EP3788157A1 - Procédé de valorisation du co2 par réduction biologique - Google Patents

Procédé de valorisation du co2 par réduction biologique

Info

Publication number
EP3788157A1
EP3788157A1 EP19744759.2A EP19744759A EP3788157A1 EP 3788157 A1 EP3788157 A1 EP 3788157A1 EP 19744759 A EP19744759 A EP 19744759A EP 3788157 A1 EP3788157 A1 EP 3788157A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
formate
reduction
bacterium
reactor
liquid phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19744759.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laurence Soussan
Azariel RUIZ-VALENCIA
Djahida BENMEZIANE
José SANCHEZ-MARCANO
Marie-Pierre Belleville
Delphine PAOLUCCI-JEANJEAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier I
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier I
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Montpellier I, Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3788157A1 publication Critical patent/EP3788157A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the invention relates to a microbiological process for reducing C0 2 to formate and / or methane, catalyzed by Stenotrophomonas maltophilia.
  • this CO2 reduction process can be intensified by the addition of electrons and exogenous protons. This contribution can be achieved by the implementation of the bacterium in an electrolytic device (bio-electrolyser).
  • the process according to the invention can advantageously be used to treat industrial or agricultural fumes rich in CO2 or biogas containing mainly a mixture of methane and CO2, in order to reduce the CO2 content of said fumes or biogas.
  • Carbon dioxide (CO2) accounts for more than 75% of global greenhouse gas (GHG) emissions, with annual anthropogenic emissions of around 25 to 35 Gt. These emissions come mainly from heavy industries and industrial production. such as cement plants, aluminum and steel production sites, coal or oil-fired power plants, etc., as well as road transport.
  • GOG global greenhouse gas
  • CO2 as raw material at the industrial level is currently considered as one of the possible solutions to reduce the emissions of this gas to the atmosphere.
  • Biological processes of CO2 activation have also been developed. These biological processes are particularly interesting because they consume little energy and generally avoid reagents and / or by-products that could have a negative impact on the environment. To date, however, only processes implementing Photosynthetic microorganisms such as microalgae or cyanobacteria have reached an industrial scale. The main products of the recovery of C0 2 by these processes are lipids or sugars which can then be transformed into biodiesel or biofuel. Open basin technology has allowed scale-up in the valuation of C0 2 by micro-algae.
  • cyanobacteria have been genetically modified to directly produce alcohols from C0 2 .
  • the carbon assimilation pathway of the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 has been directed to the production of 2,3-butanediol from CO 2 and glucose in the dark.
  • Such an advance overcomes the limitations of the need for sunshine. Nevertheless, the need to add glucose makes this bioprocess unattractive from an economic point of view.
  • the biological stability of modified cyanobacteria is still insufficient to allow its use on an industrial scale.
  • formate dehydrogenase (FDH) enzymes extracted from microorganisms have been purified and modified to improve their catalysis performance, and used to reduce CO 2 to formate (Alissandratos et al., 2013, Appl Environ Microbiol., 79 (2), 741-4, Spinner et al., 2012, Catal, Sci., Technol., 2, 19-28).
  • FDH formate dehydrogenase
  • nitrogenase enzymes have also been reported as capable of catalyzing the reduction of C0 2 to formate, carbon monoxide, acetate or methane, in addition to their N 2 nitrogen reduction activity (Khadka et al. 2016, Inorg Chem., 55, 8321-8330, Zheng et al., 2018, Nature Microbiology, 3, 281-286). Nevertheless, the addition of an expensive cofactor is necessary to perform the bioconversion reaction, making these alternatives incompatible with industrial application.
  • Electrochemically assisted reactors also called bio-electrolyzers which are inoculated with electro-active litho-autotrophic bacteria constitute another biological pathway for the conversion of C0 2 .
  • Various products such as formate, acetate, C3-C5 alcohols, polyhydroxybutyrate (PHB) or biomass have been obtained.
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • two configurations have been implemented: (1) the electrons necessary for the reduction of C0 2 are directly supplied by the polarized cathode and the protons come from the oxidation of the water at the anode or (2) the electrons of the cathode are transported to the bacteria by electrochemical mediators (such as dihydrogen or formate) that can be added to the medium or generated in situ at the polarized cathode.
  • electrochemical mediators such as dihydrogen or formate
  • the bacterium Stenotrophomonas maltophilia known for its ability to fix CO2 by its carboxylase enzymes, is also able to reduce CO2 into formate and / or methane.
  • Methane is particularly interesting because it is a fuel whose combustion produces few atmospheric pollutants (of the NO x or SO x type ) and releases less CO2 per unit of energy (nearly 30% less) than the combustion of energy. fossil such as oil or coal.
  • Methane is also a precursor to synthesis gases (H2 / CO / CO2 mixtures) which are currently used for the industrial production of methanol, ammonia and hydrocarbons ( departments Chimique de Lrance, 2013).
  • Formic acid or methanoic acid, which is the acid form of formate, is a naturally occurring aliphatic carboxylic acid, which is in the form of a colorless liquid with a persistent odor.
  • Formic acid has many applications in the leather and textile industry, in the composition of dyes and treatment products, insecticides, solvents, fumigants, anti-mold products, etc., but also in perfumery and the food industry as an aromatic molecule.
  • formic acid can be used as fuel in fuel cells (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182 (1), 124-132) or to store hydrogen which can then be released by dehydrogenation of formic acid (Lellay et al., 2008, Angewandte Chemie, 120 (21), 4030-4032).
  • formic acid as an energy carrier suggests that the need for formic acid will increase in the coming years.
  • the formate can be used in secondary bioprocesses to obtain energy sources such as methane (Conrad, Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments, FEMS Microbiology Ecology, 28 (3 ) (1999) 193-202) or alcohols (Li et al., Integrated Electromicrobial Conversion of CO2 to higher alcohols, Science, 335 (2012) 1596; Pen et al., An innovative membrane bioreactor for methane bio hydroxylation. Bioresource Technology, 174 (2014) 42-52).
  • energy sources such as methane (Conrad, Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments, FEMS Microbiology Ecology, 28 (3 ) (1999) 193-202) or alcohols (Li et al., Integrated Electromicrobial Conversion of CO2 to higher alcohols, Science, 335 (2012) 1596; Pen et al., An innovative membrane bioreactor for methane bio hydroxylation. Bioresource
  • This new pathway of reduction by S. maltophilia has many advantages over existing bioprocesses. Indeed, this biocatalyst is a native cell. Compared to enzymes, it is therefore not necessary to carry out protein extractions or to add cofactors under stoichiometric conditions, since the cells already have their own stock. This cell does not require genetic modifications either, which are poorly supported on an industrial scale. Moreover, no contribution of dihydrogen (H 2 ) or photons (light) is necessary for the reduction reaction of C0 2 because the cell has an intracellular stock of proton and electron donor, which it accumulates during the pre-culture phase (for example on acetate derived from methane oxidation or on a mixture of peptone and yeast extract).
  • H 2 dihydrogen
  • photons light
  • the subject of the invention is therefore a process for the recovery of C0 2 by biological reduction comprising a step of contacting a liquid phase containing the bacterium Stenotrophomonas maltophilia with a gas phase containing C0 2 under conditions permitting the reduction of said C0 2, especially in formate and / or methane.
  • the contacting step can be carried out at 30 ° C., +/- 10 ° C., in particular at 30 ° C. +/- 5 ° C., under atmospheric pressure or slight overpressure (up to 0.5 bar). ).
  • the liquid phase advantageously comprises mineral salts useful for the maintenance or survival of the bacteria during the CO 2 reduction reaction.
  • mineral salts useful for the maintenance or survival of the bacteria during the CO 2 reduction reaction.
  • the liquid phase contains water and phosphates and / or MgCl 2 , etc.
  • the step of bringing the aqueous liquid phase into contact with the CO 2 is carried out in a closed reactor or in a semi-closed reactor.
  • the subject of the invention is also the intensification of said process for the biological reduction of C0 2 .
  • the intracellular store of proton and electron donor being limited, the inventors have demonstrated that it is possible to provide exogenous or extracellular protons and electrons, that is to say other than intracellular protons and electrons.
  • Stenotrophomonas maltophilia so that the C0 2 reduction reaction persists over time.
  • a donor of electrons and protons such as a biopolymer and in particular polyhydroxybutyrate (PHB) and / or a electrochemical assistance type bioelectrolysis.
  • Stenotrophomonas maltophilia is capable to use the electrons of a weakly polarized cathode and the protons resulting from the oxidation of the water at the anode.
  • the energy provided to the bio-electrolysis is of green origin, solar in particular, which makes this process autonomous from the energy point of view.
  • the subject of the invention is also a process for intensifying the reduction of CO 2 by the bacterium Stenotrophomonas maltophilia comprising a step according to which exogenous PHB or an electrochemical assistance (bioelectrolysis) is added to the reactor.
  • identified products of the CO 2 reduction are formate and / or methane. It is also possible to couple the use of Stenotrophomonas maltophilia to another microorganism, in particular a microorganism able to use the formate contained in the liquid to produce other molecules of interest, such as methane, lactate or alcohols, especially C1-C5 (such as methanol, isobutanol or methyl-1-butanol).
  • the invention also relates to the use of a bacterium Stenotrophomonas maltophilia for the production of formate and / or methane and / or more generally any product whose carbon oxidation number is lower than that of C0 2, by reduction. of C0 2 .
  • the subject of the invention is also a process for the treatment of a biogas or of industrial fumes rich in C0 2 or of agricultural fumes rich in C0 2, comprising a step of reduction of C0 2 by biological reduction, comprising a step according to which contacting said biogas or industrial fumes or agricultural fumes with a liquid phase containing the bacterium Stenotrophomonas maltophilia under conditions allowing the reduction of C0 2 .
  • the invention also relates to a process for producing formate from CO 2 , comprising a step according to which a CO 2 -containing gas phase is brought into contact with a liquid phase containing the bacterium Stenotrophomonas maltophilia under conditions allowing the reduction C0 2 in formate.
  • the subject of the invention is also a process for producing methane from CO 2 , comprising a stage in which a CO 2 -containing gas phase is brought into contact with a liquid phase containing the bacterium Stenotrophomonas maltophilia under conditions allowing the reduction C0 2 in methane.
  • FIG. 3 Reduction Tests of 13 C0 2 in a closed reactor with a suspension of S. maltophilia prepared in a reaction medium enriched with ammonium (ABSA); the other reaction parameters being unchanged compared to the reference conditions.
  • a 13 CO 2 reduction test is also conducted simultaneously under reference conditions.
  • Figure 7 Scheme and principle of an embodiment of a semi-closed reactor, assisted by electrolysis (or bio-electrolyser) for the CO 2 reduction reaction according to the method of the invention.
  • Figure 8 Evolution of the cathodic current density measured over time in a bioelectrolyser inoculated with Stenotrophomonas maltophilia, according to one embodiment of the method of the invention.
  • the bias voltage is set at -0.7 V vs. Ag / AgCl.
  • Six phases are distinguished, corresponding to the various operating conditions used: (a) bubbling of CO 2 (25 mL.min 1 ); (b) Arg argon bubbling (10 mL.min 1 ); (c) stopping argon bubbling; (d) bubbling CO 2 (5 mL.min 1 ); (e) argon bubbling (100 mL.min 1 ) and (f) bubbling of CO2 (25 mL.min 1 ).
  • the symbol (#) indicates the polarization interrupts for the acquisition of cyclic voltammetries carried out at 10 mV-s 1 .
  • Stenotrophomonas maltophilia is capable of producing formate and methane (CH 4 ) by direct reduction of CO2 under mild operating conditions.
  • Stenotrophomonas maltophilia is able to produce formate and methane (CH 4 ) using CO2 as the only carbon source, without adding cofactors, organic molecules or dihydrogen. (3 ⁇ 4) or expensive growth factors.
  • CO2 reduction is understood to mean any reaction that makes it possible to pass the carbon oxidation number of CO 2 to a lower degree than in CO 2.
  • the bacterium Stenotrophomonas maltophilia is a Gram-negative aerobic bacterium of the family Pseudomonadaceae. It has so far never been used for industrial purposes. However, the inventors have discovered that this bacterium is particularly interesting for the production of molecules of interest from CO2.
  • this bacterium has the capacity to produce formate and / or methane from CO2 as the only carbon source, after having been advantageously put beforehand in culture under autotrophic conditions, that is to say in aerobic pure culture on a usual Lysogeny Broth Miller type organic medium, or in co-culture with a methanotrophic bacterium, such as Methylosinus trichosporium OB3b, on a mineral medium placed in contact with a methane / air mixture (1: lv / v).
  • the co-cultivation route is particularly advantageous because it ensures an optimal carbon balance; indeed, methane, of renewable origin, is the only source of carbon required for cultivation.
  • the liquid phase comprises at least 3 g of dry cells / L of the bacterium Stenotrophomonas maltophilia, at least 10 g of dry cells / L, at least 20 g of dry cells / L,
  • Dry cells / L 40 g dry cells / L, 50 g dry cells / L, 60 g dry cells / L, 70 g dry cells / L,
  • the cultures are carried out at 30 ° C., +/- 10 ° C. and at atmospheric pressure or slight overpressure (up to 0.5 bar).
  • the gas phase containing CO 2 brought into contact with the liquid reaction medium containing the bacterium Stenotrophomonas maltophilia may be atmospheric air.
  • the gaseous phase may otherwise be pure C0 2 or a gaseous mixture, such as a CCh-air mixture, CO2-N2, CO2-O2, CO2-CH4, CO2-H2, CO2-N2-H2, CO2-CH4- H2, C0 2 -CH 4 -air, CO2-CH4-N2 or CO2-CH4-O2.
  • the gas phase contains or consists of biogas.
  • the gas phase contains or consists of industrial or agricultural fumes rich in CO2.
  • the gaseous phase comprises at least 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% of CO2.
  • the gaseous phase comprises at least 30% of CO2. It is also possible to use a gaseous phase comprising 100% CO2. In one embodiment, the gas phase comprises between 30 and 100% of CO2.
  • the reaction medium contains 20 mM phosphate buffer at pH 7.0 ⁇ 0.1 and 5.0 mM MgCl 2 .
  • the reaction medium contains 1.3 mM KCl, 28.0 mM NH 4 Cl, 29.8 mM NaHCO 3 and 5.0 mM NaH 2 PO 4 .
  • Those skilled in the art are able to choose the appropriate reaction medium for the reduction of CO2 to formate by Stenotrophomonas maltophilia.
  • concentrations of CO2 to the desired yields.
  • the CO2 contribution can be achieved by any known means and in particular by membrane contactors (Pen et al., 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), a porous gas distribution sinter (Kim et al. 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15 (3), 476-480, Duan et al., Bioresource Technology, 102 (15), 7349-7353) or a simple gas-liquid contact in a closed reactor (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52).
  • the CO2 recovery process is implemented in a closed reactor ("batch”).
  • the process can be implemented in a semi-closed reactor (“fed-batch”).
  • the gaseous phase containing the CO2 can be injected into the headspace of the closed reactor.
  • the gaseous phase can be injected at the center of the closed or semi-closed reactor, at the heart of the liquid phase containing the bacterium Stenotrophomonas maltophilia, by means in particular of a gas distributor.
  • the gaseous phase containing CO2 is provided continuously, preferably by bubbling, inside the reactor.
  • the pH in the reaction medium that is to say the liquid phase, is maintained between 5 and 8, preferably at pH 6.5, +/- 0.5.
  • the CO2 dissolved in the water forms a buffer sufficient to allow the maintenance of the pH, without external regulation.
  • the temperature in the reaction medium is preferably maintained between 20 ° C and 50 ° C, preferably between 25 ° C and 35 ° C, and more preferably at 30 ° C, +/- 1.
  • the reaction step it is possible, prior to the reaction step, that is to say prior to bringing the bacterium into contact with the CO2 to produce the formate and / or the methane, to place the bacterium in a culture medium under conditions of temperature and pH favorable to its growth.
  • culture medium is meant the medium in which the bacteria are grown, to produce bacterial biomass.
  • the culture medium conventionally comprises the chemical elements strictly necessary for bacterial growth in a form that can be used by the bacteria, namely a source of carbon, mineral salts and water.
  • Standard media are available commercially, described in the scientific literature or in the catalogs of suppliers of bacterial strains. Those skilled in the art know what are the minimum required components in the absence of which Stenotrophomonas maltophilia can not grow, and can easily grow such a bacterium.
  • the general conditions of culture allowing the growth or maintenance of Stenotrophomonas maltophilia, are easily defined by those skilled in the art.
  • This prior culture step may, for example, enable the bacterium to accumulate proton and electron donors required for the reaction to reduce CO2 to formate and / or methane according to equations (1) and (2) and / or (1) and (3):
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • the PHB is previously produced by methanotrophic bacteria from methane, especially renewable (Pieja et al., Distribution and selection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria, Microbial Ecology, 62 (3 ) (2011) 564-573). Such an embodiment is particularly advantageous from an economic point of view.
  • exogenous PHB is added to the reactor.
  • exogenous PHB in the liquid phase is added, in particular approximately 0.3 g / L.
  • an electrochemical assistance device housed inside the reactor and in contact with the bacterium, provides electrons and protons to the bacteria.
  • the electrochemical assistance may especially be of the bio-electrolysis type (FIG. 7).
  • the energy used to operate the bioelectrolyser is solar energy.
  • the cathode may be stainless steel, graphite or felt.
  • the anode can be platinum, stainless steel, graphite or felt.
  • the cathode / reactor volume ratio is between 1 and 100 m 2 / m 3 , preferably about 10 m 2 / m 3 .
  • active surface is meant the geometrical surface exposed to the anode.
  • the projected geometric projected anode / projected geometric cathode surface ratio is preferably between 1 and 10, more preferably approximately equal to 2.
  • the range of polarization potential can for example go from -1.5 Y to 0 Y vs Ag / AgCl, especially -1 Y at -0.5 V, for example -0.7 V or -0.8 V.
  • the liquid phase comprises, in addition to the bacteria Stenotrophomonas maltophilia, another micro-organism able to use the formate resulting from the reduction of CO 2 to form more complex metabolites, such as methane, lactate or alcohols.
  • the inventors have shown that such a consortium can lead to a synergy capable of intensifying the flow of CO2 reduced by the bacteria Stenotrophomonas maltophilia.
  • All or part of the process according to the invention can be implemented on a laboratory scale or on an industrial scale, that is to say on fermenters or reactors of average capacity (approximately 0.1 L at 100 L) or large capacity (100 L to several hundred m 3 ).
  • the invention also relates to the intensification of the CO2 reduction process by the bacterium Stenotrophomonas maltophilia by means of addition of exogenous PHB or electrochemical assistance (bioelectrolysis) as described above.
  • the CO2 reduction reaction by the bacterium Stenotrophomonas maltophilia can be promoted by continuously removing the product formate in the liquid phase of the reactor in the form of formate and / or formic acid.
  • Those skilled in the art are aware of the possible techniques for continuously removing the product formate.
  • the formate-enriched liquid and inorganic reaction medium may be used as recovered in a secondary process or bioprocess to enhance the product formate into higher value molecules. added.
  • the process for producing formate according to the invention comprises the steps of:
  • the formate-enriched mineral reaction medium may be used as recovered in a secondary process for upgrading the product formate to higher value-added molecules.
  • the product formate is recovered in the form of formic acid from the reaction medium.
  • the step of recovering formic acid from the reaction medium is carried out by electrodialysis or by liquid-liquid extraction with a co-solvent.
  • These recovery devices make it possible to continuously recover the formic acid and thus avoid the possible inhibition of the bacteria by an excess of product, while obtaining a formic acid free of impurities (such as the salts of the reaction medium).
  • a continuous supply of reaction medium can be carried out in the bioreactor.
  • a bipolar electrodialysis module is advantageously coupled with a microfiltration module for continuously separating and recovering the formate produced in its acid form (formic acid).
  • bipolar electrodialysis can be performed on a reaction medium without biocatalysts, obtained continuously after separating the bacteria from the medium by a tangential microfiltration module.
  • Bipolar electrodialysis involves combining a bipolar membrane to acidify formate into formic acid and monopolar membranes to extract salts from the reaction medium.
  • the formate and / or formic acid obtained from such a microbiological process can be advantageously used in any industry that may need it, and in particular in the leather and textile industry, in perfumery , in the food industry, etc.
  • the formate and / or formic acid obtained from such a microbiological process is used in a secondary biological process (in situ or ex situ) to obtain organic compounds of higher added value, and in particular methane, lactate or C 1 -C 5 alcohols.
  • a secondary biological process in situ or ex situ
  • the compounds obtained are alcohols, a stripping process carried out by a bubbling of gas containing CO 2 can be implemented to continuously recover the alcohols produced.
  • Stenotrophomonas maltophilia it is possible, prior to the reaction step, to co-cultivate Stenotrophomonas maltophilia with one or more other methanotrophic bacterial species. It is thus possible to produce organic nutrients from methane, said nutrients being then used by Stenotrophomonas maltophilia as a source of carbon and energy.
  • the inventors have demonstrated that the co-culture under a methane / air mixture and on a mineral medium of Stenotrophomonas maltophilia with a bacterium methanotroph, such as Methylosinus trichosporium OB3b, allows the production of acetate usable by Stenotrophomonas maltophilia for its growth.
  • the inventors have also shown that the presence of such a methanotrophic bacterium in the liquid phase during the subsequent reaction step does not interfere with the reduction of CO 2 or the production of formate and / or methane by Stenotrophomonas maltophilia.
  • the reaction step that is to say putting Stenotrophomonas maltophilia into contact with the CO 2 -containing gas phase
  • the bacterium Microbacterium oxydans is added to Stenotrophomonas maltophilia.
  • hydrogenotrophic methanogenic archaea are added to obtain methane.
  • the bacterium Ralstonia eutropha H16 (LH74D) is added to Stenotrophomonas maltophilia, in particular to obtain C4-C5 alcohols.
  • a methanotrophic bacterium and an inhibitor of methanol dehydrogenase are added to Stenotrophomonas maltophilia in order to obtain methanol.
  • the reaction step for reducing CO2 to formate by Stenotrophomonas maltophilia is carried out in a first reactor, and the product formate is recovered to feed a second reactor in which the microorganism (s) capable of using the formate for produce molecules with higher added value.
  • the second reactor can be fed directly with the reaction medium of the first reactor, containing the product formate, or on the contrary contain a medium to which is added the formate extracted from the reaction medium of the first reactor.
  • the invention also relates to the use of Stenotrophomonas maltophilia, for the production of formate and / or methane and / or any other product whose carbon oxidation number is lower than that of C0 2 by CO2 reduction as exposed above.
  • Stenotrophomonas maltophilia makes it possible to consume significant amounts of CO2 and thus to answer the environmental problems related to the accumulation of CO2 in the atmosphere while valuing the CO2 consumed.
  • Other aspects and advantages of the present invention will appear in the following experimental part, which must be regarded as an illustration, in no way limiting the extent of the protection sought.
  • the source of carbon and energy used is methane, which is converted by the methanotrophic bacterium into organic nutrients assimilated by S. maltophilia bacteria for its growth.
  • acetate at a concentration of the order of 35 mg.L 1 , is measured in the culture reactor at the end of growth.
  • the culture medium is a mineral medium enriched in copper and iron.
  • the base medium is composed of: 1.06 g / L KH 2 PO 4 , 4.34 g / L Na 2 HPO 4 12H 2 O, 1.7 g / L NaNO 3, 0.34 g / LK 2 SO 4 and 0.074 g / L MgSO 4 -7H 2 0.
  • the pH of this basal medium is adjusted to 7.0 ⁇ 0.1 with 0.1 M NaOH, 0.1 M or HCl, and then autoclaved.
  • the mineral, copper and iron solutions are prepared independently and sterilized by filtration on 0.2 ⁇ m pore size cellulose acetate filters before being added to the base medium.
  • the final mineral concentrations are: 0.57 mg / L ZnSO 4 7H 2 0, 0.446 mg / L MnSO 4 H 2 O, 0.124 mg / L H3BO3, 0.096 mg / L Na 2 MoO 4 2H 2 0, 0.096 mg / L LKI and 7.00 mg / L CaCl 2 2H 2 0.
  • the final concentrations of copper and iron are: 0.798 mg / L CuSO 4 and 11.20 mg / L LeSO 4 7H 2 0.
  • the cultures are conducted in sealed closed reactors, incubated at 30 ° C. and under constant rotation (160 rpm).
  • the headspace of the reactors is filled with a mixture of air and methane (1: / v / v); the volume of gas is three times greater than that of the liquid.
  • Inoculation percentages of S. maltophilia can range from 10 to 50% v / v.
  • the cultures are stopped when the optical density at 600 nm (DCboo nm ) is constant. Two successive cultures are conducted before implementing the consortium for the C0 2 reduction reaction.
  • the bacterium S. maltophilia was first isolated from a consortium formed with the bacterium M. trichosporium OB3b (obtained according to the protocol described above). Isolation was achieved by successive transplantation of S. maltophilia colonies onto Lysogeny Broth (LB) Miller medium agars (Sigma Aldrich, France). The purity and identification of the isolated bacterium is confirmed by biochemical analyzes (see point 2 below). The strain is preserved on the one hand on LB agars stored at 4 ° C., and on the other hand, in the freezer at -20 ° C. in its native liquid culture medium to which glycerol (20% v / v) is added.
  • the culture reactor is a closed reactor with a permeable plug which is dedicated to sterile cultures.
  • a LB liquid culture medium is inoculated with the bacterium S. maltophilia, 5% v / v from a frozen aliquot or with all the colonies of an agar, then incubated for 24 hours incubated at 30 ° C. and under constant rotation (160 rpm). The cultures are stopped when the stationary phase starts (DCLoo nm is constant).
  • the Stenotrophomonas maltophilia isolate from co-culture was first characterized with Gram stain and mass spectrometry.
  • Gram staining has shown that the isolate is a Gram-negative bacillus.
  • the mass spectrometry analysis confirmed that the isolate is pure and identify the bacterium S. maltophilia which is indeed a Gram-negative bacillus.
  • a score above 1.90 indicates reliable identification and that the score obtained for S. maltophilia is 2.18.
  • RNA sequencing 16S of the isolate confirmed that the bacterium identified is S tenotrophomonas maltophilia.
  • the cells are collected by centrifugation at 4 ° C and 4000 g for 20 min. They are then resuspended in a 20 mM phosphate buffer at pH 7.0 and then centrifuged again under the same conditions as above and the bacterial pellet is recovered.
  • a reaction medium containing 20 mM phosphate buffer pH 7.0 and 5 mM MgCk was used to resuspend the bacterial pellet and obtain a DCLoo nm of (i) 10.3 ⁇ 0.5 (ie 3.1 ⁇ 0 , 2 g of dry cell / L) for closed reactor tests and (ii) 6.6 ⁇ 0.3 (ie 2.0 ⁇ 0.1 g of dry cell / L) for electrolysis assisted assays.
  • a sample of the prepared suspension is always stored at -20 ° C with glycerol (20% v / v) for subsequent biochemical analyzes. The rest of the suspension is used immediately for CO2 reduction tests.
  • the reaction medium does not contain organic nutrients for the growth of the biocatalyst, so it is used as a resting cell.
  • the bacterial suspension obtained in the previous step is distributed in sealed 60 mL closed reactors by adding 6 mL of suspension to each reactor.
  • the headspace is filled with a gaseous mixture containing 13 CC> 2 which is sterilized by filtration on Teflon filter pore diameter of 0.2 mih.
  • 13 C0 2 atmospheric air (3: 7 v / v)
  • 13 CC> 2 N2 (3: 7 v / v)
  • 13 CC> 2 pure For each experiment, a set of several reactors is prepared under identical conditions and incubated at 30 ° C. with constant stirring (160 rpm).
  • a glass reactor is used. Its useful liquid volume is 60 mL and its head space represents about 40% of its total volume.
  • a lid is screwed on the reactor and the sealing of the junction lid-reactor is guaranteed by a seal.
  • This cover has an inlet port for the gas supply ( 12 C0 2 100%) which is carried out at the heart of the solution by a gas distributor, a port for the gas outlet and 3 ports for the positioning of the electrodes .
  • the reactor is thermostated at 30 ° C. with constant stirring (300 rpm).
  • the electrochemical system is a conventional 3-electrode device (working electrode, reference electrode and counter-electrode).
  • the working electrode (or cathode) is a 2.5 cm x 2.5 cm and 0.5 cm thick (Goodfellow) surface graphite coupon, electrically connected to a titanium rod (Goodfellow).
  • the graphite coupon is washed for 1 h in a solution of 1 N HCl to dissolve any adsorbed species and then in a solution of 1 N NaOH to neutralize the acidity and finally rinsed with ultrapure sterile water before being left overnight in 1 L of sterile ultrapure water to flush out any soda residues included in the pores of the graphite.
  • the titanium rod is cleaned with acetone and then autoclaved.
  • the ratio of the active surface of the cathode to the volume of the reactor is therefore 10.4 m 2 / m 3 ; where the active surface is defined as the geometric surface being exposed to the counter electrode.
  • the counter-electrode (or anode) is a platinum grid, previously cleaned and disinfected by flame.
  • the ratio of the projected geometric surface of the anode to that of the cathode is about 1.5 to not limit the cathode phenomena.
  • the potentials are monitored and expressed with respect to an Ag / AgCl reference electrode (potential of 0.240 V / ESH, Radiometer analytical).
  • the bias potential of the working electrode is applied with a single-channel potentiostat (Ametek VersaSTAT3) and the current is recorded every 900 s.
  • the chronoamperometry (CA) is periodically stopped to acquire cyclic voltammetry (CVs) between -1.2 and 1.0 V vs. Ag / AgCl at a scanning rate of between 1 and 10 mV.s 1 .
  • a cyclic voltammetry (or cyclic voltammetry) consists of carrying out a potential sweep at the working electrode and measuring the current flowing in the electrochemical system. This technique allows: (i) to check the coherence of the CA with the CV, (ii) to acquire kinetic information about the system and (iii) highlighting redox compounds in the suspension.
  • the reactor is filled with a bacterial suspension of S. maltophilia in reaction medium (prepared according to 2.c), in which a continuous bubbling of 100% CO 2 or a CO 2 2 : CH gas mixture is carried out. 4 (1: 1 or 1: 2 v / v) is produced at a flow rate of between 2 and 25 ml.min 1 . Then a polarization ranging from -0.7 V to -1.0 V vs Ag / AgCl is applied. Polarization is started at the same time as chronoamperometry. In parallel, a control reactor without electrodes (and therefore without polarization) is implemented in the same manner as the electrochemical reactor.
  • Samples are taken over time, under microbiological hood, to measure the optical density at 600 nm (DCLoo nm ) and the pH of the liquid medium; the pH was found to be constant and equal to 6.4 ⁇ 0.2 (corresponding to pKa of C0 2, H 2 0 / HC0 3 _).
  • the gas composition is analyzed at the reactor inlet and outlet by Gas Chromatography coupled to a katharometer (GC-TCD) to determine the experimental flow of reduced CO 2 .
  • GC-TCD Gas Chromatography coupled to a katharometer
  • the complete reaction medium (with bacteria) and the supernatant (without bacteria) are analyzed.
  • the complete reaction medium is either directly analyzed or frozen at -20 ° C as soon as collected for further analysis.
  • the supernatant is obtained by centrifugation of the complete medium just taken; the centrifugation is carried out for 10 min at 10,000 g and 10 ° C and the supernatant is collected at the end of the centrifugation for immediate analysis or freezing at -20 ° C.
  • the pellet is stored at -20 ° C for later analysis.
  • 500 pL sample liquid (reaction carried out with 13 C02, 2.d) are introduced into a NMR tube of 5 mm in diameter with 50 pL of D 2 0 and then analyzed by NMR Bruker Avance III - 500MHz - CryoProbe Helium for 4 hours.
  • Different standards (labeled and unlabelled sodium formate, sodium acetate, methanol, ethanol, formaldehyde, acetaldehyde, sodium lactate, glycerol, isobutanol, sodium succinate, sodium fumarate, sodium pyruvate, sodium oxaloacetate) prepared in The reaction medium was previously analyzed by NMR to obtain the fingerprints of these molecules.
  • the detection threshold of molecules labeled with 13 C is 6 mg.L 1 .
  • NMR analyzes can only detect 13 C isotopes which have a relative abundance of 1.1% compared to their 12 C isotope in nature [W. Mook and P. Grootes, International Journal of Mass Spectrometry and Physics, 1973, 12 (3): p. 273-298] Therefore, a concentration of unlabeled agent at 13 C of about 600 mg L 1 is required to highlight these compounds.
  • Gas chromatography (Clarus 580, Perkin Elmer) is conducted with a capillary column (30m x 0.25mm ID, 8 ⁇ m film thickness, Rt-Q-Bond Plot, Restek), coupled to mass spectrometry (Clarus SQ -8-MS, Perkin Elmer) equipped with a selective quadrupole mass detector on electronic impact (El) operated at 70 eV.
  • a sample changer (Turbomatrix Headspace 16S, Perkin Elmer) is used for the injection of head spaces obtained after heating at 100 ° C. of the liquid samples.
  • the samples are taken directly into the reactor with a gas-tight syringe and manually injected into the GC-MS.
  • Helium is used as a carrier gas at a flow rate of 1.5 ml / min.
  • the assay vial is then placed in the autosampler and heated at 100 ° C for 15 minutes to complete the esterification reaction.
  • the temperature of the injector is set at 200 ° C. and the split at 1: 16.
  • a temperature gradient is carried out at 40 to 150 ° C. at a rate of 10 ° C./min.
  • the ions detected, in single-ion recording (SIR) mode correspond to one of the mass / charge ratios m! z 60 for 12 C methyl formate and 41 for acetonitrile.
  • the headspace of the closed reactor is analyzed to determine the gaseous species, marked 13 C or not, present over time.
  • 250 ⁇ l of headspace were taken from the reactor incubated at 30 ° C using a gas-tight syringe and 50 ⁇ l was injected into the GC-MS.
  • the temperature of the injector is set at 200 ° C and the split at 1:16. In the oven, a temperature gradient is achieved from 100 to 150 ° C at a rate of 10 ° C / min.
  • the ions detected are m! z 28 (N 2 ), m / z 44 (C0 2 ), m / z 45 ( 13 C0 2 ), m / z 16
  • the NH 4 + ions are assayed in the supernatants.
  • the analysis is carried out by injecting 25 ⁇ l of sample into a Dionex ICS-1000 chromatographic device (Thermo Scientifc) equipped with an IonPAc AS19 capillary column (0.4 ⁇ 250 mm).
  • the elution program is as follows: 10 mM KOH (from 0 to 10 min), then 10-45 mM KOH (from 10 to 30 min).
  • Gas chromatography (Clarus 580, Perkin Elmer) is conducted with a PE-Q column (Perkin Elmer, 30m) in series with a PE-MOLESIEVE molecular sieve column (Perkin Elmer, 30 m) coupled to a thermal conductivity detector, again called katharometer (Perkin Elmer).
  • a 10-way loop valve is used to charge and inject gaseous samples.
  • a minimum of 20 mL of gas to be analyzed is sent into the loop valve and 20 ⁇ L of sample is injected into the columns.
  • Helium is the carrier gas at a flow rate of 10 mL.min 1 .
  • a temperature gradient is formed from 40 ° C to l20 ° C at a rate of l0 C.min o _1.
  • a calibration is performed to determine the C0 2 . Determination of the% by mass of intracellular PHB
  • the bacterial pellets stored at -20 ° C. are thawed at room temperature and then digested for 3 hours at 100 ° C. in 2 ml of methanol containing 3% of concentrated sulfuric acid and 0.1% of benzoic acid supplemented with 2 ml of chloroform. Regrowth tests on LB medium showed that the bacteria contained in the pellets and treated by this acid digestion were totally deactivated.
  • 1 mL of demineralized water is added to induce phase separation.
  • the aqueous phase is then removed and 2 ⁇ l of organic phase are injected into the GC-MS.
  • the analyzes are conducted with the same GC-MS equipment as that used for formate analyzes.
  • a DB-1 (Agilent J & W) column is used for separation.
  • the vector gas is helium at a flow rate of 32 mL.min 1 .
  • the oven temperature is programmed at 80 ° C for 1 min, up to 120 ° C at a rate of 10 ° C / min, then the temperature is increased to 270 ° C at a rate of 45 ° C / min. .
  • the temperature of the injector is set at 200 ° C and split at 30 mL / min.
  • the mass of PHB measured in the sample by the method described above is divided by the dry mass of bacteria in the presence that is known from DCLoo measurement.
  • 13 C-labeled C0 2 is used.
  • the purpose of labeling C0 2 is to highlight labeled products from 13 C0 2 and to distinguish them from those resulting from a simple cell release.
  • the NMR technique is used to analyze the bacterial suspension and its supernatant while the GC-MS technique is used to characterize the reactor headspace.
  • this marking makes it possible to observe the NMR and GC-MS fingerprints of all the products having one or more 13 C which may result from (i) the reduction of 13 C0 2 and / or (ii) of the fixation. 13 C0 2 by the cell.
  • the optical density at 600 nm (DCboonm) is measured over time to follow the evolution of the bacterial mass concentration (in dry gels / L). Counts of viable cells are also made to access the bacterial cell concentration (in CFU / mL) and the pH is measured during the reaction. The ammonium ion (NH 4 + ) content in the reaction medium is monitored to study the influence of the presence of ammonium on the performance of the C0 2 reduction bioprocess.
  • FIG. 1 shows the NMR spectra obtained on the complete bacterial suspension (a) initially (start of reaction), (b) after 8 days of reaction and (c) after 35 days of reaction.
  • 13 CH 4 labeled methane
  • 13 CH 4 is a compound with a single carbon in a lower oxidation state than that of 13 C0 2.
  • This 13 CH 4 is therefore derived from the reduction of 13 C0 2 , either directly ( 13 C0 2 ® 13 CH 4 ) or indirectly ( 13 C0 2 ® 13 C-formiate ® 13 CH 4 ).
  • Methane is a particularly interesting product because it can be easily recovered by stripping and used as fuel.
  • the bacterium S. maltophilia is able to reduce C0 2 to formate and methane.
  • reduction of the tests of 13 C0 2 are reproduced in similar conditions, considered as reference conditions.
  • the concentration of 13 C-formate is this time determined by GC-MS; in addition, the optical density at 600 nm (DCLoo) and the pH are also monitored.
  • the reference conditions are defined as follows: initial bacterial concentration of 3.1 ⁇ 0.2 g of dry cell / L, initial gaseous atmosphere composed of a gas mixture 13 C0 2 : atmospheric air (3: 7 v / v ), an aqueous reaction medium composed of 20 mM phosphates and 5 mM MgCh. Three independent kinetics are conducted in parallel under these reference conditions. b. Following-up of biomass concentration and pH
  • the mass concentration of bacteria is monitored by measuring DCLoo.
  • the correlation giving the DCLoo as a function of the mass concentration of bacteria is given in Section A1].
  • a decrease in the biomass concentration is observed (data not shown).
  • the most likely reason to explain this phenomenon is cell lysis. Indeed, a lack of natural nutrients and an atmosphere rich in C0 2 exposes bacterial cells to stressful conditions, which are likely to lead to death and therefore cell lysis of part of the bacterial population. Throughout the kinetics, however, no test shows a total lysis.
  • cell mass concentration initially of 3.1 ⁇ 0.2 g of Chapter.L cell 1, drop over the first 10 days and then stabilize at an average value of 0.5 ⁇ 0.1 g of dry eye / L. This means that only part of the biocatalyst suspension lyses on the first 10 days of kinetics and the mass concentration remains stable.
  • 13 C-formate is produced in significant amount.
  • GC-MS analysis revealed that 13 C-formate is found in complete suspensions (i.e. in the presence of bacteria) but not in the respective supernatants. This shows that the production of this 13 C-formate is carried out by the honest bacteria remaining in the reaction medium and not by free enzymes derived from cell lysis.
  • the 13 C- formate appear after 8 to 10 days, which period may correspond to a latent phase during which the bacterium adapts to its new substrate 13 C0 2.
  • the fact that a high concentration of bacteria close to 10 5 CFU / mL) is still viable at the end of the kinetics confirms the presence of bacteria maintaining metabolic activity.
  • Table 1 details the AC and At values for each of the three kinetics presented above, as well as the 13 C-formate (Pfomüate) and the 13 C0 2 reduced fluxes (F 2 , vol). Table 1. 13 C-formate (Pfomüate) production and 13 C0 2 reduced flux (Fco 2 , voi) obtained in a closed reactor
  • Table 2 summarizes the results obtained. Table 2. Concentrations in initial biomass [Xo] and final biomass [X f ] (in g of dry cell / L), loss of biomass D [C] at the end of reaction (in%) and final concentrations accumulated in 13 C formate resulting from the reduction of 13 CO 2 (in mmol / L and mg / L).
  • Table 2 shows that the 13 C-formate concentration is nearly 20 times higher when the initial concentration of bacteria is doubled. Contrary to what could be expected, the final accumulated 13 C-formate concentration is therefore not correlated with the amounts of cells initially introduced. On the other hand, it is interesting to note that by doubling the initial amount of bacteria, the amount of final lysed cells is also doubled (Table 2, difference between [Xo] and [X f ]). It is therefore possible that the compounds released into the reaction medium by cell lysis can be used by the surviving cells to produce a larger amount of reducing intracellular enzyme C0 2, which would lead to an increase in production 13 C-formate.
  • Tests with different gas mixtures are carried out to study the influence of the presence of oxygen (0 2 ) and nitrogen (N 2 ) on the CO 2 reduction reaction.
  • the 13 C-formate concentration is monitored.
  • MREA contains 2 mmol / L of KCl, 28 mmol / L of NH 4 Cl, 30 mmol / L of NaHCCL and 5 mmol / L of NaH 2 PO 4 .
  • concentrations of 13 C-formate and ammonium ions (NH 4 + ) are monitored throughout the reaction ( Figure 3).
  • ammonium ions When ammonium ions are initially present in large quantities, nearly half of the initial amount is consumed over the first 8 days, then the concentration seems to stabilize (Fig. 3. A). Under reference conditions, ammonium ions appear in suspension (Fig. 3. A). This appearance in ammonium ions can be related to two productions: the reduction of N 2 by the nitrogenase and the deamination of the released proteins in the medium after cell lysis. In addition, these NH 4 + ions are not oxidized to nitrates or nitrites, which implies that these NH 4 + ions can serve as a source of assimilable nitrogen for the synthesis of enzymes by the surviving bacteria.
  • bacterial cells are indeed capable of depolymerizing PHB in its monomer (3-hydroxybutyrate) and oxidizing this monomer to acetoacetate so as to recover electrons and protons but also a source of carbon ( S. Obruca et al., PLoS One, 2016, 11 (6): e0157778).
  • the PHB is a high molecular weight polymer and insoluble in water, which makes it impossible for its transport and assimilation in the cell in its polymerized form.
  • the bacterium S. maltophilia is capable of excreting depolymerases that can depolymerize the PHB in its monomer 3-HydroxyButyrate assimilated by the bacterium (S. Wani et al., 3 Biotech, 2016, 6 (2): p. B. Tiwari et al., Bioresource Technology, 2016, 216: 1102-1105).
  • the intracellular PHB contents of the bacterial suspensions used for the tests are first measured by the method detailed in section A] 6.
  • An average mass content of intracellular PHB of 1.0 ⁇ 0, 1% w / w is obtained, corresponding to a PHB concentration of 30 ⁇ 2 mg / L, which is quite common for S. maltophilia species (B. Iqbal et al., Annual Research & Review in Biology, 2016, 9 (5): p.1).
  • a concentration 10 times higher (300 mg / L, ie 0.3 g / L) is then used for the tests to avoid a limitation in PHB.
  • Table 3 presents the results obtained initially then at 20, 30 and 35 days. It is important to note that PHB measurements for kinetics in which PHB is added are not indicated because they are not reproducible, probably due to a lack of homogeneity in the samples taken from the reactors (indeed, PHB is not soluble in water).
  • the bacterium S. maltophilia has been consortiumed with bacteria likely to use formate to study their possible synergies.
  • M. oxydans bacterium captures and introduces the formate produced in its cells as soon as the formate has been excreted by the bacterium S. maltophilia, which would explain the significant decrease in the 13 C-formate peak observed at 12 days. (Fig. 6.c).
  • the presence of M. oxydans bacteria would therefore boost the reduction of CO2 by S. maltophilia and thus the production of 13 C-formate; This may also explain the decrease in the lag phase for 13 C-formate production.
  • Such synergy between S. maltophilia and M. oxydans is quite realistic under these reaction conditions (i.e., under pure CO2) because M.
  • oxydans is facultatively aerobic (Schumann et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1999, 49 (1): 175-177); which is not the case of M. trichosporium OB3b which is aerobic strict (N. Dorina et al., Applied biochemistry and microbiology, 2008, 44 (2): pp. 182-185).
  • PHB Poly-3-Hydroxybutyrate
  • 3-hydroxybutyrate which is an identified electron and proton donor for the CO2 reduction reaction (Section B] 1.3 e]).
  • the intracellular stock of PHB is finite.
  • the idea is therefore to provide without limitation and continuously the electrons and protons required for the reaction with an in situ electrolyte device and inexpensive, so that the performance of the CO2 reduction reaction are improved and persist over time.
  • This electrochemical device is therefore intended to replace intracellular donors of protons and electrons.
  • a semi-closed reactor assisted by electrolysis (or bio-electrolyser) was thus implemented to intensify the reaction of reduction of CO2 catalyzed by the bacterium S. maltophilia.
  • the role of the polarized cathode is to supply the electrons required for the CO2 reduction reaction in a compound whose average carbon oxidation state is lower than that of the compound.
  • this compound is noted as CO2, reduced
  • the reference electrode allows for its part to maintain a bias voltage (V po iarisation) constant at the cathode.
  • V po iarisation bias voltage
  • Ag / AgCl reference electrode is used.
  • maltophilia is electro-active in reduction, that is to say able to exchange electrons with the cathode. So far, however, the bacterium S. maltophilia is known only to exchange electrons in oxidation, that is to say with an anode (K. Venkidusamy and M. Megharaj, Frontiers in microbiology, 2016, 7 : pp. 509-518, H. Xue et al., Sensores and Actuators B: Chemical, 2017, 243: pp. 303-310, J. Shen et al., Bioelectrochemistry, 2017, 114: pp. 1-7). .
  • the bias voltage is chosen on a thermodynamic basis.
  • the oxy-reduction potential of the Acetoacetate / 3-hydroxybutyrate pair being -0.53 V vs. Ag / AgCl at pH 6.4 (PA Loach, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 1976, 1: p l22), it is therefore necessary initially to impose a greater potential (by absolute value) than this potential (as for example -0.7 V vs Ag / AgCl) so that the bacterium has an energetic interest to use the electrons of the rather than those from oxidation of 3-hydroxybutyrate.
  • the retained potential is preferably chosen lower than those of the CO2 / CO2 reducing-oxidant couples, reduced involving CO2 as an oxidant so as to promote the reduction of CO2 at the cathode; the choice of polarization potential also allows to promote the production of a CO2 reduction product, reduced compared to other possible CO2 reduction products (among methane and formate for example).
  • a potential greater than or equal to -0.8 V vs Ag / AgCl (for example -0.7 V vs Ag / AgCl) will allow (i) to limit the reduction of the proton in hydrogen (FL) and (ii) ) to avoid the reduction of phosphates and magnesium ions present in the reaction medium.
  • the minimum potentials below which the proton and CO2 reductions occur can be determined precisely by cyclic voltammetry, under the reaction conditions, to take into account both thermodynamic and kinetic (surge) phenomena; overvoltages depending in particular on the material chosen for the cathode.
  • a platinum anode is retained for these tests in order to reduce the overvoltages at the anode and not to limit the cathodic phenomena.
  • Other anode materials may also be contemplated, such as steel.
  • An anode surface larger than the surface of the cathode is also preferred so as not to limit the reduction reactions at the cathode.
  • C0 2 is supplied by a porous gas distributor and a volume of liquid (allowing a high WM (Volume of gas per volume of liquid per minute) is set.
  • a high cathode surface / liquid volume ratio is also desirable for concentrating the product formed by CO 2 reduction at the cathode, a cathode surface / liquid volume ratio of the order of 10 m 2 / m 3 is desirable.
  • Figure 8 shows the evolution of the current measured over time for the first biocerolyser implemented with the bacterium S. maltophilia for the reduction of C0 2 .
  • This current is expressed in current density (i.e., in A / m 2 ); the current density corresponds to the measured current (in A) relative to the projected cathode area (in m 2 ).
  • the test is conducted with a bias voltage of -0.7 V vs Ag / AgCl.
  • the initial zero current (0.0 ⁇ 0.01 A / m 2 ) corresponds to the baseline (Fig 8.a), which is confirmed by the cyclic voltammetry performed at the beginning of kinetics (data not shown). This shows that initially, no element present in the bacterial suspension oxidizes or is reduced.
  • This reduction reaction results from the enzymatic activity of the cell which no longer requires electron donors and intracellular protons.
  • Cyclic voltammetry (CVs) are also performed during the experiment.
  • a CV realized at 5.7 days confirms the adequacy of the measured current with the imposed polarization potential (data not shown).
  • This voltammetry also shows a diffusion plateau for the reduction current ranging from -0.2 Y to -0.8 V vs Ag / AgCl, which suggests that a lower polarization voltage per absolute value (for example -0.2 V vs Ag / AgCl) may be sufficient to obtain the same reduction current.
  • this experiment demonstrates the ability of this bio-electrolytic device to substitute for the intracellular electron and proton donors required for the reduction of C0 2 catalyzed by S. maltophilia bacteria.
  • the GC-TCD analysis of the input and output gases of the bio-electrolyser made it possible to measure a reduced experimental volume flow of CO2 of 1.3 mL CCh / min for a reactor with a volume of 60 mL (which is equivalent to a flow of 1.9 m 3 CCh / d for a reactor with a volume of 60 L).
  • This flux is nearly 60 times higher than the theoretical reduced CO2 flow (Fco2, voi) computable on the basis of the CO2 reduction current obtained (by Faraday's law).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

L'invention a trait à un procédé de valorisation du C02 par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d'une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du CO2 dans des conditions permettant la production de formiate et/ou méthane à partir dudit CO2. Le procédé selon l'invention peut notamment être mis en œuvre dans un réacteur fermé ou un réacteur semi fermé ou un réacteur continu, assisté par voie électrochimique ou non.

Description

Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique
L’invention a trait à un procédé microbiologique de réduction du C02 en formiate et/ou méthane, catalysé par Stenotrophomonas maltophilia. Selon l’invention, ce procédé de réduction du CO2 peut être intensifié par l’apport d’électrons et de protons exogènes. Cet apport peut être réalisé par la mise en œuvre de la bactérie dans un dispositif électrolytique (bio- électrolyseur). Le procédé selon l’invention peut avantageusement être mis en œuvre pour traiter des fumées industrielles ou agricoles riches en CO2 ou du biogaz contenant principalement un mélange de méthane et de CO2, afin de réduire la teneur en CO2 desdits fumées ou biogaz.
Arrière-plan technologique
Le dioxyde de carbone (CO2) compte pour plus de 75 % des émissions globales de gaz à effet de serre (GES), avec des émissions anthropogéniques annuelles d’environ 25 à 35 Gt. Ces émissions proviennent surtout des industries lourdes et de production d’énergie, telles que les cimenteries, sites de production d’aluminium et d’acier, centrale à charbon ou à fuel, etc., ainsi que du transport routier.
L’utilisation du CO2 comme matière première au niveau industriel est actuellement envisagée comme une des solutions possibles pour diminuer les émissions de ce gaz à l’atmosphère.
Dans ce cadre, la conversion directe du CO2 anthropique en carburants alternatifs (tels que le méthane, les alcools C1-C5 ou l'acide formique) est devenue un sujet de recherche majeur depuis cinquante ans. Cependant, la molécule de CO2 a une forte stabilité chimique et l’activation du CO2 nécessite donc des températures et pressions relativement élevées ainsi que des catalyseurs efficaces et sélectifs.
Des catalyseurs homogènes ou hétérogènes ont été développés, qui catalysent des réactions d'hydrogénation, de photosynthèse artificielle ou de réduction électrochimique pour obtenir des carburants à partir de CO2. Néanmoins, ces voies de conversion chimique présentent encore de faibles rendement, durabilité et/ou sélectivité.
Des processus biologiques d'activation du CO2 ont également été développés. Ces processus biologiques sont particulièrement intéressants car ils consomment peu d’énergie et ils évitent en général les réactifs et/ou les sous-produits qui pourraient avoir un impact négatif sur l'environnement. A ce jour, cependant, seuls des procédés mettant en œuvre des microorganismes photosynthétiques de type microalgues ou cyanobactéries ont atteint une échelle industrielle. Les produits principaux de la valorisation du C02 par ces procédés sont des lipides ou des sucres qui peuvent ensuite être transformés en biodiesel ou biocarburant. La technologie en bassin ouvert a permis le changement d’échelle dans la valorisation du C02 par des micro-algues. Cependant, le développement de ce procédé reste encore limité à cause (i) du besoin d’ensoleillement qui implique de faibles profondeurs de photo -bioréacteurs (et donc de grandes surfaces), (ii) des problèmes de transfert de masse en nutriments, (iii) d’un besoin important en eau, (iv) de la nécessité de maintenir un pH basique (8-10) et (v) de la nécessité de récolter les microorganismes pour leur extraire les composés d’intérêt. Toutes ces contraintes se traduisent par de faibles productivités et des coûts relativement élevés.
A l’échelle laboratoire, des cyanobactéries ont été modifiées génétiquement pour produire directement des alcools à partir de C02. Très récemment, la voie métabolique d’assimilation du carbone de la cyanobactérie Synechococcus elongatus PCC 7942 a été dirigée vers la production de 2,3-butanediol à partir de C02 et de glucose dans l'obscurité. Une telle avancée permet de surmonter les limitations liées au besoin d’ensoleillement. Néanmoins, le besoin d’ajouter du glucose rend ce bioprocédé inintéressant du point de vue économique. De plus, la stabilité biologique des cyanobactéries modifiées est encore insuffisante pour permettre son utilisation à l’échelle industrielle.
Une voie de synthèse enzymatique du formiate (forme basique de l’acide formique) à partir de dioxyde de carbone (C02) a également été étudiée. Plus précisément, des enzymes de type formiate déshydrogénase (FDH) extraites de microorganismes, ont été purifiées et modifiées pour améliorer leurs performances de catalyse, et utilisées pour réduire le C02 en formiate (Alissandratos et al. 2013, Appl Environ Microbiol., 79(2), 741-4 ; Spinner et al., 2012 Catal. Sci. Technol., 2, 19-28). Récemment, les enzymes de type nitrogénase ont également été reportées comme capable de catalyser la réduction du C02 en formiate, en monoxyde carbone, en acétate ou en méthane, en plus de leur activité de réduction de l’azote N2 (Khadka et al. 2016, Inorg. Chem., 55, 8321-8330; Zheng et al. 2018, Nature Microbiology, 3, 281-286). Néanmoins, l’addition d’un cofacteur onéreux est nécessaire pour réaliser la réaction de bioconversion, rendant ces alternatives incompatibles avec une application industrielle.
Des réacteurs assistés électrochimiquement (dits aussi bio-électrolyseurs) qui sont inoculés avec des bactéries litho-autotrophes électro-actives constituent une autre voie biologique pour la conversion du C02. Divers produits tels que du formiate, de l’acétate, des alcools C3-C5, du polyhydroxybutyrate (PHB) ou de la biomasse ont pu être obtenus. Dans ces systèmes, deux configurations ont été implémentées : (1) les électrons nécessaires à la réduction du C02 sont directement fournis par la cathode polarisée et les protons proviennent quant à eux de l'oxydation de l’eau à l’anode ou (2) les électrons de la cathode sont transportés jusqu’aux bactéries par des médiateurs électrochimiques (tels que le dihydrogène ou le formiate) qui peuvent être ajoutés au milieu ou générés in situ à la cathode polarisée. Cependant, jusqu’à maintenant, la faisabilité de la configuration (1) n’a été démontrée que dans le cas où un donneur d’électrons organique est également présent dans le milieu, ce qui diminue l’attractivité économique de ce système. Par ailleurs, l’utilisation ou la production in situ de formiate ou d’un vecteur énergétique propre et coûteux tel que le dihydrogène (¾) reste problématique dans la configuration (2).
Résumé de l’invention
En travaillant sur la valorisation du C02, les inventeurs ont découvert que la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, connue pour sa capacité à fixer le CO2 par ses enzymes carboxylases, est également apte à réduire le CO2 en formiate et/ou méthane. Le méthane est particulièrement intéressant car il est un combustible dont la combustion produit peu de polluants atmosphériques (de type NOx ou SOx) et libère moins de CO2 par unité d’énergie (près de 30% moins) que la combustion d’énergie fossile telle que le pétrole ou le charbon. Le méthane est aussi un précurseur aux gaz de synthèse (mélanges H2/CO/CO2) qui servent actuellement à la production industrielle de méthanol, d’ammoniac et d’hydrocarbures (Société Chimique de Lrance, 2013). L’acide formique, ou acide méthanoïque, qui est la forme acide du formiate, est quant à lui un acide carboxylique aliphatique d’origine naturelle, qui se présente sous la forme d’un liquide incolore à odeur persistante. L’acide formique trouve de nombreuses applications dans l’industrie du cuir et du textile, dans la composition des teintures et produits de traitement, les insecticides, les solvants, les fumigènes, les produits de traitement anti moisissures, etc., mais également dans la parfumerie et l’industrie agro-alimentaire en tant que molécule aromatique. Récemment, il a été montré que l’acide formique peut être utilisé comme carburant dans des piles à combustibles (Yu et al., 2008, Journal of Power Sources, 182(1), 124-132) ou pour stocker de l’hydrogène qui peut ensuite être libéré par déshydrogénation de l’acide formique (Lellay et al. 2008, Angewandte Chemie, 120(21), 4030-4032). La possibilité d’utiliser l’acide formique en tant que vecteur énergétique laisse présager que les besoins en acide formique vont s’accroître dans les prochaines années. En outre, le formiate peut être utilisé dans des bioprocédés secondaires pour obtenir des sources d’énergie telles que du méthane (Conrad, Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sédiments, FEMS Microbiology Ecology, 28(3) (1999) 193-202) ou des alcools (Li et al., Integrated electromicrobial conversion of CO2 to higher alcohols, Science, 335 (2012) 1596 ; Pen et al., An innovative membrane bioreactor for methane bio hydroxylation. Bioresource Technology, 174 (2014) 42-52).
Cette nouvelle voie de réduction par S. maltophilia présente de nombreux atouts par rapport aux bioprocédés existants. En effet, ce biocatalyseur est une cellule native. Par comparaison à des enzymes, il n’est donc pas nécessaire de procéder à des extractions protéiques ni d’ajouter des cofacteurs en conditions stoechiométriques, car les cellules en possèdent déjà leur propre stock. Cette cellule ne requiert pas non plus de modifications génétiques, qui sont mal supportées à l’échelle industrielle. Par ailleurs, aucun apport en dihydrogène (H2) ou photons (lumière) n’est nécessaire à la réaction de réduction du C02 car la cellule possède un stock intracellulaire de donneur de protons et d’électrons, qu’elle accumule lors de la phase de pré- culture (par exemple sur de l’acétate issu de l’oxydation méthane ou sur un mélange de peptone et d’extrait de levure).
L’invention a donc pour objet un procédé de valorisation du C02 par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d’une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du C02 dans des conditions permettant la réduction dudit C02, notamment en formiate et/ou méthane.
Notamment, l’étape de mise en contact peut être réalisée à 30°C, +/- l0°C, notamment à 30°C +/- 5°C, sous pression atmosphérique ou légère surpression (jusqu’à 0,5 bars).
La phase liquide comprend avantageusement des sels minéraux utiles à la maintenance ou survie des bactéries lors de la réaction de réduction du C02. L’homme du métier saura adapter la composition en sels minéraux. Par exemple, la phase liquide contient de l’eau et des phosphates et/ou du MgCl2, etc.
Avantageusement, l’étape de mise en contact entre la phase liquide aqueuse et le C02 est réalisée dans un réacteur fermé, ou dans un réacteur semi-fermé.
L’invention a également pour objet l’intensification dudit procédé de réduction biologique du C02. Le stock intracellulaire de donneur de protons et d’électrons étant limité, les inventeurs ont démontré qu’il est possible d’apporter des protons et électrons exogènes, ou extracellulaires, c’est-à-dire autres que les protons et électrons intracellulaires de Stenotrophomonas maltophilia afin que la réaction de réduction du C02 perdure dans le temps. Par exemple, il est possible d’introduire dans le réacteur un donneur d’électrons et de protons, tel qu’un bio-polymère et notamment du polyhydroxybutyrate (PHB) et/ou une assistance électrochimique de type bio- électrolyse. En effet, les inventeurs ont montré que Stenotrophomonas maltophilia est capable d’utiliser les électrons d’une cathode faiblement polarisée et les protons issus de l’oxydation de l’eau à l’anode. Dans un mode de réalisation, l’énergie apportée à la bio-électrolyse est d’origine verte, solaire notamment, ce qui rend ce procédé autonome du point de vue énergétique.
Ainsi, l’invention a également pour objet un procédé d’intensification de la réduction du C02 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia comprenant une étape selon laquelle on ajoute du PHB exogène ou une assistance électrochimique (bio-électrolyse) dans le réacteur.
Selon l’invention, des produits identifiés de la réduction du C02 sont le formiate et/ou le méthane. Il est possible également de coupler l’utilisation de Stenotrophomonas maltophilia à un autre microorganisme, notamment un microorganisme apte à utiliser le formiate contenu dans le liquide pour produire d’autres molécules d’intérêt, telles que du méthane, du lactate ou des alcools, notamment en C1-C5 (tels que le méthanol, l’isobutanol ou le méthyl-l-butanol).
L’invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie Stenotrophomonas maltophilia pour la production de formiate et/ou méthane et/ou plus généralement tout produit dont le nombre d’oxydation du carbone est inférieur à celui du C02, par réduction de C02.
L’invention a également pour objet un procédé de traitement d’un biogaz ou de fumées industrielles riches en C02 ou de fumées agricoles riches en C02 comprenant une étape de réduction du C02 par réduction biologique comprenant une étape selon laquelle on met en contact lesdits biogaz ou fumées industrielles ou fumées agricoles avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du C02.
L’invention a également pour objet un procédé de production de formiate à partir de C02, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du C02 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du C02 en formiate.
L’invention a aussi pour objet un procédé de production de méthane à partir de C02, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du C02 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du C02 en méthane. Brève description des figures
Figure 1. Spectres RMN d’une suspension de Stenotrophomonas maltophilia mise en œuvre pour les essais de réduction du 13C02 en réacteur fermé et en conditions de référence : (a) à t = 0 jour, (b) à t = 8 jours et (c) à t = 35 jours.
Figure 2. Cinétiques de production en 13C-formiate, obtenues au cours d’essais de réduction du 13C02 conduits en réacteur fermé et en conditions de référence avec la bactérie Stenotrophomonas maltophilia. Chaque couleur représente un essai indépendant.
Figure 3. Tests de réduction du 13C02 en réacteur fermé avec une suspension de S. maltophilia préparée dans un milieu de réaction enrichi en ammonium (MREA); les autres paramètres de réaction étant inchangés par comparaison aux conditions de référence. Un test de réduction du 13C02 est également conduit simultanément en conditions de référence. (A) Evolution de la concentration en ions ammonium (NH4 +) : dans le MREA (O) et dans le milieu de réaction de référence (#). (B) Evolution de la concentration en 13C-formiate (H13COO ): dans le MREA (D) et dans le milieu de réaction de référence (A).
Figure 4. Spectre RMN d’une suspension de S. maltophilia enrichie initialement avec 1,5 mM de 13C-formiate (H13COO ).
Figure 5. Spectres RMN du milieu de réaction contenant le consortium S. maltophilia/ M. trichosporium OB3b obtenus en présence de 13C02 à (a) t = 0 jour, où le 13C02 et sa forme basique H13C03 _ sont présents et (b) t = 8 jours montrant l’apparition d’un pic de 13C-formiate.
Figure 6. Spectres RMN du milieu de réaction contenant le consortium S. maltophilia/ M. oxydans obtenus en présence de 13C02 à (a) t = 5 jours; (b) t = 8 jours et (c) t= 12 jours.
Figure 7. Schéma et principe d’un exemple de réalisation d’un réacteur semi-fermé, assisté par électrolyse (ou bio-électrolyseur) pour la réaction de réduction du C02 selon le procédé de l’invention.
Figure 8. Evolution de la densité de courant cathodique mesurée au cours du temps dans un bio-électrolyseur inoculé avec Stenotrophomonas maltophilia, selon un mode de réalisation du procédé de l’invention. La tension de polarisation est fixée à -0,7 V vs Ag/AgCl. Six phases sont distinguées, correspondant aux différentes conditions opératoires mises en œuvre : (a) bullage de C02 (25 mL.min 1); (b) bullage d’argon, noté Ar (10 mL.min 1) ; (c) arrêt du bullage d’argon ; (d) bullage de C02 (5 mL.min 1); (e) bullage d’argon (100 mL.min 1) et (f) bullage de CO2 (25 mL.min 1). Le symbole (#) indique les interruptions de polarisation pour l’acquisition des voltamétries cycliques réalisées à 10 mV-s 1.
Description détaillée de l’invention
Les inventeurs ont découvert que Stenotrophomonas maltophilia est capable de produire du formiate et du méthane (CH4) par réduction directe du CO2 dans des conditions opératoires douces. De manière particulièrement intéressante, les inventeurs ont mis en évidence que Stenotrophomonas maltophilia est apte à produire du formiate et du méthane (CH4) en utilisant comme seule source de carbone le CO2, et cela sans apport de cofacteurs, de molécules organiques, de dihydrogène (¾) ou facteurs de croissance coûteux.
Dans le contexte de l’invention, on entend par réduction du CO2, toute réaction permettant le passage du nombre d’oxydation du carbone du CO2, à un degré plus bas que dans le CO2.
La bactérie Stenotrophomonas maltophilia est une bactérie aérobie à Gram négatif, de la famille des Pseudomonadaceae. Elle n’a jusqu’à présent jamais été utilisée à des fins industrielles. Or, les inventeurs ont découvert que cette bactérie est particulièrement intéressante pour la production de molécules d’intérêt à partir de CO2. En effet, les inventeurs ont découvert que cette bactérie présente la capacité de produire du formiate et/ou du méthane à partir de CO2 comme seule source de carbone, après avoir été avantageusement mise préalablement en culture dans des conditions autotrophes, c’est-à-dire en culture pure aérobie sur un milieu organique usuel de type Lysogeny Broth Miller, ou en co-culture avec une bactérie méthanotrophe, telle que Methylosinus trichosporium OB3b, sur un milieu minéral mis en contact avec un mélange méthane/air (1 : l v/v). La voie en co-culture est particulièrement avantageuse car elle permet de garantir un bilan carbone optimal ; en effet, le méthane, d’origine renouvelable, est la seule source de carbone nécessaire à la culture.
Avantageusement, la phase liquide comprend au moins 3 g de cellules sèches/L de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, au moins 10 g de cellules sèches/L, au moins 20 g de cellules sèches/L, 30
§ de cellules sèches/L, 40 g de cellules sèches/L, 50 g de cellules sèches/L, 60 g de cellules sèches/L, 70 g de cellules sèches/L,
80 g de cellules sèches/L, 90 g de cellules sèches/L, 100 g de cellules sèches/L.
Avantageusement, et quel que soit le mode de culture, les cultures sont réalisées à 30°C, +/- l0°C et à pression atmosphérique ou légère surpression (jusqu’à 0,5 bars).
Selon l’invention, la phase gazeuse contenant du C02 mise en contact avec le milieu de réaction liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia peut être de l’air atmosphérique. La phase gazeuse peut autrement être du C02 pur ou un mélange gazeux, tel qu’un mélange CCh-air, CO2-N2, CO2-O2, CO2-CH4, CO2-H2, CO2-N2-H2, CO2-CH4-H2, C02-CH4-air, CO2- CH4-N2 ou CO2-CH4-O2. Dans un mode de réalisation, la phase gazeuse contient ou est constituée de biogaz. Dans un autre mode de réalisation, la phase gazeuse contient ou est constituée de fumées industrielles ou agricoles riches en CO2. Dans un mode de réalisation particulier, la phase gazeuse comprend au moins 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de CO2. Avantageusement, la phase gazeuse comprend au moins 30% de CO2. Il est également possible d’utiliser une phase gazeuse comprenant 100% de CO2. Dans un mode de réalisation, la phase gazeuse comprend entre 30 et 100% de CO2.
Dans un mode de réaction, le milieu de réaction contient 20 mM de tampon phosphate à pH 7,0 ± 0,1 et 5,0 mM de MgCl2. Dans un autre mode de réalisation, le milieu de réaction contient 1,3 mM de KC1, 28,0 mM de NH4Cl, 29,8 mM de NaHCOs et 5,0 mM de NaH2P04. L’homme du métier est à même de choisir le milieu de réaction approprié pour la réduction du CO2 en formiate par Stenotrophomonas maltophilia.
Le formiate et/ou le méthane et/ou tout autre produit dont le nombre d’oxydation du carbone est inférieur à celui du CO2 étant obtenu directement par réduction du CO2, le rendement en formiate et/ou méthane et/ou tout autre produit dont le nombre d’oxydation du carbone est inférieur à celui du CO2 du procédé selon l’invention dépend directement de l’apport en CO2. L’homme du métier saura adapter les concentrations en CO2 aux rendements souhaités.
Selon l’invention, l’apport en CO2 peut être réalisé par tout moyen connu et notamment par des contacteurs membranaires (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42-52), un fritté poreux de distribution de gaz (Kim et al. 2010, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15(3), 476-480 ; Duan et al. Bioresource Technology, 102(15), 7349-7353) ou un simple contact gaz-liquide dans un réacteur fermé (Pen et al. 2014, Bioresource Technology, 174, 42- 52).
Dans un mode de réalisation, le procédé de valorisation du CO2 est mis en œuvre dans un réacteur fermé (« batch »). Alternativement, le procédé peut être mis en œuvre dans un réacteur semi-fermé (« fed-batch »).
Selon l’invention, la phase gazeuse contenant le CO2 peut être injectée dans l’espace de tête du réacteur fermé. Dans un mode de réalisation, il est possible de supprimer l’air présent dans l’espace de tête du réacteur fermé préalablement à l’injection de la phase gazeuse, de manière à placer la réaction sous une atmosphère constituée uniquement de la phase gazeuse. De manière alternative ou complémentaire, la phase gazeuse peut être injectée au centre du réacteur fermé ou semi-fermé, au cœur de la phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, au moyen notamment d’un distributeur à gaz.
Dans le cas d’un réacteur semi-fermé (« fed-batch »), la phase gazeuse contenant du CO2 est apportée en continu, préférentiellement par bullage, à l’intérieur du réacteur.
Dans un exemple de réalisation, le pH dans le milieu de réaction, c’est-à-dire la phase liquide, est maintenu entre 5 et 8, préférentiellement à pH 6,5, +/- 0,5. Avantageusement, le CO2 dissous dans l’eau forme un tampon suffisant pour permetre le maintien du pH, sans régulation externe.
De même la température dans le milieu de réaction est préférentiellement maintenue entre 20°C et 50°C, de manière préférée entre 25°C et 35°C, et de manière encore préférée à 30°C, +/- 1.
Selon l’invention, il est possible, préalablement à l’étape de réaction, c’est-à-dire préalablement à la mise en contact de la bactérie avec le CO2 pour produire le formiate et/ou le méthane, de placer la bactérie dans un milieu de culture dans des conditions de température et de pH favorables à sa croissance.
Par « milieu de culture », on entend le milieu dans lequel les bactéries sont mises à croître, pour produire de la biomasse bactérienne. Le milieu de culture comprend de manière classique les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne sous une forme utilisable par les bactéries, à savoir une source de carbone, des sels minéraux et de l’eau. Des milieux standards sont disponibles dans le commerce, décrits dans la littérature scientifique ou dans les catalogues des fournisseurs de souches bactériennes. L’homme du métier sait quels sont les composants minimums requis en l’absence desquels les Stenotrophomonas maltophilia ne peuvent se développer, et peut sans difficulté cultiver une telle bactérie. Les conditions générales de culture (température, composition du milieu, agitation, etc.) permettant la croissance ou le maintien des Stenotrophomonas maltophilia, sont aisément définies par l’homme du métier.
Cette étape de culture préalable peut par exemple permettre à la bactérie d’accumuler des donneurs de protons et d’électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2 en formiate et/ou méthane selon les équations (1) et (2) et/ou (1) et (3) :
CO2 + H+ + 2e— > HCOO (équation 1)
C02 + 8H+ + 8e— > CH4 + 2 H20 (équation 2) HCOO + 7H+ + 6e- ® CH4 + 2 H20 (équation 3)
De manière alternative ou complémentaire, il est possible d’ajouter dans le réacteur un donneur d’électrons et de protons exogènes, tel qu’un bio-polymère, de manière à fournir à la bactérie les électrons et protons nécessaires à la réaction, même en l’absence ou après épuisement de donneurs intracellulaires. Notamment, il est possible d’ajouter du polyhydroxybutyrate (PHB) dans le réacteur. Dans un mode de réalisation, le PHB est préalablement produit par des bactéries méthanotrophes à partir de méthane, notamment renouvelable (Pieja et al., Distribution and sélection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria, Microbial. Ecology, 62(3) (2011) 564-573). Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux d’un point de vue économique.
Dans un mode de réalisation, on ajoute du PHB exogène dans le réacteur. Préférentiellement on ajoute entre 30 mg/L et 3 g/L, de PHB exogène dans la phase liquide, notamment environ 0,3 g/L.
De manière alternative ou complémentaire, et notamment dans le cas d’un réacteur semi-fermé, il peut être particulièrement avantageux d’utiliser un dispositif d’assistance électrochimique. Un tel dispositif, logé à l’intérieur du réacteur et en contact avec la bactérie, permet de fournir des électrons et des protons à la bactérie. L’assistance électrochimique peut notamment être de type bio-électrolyse (figure 7). Avantageusement, l’énergie utilisée pour faire fonctionner le bio-électrolyseur est une énergie solaire.
Différents matériaux peuvent être utilisés pour l’anode et la cathode, dès lors qu’ils sont conducteurs d’électrons. Par exemple, la cathode peut être en acier inoxydable, en graphite ou en feutre. L’anode peut être en platine, acier inoxydable, graphite ou feutre.
Avantageusement, le rapport surface active de cathode / volume du réacteur est compris entre 1 et 100 m2/m3, préférentiellement environ 10 m2/m3. Par « surface active », on entend la surface géométrique exposée à l’anode. Le rapport surface géométrique projetée d’anode / surface géométrique projetée de cathode est préférentiellement compris entre 1 et 10, plus préférentiellement environ égal à 2. La gamme de potentiel de polarisation peut par exemple aller de -1,5 Y à 0 Y vs Ag/AgCl, notamment -1 Y à -0,5 V, par exemple -0,7 V ou -0,8 V.
De manière à optimiser la réaction de réduction du C02, il est possible d’ajouter de l’ammonium et/ou ammoniaque dans la phase liquide et/ou de l’ammoniac dans la phase gazeuse, notamment entre 5 mmol/L et 100 mmol/L, préférentiellement entre 20 et 30 mmol/L. De manière alternative ou complémentaire, la phase liquide comprend, en plus de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia, un autre micro -organisme apte à utiliser le formiate issu de la réduction du C02 pour former des métabolites plus complexes, tels que du méthane, du lactate ou des alcools. Les inventeurs ont montré qu’un tel consortium peut conduire à une synergie apte à intensifier le flux de CO2 réduit par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia.
Tout ou partie du procédé selon l’invention peut être mis en œuvre à l’échelle du laboratoire ou à l’échelle industrielle, c’est-à-dire sur des fermenteurs, ou réacteurs, de moyenne capacité (environ 0,1 L à 100 L) ou de grande capacité (100 L à plusieurs centaines de m3).
L’invention a également pour objet l’intensification du procédé de réduction du CO2 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia au moyen d’un ajout de PHB exogène ou d’une assistance électrochimique (bio-électrolyse) comme décrit ci-dessus.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, la réaction de réduction du CO2 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia peut être favorisée en éliminant en continu le formiate produit dans la phase liquide du réacteur sous forme de formiate et/ou d’acide formique. L’Homme du métier connaît les techniques possibles pour éliminer en continu le formiate produit.
Dans un autre mode de mise en œuvre du procédé selon l’invention, le milieu liquide et minéral de réaction enrichi en formiate peut être utilisé tel que récupéré dans un procédé ou bioprocédé secondaire visant à valoriser le formiate produit en des molécules à plus forte valeur ajoutée. L’Homme du métier connaît les techniques possibles pour valoriser le formiate produit. Dans un mode de mise en œuvre particulier, le procédé de production de formiate selon l’invention comprend les étapes consistant à :
Introduire Stenotrophomonas maltophilia dans un réacteur contenant un milieu de réaction ; Approvisionner le milieu de réaction, ou phase liquide, en une phase gazeuse contenant du CO2 ; et optionnellement Récupérer le formiate produit dans le réacteur par réduction du CO2, sous forme de formiate et/ou d’acide formique.
Dans un autre mode de mise en œuvre du procédé selon l’invention, le milieu de réaction minéral enrichi en formiate peut être utilisé tel que récupéré dans un procédé secondaire visant à valoriser le formiate produit en des molécules à plus forte valeur ajoutée. Dans un autre mode de mise en œuvre du procédé selon l’invention, le formiate produit est récupéré sous forme d’acide formique à partir du milieu de réaction.
Dans un mode de réalisation particulier, l’étape de récupération de l’acide formique à partir du milieu de réaction est réalisée par électrodialyse ou par extraction liquide- liquide avec un co- solvant. Ces dispositifs de récupération permettent de récupérer en continu l’acide formique et éviter ainsi l’éventuelle inhibition des bactéries par un excédent de produit, tout en obtenant un acide formique exempt d’impuretés (comme les sels du milieu de réaction).
Dans le cas d’une récupération en continu du produit, un apport continu en milieu de réaction peut être réalisé dans le bioréacteur. Dans le cas d’un procédé de récupération par électrodialyse, un module d’électrodialyse bipolaire est avantageusement couplé avec un module de microfiltration pour séparer et récupérer en continu le formiate produit sous sa forme acide (acide formique). En particulier, l’électrodialyse bipolaire peut être réalisée sur un milieu de réaction sans biocatalyseurs, obtenu en continu après avoir séparé les bactéries du milieu par un module de microfiltration tangentielle. L’électrodialyse bipolaire consiste à combiner une membrane bipolaire pour acidifier le formiate en acide formique et des membranes monopolaires pour extraire les sels du milieu de réaction.
Le formiate et/ou l’acide formique obtenu(s) à partir d’un tel procédé microbiologique peut être avantageusement utilisé dans toute industrie susceptible d’en avoir besoin, et notamment dans l’industrie du cuir et du textile, dans la parfumerie, dans l’industrie agro-alimentaire, etc.
Préférentiellement, le formiate et/ou l’acide formique obtenu(s) à partir d’un tel procédé microbiologique est utilisé dans un procédé biologique secondaire (in situ ou ex situ) pour obtenir des composés organiques de plus forte valeur ajoutée, et notamment du méthane, du lactate ou des alcools C1-C5. De manière alternative, il est possible d’utiliser directement le milieu de réaction contenant le formiate et/ou l’acide formique obtenu(s) pour la mise en œuvre du procédé biologique secondaire. Si les composés obtenus sont des alcools, un procédé de stripping réalisé par un bullage de gaz contenant du CO2 peut être mis en œuvre pour récupérer en continu les alcools produits.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, il est possible, préalablement à l’étape de réaction, de co-cultiver Stenotrophomonas maltophilia avec une ou plusieurs autres espèces bactériennes méthanotrophes. Il est ainsi possible de produire des nutriments organiques à partir de méthane, lesdits nutriments étant ensuite utilisés par Stenotrophomonas maltophilia comme source de carbone et d’énergie. Par exemple, les inventeurs ont mis en évidence que la co-culture sous un mélange méthane/air et sur milieu minéral de Stenotrophomonas maltophilia avec une bactérie méthanotrophe, telle que Methylosinus trichosporium OB3b, permet la production d’acétate utilisable par Stenotrophomonas maltophilia pour sa croissance. Les inventeurs ont par ailleurs montré que la présence d’une telle bactérie méthanotrophe dans la phase liquide lors de l’étape de réaction ultérieure ne perturbe pas la réduction du C02 ni la production de formiate et/ou méthane par Stenotrophomonas maltophilia.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible lors de l’étape de réaction (c’est-à- dire de mise en contact de Stenotrophomonas maltophilia avec la phase gazeuse contenant le C02) d’ajouter à la phase liquide un ou plusieurs autres microorganismes, et notamment des bactéries, archées et/ou levures, aptes à utiliser le formiate pour produire des molécules à plus forte valeur ajoutée. Il est également possible de co-cultiver Stenotrophomonas maltophilia avec un ou plusieurs de ces microorganismes préalablement à l’étape de réaction, puis d’ajouter l’ensemble des microorganismes obtenus dans le milieu de réaction liquide pour l’étape de réaction. Dans un mode de réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia la bactérie Microbacterium oxydans. Dans un mode de réalisation, on ajoute des archées méthanogènes hydrogénotrophes, afin d’obtenir du méthane. Dans un mode de réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia la bactérie Ralstonia eutropha H16 (LH74D), afin d’obtenir notamment des alcools en C4-C5. Dans un mode de réalisation, on ajoute à Stenotrophomonas maltophilia une bactérie méthanotrophe ainsi qu’un inhibiteur de la méthanol déshydrogénase, afin d’obtenir du méthanol.
De manière alternative, l’étape de réaction de réduction du CO2 en formiate par Stenotrophomonas maltophilia est réalisée dans un premier réacteur, et le formiate produit est récupéré pour alimenter un second réacteur dans lequel se trouve le ou les microorganismes aptes à utiliser le formiate pour produire des molécules à plus forte valeur ajoutée. Le second réacteur peut être alimenté directement avec le milieu de réaction du premier réacteur, contenant le formiate produit, ou au contraire contenir un milieu auquel est ajouté le formiate extrait du milieu de réaction du premier réacteur.
L’invention a également pour objet l’utilisation de Stenotrophomonas maltophilia, pour la production de formiate et/ou méthane et/ou tout autre produit dont le nombre d’oxydation du carbone est inférieur à celui du C02 par réduction de CO2 comme exposé ci-dessus. L’utilisation de Stenotrophomonas maltophilia permet de consommer des quantités de CO2 significatives et de répondre ainsi aux problèmes environnementaux liés à l’accumulation de CO2 dans l’atmosphère tout en valorisant le CO2 consommé. D’autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l’étendue de la protection recherchée.
Exemples
Al Matériels et méthodes
1. Culture de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia
Deux voies de culture de S. maltophilia ont été mises en œuvre :
(i) Co-culture aérobie avec la bactérie méthanotrophe Methylosinus trichosporium OB3b
Dans ce cas, la source de carbone et d’énergie utilisée est le méthane qui est converti par la bactérie méthanotrophe en nutriments organiques assimilables par la bactérie S. maltophilia pour sa croissance. En particulier, de l’acétate, à une concentration de l’ordre de 35 mg.L 1, est mesurée dans le réacteur de culture en fin de croissance. Une telle synergie entre ces deux types de bactéries a déjà été reportée dans la nature et pour un consortium les impliquant, la production d’acétate par des méthanotrophes a déjà été mise en évidence dans des conditions limitantes en oxygène (C. Costa et al., Dénitrification with methane as électron donor in oxygen-limited bioreactors, Appl. Microbiol. Biotechnol., 53(6) (2000) 754-762).
Le milieu de culture est un milieu minéral enrichi en cuivre et en fer. Le milieu de base est composé de : 1,06 g/L KH2P04, 4,34 g/L Na2HP04 12H20, 1,7 g/L NaNOs, 0,34 g/L K2S04 et 0,074 g/L MgS04-7H20. Une fois préparé, le pH de ce milieu de base est ajusté à 7,0 ± 0,1 avec NaOH, 0,1 M ou HCl, 0,1 M puis autoclavé. Les solutions de minéraux, de cuivre et de fer sont préparées indépendamment et stérilisées par filtration sur filtres en acétate de cellulose de diamètre de pores 0,2 pm avant d’être ajoutés au milieu de base. Les concentrations finales en minéraux sont : 0,57 mg/L ZnS04 7H20, 0,446 mg/L MnS04 H20, 0,124 mg/L H3BO3, 0,096 mg/L Na2Mo042H20, 0,096 mg/L Kl et 7,00 mg/L CaCl22H20. Les concentrations finales en cuivre et en fer sont : 0,798 mg/L CuS04 and 11,20 mg/L LeS04 7H20.
Les cultures sont conduites dans des réacteurs fermés étanches, incubés à 30°C et sous rotation constante (160 rpm). L’espace de tête des réacteurs est rempli par un mélange d’air et de méthane (1 : / v/v) ; le volume de gaz est trois fois plus grand que celui du liquide. Les pourcentages d’inoculation en S. maltophilia peuvent varier de 10 à 50 % v/v. Les cultures sont arrêtées lorsque la densité optique à 600 nm (DCboonm) est constante. Deux cultures successives sont conduites avant de mettre en œuvre le consortium pour la réaction de réduction du C02.
(il) Culture pure aérobie du bio catalyseur
La bactérie S. maltophilia a tout d’abord été isolée d’un consortium formé avec la bactérie M. trichosporium OB3b (obtenu selon le protocole décrit précédemment). L’isolement a été réalisé par repiquage successifs de colonies de S. maltophilia sur des géloses de milieu Lysogeny Broth (LB) Miller (Sigma Aldrich, France). La pureté et l’identification de la bactérie isolée sont confirmées par des analyses biochimiques (voir point 2 ci-dessous). La souche est conservée d’une part sur géloses LB stockées à 4°C, et d’autre part, au congélateur à -20°C dans son milieu liquide natif de culture auquel est ajouté du glycérol (20 % v/v). Le réacteur de culture est un réacteur fermé avec un bouchon perméable à l’air qui est dédié aux cultures stériles. Un milieu de culture liquide LB est ensemencé avec la bactérie S. maltophilia, 5 % v/v à partir d’un aliquote congelé ou avec l’intégralité des colonies d’une gélose, puis incubé 24 h incubés à 30°C et sous rotation constante (160 rpm). Les cultures sont arrêtées lorsque la phase stationnaire débute (DCLoonm est constante).
Deux cultures successives sont conduites avant de mettre en œuvre le biocatalyseur pour la réaction de réduction du C02.
Une corrélation entre la DCLoonm (-) et la concentration massique [X] en bactérie S. maltophilia (g de cellules sèches.L 1) est établie pour déterminer les productivités en formiate ; la corrélation est obtenue sur la base de cinq points répliqués indépendamment :
[X] (g de cellules sèches.L-1) = 0,3035 X DOeOOnm (R2 = 0,995)
2. Analyses biochimiques
L’isolat de Stenotrophomonas maltophilia issu de la co-culture a d’abord été caractérisé avec une coloration Gram et par spectrométrie de masse. La coloration Gram a mis en évidence que l’isolat est un bacille à Gram négatif. L’analyse par spectrométrie de masse a permis de confirmer que l’isolat est bien pur et d’identifier la bactérie S. maltophilia qui est en effet un bacille à Gram négatif. En spectrométrie de masse, il est à noter qu’un score supérieur à 1,90 indique une identification fiable et que le score obtenu pour S. maltophilia est de 2,18. Avant chaque culture, une analyse qualitative des colonies de S. maltophilia étalées sur géloses est réalisée afin de déceler une éventuelle contamination. Par ailleurs, un séquençage de l’ARN 16S de l’isolat a permis de confirmer que la bactérie identifiée est bien S tenotrophomonas maltophilia.
3. Préparation de la suspension bactérienne mise en œuvre dans les essais de réduction du CO2
A la fin de la culture, les cellules sont collectées par centrifugation à 4°C et 4000 g pendant 20 min. Elles sont alors remises en suspension dans un tampon phosphate 20 mM à pH 7.0 puis centrifugées à nouveau dans les mêmes conditions que précédemment et le culot bactérien est récupéré. Un milieu de réaction contenant 20 mM de tampon phosphate à pH 7.0 et 5 mM de MgCk est utilisé pour re-suspendre le culot bactérien et obtenir une DCLoonm de (i) 10,3 ± 0,5 (soit 3,1 ± 0,2 g de cellule sèche/L) pour les essais en réacteurs fermés et (ii) 6,6 ± 0,3 (soit 2,0 ± 0,1 g de cellule sèche/L) pour les essais avec assistance par électrolyse. Un échantillon de la suspension préparée est toujours stocké à -20°C avec du glycérol (20 % v/v) pour d’éventuelles analyses biochimiques ultérieures. Le reste de la suspension est utilisé immédiatement pour les essais de réduction du CO2. Le milieu de réaction ne contient pas de nutriments organiques permettant la croissance du biocatalyseur, celui-ci est donc utilisé comme une cellule au repos.
4. Essais de réduction du 13C02 en réacteur fermé
La suspension bactérienne obtenue à l’étape précédente est distribuée dans des réacteurs fermés étanches de 60 mL en ajoutant 6 mL de suspension à chaque réacteur. Afin d’évaluer la capacité du biocatalyseur à réduire le CO2, l’espace de tête est rempli avec un mélange gazeux contenant du 13CC>2 qui est stérilisé par filtration sur des filtres en téflon de diamètre de pores 0,2 mih. Différents mélanges gazeux ont été testés : 13C02:air atmosphérique (3 :7 v/v), 13CC>2: N2 (3 :7 v/v) et du 13CC>2 pur. Pour chaque expérience, un set de plusieurs réacteurs est préparé dans des conditions identiques et incubé à 30°C sous agitation constante (160 rpm). Chaque cinétique est suivie pendant plus de 20 jours et jusqu’à 35 jours; pour cela, à chaque temps d’échantillonnage, un réacteur est sacrifié pour les analyses. Différentes mesures sont réalisées : densité optique à 600 nm (DCLoonm), pH, dosage du formiate par Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (GC-MS), caractérisation de la composition gazeuse de l’espace de tête par GC-MS, dosage du poly-3-hydroxybutyrate (PHB) intracellulaire par GC- MS et dosage des ions ammonium (NH4 +) par chromatographie ionique (CI). Les produits issus du 13CC>2 sont mis en évidence dans le milieu de réaction et dans l’espace de tête par GC-MS et RMN. Des dénombrements des bactéries viables sont également réalisés au début et à la fin des cinétiques ; pour cela, les échantillons sont cultivés en conditions autotrophes aérobies. Enfin, des blancs réalisés avec le milieu de réaction seul (sans bactéries) sous mélange 13C02:air atmosphérique (3 :7 v/v) n’ont montré aucune contamination sur la durée des essais, confirmant la stérilité des essais en réacteur fermé.
5. Essais de réduction du CO2 en réacteur semi-fermé, assisté par électrolyse
Un réacteur en verre est utilisé. Son volume liquide utile est de 60 mL et son espace de tête représente environ 40 % de son volume total. Un couvercle est vissé sur le réacteur et l’étanchéité de la jonction couvercle-réacteur est garantie par un joint. Ce couvercle présente un port d’entrée pour l’alimentation du gaz (12C02 100 %) qui est réalisée au cœur de la solution par un distributeur à gaz, un port pour la sortie du gaz et 3 ports pour le positionnement des électrodes. Le réacteur est thermostaté à 30°C sous agitation constante (300 rpm).
Le système électrochimique est un dispositif classique à 3 électrodes (électrode de travail, électrode de référence et contre-électrode). L’électrode de travail (ou cathode) est un coupon de graphite de surface 2,5 cm x 2,5 cm et d’épaisseur 0,5 cm (Goodfellow), connecté électriquement avec une tige de titane (Goodfellow). Avant chaque expérience, le coupon de graphite est lavé pendant 1 h dans une solution d’HCl 1 N pour dissoudre les éventuelles espèces adsorbées puis dans une solution de NaOH 1 N pour neutraliser l’acidité et finalement rincé avec de l’eau stérile ultrapure avant d’être laissé une nuit dans 1 L d’eau ultrapure stérile pour chasser les éventuels résidus de soude inclus dans les pores du graphite. La tige en titane est quant à elle nettoyée à l’acétone puis autoclavée. Dans ce dispositif, le rapport de la surface active de la cathode par le volume du réacteur est donc de 10,4 m2/m3 ; où la surface active est définie comme la surface géométrique étant exposée à la contre-électrode.
La contre-électrode (ou anode) est une grille de platine, préalablement nettoyée et désinfectée à la flamme. Dans ce dispositif, le rapport de la surface géométrique projetée de l’anode sur celle de la cathode est d’environ 1,5 pour ne pas limiter les phénomènes cathodiques.
Les potentiels sont contrôlés et exprimés par rapport à une électrode de référence Ag/AgCl (potentiel de 0,240 V/ESH, Radiometer analytical).
Le potentiel de polarisation de l’électrode de travail est appliqué avec un potentiostat une voie (Ametek VersaSTAT3) et le courant est enregistré toutes les 900 s. La chronoampérométrie (CA) est périodiquement arrêtée pour acquérir des voltamétries cycliques (CVs) entre -1,2 et 1,0 V vs Ag/AgCl, à une vitesse de balayage comprise entre 1 et 10 mV.s 1. Pour rappel, une voltamétrie cyclique (ou voltampérométrie cyclique) consiste à réaliser un balayage en potentiel à l’électrode de travail et à mesurer le courant circulant dans le système électrochimique. Cette technique permet : (i) de contrôler la cohérence de la CA avec la CV, (ii) acquérir des informations cinétiques sur le système et (iii) mettre en évidence de composés redox dans la suspension.
Dans un premier temps, le réacteur est rempli avec une suspension bactérienne de S. maltophilia dans du milieu de réaction (préparée selon 2.c), dans laquelle un bullage continu de C02 100 % ou d’un mélange gazeux C02:CH4 (1 : 1 ou 1 :2 v/v) est réalisé à un débit compris entre 2 ou 25 ml.min 1. Puis une polarisation allant de -0,7 V à - 1 ,0 V v.s Ag/AgCl est appliquée. La polarisation est débutée en même temps que la chronoampérométrie. En parallèle, un réacteur témoin sans électrodes (et donc sans polarisation) est mis en œuvre de la même manière que le réacteur électrochimique. Des prélèvements sont effectués au cours du temps, sous hotte microbiologique, pour mesurer la densité optique à 600 nm (DCLoonm) et le pH du milieu liquide ; le pH s’est révélé être constant et égal à 6,4 ± 0,2 (correspondant au pKa du couple C02,H20/HC03 _). La composition du gaz est analysée en entrée et en sortie de réacteur par Chromatographie Gazeuse couplée à un catharomètre (GC-TCD) pour déterminer le flux expérimental de C02 réduit.
6. Analyses physico-chimiques
• Traitement des échantillons liquides
Le milieu de réaction complet (avec bactéries) et le surnageant (sans bactéries) sont analysés. Le milieu de réaction complet est soit directement analysé soit congelé à -20°C dès collecte pour analyse ultérieure. Le surnageant est obtenu par centrifugation du milieu complet venant d’être prélevé ; la centrifugation est conduite pendant 10 min à 10 000 g et 10 °C et le surnageant est collecté dès la fin de la centrifugation pour analyse immédiate ou congélation à -20°C. Le culot est conservé à -20°C pour analyse ultérieure.
• Analyses réalisées par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) :
Pour ces analyses, 500 pL d’échantillon liquide (réaction menée avec du 13C02, 2.d) sont introduits dans un tube RMN de 5 mm de diamètre avec 50 pL de D20 puis analysés par un RMN BRUKER Avance III - 500MHz - CryoProbe Hélium pendant 4 h. Différents standards (formiate de sodium marqué et non marqué, acétate de sodium, méthanol, éthanol, formaldéhyde, acétaldéhyde, lactate de sodium, glycérol, isobutanol, succinate de sodium, fumarate de sodium, pyruvate de sodium, oxaloacétate de sodium) préparés dans du milieu de réaction ont été préalablement analysés par RMN pour obtenir les empreintes de ces molécules. Sur cet appareillage, le seuil de détection de molécules marquées au 13C est de 6 mg.L 1. Or, les analyses RMN peuvent seulement détecter les isotopes 13C qui ont une abondance relative de 1,1 % au regard de leur isotope 12C dans la nature [W. Mook and P. Grootes, International Journal of mass Spectrometry and ion Physics, 1973, 12(3): p. 273-298] Par conséquent, une concentration de produit non marqué au 13C d’environ 600 mg.L 1 est nécessaire pour mettre en évidence ces composés.
• Analyses réalisées par Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (GC-MSi :
Matériel
La chromatographie gazeuse (Clarus 580, Perkin Elmer) est conduite avec une colonne capillaire (30 m x 0,25 mm ID, épaisseur de film 8 pm, Rt-Q-Bond Plot, Restek), couplée à la spectrométrie de masse (Clarus SQ-8-MS, Perkin Elmer) équipée d'un détecteur quadripolaire sélectif de masse sur impact électronique (El) opéré à 70 eV. Un passeur d’échantillons (Turbomatrix Headspace 16S, Perkin Elmer) est mis en en œuvre pour l’injection des espaces de tête obtenus après chauffage à l00°C des échantillons liquides. Pour l’analyse de la composition de l’espace de tête du réacteur fermé maintenu à 30°C, les échantillons sont directement prélevés dans le réacteur avec une seringue étanche aux gaz et injectés manuellement dans la GC-MS. L’hélium est utilisé comme gaz vecteur au débit de 1,5 ml / min.
Dosage du 12C-formiate et 13C-formiate dans les échantillons liquides
Une méthode d'estérification basée sur le protocole décrit par Wallage et al (2008) (Formic acid and methanol concentrations in death investigations, Journal of Analytical Toxicology, 32 (2008) 241-248) a été utilisée pour la quantification du formiate. La réaction d'estérification est réalisée entre 1’ acide organique présent dans l'échantillon liquide et le méthanol ajouté dans des conditions acides. Dans un flacon d’analyse GC-MS (22 mL), 600 pL d’échantillon, 100 pL d’acétonitrile (157,2 mg.L 1) en tant qu’étalon interne, 100 pL d’acide sulfurique concentré et 100 pL de méthanol en tant qu' agent de dérivation sont introduits dans cet ordre. Le flacon d’analyse est alors placé dans le passeur d’échantillons et chauffé à 100 ° C pendant 15 minutes afin de terminer la réaction d'estérification. Dans le cas de l’analyse du milieu complet (avec bactéries), un étalement du mélange sur gélose a permis de vérifier que ces conditions permettent la lyse des bactéries car aucune re-croissance n’a été mise en évidence. La température de l’injecteur est fixée à 200 ° C et le split à 1 : 16. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 40 à 150 ° C, à la vitesse de 10 ° C / min. Les ions détectés, en mode d’enregistrement à un seul ion (SIR), correspondent à un des rapports masse/charge m ! z de 60 pour le 12C-formiate de méthyle et de 41 pour l'acétonitrile. Afin de déterminer si le carbone est 12C ou 13C, [M + 1] a également été évalué pour le 13C-formiate de méthyle (ni / z de 61). La présence d’espèces marquées n’est considérée que pour des teneurs significativement supérieures à 1 %, qui dépassent donc le pourcentage lié à l’abondance isotopique naturelle. Des courbes d’étalonnage ont été établies préalablement avec des standards de formiate et d'acétate : Na(HCOO) et Na(H13COO)obtenus chez Sigma- Aldrich.
Analyse des gaz dans l’espace de tête du réacteur fermé
L’espace de tête du réacteur fermé est analysé pour déterminer les espèces gazeuses, marquées au 13C ou non, présentes au cours du temps. Pour chaque analyse, 250 pL d’espace de tête sont prélevés dans le réacteur incubé à 30°C à l’aide d'une seringue étanche aux gaz et 50 pL sont injectés dans la GC-MS. La température de l’injecteur est fixée à 200°C et le split à 1 :16. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 100 à l50°C, à la vitesse de l0°C / min. En mode SIR, les ions détectés sont m ! z 28 (N2), m / z 44 (C02), m / z 45 (13C02), m / z 16
• Dosage des ions ammonium (NH4 ) par chromatographie ionique (CI)
Les ions NH4 + sont dosés dans les surnageants. L’analyse est réalisée en injectant 25 pL d’échantillon dans un dispositif chromatographique Dionex ICS- 1000 (Thermo Scientifïc) équipée d’une colonne capillaire IonPAc AS19 (0.4 x 250 mm). Le programme d’élution est le suivant : lOmM KOH (de 0 à 10 min), puis 10-45 mM KOH (de 10 à 30 min).
• Analyses réalisées par Chromatographie Gazeuse couplée à un catharo mètre TCD) Matériel
La chromatographie gazeuse (Clarus 580, Perkin Elmer) est conduite avec une colonne PE-Q (Perkin Elmer, 30m) en série avec une colonne tamis moléculaire PE-MOLESIEVE (Perkin Elmer, 30 m) couplée à un détecteur de conductivité thermique, encore appelé catharomètre (Perkin Elmer). Une vanne à boucle 10 voies est utilisée pour charger et injecter les échantillons gazeux.
Analyse de la composition des gaz, marqués ou non
Pour chaque analyse, 20 mL minimum de gaz à analyser sont envoyés dans la vanne à boucle et 20 pL d’échantillon sont injectés dans les colonnes. L’hélium est le gaz vecteur à un débit 10 mL.min 1. Dans le four, un gradient de température est réalisé de 40°C à l20°C à une vitesse de l0oC.min_1. Un étalonnage est effectué pour doser le C02. Dosage du % massique de PHB intracellulaire
La méthode basée sur la digestion du PHB et l’analyse de son monomère (3-hydroxybutyrate) par GC-MS (A.J. Pieja et al., Applied and environmental microbiology, 201 1 : p. AEM.00509- 11 ; G. Braunegg et al., European journal of applied microbiology and biotechnology, 1978, 6(1) : p. 29-37) a été mise en œuvre, à la différence que les culots bactériens ont été congelés au lieu d’être lyophilisés avant l’étape de digestion du PHB.
Les culots bactériens conservés à -20°C sont décongelés à température ambiante puis digérés pendant 3 h à l00°C dans 2 mL de méthanol contenant 3% d’acide sulfurique concentré et 0,1% d’acide benzoïque additionné de 2 mL de chloroforme. Des tests de re-croissance sur milieu LB ont montré que les bactéries contenus dans les culots et traitées par cette digestion acide étaient totalement désactivées. Une fois que l’échantillon est refroidi, 1 mL d’eau déminéralisée est ajouté pour induire une séparation de phase. La phase aqueuse est alors retirée et 2 pL de phase organique sont injectés dans la GC-MS. Les analyses sont conduites avec le même appareillage GC-MS que celui utilisé pour les analyses de formiate. Une colonne DB-l (Agilent J&W) est utilisée pour la séparation. Le gaz vecteur est l’hélium à un débit de 32 mL.min 1. La température du four est programmée à 80°C pour 1 min, jusqu’à l20°C à un taux de l0°C/min, puis la température est augmentée jusqu’à 270°C à un taux de 45°C/min. La température de l’injecteur est fixée à 200°C et le split à 30 mL/min.
L’utilisation d’un standard de PHB (Sigma Aldrich) a permis d’établir une courbe de calibration donnant le ratio des aires des pics de 3-hydroxybutyrate et de benzoate en fonction de la masse de PHB introduite.
Ratio des aires de pics (3-hydroxybutyrate/benzoate) = 0,1675 x mp B (R2 = 0,9865)
Pour déterminer le % massique de PHB intracellulaire par unité de masse de cellules sèches ( w PHB/W cellule sèche) dans les échantillons, la masse de PHB mesuré dans l’échantillon par la méthode décrite ci-dessus est divisée par la masse sèche de bactéries en présence qui est connue à partir de mesure de DCLoo.
B| Résultats
I. Essais de réduction du 13C02 en réacteur fermé
Afin d’évaluer la capacité du biocatalyseur à réduire le C02, du C02 marqué au 13C est utilisé. Le marquage du C02 a pour but de mettre en évidence les produits marqués issus du 13C02 et de les distinguer de ceux issus d’un simple relargage cellulaire. Pour identifier ces produits, la technique RMN est utilisée pour analyser la suspension bactérienne et son surnageant alors que la technique GC-MS est utilisée pour caractériser l’espace de tête du réacteur. De plus, ce marquage permet d’observer les empreintes RMN et GC-MS de l’ensemble des produits présentant un ou plusieurs 13C qui peuvent résulter (i) de la réduction du 13C02 et/ou (ii) de la fixation du 13C02par la cellule. La densité optique à 600 nm (DCboonm) est mesurée au cours du temps pour suivre l’évolution de la concentration massique bactérienne (en gceiiuie sèche/L). Des dénombrements des cellules viables sont aussi réalisés pour accéder à la concentration cellulaire en bactéries (en CFU/mL) et le pH est mesuré en cours de réaction. La teneur en ions ammonium (NH4 +) dans le milieu de réaction est suivie pour étudier l’influence de la présence d’ammonium sur les performances du bioprocédé de réduction du C02.
1. Suivi du métabolisme d’assimilation du par RMN et GC-MS
La suspension bactérienne de Stenotrophomonas maltophilia est mise en contact d’une atmosphère gazeuse 13C02:air atmosphérique (1 : 1 v/v). La Figure 1 présente les spectres RMN obtenus sur la suspension bactérienne complète (a) initialement (début de réaction), (b) après 8 jours de réaction et (c) après 35 jours de réaction.
Dès le début de la réaction, deux pics sont visibles : celui du 13C02 (de déplacement chimique d = 124,6 ppm) et celui du H13C03 _ (de déplacement chimique d = 160,2 ppm). Après 8 jours de réaction, un pic avec un déplacement chimique correspondant à celui du 13C-formiate (d = 171,0 ppm) apparaît.
Afin de vérifier que ce pic correspond bien au 13C-formiate (H13COO ) marqué, une petite quantité de standard 13C-formiate est ajouté à l’échantillon (à une concentration finale de 10 mg/L). L’amplitude du pic a augmenté lorsque le standard a été ajouté, ce qui confirme que ce pic est bien attribuable au 13C-formiate. Aucun autre composé que le 13C-formiate n’est détecté par RMN, ce qui suggère que ce 13C-formiate résulte d’une réduction directe du 13C02. En effet, le 13C-formiate a un seul carbone, à un degré d’oxydation plus faible que celui du 13C02. Des blancs réalisés sans bactéries dans les mêmes conditions (c’est-à-dire sous mélange 13C02/air atmosphérique) ne montrent aucun composé marqué, hormis 13C02 et H13C03 , confirmant ainsi le rôle des bactéries sur la réduction du 13C02 en 13C-formiate.
La cinétique de réduction du 13C02 par la bactérie Stenotrophomonas maltophilia est reproduite et le milieu liquide du réacteur est aussi analysé à 35 jours (Fig l .c). Les pics correspondants au 13C02 et H13C03 sont toujours visibles à 35 jours, ce qui révèle qu’il n’y a pas de limitation en C02. Seul le pic correspondant au 13C-formiate (d = 171,0 ppm) est encore mis en évidence. Ceci signifie que le 13C-formiate produit n’est pas utilisé par la bactérie pour former de nouveaux composés et que le 13C02 est probablement accepteur final d’électrons. Ces nouveaux essais ont confirmé que la présence de la bactérie S. maltophilia permet de catalyser la réaction de réduction du 13C02 en 13C-formiate en phase liquide.
Par ailleurs, l’analyse GC-MS de l’espace de tête de plusieurs réacteurs fermés révèle la présence de méthane marqué (13CH4) en quantité significative au bout de 34 jours. Dans les conditions testées, la teneur de ce gaz reste néanmoins inférieure à 1 % v/v. Comme le 13C- formiate, le 13CH4 est un composé à un seul carbone, à un degré d’oxydation plus faible que celui du 13C02. Ce 13CH4 est donc issu de la réduction du 13C02, soit directe (13C02 ® 13CH4) soit indirecte (13C02 ® 13C-formiate ® 13CH4). Le méthane est un produit particulièrement intéressant car il peut être récupéré facilement par stripping et servir de combustible.
En conclusion, la bactérie S. maltophilia est capable de réduire le C02 en formiate et en méthane. Afin de quantifier la production en 13C-formiate dans le milieu de réaction liquide, des essais de réduction du 13C02 sont reproduits dans des conditions similaires, considérées comme des conditions de référence. La concentration en 13C-formiate est cette fois-ci dosée par GC-MS ; de plus, la densité optique à 600 nm (DCLoo) et le pH sont aussi monitorés.
2. Essais de réduction du 13C02 en réacteur fermé en conditions de référence
a. Définition des conditions de référence
Les conditions de référence sont définies comme suit : concentration initiale en bactéries de 3,1 ± 0,2 g de cellule sèche/L, atmosphère gazeuse initiale composée d’un mélange gazeux 13C02 :air atmosphérique (3:7 v/v ), milieu de réaction aqueux composée de 20 mM de phosphates et 5 mM de MgCh. Trois cinétiques indépendantes sont conduites en parallèle dans ces conditions de référence. b. Suivis de la concentration en biomasse et du pH
La concentration massique en bactéries, notée [X], est monitorée en mesurant DCLoo. La corrélation donnant la DCLoo en fonction de la concentration massique en bactéries est donnée en section A.l] Pour l’ensemble des trois cinétiques suivies, une diminution de la concentration en biomasse est observée (données non montrées). La raison la plus probable pour expliquer ce phénomène est la lyse cellulaire. En effet, un manque de nutriments naturels et une atmosphère riche en C02 expose les cellules bactériennes à des conditions stressantes, qui sont susceptibles d’entraîner la mort et donc la lyse cellulaire d’une partie de la population bactérienne. Tout du long des cinétiques, aucun essai ne montre cependant une lyse totale. En effet, pour toutes les expériences, la concentration massique cellulaire, initialement de 3,1 ± 0,2 g de cellule sèche.L 1 , chute sur les 10 premiers jours puis se stabilise à une valeur moyenne de 0,5 ± 0,1 g de ceiiuie sèche/L . Ceci signifie donc qu’une partie seulement de la suspension de biocatalyseur se lyse sur les 10 premiers jours de la cinétique puis que la concentration massique reste stable.
De plus, le dénombrement de cellules viables dans la suspension bactérienne au bout de 35 jours confirme d’une part que de la lyse cellulaire se produit et d’autre part que 15 ± 4 x 104 CFU/mL sont toujours viables ; la concentration initiale étant de 60 x 107 CFU/mL. La concentration en cellules viables a donc diminuée signifîcativement mais reste tout de même élevée (de l’ordre de 105 CFU/mL). Il est supposé que cette lyse cellulaire peut être un moyen pour la bactérie de s’adapter à ses nouvelles conditions grâce aux composés organiques relargués dans le milieu par la lyse des cellules (J.M. Navarro Llorens et al., FEMS microbiology reviews, 2010, 34(4): p. 476-495).
Au cours de ces cinétiques, le pH est également suivi (données non montrées). Quelle que soit l’expérience, l’évolution du pH est très similaire. En effet, le pH initial est fixé à 7,0 ± 0,1 et pour tous les essais, le pH diminue à une valeur moyenne de 6,4 ± 0,2 sur les 5 premiers jours puis reste constant à cette valeur qui correspond au pKa du couple acido-basique C02,H20/HC03 _ induit par la dissolution de C02 dans le milieu de réaction. Le pH du milieu est donc tamponné tout au long de la cinétique. c. Suivi de la production en 13C-formiate dans le liquide
La production en 13C-formiate issu de la réduction du 13C02 est quantifiée par GC-MS et son évolution au cours des trois différentes cinétiques est présentée en Figure 2.
Quelle que soit la cinétique, du 13C-formiate est produit en quantité significative. De plus, l’analyse GC-MS a mis en évidence que le 13C-formiate se retrouve dans les suspensions complètes (c’est-à-dire en présence des bactéries) mais pas dans les surnageants respectifs. Ceci montre que la production de ce 13C-formiate est réalisée par les bactéries intègres restant dans le milieu de réaction et non pas par des enzymes libres issues de la lyse cellulaire. Le 13C- formiate apparaît au bout de 8 à 10 jours seulement, période qui peut correspondre à une phase de latence au cours de laquelle la bactérie s’adapte à son nouveau substrat 13C02. Le fait qu’une concentration importante en bactéries (proche de 105 CFU/mL) soit toujours viable à la fin des cinétiques confirme la présence de bactéries maintenant une activité métabolique.
Le 13C02 entre donc dans les cellules, soit sous la forme 13C02 ou sous la forme H13C03 _ ; en effet, le pH se stabilise autour du pKa du couple C02,H20/HC03 _ et les deux formes coexistent donc dans de proches proportions. Puis les cellules ayant survécu aux conditions de réaction et à la lyse utilisent donc un de leur système enzymatique intracellulaire pour catalyser la réaction de réduction de ce 13C02 en 13C-formiate. Deux familles d’enzymes, potentiellement présentes à l’intérieur de la bactérie S. maltophilia, sont susceptibles de catalyser cette réaction de réduction du C02 en formiate : les Formiate DésHydrogénases (FDHs) et les nitrogénases. A l’heure actuelle, ces enzymes sont d’abord isolées de leur microorganisme natif puis purifiées avant d’être mises en œuvre (L.B. Maia et al., Inorganica Chimica Acta, 2017, 455 : p. 350-363 ; Khadka et al. 2016, Inorg. Chem., 55, 8321-8330).
Il est à souligner que les concentrations maximales en formiate produites (10 - 20 mg.L 1, Figure 2) sont inférieures à la concentration maximale théorique en 13C-formiate qui aurait pu être atteinte si tout le 13C02 présent dans le réacteur avait été réduit (soit 4,6 g.L 1). Ce calcul se base (i) sur le nombre de moles de 13C02 introduites dans l’espace de tête (obtenu par la loi des gaz parfaits) et (ii) sur une stœchiométrie 1 : 1 vis-à-vis du 13C02 et du formiate (c’est-à-dire en supposant qu’une mole de 13C02 donne une mole de 13C-formiate). Ceci suggère donc qu’il n’y a pas de limitation macroscopique au transfert de 13C02 dans la phase liquide contenant les bactéries. Cependant, une limitation microscopique du transport de 13C02 du cœur du liquide vers le biocatalyseur n’est pas exclue. En effet, la présence d’ADN libre provenant de la lyse cellulaire observée pourrait créer des résistances importantes au transfert de masse dans les cellules. Une étude a en effet déjà reporté ce type de phénomène pour la bactérie E. coli, (Castan et al., John Wiler & Sons, Inc. Biotechnol. Bioeng. 77 (2002) 324-328), qui présente des similitudes avec la bactérie S. maltophilia, car elle est aussi une bactérie aérobie de type bacille à Gram négatif. Dans l’étude de Castan et al., la présence d’ADN libre limiterait le transfert de masse en oxygène (02) dissous vers les cellules. Dans le cas présent, une telle limitation pourrait aussi se produire pour le 13C02 dissous. Une solution pour augmenter la production de formiate serait d’apporter le C02 au cœur de la solution par un distributeur à gaz. Par ailleurs, la concentration en bactéries et l’activité spécifique C02-réductrice des cellules peuvent être aussi des éléments limitants à la réaction de réduction. Il est donc possible de jouer sur ces paramètres pour optimiser le flux de C02 réduit. d. Production Pformiate en 13C-formiate et flux volumique Fco2,voi de 13C02 réduit
Quelle que soit la cinétique considérée (Fig. 2), la production en 13C-formiate Pformiate, en mg 13C-formiate.(g cellule sèche) 1 1 ou mhioI 13C-formiate.(g cellule sèche) 1 1 , est définie comme étant :
P formiate AC / Dί / Cbactérie (Equation 4) avec Dΐ : période de production (jour), AC : différence de concentration en 13C-formiate sur la période de production (mg.L 1 ou pmol.L 1),
Cbactérie : concentration bactérienne initialement introduite (Cbactérie = 3,1 ± 0,2 g ceiiuie sèche.L 1) pour tenir compte de l’apport en bactéries qu’il a été nécessaire de mettre en œuvre. De la même manière, si l’on considère qu’une mole de 13C-formiate produite correspond à une mole de 13C02 réduite, alors le flux Fco2 de 13C02 réduit en mhioΐ 13C02.(g cellule sèche) 1 j 1 sera donc égal à la production en formiate Pfomüate exprimée en mhioΐ 13C-formiate.(g cellule sèche) 1 j 1. Le flux volumique Fco2,voi de 13C02 réduit exprimé en mL 13 CO 2. (g cellule sèche) 1 1 sera calculé selon l’équation suivante : Fco2,voi = FCO2 . vm (Equation 5) où Vm est le volume molaire à 30°C du 13C02 supposé gaz parfait (25,19 10 3 mL.pmol 1)
Le tableau 1 détaille les valeurs de AC et At pour chacune des trois cinétiques présentées précédemment, ainsi que les productions en 13C-formiate (Pfomüate) et les flux de 13C02 réduit (Fœ2,vol). Tableau 1. Production en 13C-formiate (Pfomüate) et flux de 13C02 réduit (Fco2,voi) obtenus en réacteur fermé
e. Production de 13C-formiate à partir de 13C02: étude de reproductibilité
Afin d’étudier la reproductibilité de ce bioprocédé, six autres essais indépendants de réduction du 13C02 ont été conduits en conditions de référence, avec des suspensions bactériennes préparées à partir de différentes cultures de S. maltophilia. Pour chacun de ces essais, une production significative en 13C-formiate a été mise en évidence. En appliquant les calculs de la section précédente (Eq. 4 et 5) aux résultats obtenus au cours de ces cinétiques (6 au total), il ressort une production Pfomüate moyenne de 9,1 mhioΐ 13C-formiate.(g cellule sèche) 1 1 (soit 0,4 mg formiate.(g cellule sèche) 1. f1), avec un minimum et maximum respectivement de 2,3 et 30 mhioΐ 13C-formiate.(g cellule sèche) 1.j 1 (soit 0,1 et 1,4 mg 13C-formiate.(g cellule sèche) 1./1).
De la même manière, un flux volumique moyen Fco2,voi de 13C02 réduit de 0,24 mL 13 CO 2. (g cellule sèche) 1.j 1 a été obtenu, avec un minimum et maximum respectivement de 0,06 et 0,76 mL 13 CO 2. (g ceiiuie sèche) 1.j 1 ; ces différences de flux étant certainement liées aux différences d’état physiologique des bactéries utilisées pour les essais de réduction du 13C02. f. Production de 13CH4 à partir de 13C02: étude de reproductibilité
La production de 13CH4 à partir de 13C02 a été évaluée à 34 jours lors de 4 essais indépendants de réduction du 13C02, conduits en conditions de référence, avec des suspensions bactériennes préparées à partir de différentes cultures de S. maltophilia. Dans tous les cas, une production significative en 13CH4 a été obtenue, avec des teneurs en 13CH4 dans l’espace de tête du réacteur variant entre 1 à 3 % v/v.
3. Effet de divers paramètres sur les performances en réduction du 13CQ2
Divers paramètres qui peuvent potentiellement influencer les performances de la réaction de réduction du C02 sont étudiés. Pour cela, des essais sont conduits dans des conditions de réaction modifiées, par comparaison aux conditions de référence. Un test en conditions de référence est toujours réalisé simultanément à l’étude de l’influence d’un paramètre pour déterminer l’impact du paramètre modifié. a. Effet de la concentration en biomasse La concentration massique initiale de la suspension bactérienne utilisée pour les essais de réduction du 13C02 est fixée à 3,1 ± 0,2 g de œiiuie sèche/L. En effet, dans les conditions de culture mises en œuvre, cette concentration est actuellement la plus forte possible permettant de lancer différent réacteurs fermés et différentes séries de réacteurs fermés. A terme, les volumes et concentrations de bactéries produites pourront être augmentés. Une concentration plus faible (1,6 ± 0,1 g de cellule sèche/L) est testée pour vérifier que la quantité de 13C-formiate produite est corrélée à la quantité de cellules ; les autres paramètres de réaction restant inchangés. La cinétique est suivie sur 25 jours.
Le tableau 2 résume les résultats obtenus. Tableau 2. Concentrations massiques en biomasse initiale [Xo] et finale [Xf] (en g de cellule sèche/L), perte en biomasse D[C] en fin de réaction (en %) et concentrations finales accumulées en 13C- formiate issu de la réduction du 13C02 (en mmol/L et mg/L).
Le Tableau 2 montre que la concentration en 13C-formiate est près de 20 fois supérieure lorsque la concentration initiale en bactéries est doublée. Contrairement à ce qui pouvait être attendu, la concentration finale accumulée en 13C-formiate n’est donc pas corrélée aux quantités de cellules introduites initialement. Par contre, il est intéressant de noter qu’en doublant la quantité de bactéries initiale, la quantité de cellules lysées finale est également doublée (Tableau 2, différence entre [Xo] et [Xf]). Il est donc possible que les composés relargués dans le milieu de réaction par lyse cellulaire puissent être utilisés par les cellules survivantes pour produire une quantité plus importante d’enzyme intracellulaire réductrice du C02, ce qui conduirait donc à une augmentation de la production en 13C-formiate.
En conclusion, la disponibilité de composés intracellulaires dans le milieu de réaction semble être un facteur limitant pour les performances de réduction en C02 quand la concentration bactérienne initiale est trop faible (1,6 g de œiiuie sèche/L). b. Influence de la nature du mélange gazeux
Des essais avec différents mélanges gazeux sont réalisés pour étudier l’influence de la présence d’oxygène (02) et d’azote (N2) sur la réaction de réduction du C02. La concentration en 13C- formiate est monitorée.
Différents mélanges gazeux initiaux contenant du 13C02 ont été testés : (i) le mélange de référence composé de 13C02:air atmosphérique (3:7 v/v ), (ii) un mélange 13C02:N2 (3:7 v/v) pour étudier l’influence de l’oxygène et (iii) du 13C02 pur pour étudier l’effet de l’azote. Ces essais ont tous été reproduits deux fois. Les résultats, montrent que l’absence d’oxygène et la présence d’azote accélèrent l’apparition de 13C-formiate dans le milieu. En effet, la production en 13C-formiate survient en moyenne 14 ± 2 jours plus tôt sous mélange 13C02:N2 (3:7 v/v), par comparaison au mélange 13C02:air atmosphérique (3:7 v/v) et au 13C02 pur. Par contre, quel que soit le ciel gazeux mis en œuvre, la concentration maximale en 13C-formiate accumulée dans le milieu sur un temps de réaction de 31 jours reste du même ordre de grandeur (autour de 0,1 mmol/L). L’oxygène est reporté pour être un inhibiteur potentiel des activités de la nitrogénase et de la FDH car il peut servir d’accepteur d’électrons et conduire à la formation d’espèces réactives de l’oxygène (J. Gallon, Trends in Biochemical Sciences, 1981, 6: p. 19-23) mais il peut aussi affecter la synthèse de la nitrogénase (Q.Liu et al., Nature communications, 2015, 6 : p. 5933). La baisse de performances observées en présence d’02 n’est donc pas surprenante.
En conclusion, utiliser un mélange 13C02:N2 est favorable à la cinétique de réaction de réduction du 13C02. c. Influence de la composition du milieu de réaction
De nouveaux essais de réduction du 13C02 sont réalisés avec un milieu de réaction enrichi en ions ammonium (MREA). Le MREA contient 2 mmol/L de KC1, 28 mmol/L de NH4Cl, 30 mmol/L de NaHCCL et 5 mmol/L de NaH2P04. Les concentrations en 13C-formiate et ions ammonium (NH4 +) sont monitorées tout au long de la réaction (Figure 3).
Quand des ions ammonium sont initialement présents en grande quantité, près de la moitié de la quantité initiale est consommée sur les 8 premiers jours, puis la concentration semble se stabiliser (Fig. 3. A). En conditions de référence, des ions ammonium apparaissent en suspension (Fig. 3. A). Cette apparition en ions ammonium peut être liée à deux productions : la réduction du N2 par la nitrogénase et la désamination des protéines relarguées dans le milieu après lyse cellulaire. De plus, ces ions NH4 + ne sont pas oxydés en nitrates ou nitrites, ce qui implique que ces ions NH4 + peuvent servir de source d’azote assimilable pour la synthèse d’enzymes par les bactéries survivantes.
En ce qui concerne la production de 13C-formiate, elle est près de 2,5 fois plus importante à 24 jours (soit une concentration de 1,45 mmol/F, c’est-à-dire environ 65 mg/F) et se produit environ 7 jours plus tôt (Fig. 3. B) quand le milieu de réaction est enrichi en ammonium. Ceci pourrait notamment être expliqué par le fait que la présence excédentaire d’une source d’azote assimilable par la bactérie (c’est-à-dire les ions NH4 +) en début de réaction pourrait avoir aidé la bactérie à sur-exprimer son système enzymatique réducteur du C02.
Il est donc aussi possible de jouer en amont sur les conditions de culture de la bactérie S. maltophilia et/ou sur des modifications génétiques de la bactérie pour sur-exprimer la quantité de son système enzymatique C02-réducteur et bénéficier d’une activité spécifique intrinsèque de réduction du C02 plus importante. d. Etude de la réversibilité de la réaction de réduction du CO2
Cette étude a montré que la bactérie S. maltophilia est capable de réduire le CO2 en formiate. Jusqu’à présent, la concentration maximale accumulée en formiate est d’environ 1,5 mmol/L (soit 67,5 mg/L). De manière à étudier la réversibilité de la réaction de ce système catalytique, c’est-à-dire sa capacité à oxyder le formiate en CO2, une concentration en 13C-formiate de sodium de 1,5 mmol/L est introduite dans une suspension de S. maltophilia préparée comme pour un test de réduction du CO2 (section A] 3). Cette suspension est alors introduite dans un tube RMN et analysée par RMN (section A] 6). Si l’équilibre de réduction du 13CC>2 est réversible, alors l’oxydation du 13C-formiate (H13COO~) en 13CC>2 devrait pouvoir se produire car le 13CC>2 est initialement minoritaire :
H13COO~ <® 13CC>2 (Equation 6)
Le spectre RMN obtenu au bout de 4 h est présenté en Figure 4.
Seulement deux pics sont visibles, correspondant respectivement aux ions 13C-formiate (d = 171,0 ppm) et 13C-hydrogénocarbonate (d = 160,2 ppm). Ce résultat confirme que quand le 13C- formiate est prédominant devant le 13CC>2, alors le 13C-formiate peut être oxydé en 13CC>2, qui se solubilise sous la forme hydrogénocarbonate (H13C03 ~). En effet, dans le cas de cet essai, le pH du milieu de réaction (7,0 ± 0,1) est supérieur au pKa du couple CCL^O/HCCL (6,4) car le milieu n’est pas tamponné par la présence de 13CC>2. Comme on pouvait s’y attendre, la réaction catalysée par la bactérie S. maltophilia semble donc être régulée par la concentration en substrat le plus abondant (CO2 dans le sens de la réduction et formiate dans le sens opposé). De plus, il est intéressant de noter que la présence de ces deux pics RMN seulement, et donc l’absence d’autres pics, confirme que le formiate produit dans ces conditions de réaction n’est pas utilisé par la bactérie pour former de la biomasse ou des enzymes (section B] 1.1). Eliminer le formiate en continu est donc une option envisageable pour favoriser la réaction de réduction du CO2. e. Influence de l’ajout de PHB au milieu de réaction
La réduction enzymatique du C02 requiert une source de protons et d’électrons. Les ions ammonium (NH4 +) n’étant pas oxydés en ions nitrates ou nitrites, il est donc improbable qu’ils servent de donneur d’électrons et de protons à la réaction de réduction du C02. La source de protons et d’électrons est très certainement accumulée dans la cellule pendant la phase de culture de la bactérie en tant que réserve énergétique. A l’heure actuelle, deux types de molécules ont été identifiées comme pouvant jouer ce rôle : le Poly-3-HydroxyButyrate (PHB) qui est un polymère naturel et les lipides. En ce qui concerne le PHB, les cellules bactériennes sont en effet capables de dépolymériser le PHB en son monomère (3-Hydroxybutyrate) et d’oxyder ce monomère en acétoacétate de manière à récupérer des électrons et des protons mais aussi une source de carbone (S. Obruca et al., PLoS One, 2016, 11(6): e0l57778).
Pour vérifier le rôle du PHB, celui-ci est ajouté initialement à la suspension bactérienne et la réaction de réduction du C02 est ensuite opérée dans les conditions de référence (décrites en section B] 1.2). Or, le PHB est un polymère à haut poids moléculaire et insoluble dans l’eau, ce qui rend impossible son transport et son assimilation dans la cellule sous sa forme polymérisée. Cependant, la bactérie S. maltophilia est capable d’excréter des dépolymérases pouvant dépolymériser le PHB en son monomère 3- HydroxyButyrate assimilable par la bactérie (S. Wani et al., 3 Biotech, 2016, 6(2): p. 179-184 ; B. Tiwari et al., Bioresource technology, 2016, 216: p. 1102-1105).
Pour déterminer la quantité de PHB à ajouter, les teneurs en PHB intracellulaire des suspensions bactériennes utilisées pour les essais sont d’abord mesurées par la méthode détaillée en section A] 6. Une teneur massique moyenne en PHB intracellulaire de 1,0 ± 0,1 % w/w est obtenue, correspondant à une concentration en PHB de 30 ± 2 mg/L, ce qui est assez usuel pour les espèces de type S. maltophilia (B. Iqbal et al., Annual Research & Review in Biology, 2016, 9(5): p. l). Une concentration 10 fois plus importante (300 mg/L, soit 0,3 g/L) est alors utilisée pour les essais pour éviter une limitation en PHB.
Deux séries indépendantes de réacteurs fermés sont réalisées, à partir de deux cultures bactériennes différentes. Pour chaque test, une cinétique est conduite en parallèle dans les conditions de référence (c’est-à-dire sans ajout de PHB). Dans tous les essais, l’atmosphère gazeuse des réacteurs est donc composée initialement d’un mélange 13C02,:air atmosphérique (3 :7 v/v). Pour la première série, le suivi est réalisé sur 20 jours et jusqu’à 40 jours pour la seconde série. Les concentrations en 13C-formiate ainsi que les concentrations en PHB intracellulaire, sont mesurées au cours des cinétiques.
Le Tableau 3 présente les résultats obtenus initialement puis à 20, 30 et 35 jours. Il est important de signaler que les mesures en PHB pour les cinétiques dans lesquelles le PHB est ajouté ne sont pas indiquées car elles ne sont pas reproductibles, à cause probablement d’un manque d’homogénéité dans les échantillons prélevés des réacteurs (en effet, le PHB n’est pas soluble dans l’eau).
Tableau 3. Concentrations en 13C-formiate ([13C-formiate] en qmo 1/L) et en PHB intra cellulaire ([PHBintra] en mg/L). NM signifie Non Mesurable et (-) signifie Non Mesuré.
En ce qui concerne la production en 13C-formiate, la production est beaucoup plus importante quand du PHB est ajouté initialement au milieu de réaction. Par comparaison aux conditions de référence (sans ajout de PHB), la concentration de 13C-formiate produite en présence de PHB est en effet augmentée par un facteur compris entre 3 et 95 (Tableau 3, séries 1 et 2 respectivement). Ce résultat montre que l’ajout de PHB permet d’améliorer les performances de la réaction de réduction du C02 et suggère qu’il pourrait être un donneur d’électrons et de protons pour cette réaction.
Une limitation en PHB en conditions de référence pourrait expliquer pourquoi la production de 13C-formiate est améliorée quand le milieu est enrichi en PHB. En effet, en conditions de référence (sans ajout de PHB), la concentration en PHB intracellulaire décroît de 30 ± 2 à 13 ± 1 mg/L quelle que soit la cinétique puis reste constante (Tableau 3, séries 1 et 2). Pour les deux séries, il apparaît donc que près de 20 mg/L de PHB intracellulaire est consommé par les cellules au cours de la réaction. De plus, la limitation en PHB n’est probablement pas le seul paramètre à impacter la production en 13C-formiate. En effet, dans les conditions de référence et pour une même quantité de PHB consommée après 20 jours de réaction, la concentration en 13C-formiate obtenue à 20 jours est près de deux fois plus importante pour la série 1 que pour la série 2 (Tableau 3). Ceci peut être expliqué par le fait que ces séries ont été réalisées à partir de deux cultures différentes et que l’état physiologique des bactéries n’était pas le même. Or, l’état physiologique peut jouer un rôle sur l’activité C02-réductrice intrinsèque de la bactérie mais aussi sur sa capacité d’adaptation à son nouveau substrat C02. En conclusion, la quantité de PHB intracellulaire est un facteur limitant pour la réaction de réduction du C02 et pour la production de 13C-formiate. Le PHB est donc probablement une source d’électrons et de protons pour la réaction de réduction du C02.
4. Etude d’effets synergiques avec d’autres bactéries
La bactérie S. maltophilia a été mise en consortium avec des bactéries susceptibles d’utiliser du formiate pour étudier leurs synergies éventuelles.
Dans un premier temps, un consortium formé par la bactérie S. maltophilia et la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b, obtenu après culture sur méthane (selon le protocole décrit en section A] 1), a été mis en œuvre dans les conditions de réaction de réduction du C02 détaillées en section A] 4. Une analyse RMN du milieu de réaction a été conduite initialement et au bout de 8 jours. Les spectres RMN obtenus sont présentés en Ligure 5.
Depuis le début (t =0 jour) et tout au long de la réaction, les pics de résonnance du 13C02 (d = 124.6 ppm) et de sa forme ionique H13C03 (d = 160.2 ppm) sont jours visibles (Ligure 5. a). Après 8 jours de cinétique, un nouveau pic apparaît (d = 171.0 ppm, Ligure 5. b), correspondant à l’empreinte du standard réalisé avec du formiate marqué au 13C. Ceci démontre la production de 13C-formiate dans ces conditions, à une concentration supérieure ou égale à la limite de détection de formiate marqué par analyse RMN, soit 6 mg.L 1. L’analyse RMN du surnageant n’a révélé aucun 13C-formiate marqué, ce qui signifie que le formiate marqué produit est intracellulaire, comme observé dans les cinétiques avec S. maltophilia seule.
Aucun autre produit marqué n’a été mis en évidence dans le spectre RMN (Ligure 5. b). Des essais conduits sur 8 jours avec la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b seule, dont la pureté a été vérifiée au préalable, ont montré que cette bactérie ne catalyse pas la réduction du C02. Par ailleurs, cette bactérie est capable de former des spores qui limitent les interactions de la bactérie avec son environnement, ce qui peut expliquer qu’aucune synergie entre S. maltophilia et M. trichosporium OB3b n’ait été observée. .
Ce résultat suggère donc que la présence de cette bactérie méthanotrophe dans le milieu de réaction ne perturbe pas la réduction du C02 et la production de formiate par S. maltophilia. Pour certaines applications, co-cultiver le biocatalyseur S. maltophilia avec la bactérie méthanotrophe M. trichosporium OB3b peut donc être envisagé pour garantir un bilan carbone optimal car le méthane, d’origine renouvelable, serait la seule source de carbone nécessaire à la culture. Dans un second temps, un consortium formé par la bactérie S. maltophilia et la bactérie de type bacille à Gram positif Microbacterium oxydans, obtenu après culture sur milieu LB (selon un protocole similaire à celui décrit en section A] 1), a été mis en œuvre dans les conditions de réaction de réduction du C02 détaillées en section A] 4. Une analyse RMN du milieu de réaction a été réalisée à 5, 8 et 12 jours (Figure 6).
Tout comme le spectre initial obtenu avec le consortium S. maltophilia / M. trichosporium OB3b, seuls les pics des substrats (13C02 et H13C03 _) sont visibles à t = 0 jour.
Après 5 jours de réaction, un pic de formiate apparaît (d = 170.9 ppm, Figure 6. a), correspondant à une concentration supérieure ou égale à 6 mg.L 1. Par comparaison aux cinétiques réalisées en culture pure avec S. maltophilia, le temps de latence apparaît réduit de deux jours au minimum (Figures 1 et 6). De plus, l’analyse RMN du surnageant n’ayant pas révélé la présence de produits marqués, ceci montre donc que le formiate marqué est aussi produit intra cellulairement.
Au bout de 8 jours de réaction, l’amplitude du pic de formiate augmente signifîcativement (par un facteur 10 environ), ce qui signifie que la concentration en formiate produit est plus importante qu’à 5 jours (Figures 6. a et 6.b). Par ailleurs, de nouveaux pics intracellulaires marqués au 13C apparaissent dont un pic (d = 182.2 ppm) pouvant correspondre à l’empreinte d’un des trois carbones contenus dans le lactate, ainsi qu’une forêt de pics dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 15 - 65 ppm (Figure 6.b).
Après 12 jours de cinétique, l’amplitude du pic RMN relatif au formiate diminue signifîcativement (par un facteur 10 environ) par rapport au pic obtenu à 8 jours (Figure 6.b et 6.c). Le composé qui semble être du lactate est toujours présent, dans des proportions comparables à celles obtenues à 8 jours. Par contre, la forêt de pics visible dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 15 - 65 ppm estplus intense (Figures 6.b et 6.c) et de nouveaux composés marqués au 13C apparaissent aussi dans la zone de déplacements chimiques comprise entre 125 - 140 ppm (Figure 6.c). Ce phénomène est caractéristique d’une activité métabolique des cellules. Comme les trois carbones du lactate ne sont pas marqués, il est important de souligner que ce lactate marqué ne peut donc pas provenir d’une réduction directe du 13C02. Cette production de lactate marqué peut néanmoins résulter d’une fixation de 13C02 et/ou de 13C-formiate sur des molécules organiques déjà présentes initialement dans les cellules, tout comme les composés marqués relatifs aux nouveaux pics (d = 125 - 140 ppm). Une explication possible à ces observations est l’établissement d’une synergie entre les deux bactéries en présence. En effet, S. maltophilia peut réduire le C02 en formiate, puis excréter le formiate produit en dehors de sa cellule pour que M. oxydans puisse l’utiliser et former de nouveaux composés nécessaires à sa subsistance tels que le lactate ou d’autres produits dont les empreintes sont incluses dans les forêts de pics. Néanmoins, l’analyse RMN du surnageant a mis seulement en évidence les signaux des substrats 13C02 et H13C03 mais pas celui du 13C- formiate. Une hypothèse probable est que la bactérie M. oxydans capte et introduit le formiate produit dans ses cellules dès que le formiate a été excrété par la bactérie S. maltophilia, ce qui expliquerait la diminution significative du pic de 13C-formiate observée à 12 jours (Fig. 6.c). La présence de la bactérie M. oxydans boosterait donc la réduction du CO2 par S. maltophilia et donc ainsi la production de 13C-formiate ; ce qui peut aussi expliquer la diminution de la phase de latence pour la production de 13C-formiate. Une telle synergie entre S. maltophilia et M. oxydans est tout à fait réaliste dans ces conditions de réaction (c’est-à-dire sous CO2 pur) car M. oxydans est aérobie facultative (P. Schumann et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1999, 49(1): p. 175-177) ; ce qui n’est pas le cas de M. trichosporium OB3b qui est aérobie stricte (N. Dorina et al., Applied biochemistry and microbiology, 2008, 44(2): p. 182-185).
II. Essai de réduction du CO2 en réacteur semi-fermé, assisté par électrolyse 1. Dispositif électrochimique et son principe
Le polymère Poly-3-Hydroxybutyrate (PHB) est dépolymérisé en 3-Hydroxybutyrate qui est un donneur identifié d’électrons et de protons pour la réaction de réduction du CO2 (section B] 1.3. e]). Néanmoins, le stock intracellulaire de PHB est fini. L’idée est donc fournir sans limitation et de manière continue les électrons et protons requis pour la réaction grâce un dispositif électrolytique in situ et peu cher, de sorte que les performances de la réaction de réduction du CO2 soient améliorées et perdurent dans le temps. Ce dispositif électrochimique vise donc à se substituer aux donneurs intracellulaires de protons et d’électrons. Un réacteur semi-fermé assisté par électrolyse (ou bio-électrolyseur) a ainsi été mis en œuvre pour intensifier la réaction de réduction du CO2 catalysée par la bactérie S. maltophilia.
Dans ce dispositif à 3 électrodes (Figure 7 et section A] 5), la cathode polarisée a pour rôle de fournir les électrons nécessaires à la réaction de réduction du CO2 en un composé dont le degré d’oxydation moyen du carbone est inférieur à celui du carbone dans la molécule CO2 (ce composé est noté CO2, réduit) alors que l’oxydation de l’eau à l’anode permet d’une part de fournir les protons et d’autre part de fermer le circuit électrique; l’électrode de référence permet quant à elle de maintenir une tension de polarisation (Vpoiarisation) constante à la cathode. Classiquement, une électrode de référence Ag/AgCl est utilisée. Une condition nécessaire pour que ce dispositif fonctionne est que la bactérie S. maltophilia soit électro-active en réduction, c’est-à-dire capable d’échanger des électrons avec la cathode. Or, jusqu’à présent, la bactérie S. maltophilia n’est connue que pour échanger des électrons en oxydation, c’est-à-dire avec une anode (K. Venkidusamy and M. Megharaj, Frontiers in microbiology, 2016, 7: p. 509-518 ; H. Xue et al., Sensores and Actuators B: Chemical, 2017, 243: p. 303-310 ; J. Shen et al., Bioelectrochemistry, 2017, 114: p. 1-7).
Dans un premier temps, la tension de polarisation est choisie sur une base thermodynamique. Le potentiel d’oxy do -réduction du couple Acétoacétate/3-Hydroxybutyrate étant de -0,53 V vs Ag/AgCl à pH 6,4 (P .A. Loach, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 1976, 1 : p. l22), il faut donc imposer initialement un potentiel plus important (par valeur absolue) que ce potentiel (comme par exemple -0,7 V vs Ag/AgCl) pour que la bactérie ait un intérêt énergétique à utiliser les électrons de l’électrode plutôt que ceux provenant de l’oxydation du 3-Hydroxybutyrate. Néanmoins, si le stock de PHB intracellulaire, source d’énergie et de 3- Hydroxybutyrate, s’épuise en cours de réaction par le métabolisme général de la bactérie, cette contrainte sur le potentiel sera levée et un potentiel plus faible (par valeur absolue) que -0,53 V vs Ag/AgCl à pH 6,4 pourra être mis en œuvre. Par ailleurs, le potentiel retenu est préférentiellement choisi plus bas que ceux des couples oxydant-réducteur CO2/CO2, réduit impliquant le CO2 en tant qu’oxydant de manière à favoriser la réduction du CO2 à la cathode ; le choix du potentiel de polarisation permet aussi de favoriser la production d’un produit de réduction CO2, réduit par rapport à d’autres produits de réduction possible du CO2 (parmi le méthane et le formiate par exemple). De manière générale, un potentiel supérieur ou égal à -0,8 V vs Ag/AgCl (par exemple -0,7 V vs Ag/AgCl) permettra (i) de limiter la réduction du proton en hydrogène (FL) et (ii) d’éviter la réduction des phosphates et ions magnésium présents dans le milieu de réaction. Les potentiels minimum en dessous desquels les réductions du proton et du CO2 se produisent pourront être déterminés précisément par voltamétrie cyclique, dans les conditions de réaction, pour tenir compte à la fois des phénomènes thermodynamique et cinétique (surtensions) ; les surtensions dépendant notamment du matériau choisi pour la cathode.
D’après la littérature, la nature du matériau peut avoir également un impact significatif sur l’établissement du transfert électronique entre la bactérie et l’électrode de travail (M. Rosenbaum et al., Bioresource Technology, 2010, 102(1): p. 324-333). La composition chimique et la structuration de surface peuvent en effet induire différentes réponses électrochimiques. Parmi les nombreux matériaux d’électrodes disponibles, le graphite est poreux et présente une rugosité de surface. Le graphite est donc susceptible de favoriser le contact entre la bactérie et l’électrode, ce qui pourrait favoriser la conduction électronique (M. Rosenbaum et al., Bioresource Technology, 2010, 102(1): p. 324-333). Le graphite est donc choisi comme matériau de cathode pour les essais présentés. De plus, une anode en platine est retenue pour ces essais en vue de réduire les surtensions à l’anode et ne pas limiter les phénomènes cathodiques. D’autres matériaux d’anode peuvent aussi être envisagés, tel que l’acier. Une surface d’anode plus grande que la surface de la cathode est aussi privilégiée pour ne pas limiter les réactions de réduction à la cathode.
Par ailleurs, un bullage continu de C02 pur est aussi mis en œuvre pour saturer la suspension en C02 et désoxygéner la solution de sorte à (1) éviter la compétition avec la voie métabolique aérobie (où le 02 deviendrait accepteur d’électrons à la place du C02) et (2) préserver l’activité catalytique de réduction de l’enzyme réductrice du C02 (en effet, l’oxygène semble avoir un effet inhibiteur sur cette enzyme, section B] 1.3. b). Afin de garantir un transfert de masse gaz- liquide optimal, l’apport en C02 est réalisé par un distributeur poreux à gaz et un volume de liquide (permettant un fort WM (Volume de gaz par Volume de liquide par Minute) est mis en œuvre. Un rapport surface de cathode/volume de liquide élevé est également souhaitable pour concentrer le produit formé par réduction du C02 à la cathode ; un rapport surface de cathode/volume de liquide de l’ordre de 10 m2/m3 est souhaitable.
2. Un premier exemple de bio-électrolyseur alimenté par du CO2 pur
La Figure 8 montre l’évolution du courant mesuré au cours du temps pour le premier bio- électrolyseur implémenté avec la bactérie S. maltophilia pour la réduction du C02. Ce courant est exprimé en densité de courant (c’est-à-dire en A/m2) ; la densité de courant correspond au courant mesuré (en A) rapporté à la surface de cathode projetée (en m2). Le test est conduit avec une tension de polarisation de -0,7 V vs Ag/AgCl.
Le courant initial nul (0,0 ± 0,01 A/m2) correspond à la ligne de base (Fig. 8. a), ce qui est confirmé par la voltamétrie cyclique réalisée en début de cinétique (données non montrées). Ceci montre donc qu’initialement, aucun élément présent dans la suspension bactérienne ne s’oxyde ou ne se réduit.
Puis, un petit courant de réduction est observé (jusqu’à -0,2 A/m2 à 1,2 jours). Cependant, ce courant revient à la ligne de base avant qu’un courant de réduction significatif apparaisse à partir du deuxième jour (Fig. 8. a) ; le profil de ce courant suit une allure comparable à celle d’une cinétique de croissance microbienne (Fig. 8. a). Il n’y a cependant pas de croissance microbienne visible dans la suspension car la densité optique (D06oo) de la suspension bactérienne mesurée initialement est de 5,6 alors qu’elle est de 2,2 à 5,7 jours (soit 136 h). Néanmoins, ceci n’exclut pas la croissance d’un biofilm à la surface de la cathode ; la bactérie S. maltophilia est en effet capable de former rapidement des bio films sur différents types de surface (O. Madhi et al., Current protocols in microbiology, 2014, 32: Unit-6F.l . l-6F. l .6).
Afin de vérifier expérimentalement la dépendance de ce courant de réduction avec le C02, des barbotages d’un gaz noble inerte (argon) ont été réalisés dans le but de chasser tout ou partie du C02 dissous. Un premier bullage d’argon à un débit de 10 mL.min 1 est réalisé pendant 3 h et a pour conséquence de réduire quasi- instantanément le courant de réduction par un facteur 2 environ, de -1,4 à -0,8 A/m2 (Fig. 8. a et 8.b). Puis, tout débit de gaz est coupé et le courant de réduction demeure quasi-constant, aux alentours de -0,8 A/m2 (Fig. 8.c). La constance du courant de réduction peut s’expliquer par la présence de CO2 résiduel dans la suspension bactérienne ; en effet, le CO2 est très soluble dans l’eau et le débit d’argon imposé était probablement trop faible pour chasser tout le CO2 dissous.
Lorsque qu’un faible débit de CO2 est réappliqué (5 mL.min 1), alors le courant de réduction augmente à nouveau, jusqu’à retrouver sa valeur stable initiale, soit -1,4 A/m2 Fig. 8. a et 8.d). Puis, l’application d’un fort débit d’argon (100 mL.min 1) pendant 3 h a pour conséquence de faire disparaître tout courant de réduction puisque le courant remonte à 0,0 A/m2 (Fig. 8.e). Ces conditions sont donc suffisantes pour chasser tout le CO2 dissous dans la suspension et confirment que ni la réduction des protons ni celle des phosphates ne se produit à ce potentiel de polarisation (-0,7 V vs Ag/AgCl). Enfin, le courant ré-augmente quand un flux de CO2 est réalisé à nouveau (à 25 mL.min 1) et atteint une valeur significative de -0,3 A/m2 (Fig. 8.f). L’ensemble de ces éléments montre que le courant de réduction est bien lié à la disponibilité du CO2 dans le milieu de réaction et que le CO2 est l’élément qui se réduit à la cathode.
La réaction qui se produit à la cathode est donc :
CO2 + H+ + 2e- ® HCOO (Equation 7)
Cette réaction de réduction résulte de l’activité enzymatique de la cellule qui ne requiert plus de donneurs d’électrons et de protons intracellulaires.
Des voltamétries cycliques (CVs) sont aussi réalisées pendant l’expérience. En particulier, une CV réalisée à 5,7 jours confirme l’adéquation du courant mesuré avec le potentiel de polarisation imposé (donnée non montrée). Cette voltamétrie montre également un palier de diffusion pour le courant de réduction allant de -0,2 Y à -0,8 V vs Ag/AgCl, ce qui suggère qu’une tension de polarisation plus faible par valeur absolue (par exemple -0,2 V vs Ag/AgCl) peut être suffisante pour obtenir le même courant de réduction.
En conclusion, cette expérience démontre la capacité de ce dispositif bio-électrolytique à se substituer aux donneurs d’électrons et de protons intracellulaires nécessaires à la réduction du C02 catalysée par la bactérie S. maltophilia.
3. Etude de reproductibilité
En plus de l’essai présenté précédemment, quatre autres essais indépendants de bio- électrolyseur selon le mode décrit par l’Invention ont permis de confirmer, par des alternances de bullage CO2 pur/argon/CCh pur, que le CO2 est bien réduit à la cathode et qu’il génère un courant significatif de réduction CCh-dépendant (données non montrées). Au cours de ces essais, deux potentiels de polarisation ont été testés : -0,7 V et -0,8 V vs Ag/AgCl et des densités de courant de réduction du CO2 comprises entre -0,5 et -1,5 A/m2 ont été obtenues.
Par ailleurs, ces essais ont validé le fait que le courant de réduction du CO2 se stabilise après quelques jours de bullage sous CO2 et qu’après le bullage d’argon, un bullage de CO2 permet au courant de revenir à sa valeur stable (atteinte avant bullage d’argon). Ceci met en évidence la robustesse de ce système de bio-électrolyse.
4. Un exemple de bio-électrolyseur alimenté par un mélange CO2/CH4
Un test complémentaire en bio-électrolyseur a permis de démontrer que la présence de méthane (CEE) dans le mélange gazeux qui contient le CO2 et qui alimente le bio-électrolyseur n’a pas d’influence sur l’activité CCh-réductrice de la bactérie S. maltophilia à la cathode (données non montrées). En effet, un bullage de CO2/CH4 (1 : 1 ou 1 :2 v/v)_permet de maintenir un courant de réduction équivalent à celui obtenu sous CO2 pur dans les mêmes conditions. Ce résultat est particulièrement intéressant dans le cadre du traitement du biogaz, contenant du CEE et du CO2 en fortes teneurs.
L’analyse GC-TCD des gaz d’entrée et de sortie du bio-électrolyseur a permis de mesurer un flux volumique expérimental de CO2 réduit de 1,3 mL CCh/min pour un réacteur d’un volume de 60 mL (ce qui équivaut donc à un flux de 1,9 m3 CCh/j pour un réacteur d’un volume de 60 L). Ce flux est près de 60 fois supérieur au flux volumique théorique de CO2 réduit (Fco2,voi) calculable sur la base du courant de réduction du CO2 obtenu (par la loi de Faraday). Ceci signifie donc que les bactéries adhérées à la cathode ne sont pas les seules à participer à la réduction du CO2 et que les bactéries planctoniques (en suspension dans le liquide du bio- électrolyseur) y contribuent aussi. Une éventuelle fixation de ce C02 par les bactéries planctoniques n’est pas non plus à exclure.
Enfin, il est important de remarquer que le flux volumique expérimental de CO2 réduit en bio- électrolyseur (soit 1,3 mL CCh/min) est 130 fois plus important que celui obtenu en réacteur fermé (soit 0,6 mL CO2/J = 0,01 mL CCh/min pour une concentration initiale en bactéries de 2 g de cellules sèches/L, tableau 1). Cette augmentation significative dans le bio-électrolyseur peut se justifier par (1) un transfert de masse en CO2 amélioré grâce à l’apport gazeux au sein de la suspension et (2) une assistance électrochimique qui permet à la bactérie de disposer d’une source d’électrons et de protons inépuisable.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de valorisation du CCh par réduction biologique comprenant une étape de mise en contact d’une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia avec une phase gazeuse contenant du C02 dans des conditions permettant la réduction du C02.
2. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon la revendication 1, selon lequel l’étape de mise en contact entre la phase liquide et le C02 est réalisée dans un réacteur fermé ou semi-fermé ou continu.
3. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon la revendication 2, dans lequel la phase gazeuse contenant du C02 est injectée au centre du réacteur, par exemple par un distributeur à gaz.
4. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon la revendication 2, selon lequel l’air présent dans un espace de tête du réacteur est supprimé, et la phase gazeuse contenant du CO2 est injectée dans ledit espace de tête du réacteur, de manière à placer la réaction de réduction du CO2 sous une atmosphère constituée uniquement de ladite phase gazeuse.
5. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon la revendication 1, selon lequel l’étape de mise en contact entre la phase liquide et la phase gazeuse contenant du C02 est réalisée en réacteur semi-fermé ou continu, dans lequel la phase gazeuse contenant du CO2 est apportée en continu, préférentiellement par bullage, à l’intérieur du réacteur.
6. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel on produit du formiate et/ou du méthane (CH4) par réduction du CO2.
7. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications 2 à
6, selon lequel l’étape de mise en contact entre la phase liquide et la phase gazeuse contenant du C02 est réalisée en présence d’un donneur d’électrons et de protons, intra ou extracellulaire.
8. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications 2 à
7, selon lequel le réacteur contient une assistance électrochimique, préférentiellement de type bio-électrolyse.
9. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon Finie des revendications précédentes, comprenant une phase préliminaire de co-culture de Stenotrophomonas maltophîlia avec au moins une bactérie méthanotrophe avant l’étape de mise en contact de la phase liquide avec la phase gazeuse.
10. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel la phase liquide contient également au moins un micro-organisme apte à utiliser le formiate pour produire des composés organiques d’intérêt, tels que du méthane du lactate ou des alcools, notamment en C1/C5.
11. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse est un biogaz ou des fumées industrielles et/ou agricoles riches en C02.
12. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse comprend au moins 30% en volume de C02 par rapport au volume total de la phase gazeuse.
13. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel la phase gazeuse comprend entre 30% et 100% en volume de C02 par rapport au volume total de la phase gazeuse.
14. Procédé de valorisation du C02 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel la phase liquide comprend au moins 3 g de cellules sèches/L de Sîenotrophomonas maltophîlia, au moins 10 g de cellules sèches/L, au moins 20 g de cellules sèches/L, 30 g de cellules sèches/L, 40 g de cellules sèches/L, 50 g de cellules sèche /L, 60 g de cellules sèches/L, 70 g de cellules sèches/L, 80 g de cellules sèches/L, 90 g de cellules sèches/L, 100 g de cellules sèches/L.
15. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel on ajoute de l’ammonium et/ou ammoniaque dans la phase liquide et/ou l’ammoniac dans la phase gazeuse, notamment entre 5 mmol/L et 100 mmol/L, préférentiellement entre 20 et 30 mmol/L.
16. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, selon lequel on ajoute du PHB dans la phase liquide, préférentiellement entre 30 g/L et 3 g/L, notamment environ 0.3 g/L.
17. Procédé de valorisation du CO2 par réduction biologique selon l’une des revendications précédentes, dans lequel du formiate est produit, ledit procédé comprenant une étape additionnelle consistant à récupérer le formiate produit sous forme de formiate et/ou d’acide formique et/ou des composés organiques d’intérêt issus de l’utilisation du formiate par un micro-organisme apte à utiliser ledit formiate pour produire des composés organiques d’intérêt.
18. Procédé de traitement d’un biogaz ou de fumées industrielles riches en C02 et/ou agricoles riches en C02 comprenant une étape de réduction du C02 par réduction biologique comprenant une étape selon laquelle on met en contact lesdits biogaz et/ou fumées avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du C02.
19. Procédé de production de formiate à partir de C02, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du C02avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du C02 en formiate.
20. Procédé de production de méthane à partir de C02, comprenant une étape selon laquelle on met en contact une phase gazeuse contenant du C02 avec une phase liquide contenant la bactérie Stenotrophomonas maltophilia dans des conditions permettant la réduction du C02 en méthane.2î . Utilisation d’une bactérie Stenotrophomonas maltophilia pour la production de formiate et/ou de méthane par réduction de C02.
EP19744759.2A 2018-06-05 2019-06-04 Procédé de valorisation du co2 par réduction biologique Pending EP3788157A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1854867A FR3081882B1 (fr) 2018-06-05 2018-06-05 Procede de valorisation du co2 par reduction biologique
PCT/FR2019/051316 WO2019234344A1 (fr) 2018-06-05 2019-06-04 Procédé de valorisation du co2 par réduction biologique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3788157A1 true EP3788157A1 (fr) 2021-03-10

Family

ID=63491644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP19744759.2A Pending EP3788157A1 (fr) 2018-06-05 2019-06-04 Procédé de valorisation du co2 par réduction biologique

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11584943B2 (fr)
EP (1) EP3788157A1 (fr)
CN (1) CN112384628A (fr)
CA (1) CA3102223A1 (fr)
FR (1) FR3081882B1 (fr)
WO (1) WO2019234344A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220110968A (ko) * 2021-02-01 2022-08-09 에스케이이노베이션 주식회사 이산화탄소 및 대기오염물질 저감방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2013E (fr) 1903-06-09 1903-11-24 Louis Denayrouze Lampe combinée à gaz et à vapeur d'hydrocarbure
FR2955335B1 (fr) * 2010-01-19 2014-10-03 Ecole Norm Superieure Lyon Procede de production de gaz methane
EP2944696A1 (fr) * 2014-05-13 2015-11-18 Evonik Degussa GmbH Procédé de production de composés organiques
EP3301181A1 (fr) * 2016-09-30 2018-04-04 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG Électrosynthèse microbienne autotrophe

Also Published As

Publication number Publication date
CN112384628A (zh) 2021-02-19
FR3081882A1 (fr) 2019-12-06
FR3081882B1 (fr) 2021-01-15
WO2019234344A1 (fr) 2019-12-12
US20210222212A1 (en) 2021-07-22
US11584943B2 (en) 2023-02-21
CA3102223A1 (fr) 2019-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Enzyme-assisted microbial electrosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate) via CO2 bioreduction by engineered Ralstonia eutropha
Katsyv et al. Overcoming energetic barriers in acetogenic C1 conversion
US11105002B2 (en) Microbial electrochemical cells and methods for producing electricity and bioproducts therein
Bae et al. Valorization of C1 gases to value-added chemicals using acetogenic biocatalysts
JP5773972B2 (ja) 微生物によるアルコール製造プロセス
Gonzales et al. Nonphotosynthetic biological CO2 reduction
FR2923491A1 (fr) Utilisation de bacteries pour la production de sources de bioenergie
Arbter et al. Metabolomic and kinetic investigations on the electricity‐aided production of butanol by Clostridium pasteurianum strains
Schwarz et al. Acetogenic conversion of H2 and CO2 into formic acid and vice versa in a fed-batch-operated stirred-tank bioreactor
WO2016113418A1 (fr) Combinaison de chaperonnes bacteriennes affectant positivement la physiologie d&#39;une cellule eucaryote native ou portant une ingenierie
US10717997B2 (en) Method for storing gaseous hydrogen through producing methanoate (formate)
EP3788157A1 (fr) Procédé de valorisation du co2 par réduction biologique
Bährle et al. Current status of carbon monoxide dehydrogenases (CODH) and their potential for electrochemical applications
Govindaraju et al. Employing methylotrophs for a green economy: one-carbon to fuel them all and through metabolism redesign them
EP2379780B1 (fr) Nouveau procédé électrochimique pour la production d&#39;hydrogène et dispositif pour sa mise en oeuvre
KR102193010B1 (ko) 생물학적 c1 가스 전환 공정을 위한 생물전기화학반응기 및 이를 이용한 공정방법
WO2016120801A1 (fr) Procédé de prétraitement thermo-chimique d&#39;une biomasse ligno-cellulosique en voie sèche
Al-Shameri Powering biocatalytical reactions with hydrogen
Oshlag Tiny Purple Toxin Eater: Exploring and Expanding the Metabolic Capacity of Rhodopseudomonas palustris
WO2017017355A1 (fr) Procédé microbiologique de production de formiate à partir de co2 au moyen d&#39;une souche méthanotrophe de classe ii
WO2014025992A1 (fr) Procédés de fabrication d&#39;alcools à partir d&#39;acides carboxyliques par fermentation
Mabala Aptitude d’écosystèmes anaérobies industriels à produire du méthane à partir d’éthanol en conditions psychrophile, mésophile et thermophile
Silva Positive aspects issued from bio corrosion studies: from hydrogen production to biofuel cells
Chatelus Contribution to the study of the role of sulfate-reducing bacteria in bio-corrosion phenomenon
Mabala Ability of industrial anaerobic ecosystems to produce methane from ethanol in psychrophilic, mesophilic and thermophilic conditions

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20201201

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)