sortie du bio-électrolyseur a permis de mesurer un flux volumique expérimental de CO2 réduit de 1,3 mL CO2/min pour un réacteur d'un volume de 60 mL (ce qui équivaut donc à un flux de 1,9 m3 CO2/j pour un réacteur d'un volume de 60 L). Ce flux est près de 60 fois supérieur au flux volumique théorique de CO2 réduit (Fco2,voi) calculable sur la base du courant de réduction du CO2 obtenu (par la loi de Faraday). Ceci signifie donc que les bactéries adhérées à la cathode ne sont pas les seules à
participer à la réduction du CO2 et que les bactéries planctoniques (en suspension dans le liquide du bio-électrolyseur) y contribuent aussi. Une éventuelle fixation de ce CO2 par les bactéries planctoniques n'est pas non plus à exclure.
Enfin, il est important de remarquer que le flux volumique expérimental de CO2 réduit en bio-électrolyseur (soit 1,3 mL CO2/min) est 130 fois plus important que celui obtenu en réacteur 5 fermé (soit 0,6 mL CO2/j = 0,01 mL CO2/min pour une concentration initiale en bactéries de 2 g de cellules sèches/L, tableau 1). Cette augmentation significative dans le bio-électrolyseur peut se justifier par (1) un transfert de masse en CO2 amélioré grâce à l'apport gazeux au sein de la suspension et (2) une assistance électrochimique qui permet à la bactérie de disposer d'une source d'électrons et de protons inépuisable.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d'une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du CO2 dans des conditions permettant la réduction du CO2.

2. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 1, selon lequel l'étape de mise en contact entre la phase liquide et le CO2 est réalisée dans un réacteur fermé ou semi-fermé ou continu.

3. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 2, dans lequel la phase gazeuse contenant du CO2 est injectée au centre du réacteur, par exemple par un distributeur à gaz.

4. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 2, selon lequel l'air présent dans un espace de tête du réacteur est supprimé, et la phase gazeuse contenant du CO2 est injectée dans ledit espace de tête du réacteur, de manière à placer la réaction de réduction du CO2 sous une atmosphère constituée uniquement de ladite phase gazeuse.

5. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 1, selon lequel l'étape de mise en contact entre la phase liquide et la phase gazeuse contenant du CO2 cst réalisée en réacteur semi-fermé ou continu, dans lequel la phase gazeuse contenant du CO2 est apportée en continu, préférentiellement par bullage, à l'intérieur du réacteur.

6. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel on produit du formiate et/ou du méthane (CH4) par réduction du CO2.

7. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications 2 à
6, selon lequel l'étape de mise en contact entre la phase liquide et la phase gazeuse contenant du CO2 est réalisée en présence d'un donneur d'électrons et de protons, intra ou extracellulaire.

8. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications 2 à
7, selon lequel le réacteur contient une assistance électrochimique, préférentiellement de type bio-électrolyse.

9. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, comprenant une phase préliminaire de co-culture de Sienotrophomonas FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) maltophilia avec au moins une bactérie méthanotrophe avant l'étape de mise en contact de la phase liquide avec la phase gazeuse.

10. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase liquide contient également au moins un micro-organisme apte à utiliser le formiate pour produire des composés organiques d'intérêt, tels que du méthane, du lactate ou des alcools, notamment en Cl/C5.

11. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse est un biogaz ou des fumées industrielles et/ou agricoles riches en CO2.

12. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse comprend au moins 30% en volume de CO2 par rapport au volume total de la phase gazeuse.

13. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse comprend entre 30% et 100% en volume de CO2 par rapport au volume total de la phase gazeuse.

14. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la phase liquide comprend au moins 3 g de cellules sèches/L de Stenotrophomonas mallophilia, au moins 10 g de cellules sèchen, au moins 20 g de cellules sèchee, 30 g de cellules sèches/L, 40 g de cellules sechen, 50 g de cellules sèchee, 60 g de cellules sèches/L, 70 g de cellules sechen, 80 g de cellules sèches/1,, 90 g de cellules seches/L, 100 g de cellules seches/L.

15. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel on ajoute de l'ammonium et/ou ammoniaque dans la phase liquide et/ou l'ammoniac dans la phase gazeuse, notamment entre 5 mmol/L et 100 rnmol/L, préférentiellement entre 20 et 30 mmol/L.

16. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, selon lequel on ajoute du PHB dans la phase liquide, préférentiellement entre 30 mg/L et 3 g/L, notamment environ 0.3 g/L.

17. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l'une des revendications précédentes, dans lequel du formiate est produit, ledit procédé comprenant une étape additionnelle consistant à récupérer le formiate produit sous forme de formiate et/ou d'acide formique et/ou des composés organiques d'intérêt issus de l'utilisation du formiate par un micro-organisme apte à utiliser ledit formiate pour produire des composés organiques d'intérêt.
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91)

18. Procédé de traitement d'un biogaz ou de fumées industrielles riches en CO2 et/ou agricoles riches en CO/ comprenant une étape de réduction du CO2 par réduction biologique comprenant une étape selon laquelle on met en contact lesdits biogaz et/ou fumées avec une phase liquide contenant la bactérie Sienotrophornonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du CO2.

19. Procédé de production de formiate à partir de CO2, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du CO2 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du CO2 en formiate.

20. Procédé de production de méthane à partir de CO2, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du CO2 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du CO2 en méthane.21. Utilisation d'une bactérie Stenotrophomonas maltophilia pour la production de formiate et/ou de méthane par réduction de CO2, FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91)