WO2016113418A1 - Combinaison de chaperonnes bacteriennes affectant positivement la physiologie d'une cellule eucaryote native ou portant une ingenierie - Google Patents

Combinaison de chaperonnes bacteriennes affectant positivement la physiologie d'une cellule eucaryote native ou portant une ingenierie Download PDF

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WO2016113418A1
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eukaryotic cell
expression
chaperones
chaperone
protein
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PCT/EP2016/050832
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Denis Pompon
Stéphane GUILLOUET
Jillian MARC
Nathalie GORRET
Carine Bideaux
Christel Boutonnet
Florence BONNOT
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Institut National De La Recherche Agronomique
Institut National Des Sciences Appliquees De Toulouse
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to the field of cellular engineering, in particular eukaryotic cells. More particularly, the invention relates to eukaryotic cells having improved growth and / or metabolic properties, as well as their uses for the production of compounds of interest. In particular, the invention relates to eukaryotic cells expressing a specific combination of chaperones. The invention finds applications in particular in the field of the production of recombinant proteins.
  • the present invention provides eukaryotic cells with improved performance, allowing the development of optimized expression systems.
  • the inventors surprisingly observed that coexpression in yeast of a set of three bacterial chaperones (RbcX, GroES and GroEL) conferred eukaryotic cells with remarkable metabolic properties, especially in terms of expression and functional folding of heterologous or endogenous proteins. Pursuing their investigations, the inventors have also demonstrated that this combination of chaperones also allowed to accelerate the growth of yeasts and remove the toxic effects of other engineering, for example when PRK kinase is co-expressed in the cell. The inventors have moreover verified and obtained the same effects on the performances on various eukaryotic cells, confirming the interest and the great potential of these unexpected results.
  • An object of the present invention therefore relates to a eukaryotic cell, characterized in that it expresses RbcX, GroES and GroEL chaperones.
  • the present invention relates to a transformed eukaryotic cell, characterized in that it contains:
  • the invention also relates to a eukaryotic cell containing:
  • the eukaryotic cells of the invention do not contain a coding sequence for the RbcL and / or RbcS subunit of a RuBisCO enzyme of form I of bacterial origin.
  • the invention notably proposes a yeast transformed as indicated above.
  • the subject of the invention is also the use of a combination of expression cassettes allowing the expression of an RbcX chaperone and GroES and GroEL chaperones, to improve the physiology of a eukaryotic cell, and in particular to increase the growth rate of said eukaryotic cell and / or increase the resistance of said eukaryotic cell to environmental stress and / or increase the resistance of said cell to the toxicity of a compound synthesized by the eukaryotic cell and / or for the production of a recombinant protein.
  • the subject of the invention is also a biotechnological process for producing at least one compound selected from chemical molecules and proteins, characterized in that it comprises a step of culturing a eukaryotic cell according to the invention under conditions allowing the synthesis, by said eukaryotic cell, of this compound, and a step of recovering said compound.
  • the invention more particularly proposes a method for producing a recombinant protein comprising (i) inserting a sequence encoding said protein into a eukaryotic cell expressing RbcX, GroES and GroEL, (ii) culturing said cell in conditions permitting the expression of said sequence and optionally (iii) the recovery or purification of said protein.
  • Figure 1 Kinetics of ethanol production strains lb, 18b, 102, 15, 14b.
  • the error bar represents a standard deviation of 3 independent cultures.
  • bacterial chaperones can be expressed in the cytosol of a eukaryotic cell and retain their chaperone function in said eukaryotic cell.
  • the bacterial chaperone function is added to the cytosolic chaperone function already present in the eukaryotic cell.
  • the inventors have furthermore discovered that the expression of a particular triplet of chaperones, namely the bacterial chaperones GroEL and GroES and the RbcX chaperone, confers on the transformed eukaryotic cell which expresses them properties of particular interest in terms of growth, d expression and functional folding of proteins.
  • the observed effects require obligatorily the simultaneous presence of the three chaperones mentioned, preferably coming from at least two different microorganisms. If it was known that coexpression of chaperones is likely to improve in a bacterial system the folding of heterologous proteins and therefore potentially the performance of a bioprocess dependent, it was not foreseeable that a specific interorganism combination of three bacterial chaperone proteins, can be particularly effective in being expressed in eukaryotic context. The molecular mechanisms leading to the effects of the invention are currently unknown even if they are probably, at least in part, related to protein folding or control of their intracellular fate.
  • a surprising generalist role is played by the protein of the RbcX family (described in the prior art as specialized for the functional association of the RuBisCO complex of photosynthetic organisms), in the presence of GroES and GroEL chaperones which play complementary roles.
  • This feature of the invention suggests that the observed effect can not be fully attributed to a facilitated folding role and may involve other mechanisms such as modulation of the lifetime of specific proteins, assembly of complexes or modification of their properties, or even specific effects of a nature to be defined.
  • the invention therefore proposes to transform eukaryotic cells so that they express a particular triplet of chaperones, namely the bacterial chaperones GroEL and GroES and chaperone RbcX.
  • Such transformed cells may find many applications, especially in the context of the production of recombinant proteins.
  • the subject of the invention is therefore a eukaryotic cell, characterized in that it expresses RbcX, GroES and GroEL chaperones.
  • the GroEL and GroES chaperones belong to the family of heat shock proteins (HSP). These chaperones are present in many bacteria.
  • these chaperones are referred to as "general chaperone" in the sense that they are known to co-act to permit efficient folding of a very large number of proteins (M. mayhew et al. 1996, "Protein folding in the central cavity of the GroEL-GwES chapewnin complex” Nature 1996 Feb 1; 379 (6564): 420-6).
  • the GroEL and GroES chaperones can come from any bacterium that expresses them, and, for example, E. coli (Gene ID: 948655 and 948665), S. elongatus (Gene ID: 3199735). , 199535 and 198035), S. pneumonia (GenBank accession number: AF 1 17741), S. pyogenes (GenBank accession number: SPGROELGN), S. aureus (GenBank accession number: STAHSP) or P. aeruginosa (GenBank accession number ATCC9027).
  • E. coli Gene ID: 948655 and 948665
  • S. elongatus Gene ID: 3199735). , 199535 and 198035
  • S. pneumonia GenBank accession number: AF 1 17741
  • S. pyogenes GenBank accession number: SPGROELGN
  • S. aureus GenBank accession number: STAHSP
  • P. aeruginosa GenBank
  • sequence similarity of the chaperones is 61% between GroEL1 of S. elongatus and GroEL of E. coli; 56% between GroEL2 of S. elongatus and GroEL of E. coli; 63% between GroELl and GroEL2 of S. elongatus.
  • the cells according to the invention also express the known RbcX chaperone in cyanobacteria and plants to participate in the good assembly of the RbcL and RbcS subunits of Rubisco.
  • this chaperone is designated as "chaperone specific” in the sense that this protein is known to play a role in the functional association of protein complexes, as is particularly the case with Rubisco (S Saschenbrecker et al., 2007, “Structure and function of RbcX, an assembly chaperone for hexadecameric Rubisco," Cell 2007 Jun 15; 129 (6): 1189-200).
  • the RbcX chaperone can come from any cyanobacterium expressing it, and, for example, from S. elongatus (SEQ ID No. 3), Synechocystis sp. (Kaneko et al., "Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium synechocystis sp. Strain PCC6803.) Sequence determination of the resulting genome and assignment of potential protein-coding regions.” DNA Res.3 (3), 109 - 36 (1996)), Anabaena sp. (Li et al., J.
  • a “chaperone activity” refers to a protein folding action and / or the functional association of protein complexes.
  • the chaperones used come preferentially from two different organisms.
  • the chaperones can come from one or more different bacteria.
  • the three chaperones originate from at least two distant Gram negative bacterial species, at least one of which is a cyanobacterium.
  • At least one of the general-interest chaperones GroES and GroEL does not come from a cyanobacterium or from another bacterium expressing an RuBisCO complex.
  • the GroES and GroEL chaperones can come from the same bacterium or from two different bacteria. In a particular embodiment, the GroES and GroEL chaperones come from E. coll.
  • the GroES and GroEL chaperones come from E. Coli and the chaperone RbcX comes from Synechococcus elongatus.
  • the three chaperones GroES, GroEL and RbcX come from Synechococcus elongatus.
  • the transformed cell can express either one or the two isoforms (GroEL1 and GroEL2) of the GroEL chaperone, preferably both isoforms.
  • a protein "comes” from a given organism as soon as it has an amino acid sequence identity greater than 95% and the same function as the relevant protein of said organism.
  • "GroES” and “GroEL” denote any protein exhibiting chaperone activity and having between 65 and 100% amino acid identity with GroES and GroEL of E. coli K 12, respectively.
  • "GroES” and “GroEL” denote general chaperones with a lower percentage of identity, and in particular between 55 and 65%, and more particularly between 56 and 63%, such as general chaperones of S. elongatus.
  • coli can be verified for example by substituting in the various examples described below, the expression cassette coding for GroES or GroEL native to E. coli by chaperone variants to be evaluated.
  • the RbcX chaperone is very far from GroEL and GroES and its sequence can not be aligned with the sequences of these two chaperones.
  • RbcX denotes any protein, in particular of cyanobacteria, having a chaperone activity and having more than 50% amino acid sequence identity with the RbcX chaperone encoded by the sequence SEQ ID No: 3 and retaining the chaperone activity specific for this protein.
  • the specific chaperone activity can be verified in a yeast expressing the RbcL and RbcS subunits of the RuBisCO of S. elongatus, replacing the expression cassette including the sequence SEQ ID No. 3 by any other sequence to be evaluated, and in measuring by an in vitro test on cell extracts the RuBisCO activity thus obtained.
  • the present invention is implemented with a chaperone RbcX whose amino acid sequence identity with chaperone RbcX encoded by SEQ ID No: 3 is greater than 80%, preferably greater than 90%, more preferably greater than at 95%, still more preferably above 99%.
  • the invention can be implemented with any type of eukaryotic cell, originating from a unicellular or multicellular organism.
  • the combination of chaperones according to the invention can be expressed in a yeast cell, fungus, plant, animal such as a mammal, etc.
  • the present invention relates to a transformed yeast expressing a specific chaperone RbcX, a general bacterial chaperone GroES, and a generalized bacterial chaperone GroEL.
  • the present invention relates to a transformed yeast, characterized in that it contains:
  • the invention can be implemented with any yeast of interest.
  • the yeast is chosen from Saccharomyces, Yarrowia and Pichia.
  • the yeast transformed according to the invention is a Saccharomyces cerevisiae cell.
  • the yeast transformed according to the invention is a Yarrowia lipolytica cell, or a Pichia pastoris cell.
  • Pichia pastoris is particularly interesting for the production of recombinant proteins.
  • Pichia has a eukaryotic protein expression system that is very efficient both for secretion and for intracellular expression. It is particularly suitable for large scale production of recombinant eukaryotic proteins.
  • Pichia can be used for the production of high-yielding excreted proteins in order to reduce costs and production times compared to those associated with mammalian cell expression systems.
  • Yarrowia lipolytica is also suitable for use in the production of recombinant proteins.
  • Yarrowia has (i) high density growth, (ii) high secretion, (iii) lack of alkaline protease EPA and (iv) ability to produce S. cerevisiae invertase allows the use of sucrose as a carbon source (Nicaudet al., 1989). This last property is particularly interesting in the case of industrial production, because this strain can grow efficiently on inexpensive substrates such as molasses.
  • the invention also relates to a eukaryotic cell derived from a multicellular organism, such as an animal cell and in particular a transformed mammalian cell expressing a specific RbcX chaperone, a generalized bacterial chaperone GroES, and a generalized bacterial chaperone GroEL.
  • such a eukaryotic cell is transformed to contain:
  • the genes encoding the GroEL, GroES and RbcX chaperones are introduced into eukaryotic cells in a form allowing their expression in said cells.
  • the sequences coding for chaperones are associated with promoter sequences allowing their transcription.
  • the same promoter sequence is associated with the coding sequences for the three chaperones.
  • the RbcX chaperone is associated with a particular promoter different from the promoter (s) associated with the GroEL and GroES chaperones.
  • each chaperone is associated with a different particular promoter.
  • Promoters useful in the context of the present invention include constitutive promoters, i.e., promoters that are active in most cellular states and environmental conditions, as well as inducible promoters that are activated or repressed by exogenous physical or chemical stimuli. thus inducing a variable level of expression depending on the presence or absence of these stimuli.
  • constitutive promoters are those of the genes TEF1, TDH3, PGI1, PGK, ADH1.
  • Examples of inducible promoters are the tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PHO5 promoters.
  • the promoters used will be different from one cassette to another.
  • Expression cassettes of the invention further include the usual sequences such as transcriptional terminators, and optionally other transcriptional regulatory elements.
  • the expression cassettes according to the invention may be inserted into the chromosomal DNA of the host cell, and / or carried by one or more extra-chromosomal replicon (s).
  • s extra-chromosomal replicon
  • the relative stoichiometry of these proteins is likely to play an important role in the optimal implementation of the present invention.
  • the coexpression systems described in the experimental section below are particularly relevant in this regard. The invention is however not limited to the use of these systems, and it can be implemented with any expression variant of the elements mentioned having effects at least equivalent, as they can be measured, for example, by measuring the growth of a cell transformed in a standard medium for said cell.
  • the three expression cassettes form a continuous block of genetic information. It may also be advantageous for the expression cassettes of the three chaperones to be carried by a single episomal genetic element.
  • a particularly interesting aspect of the present invention is therefore a unique "genetic plug-in" (continuous sequence of DNA) carried by an episomal element at the origin of centromeric replication. The transformation by this element is sufficient to introduce the properties of interest in wild yeasts or any engineering.
  • the genes coding for each chaperone can be introduced in one or more copies into the cell.
  • a cassette may contain several copies of a Sequence encoding GroES, GroEL or RbcX.
  • the same sequence is used each time, that is to say from the same bacterium. It is otherwise possible to use sequences from different bacteria.
  • the cells according to the present invention have improved properties (growth rate, resistance, production capacity, etc.). These cells are therefore particularly useful for the production of proteins or other compounds, or for the improvement of fermentation processes. Protein production
  • the invention also relates to a eukaryotic cell transformed to express a combination of chaperones as described above and which furthermore comprises at least one expression cassette for a heterologous protein other than said chaperones, and / or which has has undergone sequence engineering modifying the level of expression and / or the sequence of an endogenous protein.
  • the transformed eukaryotic cell is a yeast.
  • the transformed eukaryotic cell is a CHO cell.
  • the invention therefore also relates to a yeast or a CHO cell transformed to express a combination of chaperones as described above, and containing:
  • the protein of interest is not Rubisco.
  • the protein of interest is a protein other than PKR.
  • the transformed eukaryotic cell expresses Rubisco and / or PKR, it advantageously expresses at least one other heterologous protein.
  • the transformed cell expressing the chaplet triplet GroES, GroEL and RbcX and further modified to express and excrete a recombinant protein.
  • the cell according to the invention is transformed so as to produce at least one heterologous enzyme.
  • the cell is transformed to produce an enzyme selected from endotoxins, such as Bacillus thuringiensis endotoxin, lipases, subtilisins, cellulases and luciferases.
  • the cell according to the invention is transformed so as to produce at least one molecule of medical interest.
  • the cell is transformed to produce a hormone, a growth factor, an antibody, etc.
  • the molecule of medical interest is chosen from erythropoietin, type I and / or II alpha-interferons, granulocyte colony stimulating factors, insulin, growth hormones and tissue plasminogen activators. .
  • the concomitant expression, in a cell, of the general-interest chaperones GroES and GroEL and of the specific chaperone RbcX makes it possible to increase the growth rate of said cell and / or to increase the resistance of said cell to an environmental stress. , in particular to stress due to the toxicity of an element present in the culture medium of the cell.
  • Another advantageous application is to increase the resistance of the cell to the toxicity of a compound synthesized by itself, and thus the production of a compound of interest.
  • toxic intermediates for example drugs (hydrocortisone, artemisinic acid or even trictosinide, certain flavonoids for take developed processes) or reactive molecules such as unsaturated ketones, aldehydes (eg vanillin), etc.
  • Other examples are processes producing molecules that become toxic at high concentrations, for example ethanol or other alcohols. Ethanol production for example is limited by the tolerance of yeast strains to high concentrations of alcohol.
  • Other examples relate to the production of highly varied industrial chemical molecules, precursors of common products or chemical intermediates and of course biofuels.
  • the use of a eukaryotic cell expressing the combination of chaperones according to the invention advantageously makes it possible to increase the resistance of the transformed cell to the toxicity induced by the recombinant proteins it expresses.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule comprising:
  • pGAL10-CYCl synthetic promoter composed of the UAS of the GAL10 gene and the transcription initiation of the CYCl gene (POMPON et al, Methods Enzymol, 272, 51-64, 1996).
  • the expression cassettes thus obtained are listed in Table II below.
  • pCM 185 Commercial Plasmid (ATCC 87659)
  • PYeDP51 Plasmid "empty”, described in the following article: Urban P, C Mignote, Kazmaier M, Delorme F, Pompon D. Cloning, yeast expression, and char act of the coupling of distantly related Arabidopsis thaliana NADPH -cytochrome P450 reductases with P450 CYP73A5. J Biol Chem. 1997 Aug 1; 272 (31): 19176-86.
  • Synthetic genes Synechoccocus elongatus genes encoding the RuBisCO subunits, the RuBisCO assembly specific chaperone (RbcX), the PRK and the GroES, GroEL1 and GroEL2 general chaperones were synthesized after proprietary recoding for yeast using an inhomogeneous and cloned codon bias in pCC6301 (commercial).
  • the coding sequences of these proteins are presented in the appendix (SEQ ID No: 1: coding sequence of RbcS, SEQ ID No: 2: coding sequence of RbcL, SEQ ID No: 3: coding sequence of RbcX, SEQ ID No: 4: PRK coding sequence, SEQ ID No: 5: GroES coding sequence, SEQ ID No: 6: GroEL1 coding sequence, SEQ ID No: 7: GroEL2 coding sequence).
  • the coding sequences of the E. coli GroES and GroEL chaperones were amplified from the bacterium, cloned into pSC-B-amp / kan (Statagene) and mounted without recoding into the expression vectors (see above). .
  • the region including the three above expression cassettes (TableXI) was amplified by PCR and cloned into the commercial plasmid pYLEXl.
  • plasmids were linearized and transformed individually into a Yarrowia lipolytica strain auxotrophic for leucine according to the Yeast Transcription Kit Yeastearn Biotech protocol and selected on minimal medium and glucose at 28 ° C. (YLEX Expression Kit Yeastearn Biotech (Cat #: FYY201-1KT)).
  • Yarrowia lipolytica POlf (ATCC®MYA2613 TM)
  • Genotype MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2 :: SUC2 Evaluation of the impact of chaperones was performed on a culture of strains POlf_01 and POlf_02 in synthetic medium without leucine at 28 ° C for 72H . 1.6. CHO cell construction
  • lentiviral transduction system To ensure easy, versatile handling and a successful transfer of the "Chaperones" plug-in to all higher eukaryotic cells, a fourth-generation lentiviral transduction system was chosen. These lentiviral particles allow to transfer indifferently plug-in immortalized or transformed primary cells from different species of higher eukaryotes such as human or murine cells for example.
  • the region including the RbcX open reading phase and the two CAS55 and CAS56 expression cassettes below were PCR amplified and XhoI-KpnI cloned into the pLVX-Puro commercial plasmid from Clontech (Catalog No. 632164).
  • Table XV expression vector
  • the plasmids pLVX-Puro or pCB 10 were transformed using the Lenti-X packaging system (Clontech) in Lenti-X 293T cells (Clontech) according to the kit protocol.
  • the supernatant containing the viral particles was filtered and added diluted to 1 / 5th or 1/2 on CHO cells in culture in 10cm petri dishes for a final volume of 5mL medium.
  • the cells are washed with PBS and fresh culture medium supplemented with 2 ⁇ g / ml of puromycin is added for selection over 48 hours at 37 ° C.
  • the cell line thus established is maintained at a concentration of 0 ⁇ g / ml of puromycin in the culture medium.
  • the transformed cells are cultured at 30 ° C. in ambient air on YNB medium (yeast without nitrogen base) supplemented with ammonium sulfate 6.7 gL -1 , glucose 20 gL -1 , agar 20 gL -1 for the agar plates. complemented with a commercial medium CSM (MP Biomedicals) adapted to the selection markers of the plasmids used for the transformation (-ura, -leu, -trp) and in the presence of doxycycline 2 ⁇ / ⁇ 1 The cultures are stopped by cooling to 4 ° C.
  • YNB medium yeast without nitrogen base
  • ammonium sulfate 6.7 gL -1
  • glucose 20 gL -1 glucose 20 gL -1
  • agar 20 gL -1 for the agar plates.
  • CSM commercial medium CSM (MP Biomedicals) adapted to the selection markers of the plasmids used for the transformation (-ura, -leu, -
  • spheroplasts are prepared by enzymatic digestion of the cell walls with a zymolyase-cytohelicase mixture in hypernic sorbitol medium (1.2M sorbitol) .
  • the spheroplases are washed in medium hypertonic sorbitol in the presence of saturating concentrations of PMSF and EDTA (protease inhibitors), then broken by repeated pipetting and light sonication in isotonic medium (0.6M) sorbitol.
  • low-speed centrifugation (1500 rpm) to remove large debris and then at medium speed (4000rpm) to recover intermediate size debris and mitochondria, the supernatant is recovered and the protein concentration is quantified by the Bradford method.
  • the precultures were carried out on a chemically defined medium. After thawing, 1 mL of a stock tube (-80 ° C) was taken to inoculate a penicillin flask (100 mL) containing 10 mL of culture medium, incubated 18 hours at 30 ° C and 120 rpm. The precultures were carried out anaerobically (flasks previously flushed with nitrogen) and in the presence of doxycycline in order to avoid the toxicity problems observed in the presence of the PRK gene.
  • the precultures were then washed three times (centrifugation, resuspension, vortex 15 s) with physiological water (NaCl, 9 g L "1 ), then the cell pellet was resuspended in culture medium without doxycycline.
  • the starting volume of the cultures was 50 ml aerobically (flasks of Erlenmeyer flasks 250 mL) or anaerobic 35 mL (penicillin flasks of 100 mL).
  • Glucose, formic acid and major metabolites were measured by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the apparatus used was a chromatograph (Waters, Alliance 2690) equipped with an Aminex HPX 87-H + column (300 mm x 7.8 mm). Detection of the molecules was provided by a refractive index detector (Waters 2414 refractometer).
  • the eluent was 4 to 8 mM H 2 SO 4 at a flow rate of 0.5 mL min -1 , and the column temperature was set at 50 ° C. In anaerobiosis, this analysis was performed on a single flask. In this case, the calculation of the standard deviation was performed on the loss of mass and then applied to the metabolites. .
  • the Calvin cycle allows plants and cyanobacteria to make glucose from carbon dioxide.
  • the critical step is the fixation of CO2 on ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP), a molecule with 5 carbons.
  • RuBP ribulose-1,5-bisphosphate
  • This step requires an enzyme called RuBisCO (for Ribulose-1, 5-Biphosphate Carboxylase / Oxygenase).
  • RuBisCO for Ribulose-1, 5-Biphosphate Carboxylase / Oxygenase.
  • This enzyme allows the formation of an unstable molecule with 6 carbons which rapidly gives two molecules of 3-phosphoglycerate with 3 carbons.
  • RuBisCO There are several forms of RuBisCO. Form I consists of two types of subunits: large subunits (RbcL) and small subunits (RbcS), whose correct assembly also requires the intervention of at least one specific chaperone: RbcX.
  • RuBP substrate of RuBisCO, is
  • an artificial Calvin cycle is reconstituted by the co-transformation of the yeast strain CEN.PK 1605 by the combinations of vectors No. 3 and 4 of Table IV above, which allow the simultaneous expression of the RbcS and RbcL units of RuBisCO, RbcX-specific chaperone and Synechoccocus elongatus PRK enzyme, with (combination 3 and 101) or without (combination 4) the general Groel and GroES chaperones of E. coli or synechoccocus according to the number of the combination.
  • RuBisCO activity tests on three independent experiments A, B and C are made from protein extracts derived from yeast culture on glucose (protocol detailed above, point 1.3); their yield is evaluated by measuring the phosphoglyceric acid production as a function of time. The results are shown in Table XVII below.
  • Table XVII In vitro activity tests of RuBisCO made from extracts of CEN-PK strains grown on glucose and containing the engineering indicated in the first column. The tests are carried out for 80 min of incubation with 0.01-0.02 mg of yeast soluble extract protein in a reaction volume of 200 microL containing 2 mM ribulose diphosphate at room temperature. The activities are given in nmoles of 3-phosphoglycerate formed / min / mg of total protein in the extract.
  • experiment C shows that the RuBisCO activity drops dramatically by more than 90% when the RbcL / RbcS subunits of Synechoccocus elongatus are associated with homologous RbcX, GroES GroEL2 chaperones from the same organism. This illustrates in a striking way the interest of an association of heterologous chaperonines.
  • Example 3 Protective effect of the combination of chaperones against the toxicity of recombinant proteins
  • Example 1 The methods and analyzes used are described in Example 1 above.
  • the expression of ribulokinase alone in yeast (strain 18b) results in a long latency phase (of more than 50 hours) and a drastic fall in its maximum growth rate (from 70% aerobically and 82% anaerobically) relative to the wild-type strain (WT) (Table XVIII).
  • Table XVIII Genotype, maximum growth rate and growth retardation of strains WT, lb, 18b, 102, 15, 14b.
  • This PRK-induced toxicity can be partially overcome by coexpression in strain 102 of GroES / GroEL chaperones of E. coli. coli (removal of 26% anaerobiosis and 42% aerobic aerobic toxicity) or RbcX chaperone from Synechococcus elongatus in strain 14b (release of 34% anaerobiosis 10% aerobic).
  • Example 4 Exemplification of the general effect on the growth of a transformed cell
  • Example 1 The methods and analyzes used are described in Example 1 above. The results are shown in Table XIX below.
  • Table XIX Genotype, maximum growth rate and growth retardation of strains WT, lb, 103, 13b.
  • strain 13b is equal to 96 and 86% of the growth rate of the wild-type (WT) strain CEN.PK 113-7D which is not transformed and therefore not stressed, aerobically and anaerobically respectively (Table XVIII). ).
  • the two strains were seeded at the same cell concentration evaluated on a 100H fermentation, the maximum mu of the strain calculated on the exponential phase of the growth curve for the strain PPGC115_02 a proliferative advantage of the order of 30% by compared to that of the control strain PPGC115_01.
  • the CHO-01 and CHO-02 lines are seeded at the same density (ie 2.10 6 cells per 10 cm dish and the growth is evaluated over 4 days)
  • the cells are detached and individualized by treatment trypsin and counted daily using a meter automatic.
  • the growth rate of the cells of the CHO-02 line is higher than that of the CHO-01 control line of the order of 25%.
  • the combination of chaperones has an effect on the cell doubling time.
  • Example 5 Exemplification of the Effect on the Production of Recombinant Proteins 5.1. Production of human growth hormone in Saccharomyces cerevisiae
  • the human growth hormone gene (GenBank: K02382.1) was synthesized and cloned downstream of the constitutive promoter TEF1 according to the cassette below.
  • the strains 200, 230 and 231 were cultured in a synthetic medium (-leu-ura) up to a OD 600 of 0.7.
  • the cells were harvested and washed once with 1 ml of cold lysis buffer (PBS IX pH 7.4, 1 mM PMSF), then resuspended in 0.3 ml of Laemli buffer and incubated for 5 min at 98 ° C. .
  • Serial dilution (1:10) is performed and the same volume of each sample is deposited on a 4% -20% SDS gradient page gel, transferred to a nitrocellulose membrane.
  • hGH The expression of hGH is evaluated with the Abcam [GH-1] antibody (ab9821) and standardized with respect to the expression of the ubiquitous GAPDH gene (Ab9485) from Abcam. Moreover, the quantification of the expression of hGH is carried out by Elisa assay with and according to the protocol of the Growth Hormone kit ELISA Kit, Human Catalog number: EHGH1 from thermoscientific
  • the amount of hGH protein produced evaluated in strain 230 is 40% higher than that obtained in strain 211.
  • the firefly luciferase gene was amplified from the pGL4 vector (Promega) and cloned downstream of the constitutive promoter TEF1 according to the cassette below.
  • Table XXIII expression cassette
  • Table XXV plasmids and strains
  • the strains 200, 210 and 211 were cultured in a synthetic medium (-leu-ura) up to a OD 600 of 0.7.
  • the cells were harvested and washed once with 1 ml of cold lysis buffer (pH 7.4 PBS, 1 mM PMSF), and resuspended in 0.3 ml of the same buffer.
  • the cells in suspension were lysed with glass beads (fast prep).
  • the concentration of crude lysates was determined by the Bradford method (BioRad) and diluted to 0.5 mg / mL, and Luciferase activities were determined using 5 ⁇ L of lysate / sample using the Luciferase Assay System (Promega) and the luminescence evaluated on a luminometer.
  • the activity is standardized with respect to the amount of total protein.
  • the luciferase activity evaluated in strain 210 is 60% higher than that evaluated in strain 211 5.3. Evaluation of the activity of a recombinant cellulase in Saccharomyces cerevisiae
  • Chaperonnes engineering is associated with engineering to express Talaromyces emersonii cellulase, cellobiohydrolase 1 (CBH1) (GenBank accession No. AAL89553) under TEF2 promoter.
  • CBH1 cellobiohydrolase 1
  • Cellulase activity analysis was conducted as described in Y. Ito et al. 2015 (Combinatorial Screening for Transgenic Yeasts with High Cellulase Activities in Combination with a Tunable Expression System, PLoS One 2015 Dec 21; 10 (12)).
  • the activity recorded for the strain coexpressing Cellulase engineering in the presence of Chaperones exhibits a 37% higher activity yield than the strain expressing only Cellulase engineering alone.
  • chaperones to improve the production of proteins described above for Saccharomyces can easily be implemented in any eukaryotic cell of interest and in particular in Pichia and Yarrowia, so as to optimize the yield and / or the activity of proteins endogenous or heterogeneous.
  • Those skilled in the art may in particular refer to the publications below to produce by yeast expressing the combination of chaperones according to the invention various proteins of interest for the food industry, the pharmaceutical field, the hydrolysis of biomass , energy, etc. :
  • Zinjarde SS Zinjarde SS. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem.

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Abstract

La présente invention concerne l'expression d'une combinaison spécifique de trois chaperonnes bactériennes dans une cellule eucaryote, ce qui améliore significativement ses propriétés de croissance et de résistance à des contraintes physico chimiques, en particulier lorsque cette cellule comporte une ingénierie supplémentaire mettant en œuvre un ou plusieurs gènes non-natifs. Une combinaison de chaperonnes préférée comprend les chaperonnes GroES et GroEL d' E. coli et la chaperonne RbcX de Synechococcus elongatus.

Description

COMBINAISON DE CHAPERONNES BACTERIENNES AFFECTANT POSITIVEMENT LA PHYSIOLOGIE
D'UNE CELLULE EUCARYOTE NATIVE OU PORTANT UNE INGENIERIE
La présente invention concerne le domaine de l'ingénierie cellulaire, en particulier des cellules eucaryotes. Plus particulièrement, l'invention concerne des cellules eucaryotes présentant des propriétés de croissance et/ou métaboliques améliorées, ainsi que leurs utilisations pour la production de composés d'intérêt. L'invention concerne en particulier des cellules eucaryotes exprimant une combinaison spécifique de chaperonnes. L'invention trouve des applications notamment dans le domaine de la production de protéines recombinantes.
Arrière-plan technologique
Il existe actuellement de nombreux systèmes d'expression de protéines d'intérêt utilisés dans des domaines aussi variés que les biotechnologies, agroalimentaire, l'industrie du médicament ou la recherche diagnostic, fondamentale et/ou appliquée. Parmi ces systèmes d'expression, les cellules eucaryotes et en particulier les levures jouent un rôle important en raison notamment de leur capacité de glycosylation et de leur facilité de culture en conditions industrielles. Ces cellules présentent cependant des limites, dues notamment à des contraintes de toxicité liées par exemple à l'accumulation de produits d'intérêt (par exemple une grande concentration d'éthanol ou autre alcool) ou encore à une toxicité directe ou indirecte des protéines exprimées ou à la charge énergétique que requiert la présence des plasmides d'expression.
Résumé de l'invention
La présente invention fournit des cellules eucaryotes ayant des performances améliorées, permettant le développement de systèmes d'expression optimisés.
Dans le cadre d'un projet visant à introduire chez la levure un cycle de Calvin synthétique, les inventeurs ont observé de manière surprenante que la coexpression, chez la levure, d'un ensemble de trois chaperonnes bactériennes (RbcX, GroES et GroEL) conférait aux cellules eucaryotes des propriétés métaboliques remarquables, notamment en terme d'expression et de repliement fonctionnel de protéines hétérologues ou endogènes. Poursuivant leurs investigations, les inventeurs ont également mis en évidence que cette combinaison de chaperonnes permettait en outre d'accélérer la croissance des levures et de lever les effets toxiques d'autres ingénieries, par exemple lorsque la kinase PRK est co-exprimée dans la cellule. Les inventeurs ont par ailleurs vérifié et obtenu les mêmes effets sur les performances sur différentes cellules eucaryotes, confirmant l'intérêt et le grand potentiel de ces résultats inattendus.
Un objet de la présente invention concerne donc une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle exprime les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL.
Dans un mode particulier, la présente invention porte sur une cellule eucaryote transformée, caractérisée en ce qu'elle contient :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne RbcX impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et
(iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
L'invention vise également une cellule eucaryote contenant:
(i) une séquence codant pour une chaperonne RbcX sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une séquence codant pour une chaperonne GroES sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et
(iii) une séquence codant pour une chaperonne GroEL sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Selon un mode particulier, les cellules eucaryotes de l'invention ne contiennent pas de séquence codant pour la sous-unité RbcL et/ou RbcS d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne.
L'invention propose notamment une levure transformée comme indiqué ci-dessus. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression d'une chaperonne RbcX et des chaperonnes GroES et GroEL, pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote, et notamment pour augmenter la vitesse de croissance de ladite cellule eucaryote et/ou augmenter la résistance de ladite cellule eucaryote à un stress environnemental et/ou augmenter la résistance de ladite cellule à la toxicité d'un composé synthétisé par la cellule eucaryote et/ou pour la production d'une protéine recombinante.
L'invention a aussi pour objet un procédé biotechnologique pour produire au moins un composé sélectionné parmi les molécules chimiques et les protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une cellule eucaryote selon l'invention dans des conditions permettant la synthèse, par ladite cellule eucaryote, de ce composé, et une étape de récupération dudit composé.
L'invention propose plus particulièrement un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant (i) l'insertion d'une séquence codant ladite protéine dans une cellule eucaryote exprimant RbcX, GroES et GroEL, (ii) la culture de ladite cellule dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence et optionnellement (iii) la récupération ou purification de ladite protéine.
Bref description de la figure
Figure 1 : Cinétiques de production d'éthanol des souches lb, 18b, 102, 15, 14b. La barre d'erreur représente un écart-type de 3 cultures indépendantes. Description détaillée
En travaillant sur l'expression de certaines protéines chaperonnes bactériennes dans une cellule eucaryote, les inventeurs ont découvert que de manière tout à fait étonnante des chaperonnes bactériennes peuvent être exprimées dans le cytosol d'une cellule eucaryote et conserver leur fonction chaperonne dans ladite cellule eucaryotes. La fonction chaperonne bactérienne s'ajoute à la fonction chaperonne cytosolique déjà présente dans la cellule eucaryote. Les inventeurs ont en outre découvert que l'expression d'un triplet de chaperonnes particulier, à savoir les chaperonnes bactériennes GroEL et GroES et la chaperonne RbcX, confère à la cellule eucaryote transformée qui les exprime des propriétés particulièrement intéressantes en termes de croissance, d'expression et de repliement fonctionnel de protéines.
Les effets observés requièrent obligatoirement la présence simultanée des trois chaperonnes citées, provenant préférentiellement d'au moins deux microorganismes différents. S'il était connu que la coexpression de chaperonnes est de nature à améliorer dans un système bactérien le repliement de protéines hétérologues et donc potentiellement les performances d'un bioprocédé en dépendant, il n'était pas prévisible qu'une combinaison spécifique interorganismes de trois protéines chaperonnes bactériennes, puisse se révéler particulièrement efficace en étant exprimée en contexte eucaryote. Les mécanismes moléculaires conduisant aux effets de l'invention sont actuellement inconnus même si ils sont probablement, au moins pour partie, liés au repliement des protéines ou au contrôle de leur devenir intracellulaire. Un rôle généraliste surprenant est joué par la protéine de la famille RbcX (décrite dans l'art antérieur comme spécialisée pour l'association fonctionnelle du complexe RuBisCO des organismes photosynthétiques), en présence des chaperonnes GroES et GroEL qui jouent des rôles complémentaires. Cette caractéristique de l'invention laisse penser que l'effet observé ne peut être totalement attribué à un rôle de repliement facilité et pourrait impliquer d'autres mécanismes comme une modulation de la durée de vie de protéines spécifiques, l'assemblage de complexes ou la modification de leurs propriétés, voire des effets spécifiques de nature à définir.
Dans ce contexte, l'invention propose donc de transformer des cellules eucaryotes de manière à ce qu'elles expriment un triplet de chaperonnes particulier, à savoir les chaperonnes bactériennes GroEL et GroES et la chaperonne RbcX. De telles cellules transformées peuvent trouver de nombreuses applications, notamment dans le cadre de la production de protéines recombinantes.
L'invention a donc pour objet une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle exprime les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL. Les chaperonnes GroEL et GroES appartiennent à la famille des protéines de choc thermique (HSP). Ces chaperonnes sont présentes dans de nombreuses bactéries. Dans le contexte de l'invention, ces chaperonnes sont désignées comme « chaperonnes généralistes » en ce sens qu'elles sont connues pour co-agir afin de permettre un repliement efficace d'un très grand nombre de protéines (M. mayhew et al. 1996, « Protein folding in the central cavity of the GroEL-GwES chapewnin complex » Nature 1996 Feb 1 ;379(6564) :420-6). Selon l'invention, les chaperonnes GroEL et GroES peuvent provenir de n'importe quelle bactérie les exprimant, et notamment à titre d'exemple, de E. coli (Gene ID: 948655 et 948665), S. elongatus (Gene ID: 3199735, 3 199535 et 3 198035 ), S. pneumonia (GenBank accession number: AF 1 17741 ), S. pyogenes (GenBank accession number: SPGROELGN), S. aureus (GenBank accession number: STAHSP) ou P. aeruginosa (GenBank accession number: ATCC9027). L'homme du métier est parfaitement en mesure d'identifier dans une bactérie les séquences nucléiques susceptibles de codées pour l'une ou l'autre de ces chaperonnes. A titre informatif, on notera que la similarité de séquence des chaperonnes (% d'acides aminés identiques dans l'alignement) est de 61 % entre GroELl de S. elongatus et GroEL de E. coli ; de 56 % entre GroEL2 de S. elongatus et GroEL de E. coli ; de 63 % entre GroELl et GroEL2 de S. elongatus.
Les cellules selon l'invention expriment en outre la chaperonne RbcX connue chez les cyanobactéries et les plantes pour participer au bon assemblage des sous-unités RbcL et RbcS de la Rubisco. Dans le contexte de l'invention, cette chaperonne est désignée comme « chaperonne spécifique » en ce sens que cette protéine est connue pour jouer un rôle dans l'association fonctionnelle de complexes protéiques, comme c'est notamment le cas avec la Rubisco (S. Saschenbrecker et al. 2007, « Structure and function of RbcX, an assembly chaperone for hexadecameric Rubisco », Cell. 2007 Jun 15 ; 129(6) : 1189-200). Selon l'invention, la chaperonne RbcX peut provenir de n'importe quelle cyanobactérie l'exprimant, et notamment à titre d'exemple, de S. elongatus (SEQ ID N°3), Synechocystis sp. ( Kaneko et al., "Séquence analysis of the génome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Séquence détermination of the en tire génome and assignaient of potential protein- coding régions." DNA Res. 3 (3), 109- 1 36 (1996)), Anabaena sp. (Li et al. J. Bacteriol. (1997), 179(11), 3793-3796), Microcystis sp., Tychonema sp., Planktothrix sp. or Nostoc sp. (Rudi et al, J. Bacteriol. (1998), 180(13), 3453-3461).
Dans le contexte de l'invention, une « activité chaperonne » s'entend d'une action repliement de protéines et/ou sur l'association fonctionnelle de complexes protéiques. Dans un mode particulier de l'invention, les chaperonnes utilisées proviennent préférentiellement de deux organismes différents. Selon l'invention, les chaperonnes peuvent provenir d'une ou plusieurs bactéries différentes. De préférence, les trois chaperonnes proviennent d'au moins deux espèces bactériennes Gram négatives éloignées, dont l'une au moins est une cyanobactérie.
Selon une autre mise en œuvre particulière de la présente invention, au moins une des chaperonnes généralistes GroES et GroEL ne provient ni d'une cyanobactérie ni d'une autre bactérie exprimant un complexe RuBisCO. Selon l'invention, les chaperonnes GroES et GroEL peuvent provenir d'une même bactérie ou de deux bactéries différentes. Dans un exemple de réalisation particulier, les chaperonnes GroES et GroEL proviennent de E. coll.
Dans un exemple de réalisation particulier, les chaperonnes GroES et GroEL proviennent de E. Coli et la chaperonne RbcX provient de Synechococcus elongatus.
Dans un autre exemple de réalisation, les trois chaperonnes GroES, GroEL et RbcX proviennent de Synechococcus elongatus. Dans un tel cas, la cellule transformée peut exprimer l'une ou l'autre ou les deux isoformes (GroELl et GroEL2) de la chaperonne GroEL, préférentiellement les deux isoformes.
Dans le contexte de l'invention, on considère qu'une protéine « provient » d'un organisme donné dès lors qu'elle présente une identité de séquence en acides aminés supérieure à 95% et la même fonction que la protéine considérée dudit organisme. Dans le présent texte, on désigne par "GroES" et "GroEL" toute protéine présentant une activité de chaperonne et ayant entre 65 et 100 % d'identité en acides aminés avec les GroES et GroEL de E. coli K 12, respectivement. Alternativement, "GroES" et "GroEL" désignent des chaperonnes généralistes présentant un pourcentage d'identité inférieur, et notamment entre 55 et 65%, et plus particulièrement entre 56 et 63%, telles que les chaperonnes généralistes de S. elongatus. L'activité chaperonne d'un variant des chaperonnes généralistes GroES et GroEL d'E. coli pourra être vérifiée par exemple en substituant dans les différents exemples décrits ci- dessous, la cassette d'expression codant pour GroES ou GroEL natif de E. coli par des variants de chaperonnes à évaluer. La chaperonne RbcX est très éloignée de GroEL et GroES et sa séquence ne peut être alignée avec les séquences de ces deux chaperonnes.
Dans le présent texte, on désigne par "RbcX" toute protéine, notamment de cyanobactérie, présentant une activité de chaperonne et ayant plus de 50% d'identité de séquence en acides aminés avec la chaperonne RbcX codée par la séquence SEQ ID No : 3 et conservant l'activité de chaperonne spécifique de cette protéine. L'activité chaperonne spécifique peut être vérifiée dans une levure exprimant les sous unités RbcL et RbcS de la RuBisCO de S. elongatus, en remplaçant la cassette d'expression incluant la séquence SEQ ID N°3 par toute autre séquence à évaluer, et en mesurant par un test in vitro sur des extraits cellulaires l'activité RuBisCO ainsi obtenue.
De préférence, la présente invention est mise en œuvre avec une chaperonne RbcX dont l'identité de séquence en acides aminés avec la chaperonne RbcX codée par la SEQ ID No : 3 est supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 90 %, plus préférentiellement supérieure à 95%, encore plus préférentiellement supérieure à 99%.
L'invention peut être mise en œuvre avec tout type de cellule eucaryote, provenant d'un organisme unicellulaire ou pluricellulaire. Notamment, la combinaison de chaperonnes selon l'invention peut être exprimée dans une cellule de levure, de champignon, de plante, d'animal tel qu'un mammifère, etc.
Notamment, la présente invention se rapporte à une levure transformée exprimant une chaperonne spécifique RbcX, une chaperonne bactérienne généraliste GroES, et une chaperonne bactérienne généraliste GroEL.
Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une levure transformée, caractérisée en ce qu'elle contient :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la chaperonne RbcX impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et (iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
L'invention peut être mise en œuvre avec toute levure d'intérêt. Avantageusement, la levure est choisie parmi Saccharomyces, Yarrowia et Pichia. Par exemple, la levure transformée selon l'invention est une cellule de Saccharomyces cerevisiae. Dans un autre exemple, la levure transformée selon l'invention est une cellule de Yarrowia lipolytica, ou une cellule de Pichia pastoris.
L'utilisation de Pichia pastoris est particulièrement intéressante pour la production de protéines recombinantes. En effet, Pichia présente un système d'expression de protéines eucaryotes très performant tant pour pour la sécrétion et que pour l'expression intracellulaire. Il est particulièrement adapté pour une production à grande échelle de protéines eucaryotes recombinantes. Notamment, Pichia peut être utilisée pour la production de protéines excrétées à haut rendement , afin de réduire les coûts et les délais de production comparativement à ceux associés aux systèmes d'expression des cellules de mammifères. Yarrowia lipolytica est également adaptée à une utilisation pour la production de protéines recombinantes. En effet, Yarrowia présente (i) une croissance à haute densité, (ii) un taux élevé de sécrétion, (iii) une absence de la protéase alcaline AEP et (iv) une capacité à produire de l'invertase de S. cerevisiae qui permet l'utilisation du saccharose comme source de carbone (Nicaudet al., 1989). Cette dernière propriété est particulièrement intéressante dans le cas de production industrielle, car cette souche peut croître efficacement sur des substrats bon marché tels que les mélasses.
L'invention se rapporte également à une cellule eucaryote issue d'un organisme pluricellulaire, telle qu'une cellule animale et notamment une cellule de mammifère, transformée exprimant une chaperonne spécifique RbcX, une chaperonne bactérienne généraliste GroES, et une chaperonne bactérienne généraliste GroEL.
Dans un exemple de réalisation, une telle cellule eucaryote est transformée pour contenir :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la chaperonne RbcX impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; (ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et
(iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. L'invention a notamment trait à une cellule CHO transformée exprimant le triplet de chaperonnes selon l'invention.
Selon l'invention, les gènes codant pour les chaperonnes GroEL, GroES et RbcX sont introduits dans les cellules eucaryotes sous une forme permettant leur expression dans lesdites cellules. Ainsi, les séquences codant pour les chaperonnes sont associées à des séquences promotrices permettant leur transcription. Dans un mode de réalisation, une même séquence promotrice est associée aux séquences codant pour les trois chaperonnes. Dans un autre mode de réalisation, la chaperonne RbcX est associée à un promoteur particulier différent du ou des promoteurs associés aux chaperonnes GroEL et GroES. Dans un autre mode de réalisation, chaque chaperonne est associée à un promoteur particulier différent. Des promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d'expression variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli. Pour les cassettes d'expression dans les levures, des exemples de promoteurs constitutifs sont ceux des gènes TEF1 , TDH3, PGI1 , PGK, ADH1. Des exemples de promoteurs inductibles sont les promoteurs tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1, PH05. De préférence, les promoteurs utilisés seront différents d'une cassette à l'autre. Les cassettes d'expression de l'invention comprennent en outre les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription. Les cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent être insérées dans l'ADN chromosomique de la cellule-hôte, et/ou portées par un ou plusieurs réplicon(s) extra-chromosomiques. La stœchiométrie relative de ces protéines est susceptible de jouer un rôle important dans la mise en œuvre optimale de la présente invention. Les systèmes de coexpression décrits dans la partie expérimentale ci-après sont particulièrement pertinents à cet égard. L'invention n'est toutefois pas limitée à l'utilisation de ces systèmes, et elle peut être mise en œuvre avec n'importe quelle variante d'expression des éléments mentionnés ayant des effets au moins équivalents, tels qu'ils peuvent être mesurés, par exemple, en mesurant la croissance d'une cellule transformée dans un milieu standard pour ladite cellule. Selon un mode de réalisation avantageux, les trois cassettes d'expression forment un bloc continu d'information génétique. Il peut également être avantageux que les cassettes d'expression des trois chaperonnes soient portées par un élément génétique épisomique unique. Un aspect particulièrement intéressant de la présente invention est donc un "plug-in génétique" unique (séquence continue d'ADN) porté par un élément épisomique à origine de réplication centromérique. La transformation par cet élément est suffisante pour introduire les propriétés d'intérêt chez des levures sauvages ou portant une ingénierie quelconque.
Selon l'invention, les gènes codant pour chacune des chaperonnes peuvent être introduits en un ou plusieurs exemplaires dans la cellule. Notamment, il est possible d'introduire une, deux, trois ou plus cassettes contenant une séquence codant pour GroES, une, deux, trois ou plus cassettes contenant une séquence codant pour GroEL, et une, deux, trois ou plus cassettes contenant une séquence codant pour RbcX. De même, une cassette peut contenir plusieurs exemplaires d'une séquence codant pour GroES, GroEL ou RbcX. Dans le cas où plusieurs exemplaires de gènes codant pour une chaperonne sont introduits dans la cellule, on utilise préférentiellement la même séquence à chaque fois, c'est-à-dire provenant d'une même bactérie. Il est autrement possible d'utiliser des séquences provenant de bactéries différentes.
Comme mentionné plus haut, les cellules selon la présente invention présentes des propriétés améliorées (vitesse de croissance, résistance, capacité de production, etc.). Ces cellules sont donc particulièrement utiles pour la production de protéines ou autres composés, ou pour l'amélioration de procédés de fermentation. Production de protéines
Aussi, l'invention porte également sur une cellule eucaryote transformée pour exprimer une combinaison de chaperonnes telle que décrite ci-dessus et qui comporte en outre au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, et/ou qui a subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène. Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, la cellule eucaryote transformée est une levure. Selon une autre mise en œuvre préférée de l'invention, la cellule eucaryote transformée est une cellule CHO.
L'invention a donc également pour objet une levure ou une cellule CHO transformée pour exprimer une combinaison de chaperonnes telle que décrite ci-dessus, et contenant :
(iv) une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes ; et/ou
(v) ayant subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène. Selon l'invention, il est possible d'utiliser une telle cellule transformée pour produire une ou plusieurs protéines d'intérêt.
Avantageusement, la protéine d'intérêt n'est pas la Rubisco. De même, préférentiellement, la protéine d'intérêt est une protéine autre que la PKR. Aussi, si la cellule eucaryote transformée exprime la Rubisco et/ou la PKR, elle exprime avantageusement au moins une autre protéine hétérologue.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule transformée exprimant le triplet de chaperonnes GroES, GroEL et RbcX et en outre modifiée de manière à exprimer et excréter une protéine recombinante.
La présente invention concerne également un procédé biotechnologique pour produire au moins un composé sélectionné parmi les molécules chimiques, les enzymes, les hormones, les anticorps et les protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une cellule transformée telle que décrite ci-dessus, dans des conditions permettant la synthèse, par ladite cellule, de ce composé, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification dudit composé. L'invention concerne également un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant (i) l'insertion d'une séquence codant ladite protéine dans une cellule eucaryote exprimant le triplet de chaperonnes RbcX, GroES et GroEL, (ii) la culture de ladite cellule dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite protéine. Avantageusement, ladite protéine est une enzyme ou une hormone.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule selon l'invention est transformée de manière à produire au moins une enzyme hétérologue. Par exemple, la cellule est transformée pour produire une enzyme choisie parmi les endotoxines, telle que l'endotoxine de Bacillus thuringiensis, les lipases, les subtilisines, les cellulases et les luciférases.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la cellule selon l'invention est transformée de manière à produire au moins une molécule d'intérêt médical. Par exemple, la cellule est transformée pour produire une hormone, un facteur de croissance, un anticorps, etc. Préférentiellement, la molécule d'intérêt médical est choisie parmi l'érythropoïétine, les alpha- interférons de type I et/ou II, les facteurs de stimulation des colonies de granulocytes, l'insuline, les hormones de croissance, les activateurs tissulaire du plasminogène.
Avantageusement, la cellule transformée selon l'invention présente une production améliorée de la ou des protéines d'intérêt, comparativement à une cellule recombinante n'exprimant pas la combinaison de chaperonne de l'invention. Dans le contexte de l'invention, une production « améliorée » s'entend en termes de quantité et/ou de qualité. Notamment, la cellule transformée selon l'invention peut produire des protéines d'intérêt plus actives et/ou plus stables, et donc moins susceptibles d'être dégradées, ce qui permet une plus grande accumulation desdites protéines, comparativement aux protéines hétérologues produites par une cellule recombinante n'exprimant pas la combinaison de chaperonne de l'invention. Ainsi, l'augmentation du niveau d'expression d'une protéine recombinante par une cellule eucaryote transformée selon l'invention s'explique notamment par une plus grande stabilité et donc une plus forte accumulation desdites protéines dans la cellule et/ou le milieu de culture. En outre, l'expression de la combinaison de chaperonnes par la cellule transformée peut de manière avantageuse augmenter la résistance de la cellule recombinante aux protéines recombinantes qu'elle exprime, participant ainsi également à l'augmentation du rendement de production.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression, dans une cellule eucaryote, de la chaperonne spécifique RbcX et des chaperonnes généralistes GroES et GroEL, pour améliorer la physiologie et/ou les performances (notamment la vitesse de croissance) de ladite cellule eucaryote. Selon une mise en œuvre préférée de cet aspect de l'invention, la cellule eucaryote dont on cherche à améliorer la physiologie est une levure. Selon une autre mise en œuvre préférée, ladite cellule eucaryote n'a pas été transformée pour exprimer une séquence codant pour la sous-unité RbcL d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, et/ou une séquence codant pour la sous- unité RbcS de ladite enzyme RuBisCO.
Comme évoqué plus haut, une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression des chaperonnes généralistes GroES et GroEL et de la chaperonne spécifique RbcX est particulièrement utile pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote ayant subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène ou comprenant au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, par exemple sous forme d'un élément génétique épisomique.
En particulier, l'expression concomitante, dans une cellule, des chaperonnes généralistes GroES et GroEL et de la chaperonne spécifique RbcX permet d'augmenter la vitesse de croissance de ladite cellule et/ou d'augmenter la résistance de ladite cellule à un stress environnemental, notamment à un stress dû à la toxicité d'un élément présent dans le milieu de culture de la cellule. Une autre application avantageuse est d'augmenter la résistance de la cellule à la toxicité d'un composé synthétisé par elle-même, et donc la production d'un composé d'intérêt.
De très nombreuses applications de l'invention sont envisageables, notamment toutes les applications liées à l'amélioration du repliement ou de la stabilité (résistance aux agents chimiques ou thermiques, durée de vie intrinsèque) de protéines homologues ou hétérologues à la cellule eucaryote transformée. Il peut s'agir des protéines en elles-mêmes, soit d'intérêt en catalyse enzymatique, soit du fait de leurs propriétés intrinsèques (anticorps, protéines thérapeutiques, protéines structurales aux seins de complexes, etc.) ; Les applications liées à l'amélioration des performances d'une chaîne métabolique synthétique ou semi- synthétique
(impliquant des protéines de la cellule eucaryote transformée) ; dans ce cas, l'avantage est principalement une amélioration du résultat de leurs actions au niveau de la production d'un produit d'intérêt (molécule chimique). Cet effet peut résulter de l'amélioration du repliement ou de la stabilité mais aussi d'autres phénomènes par exemple transport subcellulaire, formation facilitée ou modifiée de complexes, modulation de mécanismes de couplage, etc. ; Les applications résultant d'effets globaux positifs sur un organisme en terme de croissance, de viabilité, d'adaptabilité, de résistance ou de récupération au stress, de formation de produits d'intérêt sans que le mécanisme soit connu ou explicitable.
A titre d'exemples d'applications industrielles de l'invention, on peut citer, sans que cela soit limitatif : Effet sur le repliement / stabilité des protéines
La production de certaines protéines recombinantes d'intérêt considérées comme difficiles, voire impossibles à produire sous forme soluble et fonctionnelle peut être améliorée par la mise en œuvre de l'invention. Cela s'explique notamment par une correction des défauts de repliement desdites protéines dans la cellule eucaryote transformée selon l'invention. Cela peut être particulièrement utile dans les domaines de la santé, de l'énergie, de la chimie, de Γ agroalimentaire, etc.
Protection contre la toxicité induite par les produits d'une ingénierie d'intérêt ou des intermédiaires de cette ingénierie
Il peut s'agir de la bio -production de molécules toxiques pour la cellule hôte ou dont le procédé de production implique des intermédiaires toxiques, par exemple des médicaments (l'hydrocortisone, l'acide artémisinique ou bien encore la trictosinide, certains flavonoïdes pour prendre des procédés développés) ou des molécules réactives comme des cétones insaturée, des aldéhydes (par exemple la vanilline), etc. D'autres exemples correspondent à des procédés produisant des molécules devenant toxiques à haute concentration, par exemple l'éthanol ou d'autres alcools. La production d'éthanol par exemple est limitée par la tolérance des souches de levure à des concentrations élevées d'alcool. D'autres exemples concernent la production de molécules chimiques industrielles très variées, de précurseurs de produits courants ou d'intermédiaires chimiques et bien sûr les biocarburants. Il peut également s'agir de protéines recombinantes dont la production par une cellule recombinante tend à déséquilibrer le métabolisme, induisant une mort cellulaire. L'utilisation d'une cellule eucaryote exprimant la combinaison de chaperonnes selon l'invention permet avantageusement d'augmenter la résistance de la cellule transformée à la toxicité induite par les protéines recombinantes qu'elle exprime. Tolérance thermique
L'amélioration de la tolérance thermique d'enzymes spécifiques ou d'organismes telles que les levures est un facteur important pour la productivité biotechnologique de nombreuses molécules peu solubles par exemple. Augmentation de la biomasse d'un microorganisme produite à partir d'une quantité fixée de source de carbone
Il s'agit là d'effets qui ne sont pas compris au niveau moléculaire mais qui sont observés dans les premières expériences relatées ci-dessous.
Comme mentionné plus haut, la présente invention porte également sur une molécule d'acide nucléique comprenant :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la chaperonne RbcX impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et
(iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Un exemple de tel "plug-in génétique" est une séquence continue d'ADN comprenant les trois cassettes mentionnées plus haut (dans un ordre quelconque), portée par un élément épisomique à origine de réplication centromérique.
La partie expérimentale ci-dessous illustre l'invention sans toutefois la limiter, en présentant :
Les constructions réalisées et les méthodes mises en œuvre (Exemple 1) ;
Une première série de tests comparant l'effet de différentes combinaisons de chaperonnes sur la reconstruction de l'activité d'une RuBisCO de type I constituée de l'assemblage de 16 chaînes peptidiques appartenant à deux types différents. L'expression de différentes associations de chaperonnes a été combinée à l'expression des polypeptides RbcL et RbcS d'une "RuBisCO de type I". Cela a permis d'analyser le rôle de la combinaison des chaperonnes sur l'activité RuBisCO mesurée in vitro sur des extraits cellulaires de levure (Exemple 2) ;
- Une seconde série de tests impliquant la coexpression des systèmes de chaperonnes dans une levure exprimant de manière conditionnelle une phophoribulokinase (PRK) de S. elongatus. En absence de l'invention, l'induction de l'expression de la PRK induit sur la levure un effet toxique majeur allant d'une croissance très ralentie à la létalité totale (>99,99 %) selon les souches de S. cerevisiae et les conditions de culture (milieu, niveau d'oxygène, pH). L' exemplification illustre que l'invention "guérit" cet état morbide sans pour cela interférer avec l'activité de l'enzyme PRK qui reste totalement active (Exemple 3) ;
Une troisième série de tests démontrant que l'invention rétablit un niveau de croissance sauvage dans une souche portant des autotrophies complémentées par des plasmides même neutres (ne conduisant pas en eux même à l'expression d'autres fonctions que leur propre réplication). Cette situation est typique des ingénieries métaboliques impliquant des éléments génétiques épisomiques. Dans l'exemple, l'invention corrige totalement l'impact négatif sur la croissance lié à la présence de structures génétiques épisomiques (Exemple 4) ; et
Une autre série de tests illustrant que les cellules de l'invention sont particulièrement utiles pour la production de composés et notamment de protéines recombinantes (Exemple 5).
EXEMPLES :
Dans les exemples ci-dessous, et sauf mention contraire, les mêmes acronymes sont utilisés d'un tableau à l'autre et d'une expérimentation à l'autre pour désigner les mêmes éléments.
Exemple 1 : Matériels et méthodes - Construction du "plug-in CHAPERONNES" et des vecteurs - Constructions des différentes souches - Méthodes de culture et de mesure
1.1. Construction du "plug-in CHAPERONNES" et des vecteurs pour S. cerevisiae
Certaines constructions décrites ci-dessous permettent l'expression des deux sous-unités RbcS et RbcL de la RuBisCO (pFPP45) et celle de la phosphoribulokinase PRK (pFPP20) de Synechoccocus elongatus pCC6301. D'autres constructions décrites ci-dessous ont été réalisées afin de permettre d'élaborer, à partir d'un seul et même vecteur d'expression, des combinaisons variables d'expression de la chaperonnes spécifique RbcX de Synechoccocus elongatus et des chaperonnes généralistes de E. coli GroES (Gene ID: 948655), GroEL (Gene ID: 948665) ou de leurs homologues GroES (Gene ID: 3199735), GroEL 1 (Gene ID: 3199535) et GroEL2 (Gene ID: 3198035) de Synechoccocus elongatus.
Des gènes synthétiques codant pour les sous-unités RbcS (Gene ID: 3200023) et RbcL (Gene ID : ID: 3200134) et pour la chaperonne spécifique RbcX (Gene ID: 3199060) de la RuBisCO de Synechoccocus elongatus pCC6301, et optimisés pour l'expression dans la levure, ont été préparés et clonés dans le plasmide pBSII (Genecust). Des variants optimisés pour l'expression dans la levure, dans lesquels une étiquette HA a été ajoutée à l'extrémité 3' de la séquence codante, ont également été construits. Les séquences de ces gènes synthétiques (sans l'étiquette HA) sont respectivement indiquées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO:3.
De même, des gènes synthétiques codant pour la phosphoribulokinase PRK (SEQ ID NO: 4) (pFPP20), ainsi que pour les chaperonnes généralistes GroES (SEQ ID NO: 5), GroELl (SEQ ID NO: 6) et GroEL2 (SEQ ID NO: 7) de Synechoccocus elongatus pCC6301, et optimisés pour l'expression dans la levure, ont été construits et clonés.
Les séquences codant pour les chaperonnes GroES et GroEL de E. coli ont été amplifiées à partir de cultures d'E. coli et clonées dans le plasmide pSC-B-amp/kan (Stratagène). Les séquences récupérées à partir des vecteurs de clonage ont été introduites dans des vecteurs d'expression de levure. Ces vecteurs hôtes sont listés dans le Tableau I ci-dessous.
Tableau I : Liste des vecteurs utilisés
Figure imgf000019_0001
Note : pGAL10-CYCl : promoteur synthétique composé de l'UAS du gène GAL10 et de l'initiation de transcription du gène CYCl (POMPON et al, Methods Enzymol, 272, 51-64, 1996). Les cassettes d'expression ainsi obtenues sont listées dans le Tableau II ci-dessous.
Tableau II : cassettes d'expression
Figure imgf000019_0002
Dans certains vecteurs, 2 ou 3 cassettes ont été insérées. Pour cela, les plasmides ont été amplifiés dans la bactérie Escherichia coli DH5a et préparés par maxiprep, puis digérés par des enzymes de restriction adaptées. Enfin, les fragments sont intégrés aux vecteurs hôtes par ligation à la ligase T4 (FERMENTAS) ou par recombinaison homologue directement chez la levure. La liste des vecteurs construits est indiquée dans le Tableau III ci-dessous.
Tableau III : vecteurs d'expression
Figure imgf000020_0001
1.2. Construction de différentes souches de S. cerevisiae
Les différents plasmides ci-dessus ont été construits de manière à permettre à volonté l'expression de composantes individuelles ou d'une association de ces composantes au sein de souches de levure. Différents vecteurs ou combinaisons de vecteurs ont donc été utilisés pour transformer plusieurs souches de levure S. cerevisiae (W303.1B, FY1679 et CEN.PK 1605). CEN.PK 1605 est la version prototrophe de la souche 1605. C'est donc un contrôle positif de "comportement physiologique". Chaque numéro, compilé dans la première colonne du tableau IV ci-dessous, correspond à l'association de vecteurs décrite sur la ligne correspondante du même tableau. Ainsi pour chacune des souches utilisée, le chiffre référence associé apporte l'information de l'ingénierie reconstruite. Seules les souches CEN.PK 1605 ont été exemplifiées (Tableau IV) par soucis de clarté, mais la nomenclature est la même pour les deux autres souches. ^„
Tableau IV. Combinaison de plasmides et souches (références au Tableau III.)
N° Protéines exprimées
Souche
Vecteur Vecteur Vecteur
Rbc Rbc Rbc PRK GroE GroE combinaiso 1 2 3
parente S L X syn S L n
CEN.PK PYEDP pCM18 pFPP1
1 b
1605 51 5 3
CEN.PK pCM18 pFPP5 E. E.
2 pFPP45 X X X
1605 5 6 coli coli
CEN.PK pFPP5 E. E.
3 pFPP45 pFPP20 X X X syn
1605 6 coli coli
CEN.PK pFPP5
4 pFPP45 pFPP20 X X X syn
1605 3
CEN.PK pCM18 pFPP5
5 pFPP45 X X X
1605 5 3
CEN.PK PYEDP pCM18 pFPP5
12 X
1605 51 5 3
CEN.PK PYEDP pCM18 pFPP5 E. E.
13b X
1605 51 5 6 coli coli
CEN.PK PYEDP pFPP5
14b pFPP20 X Syn
1605 51 3
CEN.PK PYEDP pFPP5 E. E.
15 pFPP20 X syn
1605 51 6 coli coli
CEN.PK pCM18 pFPP1
16b pFPP45 X X
1605 5 3
CEN.PK pFPP1
17b pFPP45 pFPP20 X X syn
1605 3
CEN.PK PYEDP pFPP1
18b pFPP20 syn
1605 51 3
CEN.PK L2
101 pFPP45 pFPP20 pFB08 X X X Syn syn
1605 syn CEN.PK PYEDP E. E.
102 pFPP20 pFB09 Syn
1605 51 coli coli
CEN.PK E. E.
102b pFPP45 pFPP20 pFB09 X X syn
1605 coli coli
CEN.PK PYEDP pCM18 E. E.
103 pFB09
1605 51 5 coli coli
(Syn : Synechoccocus elongatus ; L2 syn :GroEL2 Synechoccocus elongatus , Ll syn :GroELl Synechoccocus elongatus )
Notes concernant certains tableaux :
1. pCM 185 : plasmide commercial (ATCC 87659)
2. pFL36 : Plasmide commercial (ATCC 77202)
3. PYeDP51 : Plasmide « vide », décrit dans l'article suivant : Urban P, Mignotte C, Kazmaier M, Delorme F, Pompon D. Cloning, yeast expression, and char acte rization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450 reductases with P450 CYP73A5. J Biol Chem. 1997 Aug 1 ; 272(31): 19176-86.
4. GroES E. coli Gene ID: 6061370 ; GroEL E. coli Gene ID: 6061450
5. Souche S. Cerevisiae CEN.PK 113-7D : Mat a prototrophe
6. Souche S. Cerevisiae CEN.PK 1605 : Mat a HIS3leu2-3.112trpl-289 ura3-52 MAL.28c. Souche issue de CEN.PK 113-7D
7. Les autres abréviations se rapportent aux gènes de S. cerevisiae décrits dans les banques de données
8. Gènes synthétiques : les gènes de Synechoccocus elongatus codant pour les sous-unités de la RuBisCO, la chaperonne spécifique de l'assemblage de la RuBisCO (RbcX), la PRK ainsi que les chaperonnes généralistes GroES, GroELl et GroEL2 ont été synthétisées après recodage propriétaire pour la levure mettant en œuvre un biais de codons inhomogènes et clonés dans pCC6301 (commercial). Les séquences codantes de ces protéines (après recodage) sont présentées en annexe (SEQ ID No : 1 : séquence codante de RbcS ; SEQ ID No : 2 : séquence codante de RbcL ; SEQ ID No : 3 : séquence codante de RbcX ; SEQ ID No : 4 : séquence codante de PRK ; SEQ ID No : 5 : séquence codante de GroES ; SEQ ID No : 6 : séquence codante de GroELl ; SEQ ID No : 7 : séquence codante de GroEL2). 9. Les séquences codantes des chaperonnes de E. coli GroES et GroEL ont été amplifiées à partir de la bactérie, clonées dans pSC-B-amp/kan (Statagène) et montées sans recodage dans les vecteurs d'expression (voir plus haut).
10. Les séquences recodées des ADNc codant pour les chaperonines de Synechoccocus elongatus ont été insérées par recombinaison homologue dans le vecteur pUC57 préalablement linéarisé en cotransformant les deux molécules dans la levure. De la même manière les ORFs ont été amplifiées par PCR à partir des constructions précédentes, générant des régions flanquantes homologues aux promoteurs et terminateurs portés par le vecteur pFPP56. Cela a permis ainsi un clonage par recombinaison homologue en co-transformant ce produit PCR dans une souche de levure avec le vecteur pFPP56 préalablement linéarisé, générant les différents vecteurs d'expression décrits Tableau III selon les cassettes décrites Tableau IL
1.3. Construction de différentes souches de Saccharomyces cerevisiae intégrant des chaperonnes d'origines différentes
Des chaperonnes issues de différentes bactéries ont été évaluées. Ainsi, des combinaisons incluant des protéines issues de la même espèce (S. elongatus) ont également été testées, en combinant RbcX de S. elongatus à GroES et GroEL 1 et/ou GroEL2 de S. elongatus.
Tableau V : Cassettes d'expression
Noms Promoteur Phase ouverte de lecture Etiquette Terminateur
CAS 19 TEF1 p RbcX S. elongatus optimisée Sans PGKt
CAS21 PGM p GroES E. coli Sans CYC1t
CAS22 TDH3p GroEL E. Coli Sans ADH1t
CAS23 PGM p GroES S. elongatus optimisée sans CYC1t
CAS24 TEF2p GroEU S. elongatus optimisée sans TEF1t
CAS25 TDH3p GroEL2 S. elongatus optimisée sans ADH1t ^„
Tableau VI : Vecteurs d'expression
Figure imgf000024_0001
Tableau VII : Combinaison de plasmides et souches
Figure imgf000024_0002
Synechoccocus elongatus ; L2 syn :GroEL2, Ll syn :GroELl Synechoccocus elongati
1.4.Constructions de souches de Pichia pastoris
Afin de maintenir une expression fonctionnelle des gènes contenus dans le plug-in les promoteurs et terminateurs ont été remplacés par des promoteurs et terminateurs fonctionnel chez Pichia pasteuris GS115 (Thermofischer scientific Cl 81-00)
Sur le plasmide pFPP56 (Tableau III), chaque promoteur contrôlant l'expression des gènes RbcX, GroES et GroEL, issus des CAS 19, CAS20 et CAS21 (TableauII) a été remplacé par un promoteur compatible selon la littérature (tableau VIII ci-dessous). Tableau VIII : cassettes d'expression
Figure imgf000025_0001
La région incluant les trois cassettes d'expression ci-dessous (Tableau IX) a été amplifiée par PCR et clonée Notl dans le plasmide commercial pPIC3.5 de chez Thermofischer K1710-01.
Tableau IX : vecteurs d'expression
Figure imgf000025_0002
Ces plasmides ont été préalablement linéarisé et transformés individuellement dans une souche Pichia pasteuris GS115 (thermofischer Cl 81-00) auxotrophe pour l'histidine selon le protocole Easy select Pichia expression kit de Thermofischer et sélectionnée sur milieu minimal et glucose à 30°C.
Tableau X : Plasmides et Souches
Figure imgf000025_0003
Construction de souches de Yarrowia lipolytica
La souche sauvage W29 (ATCC 20460, MatA) isolée d'eaux usées a été utilisée. Sur le plasmide pFPP56 (Tableau III), chaque promoteur contrôlant l'expression des gènes RbcX, GroES et GroEL, issus des CAS 19, CAS20 et CAS21 (Tableau II) a été remplacé par un promoteur compatible selon la littérature (tableau XI ci-dessous). Tableau XI : cassettes d'expression
Figure imgf000026_0001
La région incluant les trois cassettes d'expression ci-dessus (TableauXI) a été amplifiée par PCR et clonée dans le plasmide commercial pYLEXl .
Tableau XII : vecteur d'expression
Figure imgf000026_0002
Ces plasmides ont été linéarisés et transformés individuellement dans une souche Yarrowia lipolytica auxotrophe pour la leucine selon le protocole YLOS transformation kit de Yeastearn Biotech et sélectionnée sur milieu minimal et glucose à 28°C. (YLEX Expression Kit de Yeastearn Biotech (Cat. #: FYY201-1KT)).
Tableau XIII : Plasmides et Souches
Figure imgf000026_0003
Yarrowia lipolytica POlf (ATCC®MYA2613™)
Génotype: MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2 L'évaluation de l'impact des chaperonnes a été réalisée sur une culture des souches POlf_01 et POlf_02 en milieu synthétique sans leucine à 28°C pendant 72H. 1.6. Construction de cellules CHO
Pour s'assurer une manipulation aisée, polyvalente et un transfert performant du plug-in « Chaperonnes » sur l'ensemble des cellules d'eucaryotes supérieurs un système de transduction lentiviral de quatrième génération a été choisi. Ces particules lentivirales permettent de transférer indifféremment le plug-in dans des cellules primaires, immortalisées ou transformées issues de différentes espèces d'eucaryotes supérieurs comme des cellules humaines ou murines par exemple.
Sur le plasmide pFPP56 (Tableau III), chaque promoteur contrôlant l'expression des gènes GroES et GroEL issus des CAS20 et CAS21 (Tableau II) a été remplacé par un promoteur compatible selon la littérature (tableau XIV).
Tableau XIV: cassettes d'expression
Figure imgf000027_0001
La région incluant la phase ouverte de lecture de RbcX et les deux cassettes d'expression CAS55 et CAS56 ci-dessous ont été amplifiées par PCR et clonées Xhol-Kpnl dans le plasmide commercial pLVX-Puro de chez Clontech (Catalog No. 632164).
Tableau XV : vecteur d'expression
Figure imgf000027_0002
Les plasmides pLVX-Puro ou pCB lO ont été transformés à l'aide du Lenti-X packaging System (Clontech) dans des cellules Lenti-X 293T (Clontech) selon le protocole du kit. Le surnagent contenant les particules virales a été filtré et ajouté dilué au l/5e ou 1/2 sur des cellules CHO en culture dans des boites de pétri de 10cm pour un volume final de milieu de 5mL.
Après 24H de transduction, les cellules sont lavées au PBS et du milieu de culture frais supplémenté avec 2μg/mL de puromycine est rajouté pour la sélection sur 48H00 à 37 °C. La lignée cellulaire ainsi établie est maintenue sous une concentration de O^g/mL de puromycine dans le milieu de culture.
Tableau XVI :plasmide et souches
Figure imgf000028_0001
1.7. Méthodes
Méthode de culture 1 : Croissance sur glucose
Les cellules transformées sont cultivées à 30°C à l'air ambiant sur milieu YNB {yeast without nitrogen base) supplémenté en sulfate d'ammonium 6,7 g.L"1, glucose 20 g.L"1, agar 20 g.L"1 pour les géloses complémenté avec un milieu commercial CSM (MP Biomedicals) adapté aux marqueurs de sélection des plasmides utilisés pour la transformation (-ura, -leu, -trp) et en présence de doxycycline 2μ/ιη1. Les cultures sont arrêtées par refroidissement à 4°C une génération avant la fin de la phase exponentielle. La culture est centrifugée, puis des sphéroplastes sont préparés par digestion enzymatique des parois cellulaires avec un mélange zymolyase-cytohélicase en milieu sorbitol hyperto nique (1,2M sorbitol). Les sphéroplases sont lavés en milieu hypertonique sorbitol en présence de concentrations saturantes de PMSF et d'EDTA (inhibiteurs des protéases), puis cassés par pipetage répétés et sonication légère en milieu isotonique (0,6M) sorbitol. Après centrifugation à basse vitesse (1500 rpm) pour éliminer les gros débris puis à moyenne vitesse (4000rpm) pour récupérer les débris de tailles intermédiaires et les mitochondries, le surnageant est récupéré et la concentration en protéines est quantifiée par la méthode de Bradford.
Test d'activité RuBisCO in vitro
In vitro, 15μg d échantillon protéique, issu de cette lyse cellulaire, est ajouté à la molécule synthétique RuBP (2mM final) dans un tampon approprié (50mM Tris/HCl pH7.4, lOmM MgC12+, 60mM bicarbonate de sodium), pour un volume réactionnel de 200μί, permettant au complexe RuBisCO, exprimé dans le lysat de levure, de catalyser la formation de molécules d'acide phosphoglycérique. A des temps variables, les réactions sont stoppées par ajout de HC1 (12,1M) et les produits de la réaction sont analysés par HPLC/MS afin d'évaluer l'activité carboxylase de l'échantillon protéique en dosant l'acide phosphoglycérique produit en fonction du temps. Cultures en milieu contrôlé
Les précultures ont été réalisées sur milieu chimiquement défini. Après décongélation, 1 mL d'un tube du stock (- 80°C) a été prélevé pour ensemencer un flacon pénicilline (100 mL) contenant 10 mL de milieu de culture, incubé 18 heures à 30 °C et 120 rpm . Les précultures ont été réalisées en anaérobiose (flacons préalablement flushés à l'azote) et en présence de doxycycline afin d'éviter les problèmes de toxicité observés en présence du gène PRK Les précultures ont ensuite été lavées trois fois (centrifugation, resuspension, vortex 15 s) à l'eau physiologique (NaCl, 9 g L"1), puis le culot cellulaire a été resuspendu dans du milieu de culture sans doxycycline .
Ces cellules issues des précultures ont ensuite été inoculées afin d'atteindre une densité optique initiale de 0,05 (soit 0,1 g L"1). Le volume de départ des cultures était de 50 mL en aérobiose (fioles d'Erlenmeyer bafflées de 250 mL) ou de 35 mL en anaérobiose (flacons pénicilline de 100 mL).
Les cultures ont été arrêtées après consommation totale du glucose ou arrêt de la production d'éthanol. Chaque culture a été tripliquée. Analyses : Caractérisation des métabolites extracellulaires
Les concentrations du glucose, de l'acide formique et des principaux métabolites (éthanol, glycérol, acides acétique, succinique et pyruvique) ont été mesurées par chromatographie liquide à haute performance (C.L.H.P.). L'appareil utilisé était un chromatographe (Waters, Alliance 2690) équipé d'une colonne Aminex HPX 87-H+ (300 mm x 7,8 mm). La détection des molécules a été assurée par un détecteur à indice de réfraction (réfractomètre Waters 2414). L'éluant était de l'H2S04 à 8 mM à un débit de 0,5 mL mn"1, et la température de la colonne fixée à 50 °C. En anaérobiose, cette analyse a été réalisée sur un seul flacon de chaque souche. Dans ce cas, le calcul de l'écart-type a été réalisé sur la perte de masse, puis appliqué aux métabolites. .
2 y
Exemple 2 : Effet de la combinaison de chaperonnes sur la reconstruction de l'activité carboxylase de la RuBisCO de type I chez la levure.
Le cycle de Calvin permet chez les Plantes et les cyanobactéries de fabriquer du glucose à partir du dioxyde de carbone. L'étape critique est la fixation du CO2 sur le ribulose-l,5-biphosphate (RuBP), molécule possédant 5 carbones. Cette étape nécessite une enzyme appelée la RuBisCO (pour Ribulose-1 ,5-Biphosphate Carboxylase/Oxygénase). Cette enzyme permet la formation d'une molécule instable à 6 carbones qui donne rapidement deux molécules de 3- phosphoglycérate à 3 carbones. Il existe plusieurs formes de RuBisCO. La forme I est constituée de deux types de sous-unités : des grandes sous-unités (RbcL) et des petites sous-unités (RbcS), dont l'assemblage correct nécessite en outre l'intervention d'au moins une chaperonne spécifique : RbcX. Le RuBP, substrat de la RuBisCO, est formé par réaction du ribulose 5- phosphate avec ATP ; cette réaction est catalysée par une phosphoribulokinase (PRK).
Dans cet exemple, un cycle de Calvin artificiel est reconstitué par la co-transformation de la souche de levure CEN.PK 1605 par les combinaisons de vecteurs n°3 et 4 du tableau IV ci- dessus, qui permettent l'expression simultanée des sous unités RbcS et RbcL de la RuBisCO, de la chaperonne spécifique RbcX et de l'enzyme PRK de Synechoccocus elongatus, avec (combinaison 3 et 101) ou sans (combinaison 4) les chaperonnes généralistes GroEL et GroES de E. coli ou de synechoccocus selon le n° de la combinaison.
Ainsi, des essais d'activité RuBisCO sur trois expériences indépendantes A, B et C sont réalisés à partir d'extraits protéiques issus de culture de levures sur glucose (protocole détaillé ci-dessus, point 1.3) ; leur rendement est évalué en mesurant la production d'acide phosphoglycérique en fonction du temps. Les résultats sont présentés dans le tableau XVII ci-dessous.
Tableau XVII : Tests d'activité in vitro de la RuBisCO réalisés à partir d'extraits de souches CEN-PK cultivées sur glucose et contenant l'ingénierie indiquée dans la première colonne. Les tests sont effectués durant 80 min d'incubation avec 0.01-0.02 mg de protéine d'extrait soluble de levure dans un volume réactionnel de 200 microL contenant 2 mM de ribulose diphosphate à température ambiante. Les activités sont données en nmoles de 3-phosphoglycérate formé/min/mg de protéines totales dans l'extrait. Souches A li C
CEN.PK n°3 RbcS/RbcL/RbcX/PRK/(GroES/GroEL) E.coli 20 13 20
CEN.PK n°4 RbcS/RbcL/RbcX 0 ND ND
CEN.PK
RbcS/RbcL/RbcX/PRK/(GroES/GroEL2) S.elongatus ND ND 1,5 n°101
L'expérience A démontre que la présence de la chaperonne RbcX seule, pourtant spécifique du complexe RuBisCO, n'est pas suffisante pour permettre l'expression d'un complexe enzymatique actif. Seule la combinaison des deux chaperonnes généralistes GroES et GroEL de E. coli associées dans une stœchiométrie adaptée à la présence de RbcX, permet de détecter la production d'acide phosphoglycérique croissante dans le temps.
De plus, l'expérience C montre que l'activité RuBisCO chute dramatiquement de plus de 90% quand les sous-unités RbcL/RbcS de Synechoccocus elongatus sont associées aux chaperonnes homologues RbcX, GroES GroEL2 issues du même organisme. Cela illustre de manière frappante l'intérêt d'une association de chaperonines hétérologues.
Cet exemple permet de déterminer clairement que l'association de chaperonnes généralistes bactériennes hétérologues à la chaperonne spécialiste bactérienne RbcX est nécessaire pour optimiser l'activité d'un complexe RuBisCO synthétique chez la levure.
Exemple 3 : Effet de protection de la combinaison de chaperonnes contre la toxicité de protéines recombinantes
Effet sur la levée de toxicité liée à l'expression de la ribulokinase in vivo, indépendamment de la RuBisCO
Les méthodes et analyses mises en œuvre sont décrites à l'exemple 1 ci-dessus. L'expression de la seule ribulokinase chez la levure (souche 18b) entraîne une longue phase de latence (de plus de 50 heures) et une chute drastique de son taux de croissance maximale (de 70% en aérobiose et de 82% en anaérobiose) par rapport à la souche sauvage (WT) (Tableau XVIII).
Tableau XVIII : Génotype, taux de croissance maximal et retard de croissance des souches WT, lb, 18b, 102, 15, 14b.
Figure imgf000032_0001
PV = plasm ide vide
Cette toxicité, induite par la PRK, peut être partiellement levée par la co-expression dans la souche 102 des chaperonnes GroES/GroEL d'E. coli (levée de la toxicité sur le taux de croissance de 26% en anaérobiose et de 42% en aérobiose) ou de la chaperonne RbcX de Synechococcus elongatus dans la souche 14b (levée de la toxicité sur le taux de croissance de 34% anaérobiose et de 10% en aérobiose).
La co-expression dans la souche 15 des chaperonnes GroES/GroEL d'E. coli et RbcX de Synechococcus elongatus permet de restaurer la quasi-totalité de la croissance (levée de la toxicité sur le taux de croissance de 78% en anaérobiose et de 63% en aérobiose). Cette co- expression permet également d'éliminer totalement la longue phase de latence. La toxicité liée à l'expression de la ribulokinase (PRK) affecte la fermentation alcoolique caractérisée par une chute de la productivité en éthanol (souche 18b) (Figure 1) directement liée à la présence de phase de latence et à la chute du taux de croissance. L'expression de l'ingénierie « CHAPERONNES » (GroES+ GroEL de E.coli + RbcX de Synechococcus elongatus) permet non seulement de lever totalement la toxicité de la ribulokinase (PRK) et plus particulièrement à l'accumulation du produit de la réaction catalysée par la PRK, mais aussi par conséquent d'augmenter la productivité en éthanol (souche 15), alors que le couple de chaperonines généralistes GroES/GroEL n'a qu'un effet partiel (souche 102) et l'expression de RbcX seule n'en a aucun (souche 14b).
Exemple 4 : Exemplification de l'effet généraliste sur la croissance d'une cellule transformée
4.1. Effet généraliste sur la croissance de Saccharomyces cerevisiae en fermentation
Les méthodes et analyses mises en œuvre sont décrites à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont présentés dans le Tableau XIX ci-dessous.
Tableau XIX : Génotype, taux de croissance maximal et retard de croissance des souches WT, lb, 103, 13b.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0002
PV = plasmide vide
De manière intéressante, l'expression de l'ingénierie « CHAPERONNES » offre un avantage prolifératif de 30% à la souche 13b (RbcX+(Gros/GroEL) E. coli) en comparaison de la souche contrôle contenant 3 plasmides « vides » (souche lb), ou encore la souche 103 n'exprimant que les chaperonnes généralistes de E. coli GroES/GroEL.
De plus, le taux de croissance de la souche 13b est égal à 96 et 86% du taux de croissance de la souche sauvage (WT) CEN.PK 113-7D non transformée et donc non stressée, en aérobiose et anaérobiose respectivement (Tableau XVIII).
4.2. Effet généraliste sur la croissance de Pichia pastoris en fermentation
L'évaluation de l'impact des chaperonnes a été réalisé sur une culture des souches PPGC115_01 et PPGC115_02 milieu minimal glycérolée à 30°C pendant 14H et une induction avec 1% méthanol pendant 48H à 100H selon le protocole décrit dans F. Wang et al. 2015 (PLoS One. 2015 Mar 17; 10(3):e0120458. "High-level expression of endo-β-Ν- acetylglucosaminidase H from Streptomyces plicatus in Pichia pastoris and its application for the deglycosylation of glycoproteins.").
Les deux souches ont été ensemencées à la même concentration cellulaire évaluée sur une fermentation de 100H, le mu maximal de la souche calculé sur la phase exponentielle de la courbe de croissance présente pour la souche PPGC115_02 un avantage prolifératif de l'ordre de 30% par rapport à celui de la souche contrôle PPGC115_01.
4.3. Effet généraliste sur la croissance de Yarrowia lipolytica en fermentation
Les souches POlf_01 et POlf_02 ont été évaluées selon le protocole décrit dans JM Nicaud et al. 2002 (Protein expression and sécrétion in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res. 2002 Aug;2(3):371-9). Le phénotype montre une croissance accrue pour la souche exprimant la combinaison de chaperonnes. L'avantage prolifératif est évalué à plus de 35%.
4.4. Effet généraliste sur la croissance de cellules CHO Les lignées CHO-01 et CHO-02 sont ensemencées à la même densité (soit 2.106 cellules par boite de 10 cm et la croissance est évaluée sur 4 jours. Les cellules sont décollées et individualisées par traitement à la trypsine et comptées tous les jours à l'aide d'un compteur automatique. La vitesse de croissance des cellules de la lignée CHO-02 est plus élevée que celle de la lignée contrôle CHO-01 de l'ordre de 25%. La combinaison de chaperonnes a un effet sur le temps de doublement des cellules.
Ces études démontrent que cette ingénierie « CHAPERONNES » permet (i) de restaurer une croissance normale de cellules eucaryotes, contenant une autre ingénierie ou non, mais soumises à des stress physicochimiques et (ii) d'offrir un avantage prolifératif par rapport à des souches/cellules utilisées dans les mêmes conditions.
Exemple 5 : Exemplification de l'effet sur la production de protéines recombinantes 5.1. Production de l'hormone de croissance humaine chez Saccharomvces cerevisiae
Le gène de l'hormone de croissance humaine (GenBank: K02382.1 ) a été synthétisé et cloné en aval du promoteur constitutif TEF1 selon la cassette ci-dessous.
Tableau XX : Cassette d'expression
Figure imgf000035_0001
Ces plasmides ont été transformés conjointement dans la souche CEN.PK 1605 selon le protocole de transformation précédemment décrit. Les souches ont été sélectionnées sur milieu synthétique (-leu-ura). „ ^
Tableau XXII : Souches
Figure imgf000036_0001
Les souches 200, 230 et 231 ont été cultivées dans un milieu synthétique (-leu-ura) jusqu'à une D.O.ôOOnm de 0,7. Les cellules ont été récoltées et lavées une fois avec 1 ml de tampon de lyse froid (PBS IX pH 7,4, PMSF 1 mM), puis remises en suspension dans 0,3 ml du tampon Laemli et incubées 5 min à 98°C. Une dilution sérielle (1 : 10) est réalisée et le même volume de chaque échantillon est déposé sur un gel SDS page gradient 4%-20%, transféré sur une membrane de nitrocellulose. L'expression de hGH est évaluée avec l'anticorps [GH-1] (ab9821) de chez Abcam et standardisée par rapport à l'expression du gène ubiquitaire GAPDH (ab9485) de chez Abcam. Par ailleurs, la quantification de l'expression de hGH est réalisée par dosage Elisa avec et selon le protocole du kit Growth Hormone ELISA Kit, Human Numéro de catalogue: EHGH1 de chez thermoscientific
La quantité de protéine hGH produite évaluée dans la souche 230 est 40% plus élevée que celle obtenue dans la souche 211.
5.2. Evaluation de l'activité de la luciférase endogène chez Saccharomyces cerevisiae
Le gène de la luciférase firefly a été amplifié à partir du vecteur pGL4 (Promega) et cloné en aval du promoteur constitutif TEF1 selon la cassette ci-dessous. Tableau XXIII : cassette d'expression
Noms Promoteurs Phase ouverte de lecture Terminateur
CAS 53 TEFlp fLuc PGK „„
Tableau XXIV : vecteurs d'expression
Figure imgf000037_0001
Ces plasmides ont été transformés conjointement dans la souche CEN.PK 1605 selon le protocole de transformation précédemment décrit. Les souches ont été sélectionnées sur milieu synthétique (-leu-ura).
Tableau XXV : plasmides et souches
Figure imgf000037_0002
Les souches 200, 210 et 211 ont été cultivées dans un milieu synthétique (-leu-ura) jusqu'à une D.O.ôOOnm de 0,7. Les cellules ont été récoltées et lavées une fois avec 1 ml de tampon de lyse froid (PBS IX pH 7,4, PMSF 1 mM), puis remises en suspension dans 0,3 ml du même tampon.
Les cellules en suspension ont été lysées avec des billes de verre (fast prep).
La concentration des lysats bruts a été déterminée par la méthode de Bradford (BioRad) et diluée à 0.5 mg/mL, et les activités Luciférase ont été déterminées en utilisant 5 uL de lysat / échantillon en utilisant le Système Luciferase Assay (Promega) et la luminescence évaluée sur un luminomètre.
L'activité est standardisée par rapport à la quantité de protéine totale.
L'activité luciférase évaluée dans la souche 210 est 60% plus élevée que celle évaluée dans la souche 211 5.3. Evaluation de l'activité d'une cellulase recombinante chez Saccharomyces cerevisiae
L'ingénierie Chaperonnes est associée à une ingénierie permettant d'exprimer une cellulase, cellobiohydrolase 1 (CBH1) de Talaromyces emersonii (GenBank accession no. AAL89553) sous promoteur TEF2. L'analyse de l'activité cellulase a été conduite comme décrit dans Y. Ito et al. 2015 (Combinatorial Screening for Transgenic Yeasts with High Cellulase Activities in Combination with a Tunable Expression System. PLoS One. 2015 Dec 21 ; 10(12)).
L'activité enregistrée pour la souche co-exprimant l'ingénierie Cellulase en présence de Chaperonnes présent un rendement d'activité 37% plus élevé que la souche exprimant uniquement l'ingénierie Cellulase seule.
5.4. Amélioration de la production de protéines
L'utilisation des chaperonnes pour améliorer la production de protéines décrit précédemment pour Saccharomyces peut aisément être mise en œuvre dans toute cellule eucaryote d'intérêt et notamment chez Pichia et Yarrowia, de manière à en optimiser le rendement et/ou l'activité de protéines endogènes ou hétérogènes. L'homme du métier peut notamment se référer aux publications ci-dessous pour faire produire par une levure exprimant la combinaison de chaperonnes selon l'invention diverses protéines d'intérêt pour l'industrie agroalimentaire, le domaine pharmaceutique, l'hydrolyse de la biomasse, l'énergie, etc. :
Spohner SC, Millier H, Quitmann H, Czermak P. Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris. J Biotechnol. 2015 May 20;202: 118-34. Kim H, Yoo SJ, Kang HA. Yeast synthetic biology for the production of recombinant therapeutic proteins. FEMS Yeast Res. 2014 Aug 12.
Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: récent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Jun;98(12):5301-17. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5. Epub 2014 Apr 18. Review.
Weinacker D, Rabert C, Zepeda AB, Figueroa CA, Pessoa A, Farias JG. Applications of recombinant Pichia pastoris in the healthcare industry. Braz J Microbiol. 2014 Mar 10;44(4): 1043-8
Rabert C, Weinacker D, Pessoa A Jr, Farias JG. Recombinants proteins for industrial uses: utilization of Pichia pastoris expression System. Braz J Microbiol. 2013 Oct 30;44(2):351-6. Spadiut O, Capone S, Krainer F, Glieder A, Herwig C. Microbiais for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments. Trends Biotechnol. 2014 Jan;32(l):54- 60.
Espejo-Mojica ÂJ, Alméciga-Diaz CJ, Rodriguez A, Mosquera Â, Diaz D, Beltrân L, Diaz S, Pimentel N, Moreno J, Sânchez J, Sânchez OF, Côrdoba H, Poutou-Pinales RA, Barrera LA. Human recombinant lysosomal enzymes produced in microorganisms. Mol Genêt Metab. 2015 Sep-Oct;116(l-2): 13-23.
Giindiiz Ergiin B, Çalik P. Lignocellulose degrading extremozymes produced by Pichia pastoris: current status and future prospects. Bioprocess Biosyst Eng. 2015 Oct 23. Ledesma-Amaro R, Dulermo T, Nicaud JM. Engineering Yarrowia lipolytica to produce biodiesel from raw starch. Biotechnol Biofuels. 2015 Sep 15;8: 148.
Kalyani D, Tiwari MK, Li J, Kim SC, Kalia VC, Kang YC, Lee JK. A highly efficient recombinant laccase from the yeast Yarrowia lipolytica and its application in the hydrolysis of biomass. PLoS One. 2015 Mar 17;10(3):e0120156.
Zinjarde SS. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem.
2014;152: 1-10.
Hughes SR, Lôpez-Nunez JC, Jones MA, Moser BR, Cox EJ, Lindquist M, Galindo- Leva LA, Riano-Herrera NM, Rodriguez- Valencia N, Gast F, Cedeno DL, Tasaki K, Brown RC, Darzins A, Brunner L. Sustainable conversion of coffee and other crop wastes to biofuels and bioproducts using coupled biochemical and thermochemical processes in a multi-stage biorefinery concept. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Oct;98(20):8413-31.
Groenewald M, Boekhout T, Neuvéglise C, Gaillardin C, van Dijck PW, Wyss M. Yarrowia lipolytica: safety assessment of an oleaginous yeast with a great industrial potential. Crit Rev Microbiol. 2014 Aug;40(3): 187-206.
Celik E, Calik P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol Adv. 2012 Sep-Oct;30(5): 1108-18.
Sabirova JS, Haddouche R, Van Bogaert I, Mulaa F, Verstraete W, Timmis K, Schmidt-Dannert C, Nicaud J, Soetaert W. The 'LipoYeasts' project: using the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica in combination with spécifie bacterial gènes for the bioconversion of lipids, fats and oils into high-value products. Microb Biotechnol. 2011 Jan;4(l):47-54.

Claims

REVENDICATIONS
1) Cellule eucaryote transformée, caractérisée en ce qu'elle contient :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne RbcX impliquée dans le repliement d'une enzyme Rubisco de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et
(iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
2) Cellule eucaryote selon la revendication 1, caractérisée en ce que la chaperonne RbcX est une chaperonne de cyanobactérie.
3) Cellule eucaryote selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'au moins une des chaperonnes généralistes GroES et GroEL ne provient ni d'une cyanobactérie ni d'une autre bactérie exprimant un complexe RuBisCO.
4) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les trois cassettes d'expression forment un bloc continu d'information génétique.
5) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les cassettes d'expression des trois chaperonnes sont portées par un élément génétique épisomique unique.
6) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, ou en ce qu'elle a subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène.
7) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle ne contient pas de séquence codant pour une sous-unité RbcL ou RbcS d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne. 8) Cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure, préférentiellement choisie parmi Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris.
9) Utilisation d'une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression d'une chaperonne RbcX et des chaperonnes GroES et GroEL, pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote.
10) Utilisation selon la revendication 9, pour améliorer la physiologie d'une souche de levure.
11) Utilisation selon la revendication 9 ou 10, pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote comprenant au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, ou ayant subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène.
12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, pour augmenter la vitesse de croissance de ladite cellule eucaryote.
13) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, pour augmenter la résistance de ladite cellule eucaryote à un stress environnemental.
14) Utilisation selon la revendication 13, dans laquelle le stress environnemental est dû à la toxicité d'un élément présent dans le milieu de culture de la cellule eucaryote.
15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, pour augmenter la résistance de ladite cellule à la toxicité d'un composé synthétisé par la cellule eucaryote. 16) Utilisation d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la production d'une protéine recombinante.
17) Procédé biotechnologique pour produire au moins un composé sélectionné parmi les molécules chimiques et les protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans des conditions permettant la synthèse, par ladite cellule eucaryote, de ce composé, et de manière optionnelle une étape de récupération dudit composé. 18) Procédé de production d'une protéine recombinante comprenant (i) l'insertion d'une séquence codant ladite protéine dans une cellule eucaryote exprimant RbcX, GroES et GroEL, (ii) la culture de ladite cellule dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence et de manière optionnelle (iii) la récupération ou purification de ladite protéine. 19) Procédé selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce que ladite protéine est une enzyme.
20) Procédé selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce que ladite protéine est une hormone.
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