JP2018501810A - 天然又は改変真核細胞の生理機能に正の作用を有する細菌シャペロンの組合せ - Google Patents

天然又は改変真核細胞の生理機能に正の作用を有する細菌シャペロンの組合せ Download PDF

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Abstract

本発明は、真核細胞における特定の組合せの３つの細菌性シャペロンの発現に関する。これは特に、細胞が少なくとも１つの非天然遺伝子を用いるさらなる改変を含むときに、その増殖特性、及び物理化学的ストレスに対する抵抗性に関するその特性を顕著に向上させる。シャペロンの好ましい組合せは、大腸菌のシャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ、並びにシネココッカス・エロンガタスのシャペロンＲｂｃＸを含む。【選択図】なし

Description

本発明は細胞工学分野に関し、特に真核細胞分野に関する。また特に、本発明は、増殖及び／又は代謝特性が改善された真核細胞に関し、目的の化合物産生のためのその使用に関する。本発明は、特定の組合せのシャペロンを発現する真核細胞に特に関する。本発明は、組換えタンパク質産生の分野において特に適用される。
現在のところ、バイオテクノロジー、食品加工、医薬産業、又は基礎及び／若しくは応用的診断研究という多様な分野で用いられる目的のタンパク質のための多くの発現系が存在する。これらの発現系のなかで、真核細胞、特に酵母は、とりわけそのグリコシル化能力及び産業的条件での培養の容易性から、重要な役割を果たしている。しかし、これらの細胞には制限があり、これは特に、例として目的の産生物の蓄積（例えば高濃度のエタノール又は他のアルコール）に関連する毒性的制約、又は発現タンパク質の直接的又は非直接的毒性、又は発現プラスミドの存在を必要とするエネルギー負荷のためである。
本発明は性能が改善された真核細胞を提供し、最適な発現系の取得を可能にする。
酵母に合成カルビン回路を導入することに関する研究において、本発明者らは、酵母における３つの細菌シャペロン（ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ）一式の共発現が、特に異種性又は内在性タンパク質の発現及び機能性フォールディングについて、真核細胞に顕著な代謝特性を与えることを驚くべきことに観察した。本発明者らはまた、その検討に取り組み、このシャペロンの組合せが酵母の増殖促進、及び例えばキナーゼＲＰＫが細胞に共発現されるときなどの他の改変における毒性作用の除去をも可能にすることも示した。さらに、本発明者らは、様々な真核細胞における適用で同様の効果を確認及び取得し、これらの予期しなかった結果の有用性及び大きな潜在性を確かめた。
このように、本発明の目的は、シャペロンＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬを発現することを特徴とする真核細胞に関する。
所定の実施形態において、本発明は形質転換真核細胞に関し、該真核細胞は、
（ｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のフォールディングに関与するシャペロンＲｂｃＸをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を含む発現カセットと、を含むことで特徴づけられる。
本発明はまた、
（ｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、シャペロンＲｂｃＸをコードする配列と、
（ｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、シャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列と、
（ｉｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、シャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列と、を含む真核細胞にも関する。
所定の実施形態において、本発明の真核細胞は、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＬ及び／又はＲｂｃＳサブユニットをコードする配列を含まない。
本発明は、特に上述のような形質転換酵母を提示する。
本発明はまた、真核細胞の生理機能を向上させるための、特に、真核細胞の増殖速度を増加させる、及び／又は環境ストレスに対する真核細胞の抵抗性を増大する、及び／又は真核細胞によって合成された化合物の毒性に対する細胞の抵抗性を増大する、及び／又は組換えタンパク質を産出するための、シャペロンＲｂｃＸ並びにシャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの発現を可能にする発現カセットの組合せの使用を目的とする。
本発明はまた、化学分子及びタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を産生するための生物工学的プロセスも目的とし、該プロセスは、本発明の真核細胞によるその化合物の合成を可能にする条件下で該真核細胞を培養するステップと、該化合物を採取するステップと、を含むことを特徴とする。
本発明は特に、組換えタンパク質を産生するプロセスを提示し、該プロセスは、（ｉ）該タンパク質をコードする配列を、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬを発現する真核細胞に挿入すること、（ｉｉ）該配列の発現を可能にする条件下で真核細胞を培養すること、任意的に（ｉｉｉ）該タンパク質を採取又は精製すること、を含む。
図１は、１ｂ、１８ｂ、１０２、１５、１４ｂ株のエタノール産生速度を示す。エラーバーは、３つの独立的培養の標準偏差を示す。
発明者等は、真核細胞における所定の細菌シャペロンタンパク質の発現検討時に、細菌シャペロンが真核細胞サイトゾルに発現され、真核細胞においてそのシャペロン機能を保持することが可能であるということを驚くべきことに発見した。細菌シャペロン機能は、サイトゾルシャペロン機能に加えて、真核細胞に既に存在するものである。発明者等はさらに、特定の３つのシャペロン、即ち細菌シャペロンＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳ並びにシャペロンＲｂｃＸの発現が、それらを発現する形質転換真核細胞に、増殖、発現及び機能性タンパク質フォールディングに関して特に有用な特性を与えることを発見した。
必要から観察された効果は、好ましくは少なくとも２つの異なる微生物由来の、前述の３つのシャペロンの同時的存在を必要とするものである。シャペロンの共発現が、細菌系において異種タンパク質のフォールディングを向上させ、ゆえにそれに依存するバイオプロセスの性能を向上させる可能性があることが既知であれば、特定の生物体間の３つの細菌シャペロンタンパク質の組合せが真核環境において発現されることによって特に効果的であることを示すことは予見できなかった。本発明の効果をもたらす分子機構は、タンパク質フォールディング又はその細胞内運命の制御に恐らく少なくとも部分的に関するとしても、現在のところ未知である。補完的役割をするシャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの存在下で、ＲｂｃＸファミリータンパク質は（光合成生物体のＲｕＢｉｓＣＯ複合体の機能性会合に特化するとして先行技術に記載される）、興味深い全般的な役割を果たしている。観察された効果は全体的にフォールディング促進に起因するとすることはできず、特定のタンパク質の寿命調節、複合体の会合若しくはその特徴の改変、又は規定される特性の特定の効果などの他の機構に関与し得るということを、本発明のこの特徴は示唆する。
この文脈において、本発明は、真核細胞を形質転換して、該細胞が特定の３つのシャペロン、即ち細菌シャペロンＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳ並びにシャペロンＲｂｃＸを発現することをこのように提示する。そうした形質転換細胞には、特に組換えタンパク質産生に関して、多くの適用があり得る。
このように、本発明は、シャペロンＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬを発現することを特徴とする真核細胞を目的とする。
シャペロンＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳは熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ファミリーに属する。これらのシャペロンは多くの細菌に存在するものである。本発明において、これらのシャペロンは、非常に多くのタンパク質の効果的なフォールディングを可能にするように共作用することで知られるという意味で、「一般シャペロン」として言及される(M.Mayhew等、1996年、「Proteinfolding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex」、Nature、1996 Feb 1;379(6564):420-6)。本発明において、シャペロンＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳは、それらを発現する任意の細菌に由来し得、特に例えば大腸菌(E.coli)（遺伝子ＩＤ：９４８６５５及び９４８６６５）、Ｓ．エロンガタス(S.elongatus)（遺伝子ＩＤ：３１９９７３５、３１９９５３５及び３１９８０３５）、Ｓ．ニューモニア(S.pneumonia)（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＦ１１７７４１）、Ｓ．ピオゲネス(S. pyogenes)（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＳＰＧＲＯＥＬＧＮ）、Ｓ．アウレウス(S. aureus)（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＳＴＡＨＳＰ）、又はＰ．エルジノーサ(P. aeruginosa)（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＴＣＣ９０２７）に由来し得る。当業者は、細菌において、これらのシャペロンのいずれかをコードする可能性のある核酸配列を問題なく特定することができる。情報提供を目的として、シャペロンの配列類似性（アライメントにおいて同一のアミノ酸％）は、Ｓ．エロンガタスのＧｒｏＥＬ１と大腸菌のＧｒｏＥＬとで６１％、Ｓ．エロンガタスのＧｒｏＥＬ２と大腸菌のＧｒｏＥＬとで５６％、Ｓ．エロンガタスのＧｒｏＥＬ１とＧｒｏＥＬ２とで６３％、であることが言及される。
本発明に記載の細胞はまた、ＲｕｂｉｓｃｏのＲｂｃＬ及びＲｂｃＳサブユニットの適切な会合に関わることでシアノバクテリア及び植物において既知のシャペロンＲｂｃＸをも発現する。本発明において、このシャペロンは「特異的シャペロン」として言及され、これはこのタンパク質が、特にＲｕｂｉｓｃｏの場合のように、タンパク質複合体の機能性会合において役割を果たすことが既知であるという意味で言及されるものである(S.Saschenbrecker等、2007年、「Structure and function of RbcX, an assembly chaperone forhexadecameric Rubisco」Cell. 2007 Jun 15;129(6):1189-200)。本発明において、シャペロンＲｂｃＸは、それを発現する任意のシアノバクテリア由来であり得、特に例えばＳ．エロンガタス（配列番号３）、シネコシスティス属(Synechocystis sp.) (Kaneko等、「Sequence analysis ofthe genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803.II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potentialprotein-coding regions.」DNA Res. 3(3), 109-136 (1996年))、アナベナ属(Anabaena sp.) (Li他、J. Bacteriol.(1997年), 179(11), 3793-3796)、ミクロシスティス属(Microcystissp.)、チコネマ属（Tychonemasp.）、プランクトスリックス属(Planktothrix sp.)、又はノストック属(Nostoc sp.)(Rudi等, J. Bacteriol. (1998年), 180(13), 3453-3461)由来であり得る。
本発明において、「シャペロン活性」は、タンパク質フォールディングにおける作用及び／又はタンパク質複合体の機能性会合における作用に関する。
本発明の所定の実施形態において、用いられるシャペロンは好ましくは２つの異なる生物体由来である。本発明において、シャペロンは１つ以上の異なる細菌由来であってよい。好ましくは、３つのシャペロンは少なくとも２つの遠隔のグラム陰性細菌種に由来し、その少なくとも１つがシアノバクテリアである。
本発明の他の所定の実施形態において、一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの少なくとも１つは、シアノバクテリアにもＲｕＢｉｓＣＯ複合体を発現する他のバクテリアにも由来しない。本発明において、シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬは、同じ細菌又は２つの異なる細菌由来であってよい。特定の例示的実施形態において、シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬは大腸菌由来である。
所定の例示的実施形態において、シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬは大腸菌由来であり、シャペロンＲｂｃＸはシネココッカス・エロンガタス由来である。
他の例示的実施形態において、３つのシャペロンＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ及びＲｂｃＸはシネココッカス・エロンガタス由来である。そうした場合、形質転換細胞は、シャペロンＧｒｏＥＬのどちらか一方又は両方のアイソフォーム（ＧｒｏＥＬ１及びＧｒｏＥＬ２）を発現し得、好ましくは両方のアイソフォームを発現するとよい。
本発明において、タンパク質は、所定の生物体からのものと考えられるタンパク質と９５％より大きいアミノ酸配列同一性を有し且つ同じ機能を有する場合に、該生物体に「由来」すると考えられる。
本明細書において、「ＧｒｏＥＳ」及び「ＧｒｏＥＬ」は、シャペロン活性を有し、且つそれぞれ大腸菌Ｋ１２のＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬに６５％〜１００％のアミノ酸同一性を有する、任意のタンパク質に関する。代替的に「ＧｒｏＥＳ」及び「ＧｒｏＥＬ」は、Ｓ．エロンガタスの一般シャペロンなど、低率の同一性、特に５５％〜６５％、さらに５６％〜６３％の同一性を有する一般シャペロンに関する。大腸菌の一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの変異体におけるシャペロン活性は、例えば、以下に記載の種々の例において、大腸菌の天然ＧｒｏＥＳ又はＧｒｏＥＬをコードする発現カセットを、評価されるシャペロンの変異体で置換することで、検証され得る。
シャペロンＲｂｃＸは、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬと非常に隔たりがあり、その配列はこれら２つのシャペロンの配列とアライメントできないものである。
本明細書において、「ＲｂｃＸ」は任意のタンパク質、特にシアノバクテリアからの任意のタンパク質に関し、該タンパク質は、シャペロン活性を有し、配列番号３によってコードされるシャペロンＲｂｃＸに５０％を超えるアミノ酸配列同一性を有し、このタンパク質の特異的シャペロン活性を保持する。特異的シャペロン活性は、Ｓ．エロンガタスのＲｕＢｉｓＣＯのＲｂｃＬ及びＲｂｃＳサブユニットを発現する酵母において検証され得、これは、配列番号３を含む発現カセットを、評価される任意の他の配列で置換することと、こうして得られたＲｕＢｉｓＣＯ活性を細胞抽出物のインビトロ試験で測定することで行われ得る。
好ましくは、本発明は、配列番号３によってコードされるシャペロンＲｂｃＸに、８０％より大きい、好ましくは９０％より大きい、より好ましくは９５％より大きい、さらにより好ましくは９９％より大きいアミノ酸配列同一性を有するシャペロンＲｂｃＸで実施される。
本発明は、単細胞又は多細胞生物体からの任意のタイプの真核細胞で実施可能である。特に、本発明のシャペロンの組合せは、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などの動物細胞等において発現され得る。
特に、本発明は、特異的シャペロンＲｂｃＸ、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳ、及び細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬを発現する形質転換酵母に関する。
さらに特に、本発明は形質転換酵母に関し、該酵母は、
（ｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のフォールディングに関与するシャペロンＲｂｃＸをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を含む発現カセットと、を含むことを特徴とする。
本発明は、目的の任意の酵母で実施可能である。酵母は、有利にはサッカロマイセス(Saccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、及びピキア(Pichia)から選択される。例として、本発明の形質転換酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。他の例において、本発明の形質転換酵母は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞、又はピキア・パストリス(Pichiapastoris)細胞である。
ピキア・パストリスの使用は、組換えタンパク質産生に特に有利である。実際に、ピキアは、分泌及び細胞内発現の両方に関して、高性能の真核細胞タンパク質発現系を有する。これは、組換え真核細胞タンパク質の大規模産生に特に適する。特に、ピキアは、高産生量の分泌タンパク質産生に使用可能であって、哺乳動物細胞発現系に関連するものと比較して製造費及び製造時間を削減する。
また、ヤロウィア・リポリティカも組換えタンパク質産生のための使用に適する。実際に、ヤロウィアは、（ｉ）高密度増殖性、（ｉｉ）高分泌率、（ｉｉｉ）アルカリプロテアーゼＡＥＰの欠失、及び（ｉｖ）炭素源としてショ糖の使用を可能にするＳ．セレビシエインベルターゼ産生能を有する（Nicaud等、1989年）。後者の特性は、この株が糖蜜などの安価な基質で効率的に増殖可能であるので、産業的製造の場合に特に有利である。
本発明はまた、形質転換され、特異的シャペロンＲｂｃＸ、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳ及び細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬを発現する、動物細胞、特に哺乳動物細胞などの多細胞生物体真核細胞にも関する。
例示的実施形態において、そうした真核細胞は、
（ｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のフォールディングに関与するシャペロンＲｂｃＸをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を含む発現カセットと、を含むように形質転換される。
本発明は、本発明の３つのシャペロンを発現する形質転換ＣＨＯ細胞に特に関する。
本発明において、シャペロンＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ及びＲｂｃＸをコードする遺伝子は、真核細胞に、該細胞におけるその発現を可能にする形態で導入される。このように、シャペロンをコードする配列は、それらの転写を可能にするプロモーター配列に連結する。一実施形態において、同じプロモーター配列が、３つのシャペロンをコードする配列に連結する。他の実施形態において、シャペロンＲｂｃＸは、シャペロンＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳと連結するプロモーターとは異なる特定のプロモーターと連結する。他の実施形態において、各シャペロンは異なる特定のプロモーターと連結する。
本発明に関して使用可能なプロモーターは、構成的プロモーター、即ち大部分の細胞状態及び環境条件で活性であるプロモーターと、外因性の物理的又は化学的刺激によって活性化又抑制され、これらの刺激の存否の結果として種々のレベルの発現を誘導する誘導的プロモーターとを含む。
酵母における発現カセットについて、構成的プロモーターの例は、遺伝子ＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＰＧＩ１、ＰＧＫ、ＡＤＨ１のものである。誘導的プロモーターの例はｔｅｔＯ−２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＰＨＯ５プロモーターである。好ましくは、用いられるプロモーターはカセットごとに異なり得る。本発明の発現カセットは、転写ターミネータや、必要であれば他の転写調節要素などの共通の配列をさらに含む。本発明に記載の発現カセットは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに挿入されるか、及び／又は１つ以上の染色体外複製単位（レプリコン）によって保持されることが可能である。これらのタンパク質の相対的なストイキオメトリは、本発明の最適な実施形態において重要な役割を果たす可能性が高いものである。以下の実験の項に記載の共発現系は特にこれに関して関連する。しかしながら、本発明はこの系の使用に限定されず、例えば形質転換細胞用標準培地において形質転換細胞の増殖を測定することによって測定可能である、少なくとも同等の作用を有する記載要素の発現の任意の変形で実施可能である。
有利な実施形態において、３つの発現カセットは遺伝子情報の連続的ブロックを形成する。また、３つのシャペロンの発現カセットが単一のエピソーム遺伝要素により保持されることも有利であり得る。ゆえに本発明の特に有利な態様は、複製のセントロメア源を有するエピソーム要素が保持する単一の「遺伝子プラグイン」（連続的ＤＮＡ配列）である。この要素による形質転換は、野生型酵母又は任意の改変を有する酵母における目的の特性の導入に十分なものである。
本発明において、各シャペロンをコードする遺伝子は、１つ以上のコピーで細胞に導入され得る。特に、ＧｒｏＥＳをコードする配列を含む、１、２、３、又はそれ以上のカセット、ＧｒｏＥＬをコードする配列を含む、１、２、３、又はそれ以上のカセット、及び、ＲｂｃＸをコードする配列を含む、１、２、３、又はそれ以上のカセットを導入可能である。同様に、カセットは、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ又はＲｂｃＸをコードする配列の複数のコピーを含み得る。シャペロンをコードする遺伝子の複数のコピーが細胞に導入される場合、同じ配列、即ち同じ細菌由来の配列が好ましくは各回に用いられる。異なる細菌由来の配列を用いることも可能である。
上述のように、本発明の細胞は特性が向上されている（増殖速度、抵抗性、産生能力など）。このように、これらの細胞はタンパク質若しくは他の化合物の産生に、又は発酵処理の向上に特に有用である。
［タンパク質産生］
本発明は、上述のようなシャペロンの組合せを発現するように形質転換された真核細胞にも関し、該細胞は、該シャペロン以外の異種性タンパク質のための少なくとも１つの発現カセットをさらに含む、並びに／又は内在性タンパク質の発現レベル及び／若しくは配列を変更する配列改変を受けている。
本発明の好ましい実施形態において、形質転換真核細胞は酵母である。本発明の他の好ましい実施形態において、形質転換真核細胞はＣＨＯ細胞である。
このように、本発明はまた、上述のようなシャペロンの組合せを発現するように形質転換された酵母又はＣＨＯ細胞を目的とし、該酵母又はＣＨＯ細胞は、
（ｉｖ）前述のシャペロン以外の異種性タンパク質のための発現カセット、並びに／又は
（ｖ）内在性タンパク質の発現レベル及び／若しくは配列を変更する配列改変を受けていること、を含む。
本発明において、１つ以上の目的のタンパク質を産生するためにそうした形質転換細胞を用いることが可能である。
有利には、目的のタンパク質はＲｕｂｉｓｃｏではない。同様に、好ましくは、目的のタンパク質はＰＫＲ以外のタンパク質である。また、形質転換真核細胞がＲｕｂｉｓｃｏ及び／又はＰＫＲを発現する場合、少なくとも１つの他の異種性タンパク質を有利には発現する。
所定の実施形態において、３つのシャペロンＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ及びＲｂｃＸを発現する形質転換細胞は、組換えタンパク質を発現及び排出するようにさらに改変される。
本発明はまた、化学分子、酵素、ホルモン、抗体及びタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を産生するための生物工学的プロセスにも関し、該プロセスは、上述のような形質転換細胞を、該細胞による化合物の合成を可能にする条件下で培養するステップと、任意的に、該化合物を採取及び／又は精製するステップとを含むことを特徴とする。
本発明はまた、組換えタンパク質を産生するプロセスにも関し、該プロセスは、（ｉ）該タンパク質をコードする配列を、３つのシャペロンＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ及びＲｂｃＸを発現する真核細胞に挿入すること、（ｉｉ）該配列を発現可能にする条件下で該細胞を培養すること、並びに任意的に（ｉｉｉ）該タンパク質を採取及び／又は精製することを含む。有利にはタンパク質は酵素又はホルモンである。
所定の実施形態において、本発明に記載の細胞は、少なくとも１つの異種性酵素を産生するように形質転換される。例えば、細胞は、バチルス・チューリンゲンシス内毒素などの内毒素、リパーゼ、サブチリシン、セルラーゼ、及びルシフェラーゼから選択される酵素を産生するように形質転換される。
他の所定の実施形態において、本発明に記載の細胞は、少なくとも１つの医学的目的の分子を産生するように形質転換される。例として、細胞は、ホルモン、成長因子、抗体などを産生するように形質転換される。好ましくは、医学的目的の分子は、エリスロポエチン、Ｉ型及び／又はＩＩ型αインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子から選択される。
本発明に記載の形質転換細胞では、有利には、本発明のシャペロンの組合せを発現しない組換え細胞と比較して、目的のタンパク質の産生が向上する。本発明において、産生が「向上する」とは、量及び／又は質に関することを意味する。特に、本発明に記載の形質転換細胞は、より活性がある及び／又はより安定的であるがゆえに分解される可能性が低い目的のタンパク質を産生可能であり、これは本発明のシャペロンの組合せを発現しない組換え細胞によって産生される異種性タンパク質と比較してタンパク質を多く蓄積可能とする。こうして、本発明の形質転換真核細胞による組換えタンパク質の発現レベルの増大は、特に高い安定性によって、ゆえにタンパク質が細胞及び／又は培地に多く蓄積することによって説明される。さらに、形質転換細胞によるシャペロンの組合せの発現は、組換え細胞が発現する組換えタンパク質に対する組換え細胞の抵抗性を有利に増大し得、ゆえに産生量の増大にも関与し得る。
本発明はまた、真核細胞の生理機能及び／又は特性（特に増殖速度）を向上させるために、真核細胞において特異的シャペロンＲｂｃＸと一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬとの発現を可能にする発現カセットの組合せを使用することにも関する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、生理機能の向上が望まれる真核細胞は酵母である。他の好ましい実施形態において、真核細胞は、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＬサブユニットをコードする配列及び／又は該ＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＳサブユニットをコードする配列を発現するように形質転換されていない。
上述のように、一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ並びに特異的シャペロンＲｂｃＸの発現を可能にする発現カセットの組合せは、内在性タンパク質の発現レベル及び／若しくは配列を変更する配列改変を受けた真核細胞、又は、例えばエピソーム遺伝要素の形態で、該シャペロン以外の異種性タンパク質のための少なくとも１つの発現カセットを含む真核細胞の生理機能の向上に特に有用である。
特に、一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ並びに特異的シャペロンＲｂｃＸを細胞において共に発現することは、細胞の増殖速度の増大、及び／又は環境ストレス、特に細胞培地に存在する要素の毒性によるストレスに対する細胞の抵抗性の増大を可能にする。他の有利な適用は、合成された化合物の毒性に対する細胞の抵抗性を増大させ、ゆえに目的の化合物の産生を増大させることである。
本発明の数多くの適用が考えられ得、特に、形質転換真核細胞と同種又は異種であるタンパク質のフォールディング又は安定性（化学的又は熱的薬剤への抵抗性、固有の寿命）の向上に関するあらゆる適用が考えられ得る。適用とは、酵素触媒を目的とする、又はその固有の特性のため（抗体、治療タンパク質、複合体内の構造タンパク質など）のタンパク質自体であり得、（形質転換真核細胞のタンパク質に関与する）合成又は準合成代謝チェーンの特性向上に関する適用であり得、この場合、有利性は主に目的の産生物（化学分子）産生における作用の結果の向上である。この効果は、フォールディング又は安定性の向上からだけでなく、例えば細胞内輸送、複合体形成の容易性又は改変性、結合機構の改変などの他の現象からももたらされ得る。適用は、増殖性、生存性、適応性、ストレスに対する抵抗性若しくはストレスからの回復性、既知である又は説明可能であるメカニズムのなしの対象産生物形成に関する生物体における全体的に正である効果を起因とするものである。
本発明の産業的適用の例は、以下のものを含むがこれらに限定されない。
‐タンパク質フォールディング・安定性における効果
本発明の適用によって、可溶性及び機能性形態で産生することが困難である又は不可能とさえ考えられていた目的の所定の組換えタンパク質の産生が向上可能である。これは、本発明による形質転換真核細胞における特にタンパク質のフォールディング不良の修正によって説明される。またこれは、保健衛生、エネルギー、化学、食品加工などの分野で特に有用であり得る。
‐目的の改変産生物又は改変中間物により誘導される毒性に対する防御
宿主細胞に対して毒性のある分子、又はその産生プロセスが毒性中間物に関与する分子の生物生産は問題であり得、例として、医薬、（ヒドロコルチゾン、アルテミシン酸又はｔｒｉｃｔｏｓｉｎｉｄｅ、開発プロセスのある種のフラボノイド）又は反応分子（不飽和ケトン、アルデヒド（例えばバニリン））などが挙げられる。他の例は、高濃度で毒性になる分子を産生するプロセスに相当するものであり、例えば、エタノール又は他のアルコールが挙げられる。例えばエタノール産生は、高アルコール濃度に対する酵母株の耐性によって制限される。他の例は、非常に多様な産業的化学分子、現在の産生物の前駆体又は化学的中間物、そして言うまでもなくバイオ燃料の産生に関わる。それらはまた組換えタンパク質で有り得、組換え細胞によるその産生が代謝を不均衡にする傾向があり、細胞死を誘導する。本発明のシャペロンの組合せを発現する真核細胞の使用により、細胞が発現する組換えタンパク質により誘導される毒性に対する形質転換細胞の耐性が増大されることが有利に可能である。
‐耐熱性
特定の酵素又は酵母などの生物体の耐熱性の向上は、例えば多くの溶解しにくい分子の生物工学的生産性にとって重要な要素である。
‐固定量の炭素源から産生される微生物のバイオマス増大
これらは分子レベルでは理解されていないが、以下に記載の第１の実験において観察される効果である。
上述のように、本発明はまた核酸分子に関し、該核酸分子は、
（ｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のフォールディングに関与するシャペロンＲｂｃＸをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を含む発現カセットと、
（ｉｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を含む発現カセットと、を含む。
そうした「遺伝子プラグイン」の例は、複製のセントロメア源を有するエピソーム要素が保持する、上述の３つのカセットを（任意の順番で）含む連続的ＤＮＡ配列である。
以下の実験の項は、
‐創製されるコンストラクト及び実施される方法（実施例１）、
‐２つの異なるタイプに属する１６ペプチド鎖の会合からなるタイプＩＲｕＢｉｓＣＯ活性の再構成における様々な組合せのシャペロンの効果を比較する第１の試験一式。様々な会合のシャペロンの発現を「タイプＩＲｕＢｉｓＣＯ」のＲｂｃＬ及びＲｂｃＳポリペプチドの発現と組み合わせる。このため、酵母細胞抽出物においてインビトロで測定されるＲｕＢｉｓＣＯ活性におけるシャペロン組合せの役割を解析することが可能になる（実施例２）、
‐Ｓ．エロンガタスのホスホリブロキナーゼ（phosphoribulokinase、ＰＲＫ）を条件的に発現する酵母におけるシャペロン系の共発現に関与する第２の試験一式。本発明なしでは、ＰＲＫ発現の誘導は、Ｓ．セレビシエ株及び培養条件（培地、酸素レベル、ｐＨ）次第で顕著な増殖遅延から全死滅（＞９９．９９％）までの、酵母における高い毒性効果を誘導する。本発明がＲＰＫ酵素の活性に干渉することなくこの不健全な状態を「治癒」し、ＲＰＫ酵素は完全に活性を維持することを、例示は示している（実施例３）、
‐本発明が、中性プラスミド（それ自体はその自己複製以外に機能発現をもたらさない）でも補完される独立栄養性を有する株の野生増殖レベルを回復することを示す第３の試験一式。この状態は、エピソーム遺伝要素に関与する代謝改変において典型である。実施例において、本発明は、エピソーム遺伝要素の存在に関与する増殖における負の影響を完全に修正する（実施例４）、並びに
‐本発明の細胞が、化合物産生に、特に組換えタンパク質産生に特に有用であることを示す他の試験一式（実施例５）、
を提示することによって本発明を記載したものであるが、本発明を限定するものではない。
以下の実施例において、他に特定されない限り、同様の頭字語が同じ要素を示すために各表及び各実験に用いられる。
［実施例１：材料と方法、「シャペロンプラグイン」及びベクターの構築、様々な株の構築、培養及び測定方法］
＜１．１．「シャペロンプラグイン」及びＳ．セレビシエのベクターの構築＞
以下に記載される所定のコンストラクトは、シネココッカス・エロンガタスｐＣＣ６３０１からのＲｕＢｉｓＣＯ（ｐＦＰＰ４５）の２つのＲｂｃＳ及びＲｂｃＬサブユニットの発現、及びホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）（ｐＦＰＰ２０）の発現を可能にする。以下に記載される他のコンストラクトは、単一の発現ベクターから、シネココッカス・エロンガタスからの特異的シャペロンＲｂｃＸと、大腸菌ＧｒｏＥＳ（遺伝子ＩＤ：９４８６５５）、ＧｒｏＥＬ（遺伝子ＩＤ：９４８６６５）、又はシネココッカス・エロンガタスからのその相同体ＧｒｏＥＳ（遺伝子ＩＤ：３１９９７３５）、ＧｒｏＥＬ１（遺伝子ＩＤ：３１９９５３５）及びＧｒｏＥＬ２（遺伝子ＩＤ：３１９８０３５）である一般シャペロンとの様々な組合せの発現を行うことを可能にするために作製された。
シネココッカス・エロンガタスｐＣＣ６３０１からのＲｕＢｉｓＣＯのＲｂｃＳ（遺伝子ＩＤ：３２０００２３）及びＲｂｃＬ（遺伝子ＩＤ：３２００１３４）サブユニット、並びに特異的シャペロンＲｂｃＸ（遺伝子ＩＤ：３１９９０６０）をコードし、且つ酵母における発現に最適化された合成遺伝子を調製し、プラスミドｐＢＳＩＩ（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ）にクローニングした。コード配列の３′末端にＨＡタグを追加した、酵母における発現に最適化された変異体も構築した。これらの合成遺伝子の配列（ＨＡタグ無し）は、添付の配列表において配列番号１〜配列番号３の番号下にそれぞれ示される。
同様に、シネココッカス・エロンガタスｐＣＣ６３０１からのホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）（配列番号４）（ｐＦＰＰ２０）、並びに一般シャペロンＧｒｏＥＳ（配列番号５）、ＧｒｏＥＬ１（配列番号６）及びＧｒｏＥＬ２（配列番号７）をコードし、且つ酵母における発現に最適化された合成遺伝子を構築してクローニングした。
大腸菌のシャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬをコードする配列を大腸菌培養物から増幅し、プラスミドｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。
クローニングベクターから回収した配列を酵母発現ベクターに導入した。これらの宿主ベクターを以下の表１に示す。
表１：使用ベクターリスト
注：ｐＧＡＬ１０-ＣＹＣ１はＧＡＬ１０遺伝子のＵＡＳとＣＹＣ１遺伝子の転写開始点からなる合成プロモーターである（Ｐｏｍｐｏｍ他、Methods Enzymol、272、51‐64、1996年）。
このように得られた発現カセットは以下の表２に示される。
表２：発現カセット
所定のベクターにおいて、２又は３つのカセットを挿入した。そのため、プラスミドを大腸菌ＤＨ５αバクテリアにおいて増幅し、マキシプレップによって調製し、そして適切な制限酵素で消化した。最後に、フラグメントをＴ４リガーゼ（ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ）によってライゲーションで、又は酵母に直接的に相同組換えを行うことで宿主ベクターに組み込む。構築ベクターのリストは以下の表３に示される。
表３：発現ベクター
＜１．２．種々のＳ．セレビシエ株の構築＞
酵母株内の個々の成分の要求に応じた発現又はこれらの成分の会合を可能にするために、上述の様々なプラスミドを構築した。このように、酵母Ｓ．セレビシエの複数の株（Ｗ３０３．１Ｂ、ＦＹ１６７９及びＣＥＮ．ＰＫ１６０５）を形質転換するために、様々なベクター又はベクターの組合せを用いた。ＣＥＮ．ＰＫ１６０５は、１６０５株の原栄養性型であり、ゆえに「生理的挙動」の正のコントロールである。以下の表４の第１列に示す各番号は、同表の対応する行に記載されるベクターの関連性に相当する。つまり、用いられる各株について、関連参照番号により再構築エンジニアリングの情報が得られる。ＣＥＮ．ＰＫ１６０５株のみが明確化のため例示されている（表４）が、命名法は他の２つの株についても同様である。
表４：プラスミド及び株の組合せ（表３に関連）
（Ｓｙｎ：シネココッカス・エロンガタス；Ｌ２ ｓｙｎ：ＧｒｏＥＬ２ シネココッカス・エロンガタス；Ｌ１ ｓｙｎ：ＧｒｏＥＬ１ シネココッカス・エロンガタス）
所定の表に関する注釈は以下のとおりである。
１．ｐＣＭ１８５：市販のプラスミド（ＡＴＣＣ８７６５９）
２．ｐＦＬ３６：市販のプラスミド（ＡＴＣＣ７７２０２）
３．ＰＹｅＤＰ５１：「空の」プラスミド、Ｕｒｂａｎ Ｐ、Ｍｉｇｎｏｔｔｅ Ｃ、Ｋａｚｍａｉｅｒ Ｍ、Ｄｅｌｏｒｍｅ Ｆ、Ｐｏｍｐｏｍ Ｄの、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの２種の遠い関係にあるＮＡＤＰＨ‐チトクロームＰ４５０レダクターゼのクローニング、酵母での発現、及びＰ４５０ ＣＹＰ７３Ａ５とのカップリングの特性化(Cloning, yeastexpression, and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450 reductases with P450 CYP73A5、J BiolChem.、1997年8月1日、272(31):19176-86)の文献に記載される
４．ＧｒｏＥＳ大腸菌遺伝子ＩＤ：６０６１３７０、ＧｒｏＥＬ大腸菌遺伝子ＩＤ：６０６１４５０
５．Ｓ．セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ：Ｍａｔ ａ原栄養性
６．Ｓ．セレビシエ株ＣＥＮ．ＰＫ１６０５：ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ由来の、Ｍａｔ ａ ＨＩＳ３ｌｅｕ２−３．１１２ｔｒｐ１−２８９ ｕｒａ３−５２ ＭＡＬ．２８ｃ．株
７．他の省略形は、データバンクに記載されるＳ．セレビシエ遺伝子を参照
８．合成遺伝子：ＲｕＢｉｓＣＯサブユニット、ＲｕＢｉｓＣＯ会合に特異的なシャペロン（ＲｂｃＸ）、ＰＲＫ，並びに一般シャペロンＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ１及びＧｒｏＥＬ２をコードするシネココッカス・エロンガタス遺伝子は、不均質なコドンバイアスがある酵母のために独占的再コードを行った後に合成され、ｐＣＣ６３０１（市販）にクローニングした。これらのタンパク質のコード配列（再コード後）は添付に示される（配列番号１：ＲｂｃＳコード配列；配列番号２：ＲｂｃＬコード配列；配列番号３：ＲｂｃＸコード配列；配列番号４：ＰＲＫコード配列；配列番号５：ＧｒｏＥＳコード配列；配列番号６：ＧｒｏＥＬ１コード配列；配列番号７：ＧｒｏＥＬ２コード配列）
９．大腸菌シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬのコード配列は、細菌から増幅され、ｐＳＣ−Ｂ−ａｍｐ／ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングされ、発現ベクターにおいて再コードされることなく連結された（上述を参照）
１０．シネココッカス・エロンガタスシャペロニンをコードするｃＤＮＡの再コード配列は、酵母の２分子を共形質転換することで、予め線状化されたベクターｐＵＣ５７に相同組換えにより挿入された。同様に、ＯＲＦは、以前のコンストラクトからＰＣＲによって増幅され、ベクターｐＦＰＰ５６が保持するプロモーター及びターミネーターに相同である側部領域を生成した。このため、酵母株に対してＰＣＲ産生物と予め線状化されたベクターｐＦＰＰ５６とで共形質転換することによって相同組換えによるクローニングが可能になり、表２に記載のカセットによって表３に記載の様々な発現ベクターを生成した。
＜１．３．異なる由来のシャペロンを組み込む様々なサッカロマイセス・セレビシエ株の構築＞
様々な細菌のシャペロンを評価した。また、同じ種（Ｓ．エロンガタス）からのタンパク質を含む組合せも、Ｓ．エロンガタスのＲｂｃＸをＳ．エロンガタスのＧｒｏＥＳ並びにＧｒｏＥＬ１及び／又はＧｒｏＥＬ２と組み合わせて試験した。
表５：発現カセット
表６：発現ベクター
表７：プラスミド及び株の組合せ
（Ｓｙｎ：シネココッカス・エロンガタス；Ｌ２ ｓｙｎ：ＧｒｏＥＬ２；Ｌ１ ｓｙｎ：ＧｒｏＥＬ１ シネココッカス・エロンガタス）
＜１．４．ピキア・パストリス株の構築＞
プラグインに包含される遺伝子の機能発現を維持するために、プロモーター及びターミネーターをピキア・パストリスＧＳ１１５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ１８１−００）で機能的なプロモーター及びターミネーターで置換した。
プラスミドｐＦＰＰ５６（表３）において、ＣＡＳ１９、ＣＡＳ２０及びＣＡＳ２１（表２）の、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ遺伝子発現を制御する各プロモーターを、文献に従って互換性プロモーターで置換した（以下の表８）。
表８：発現カセット
以下の３つの発現カセットを含む領域（表９）をＰＣＲで増幅し、市販のプラスミドｐＰＩＣ３．５にＮｏｔＩサイトでクローニングした（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ１７１０−０１）。
表９：発現ベクター
これらのプラスミドを予め線状化し、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ Ｐｉｃｈｉａ発現キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）プロトコルに従ってヒスチジン栄養要求性のピキア・パストリス株ＧＳ１１５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃ１８１−００）に個別に形質転換し、３０℃の最小培地及びグルコースにおいてセレクションをした。
表１０：プラスミド及び株
＜１．５．ヤロウィア・リポリティカ株の構築＞
廃水から単離した野生株Ｗ２９（ＡＴＣＣ２０４６０、ＭａｔＡ）を用いた。
プラスミドｐＦＰＰ５６（表３）において、ＣＡＳ１９、ＣＡＳ２０及びＣＡＳ２１（表２）の、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ遺伝子発現を制御する各プロモーターを、文献に従って互換性プロモーターで置換した（以下の表１１）。
表１１：発現カセット
上記の３つの発現カセットを含む領域（表１１）をＰＣＲで増幅し、市販のプラスミドｐＹＬＥＸ１にクローニングした。
表１２：発現ベクター
これらのプラスミドを線状化し、ＹＬＯＳ形質転換キットプロトコル（Ｙｅａｓｔｅａｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従ってロイシン栄養要求性のヤロウィア・リポリティカ株に個別に形質転換し、２８℃の最小培地及びグルコースにおいてセレクションをした（ＹＬＥＸ発現キット、Ｙｅａｓｔｅａｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：ＦＹＹ２０１−１ＫＴ）。
表１３：プラスミド及び株
ヤロウィア・リポリティカＰＯ１ｆ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＭＹＡ２６１３）
遺伝子型：MATAura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2
シャペロンの影響の評価を、合成培地内の株ＰＯ１ｆ＿０１及びＰＯ１ｆ＿０２の培養物において、ロイシン無しにて、２８℃で７２時間行った。
＜１．６．ＣＨＯ細胞の構築＞
高等真核生物細胞一式における「シャペロン」プラグインの容易且つ多目的なハンドリング、並びに高性能トランスファーを確実にするため、第４世代レンチウイルス形質導入系を選択した。これらのレンチウイルス粒子により、例えばヒト又はマウス細胞などの様々な種の高等真核生物の不死化又は形質転換された初代細胞に同様にプラグインをトランスファーすることができる。
プラスミドｐＦＰＰ５６（表３）において、ＣＡＳ２０及びＣＡＳ２１（表２）のＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬ遺伝子の発現を制御する各プロモーターを、文献に従って互換性プロモーターで置換した（表１４）。
表１４：発現カセット
ＲｂｃＸのオープンリーディングフレーム並びに以下の２つの発現カセットＣＡＳ５５及びＣＡＳ５６を含む領域をＰＣＲによって増幅し、市販のプラスミドｐＬＶＸ−ＰｕｒｏにＸｈｏＩ−ＫｐｎＩサイトでクローニングした（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１６４）。
表１５：発現ベクター
プラスミドｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ又はｐＣＢ１０を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘパッケージングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、キットのプロトコルに従って、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に形質転換した。ウイルス粒子を含む上清を濾過して、５ｍｌの培地最終量のために、１０ｃｍペトリディッシュで培養したＣＨＯ細胞に１／５又は１／２希釈で添加した。
２４時間の形質導入後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で４８時間を超えるセレクションのために、２μｇ／ｍｌピューロマイシンで補完した新しい培地を添加した。
こうして株化された細胞株を培地内の０．５μｇ／ｍｌ濃度のピューロマイシンのもとで維持した。
表１６：プラスミド及び株
＜１．７．方法＞
＜＜培養方法１：グルコースにおける増殖＞＞
６．７ｇ／ｌ硫酸アンモニウム、２０ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌアガーで補完し、アガーについては形質転換に用いられるプラスミドの選択マーカーに適し（−ｕｒａ、−ｌｅｕ、−ｔｒｐ）、２μ／ｍｌドキシサイクリンの存在下の市販のＣＳＭ培地（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で補完したＹＮＢ培地（酵母用窒素源非含有）において、形質転換細胞を、周囲空気下３０℃で増殖させた。対数期終了の一世代前に４℃で冷却することで、培養を停止した。培養物を遠心分離し、高張性ソルビトール培地（１．２Ｍソルビトール）内でザイモリエース・サイトへリカーゼ混合物で細胞壁の酵素消化をすることで、スフェロプラストを調製する。スフェロプラストを、飽和濃度のＰＭＳＦ及びＥＤＴＡ（プロテアーゼ阻害剤）の存在下で高張性ソルビトール培地内で洗浄し、等張性ソルビトール培地（０．６Ｍ）内にてピペッティングの反復と弱い音波処理とで破砕する。大きな破片を除くために低速（１５００ｒｐｍ）で、そして中程度のサイズの破片とミトコンドリアとを採取するために中速（４０００ｒｐｍ）で遠心分離した後、上清を採取し、ブラッドフォード法にてタンパク質濃度を定量化する。
＜＜インビトロのＲｕＢｉｓＣＯ活性試験＞＞
インビトロにおいて、この細胞溶解物からの１５μｇのタンパク質試料を、２００μｌの反応量のため、適切なバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２ ＋、６０ｍＭ炭酸水素ナトリウム）内の合成分子ＲｕＢＰ（最終２ｍＭ）に添加して、酵母溶解物に発現されるＲｕＢｉｓＣＯ複合体がホスホグリセリン酸分子形成を触媒可能にする。種々の時間で、ＨＣｌ（１２．１Ｍ）を添加することで反応を停止し、時間の経過に伴い産生されたホスホグリセリン酸のアッセイを行ってタンパク質試料のカルボキシラーゼ活性を評価するために、反応産生物をＨＰＬＣ／ＭＳで分析する。
＜＜制御培地内の培養物＞＞
前培養物を既知組成の培地で調製した。１ｍｌのストック管（−８０℃）を解凍後、これを用いて、１０ｍｌの培地を含むペニシリンボトル（１００ｍｌ）に播種し、１８時間３０℃で１２０ｒｐｍにおいてインキュベートした。ＰＲＫ遺伝子の存在下で見受けられる毒性の問題を避けるため、前培養物を、嫌気状態において（事前に窒素を流したボトル）、ドキシサイクリン（２μ／ｍｌ）の存在下で調製した。そして、前培養物を生理食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／ｌ）で３回洗浄し（遠心分離、再懸濁、１５秒間の撹拌）、細胞のペレットをドキシサイクリン非含有培地に再懸濁した。
前培養物に由来するこれらの細胞を、０．０５（又は０．１ｇ／ｌ）の初期光学密度を得るために播種した。開始培養量は、好気状態において５０ｍｌ（２５０ｍｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）又は嫌気状態において３５ｍｌ（１００ｍｌペニシリンボトル）であった。
すべてのグルコースが消費されるか又はエタノール産生が停止した後、培養は停止された。各培養物をトリプリケートで調製した。
＜＜解析：細胞外代謝物の特性評価＞＞
グルコース、ぎ酸、及び主な代謝物（エタノール；グリセロール；酢酸、コハク酸、及びピルビン酸）の濃度を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した。用いた装置は、アミネックスＨＰＸ８７−Ｈ＋（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）カラムを備えたクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ、Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０）であった。示差屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ２４１４検出器）によって分子検出を行った。溶出剤は、流速０．５ｍｌ／分の８ｍＭのＨ２ＳＯ４であり、カラム温度は５０℃に設定された。この解析は、嫌気状態において、単一ボトルの各株にて行われた。この場合、標準偏差の算出は損失質量において行われ、代謝物に適用された。
［実施例２： 酵母におけるタイプＩＲｕＢｉｓＣＯのカルボキシラーゼ活性の再構成におけるシャペロン組合せの効果］
カルビン回路により、植物及びシアノバクテリアが二酸化炭素からグルコースを産生することが可能になる。重要なステップは、５炭素を有する分子であるリブロース−１，５−ビスリン酸（ＲｕＢＰ）におけるＣＯ２の固定である。このステップは、ＲｕＢｉｓＣＯ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）と呼ばれる酵素を要求する。この酵素により、不安定な６炭素分子の形成が可能になり、これが即座に２つの３炭素３−ホスホグリセラート分子をもたらす。ＲｕＢｉｓＣＯには複数の形態が存在する。フォームＩは、大サブユニット（ＲｂｃＬ）及び小サブユニット（ＲｂｃＳ）の２タイプのサブユニットからなり、これらのサブユニットの適切な会合には、少なくとも１つの特異的シャペロン、ＲｂｃＸの介入をさらに必要とする。ＲｕＢｉｓＣＯの基質であるＲｕＢＰは、リブロース−５−リン酸とＡＴＰとの反応によって形成され、この反応はホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）により触媒される。
この例では、人工的カルビン回路が再構築され、これは、組合せ番号に従って大腸菌又はシネココッカスの一般シャペロンＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳあり（組合せ３番及び１０１番）又はなし（組合せ４番）で、シネココッカス・エロンガタスのＲｕＢｉｓＣＯのＲｂｃＳ及びＲｂｃＬサブユニット、特異的シャペロンＲｂｃＸ、並びにＰＲＫ酵素を共に発現可能にする上記表４の３番及び４番のベクターの組合せによって、酵母株ＣＥＮ．ＰＫ１６０５の共形質転換をすることにより行われる。
こうして、グルコースにおける酵母培養からのタンパク質抽出物から（プロトコルは上述の１．３に詳細される）、３つの独立的実験（Ａ，Ｂ及びＣ）におけるＲｕＢｉｓＣＯ活性試験を行う。時間の関数としてホスホグリセリン酸産生を測定することで、その産生物を評価した。結果を以下の表１７に示す。
表１７：インビトロにおけるＲｕＢｉｓＣＯ活性試験を、グルコース上で増殖させ且つ第１列に示されたエンジニアリングを含むＣＥＮ−ＰＫ株の抽出物でおこなった。室温において、２ｍＭリブロース二リン酸を含む２００μｌの反応量内で酵母の可溶性抽出物からの０．０１〜０．０２ｍｇのタンパク質と共に８０分のインキュベーションをおこなう間に試験を行う。形成された３−ホスホグリセラートのｎｍｏｌ／分／抽出物における全タンパク質のｍｇで、活性を示す。
実験Ａにおいて、ＲｕＢｉｓＣＯ複合体に特異的であるが単独であるシャペロンＲｂｃＸの存在は、活性酵素複合体の発現を可能にするには十分でないことが示される。ＲｂｃＸの存在に適するストイキオメトリに関連した、大腸菌の一般シャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの両方の組合せのみが、時間経過におけるホスホグリセリン酸産生増加を検出可能にする。
さらに、実験Ｃは、シネココッカス・エロンガタスＲｂｃＬ・ＲｂｃＳサブユニットが、同じ生物体の同種のシャペロンＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ２に会合する場合に、ＲｕＢｉｓＣＯ活性が９０％を超えて大きく下落することを示す。これは、異種性シャペロニン会合の有利性を明確に示すものである。
この実施例により、異種性細菌一般シャペロンの細菌特異的シャペロンＲｂｃＸとの会合が、酵母における合成ＲｕＢｉｓＣＯ複合体の活性最適化に必要とされることを、明確に定めることができる。
［実施例３：組換えタンパク質の毒性に対するシャペロン組合せの防御効果］
＜ＲｕＢｉｓＣＯとは別の、インビボにおけるリブロキナーゼ発現関連毒性の除去における効果＞
実施された方法及び解析は上述の実施例１に記載される。
酵母（株１８ｂ）におけるリブロキナーゼのみの発現は、野生型（ＷＴ）と比較して、（５０時間を超える）長い潜伏期、並びに（好気状態で７０％及び嫌気状態で８２％の）最大増殖速度の大きな下落に関与する（表１８）。
表１８：ＷＴ、１ｂ、１８ｂ、１０２、１５、１４ｂ株の遺伝子型、最大増殖速度、及び増殖遅延を示す。
ＰＲＫによって誘導されるこの毒性は、株１０２における大腸菌のシャペロンＧｒｏＥＳ・ＧｒｏＥＬの共発現（嫌気状態で２６％及び好気状態で４２％の増殖速度における毒性除去）、又は、株１４ｂにおけるシネココッカス・エロンガタスのシャペロンＲｂｃＸの共発現（嫌気状態で３４％及び好気状態で１０％の増殖速度における毒性除去）によって、部分的に除去可能である。
株１５における大腸菌のシャペロンＧｒｏＥＳ・ＧｒｏＥＬ及びシネココッカス・エロンガタスのシャペロンＲｂｃＸの共発現は、ほぼ完全な増殖を回復可能にする（嫌気状態で７８％及び好気状態で６３％の増殖速度における毒性除去）。この共発現はまた、長い潜伏期を完全に排除することができる。
リブロキナーゼ（ＰＲＫ）発現に関連する毒性は、潜伏期の存在と増殖速度の下落とに直接的に関連するエタノール産生の下落により特徴づけられ、アルコール発酵に影響を与える（株１８ｂ）（図１）。「シャペロン」エンジニアリング（大腸菌のＧｒｏＥＳ＋ＧｒｏＥＬ＋シネココッカス・エロンガタスのＲｂｃＸ）の発現は、一般シャペロニンのペアＧｒｏＥＳ・ＧｒｏＥＬが部分的な効果しか持たず（株１０２）、ＲｂｃＸ単独の効果がなくても（株１４ｂ）、リブロキナーゼ（ＰＲＫ）毒性、特にＰＲＫ触媒反応産生物の蓄積を完全に除去するだけでなく、最終的にエタノール産生を向上することができる（株１５）。
［実施例４：形質転換細胞増殖における一般的効果の例］
＜４．１．発酵におけるサッカロマイセス・セレビシエ増殖への一般的効果＞
実施された方法及び解析は上述の実施例１に記載される。結果は以下の表１９に示される。
表１９：ＷＴ、１ｂ、１０３、１３ｂ株の遺伝子型、最大増殖速度、及び増殖遅延を示す。
有利なことに、「シャペロン」エンジニアリングの発現は、３つの「空の」プラスミドを含むコントロール株（株１ｂ）又は大腸菌一般シャペロンＧｒｏＥＳ・ＧｒｏＥＬのみを発現する株１０３と比較して、株１３ｂ（ＲｂｃＸ＋（Ｇｒｏｓ・ＧｒｏＥＬ）、大腸菌）に３０％の増殖有利性を与える。
さらに、株１３ｂの増殖速度は、形質転換されておらず故にストレスを受けていない野生株（ＷＴ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの好気状態及び嫌気状態におけるそれぞれ９６％及び８６％の増殖速度と等しいものである（表１８）。
＜４．２．発酵におけるピキア・パストリス増殖への一般的効果＞
シャペロンの影響評価を、Ｆ．Ｗａｎｇ等により記載されたプロトコル（2015年、PLoS One. 2015 Mar 17;10(3):e0120458.“High-level expression ofendo-β- N-acetylglucosaminidase H from Streptomyces plicatus in Pichia pastorisand its application for the deglycosylation of glycoproteins.”)に従って、株ＰＰＧＣ１１５＿０１及びＰＰＧＣ１１５＿０２の、グリセロールを含む最小培地における３０℃で１４時間の培養、並びに１％メタノールでの４８〜１００時間の誘導において行った。
２つの株を、同じ細胞濃度で播種し、１００時間の発酵において評価した。増殖曲線の対数期において算出された株の最大ｍｕは、株ＰＰＧＣ１１５＿０２について、コントロール株ＰＰＧＣ１１５＿０１のものに対して約３０％の増殖有利性を示す。
＜４．３．発酵におけるヤロウィア・リポリティカ増殖への一般的効果＞
株ＰＯ１ｆ＿０１及びＰＯ１ｆ＿０２を、ＪＭ Ｎｉｃａｕｄ等により記載されたプロトコル（2002年、(Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS Yeast Res. 2002 Aug;2(3):371-9)に従って評価した。シャペロン組合せを発現する株について、表現型は増殖増加を示す。増殖有利性は３５％を超えて評価された。
＜４．４．ＣＨＯ細胞増殖における一般的効果＞
ＣＨＯ−０１及びＣＨＯ−０２株を同じ密度で（２×１０６細胞／１０ｃｍディッシュ）播種し、増殖を４日にわたって評価した。細胞をトリプシン処理で剥離及び個別化し、自動カウンターを用いて各日にカウントする。ＣＨＯ−０２株細胞の増殖速度は、コントロール株ＣＨＯ−０１のものよりも約２５％高い。シャペロン組合せは細胞倍加時間において効果を有する。
これらの検討は、この「シャペロン」エンジニアリングが、（ｉ）他の改変を含む又は含まないが、物理化学的ストレスを受ける真核細胞の正常増殖を回復すること、及び（ｉｉ）同じ条件下で用いられる株・細胞に対して増殖有利性を提供すること、を可能にすることを示す。
［実施例５：組換えタンパク質産生における効果の例］
＜５．１．サッカロマイセス・セレビシエにおけるヒト成長ホルモンの産生＞
ヒト成長ホルモン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０２３８２．１）を合成し、以下のカセットに従って構成的プロモーターＴＥＦ１の下流にクローニングした。
表２０：発現カセット
表２１：発現ベクター
これらのプラスミドを、以前に記載された形質転換プロトコルに従って株ＣＥＮ．ＰＫ１６０５に共に形質転換した。株を合成培地（−ｌｅｕ−ｕｒａ）にて選択した。
表２２：株
株２００、２３０及び２３１を、ＯＤ６００ｎｍでの０．７まで合成培地（−ｌｅｕ−ｕｒａ）にて増殖させた。細胞を採取し、１ｍｌの冷溶解バッファー（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＰＭＳＦ）で１度洗浄し、そして０．３ｍｌのレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファーに再懸濁して、５分間９８℃でインキュベートした。段階希釈物（１：１０）を調製し、同量の各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに堆積させ（勾配４％〜２０％）、ニトロセルロース膜に移した。ｈＧＨ発現を抗体［ＧＨ−１］（ａｂ９８２１、Ａｂｃａｍ）で評価し、ユビキタス遺伝子ＧＡＰＤＨ（ａｂ９４８５， Ａｂｃａｍ）の発現に対して標準化する。さらに、ｈＧＨ発現を、成長ホルモンＥＬＩＳＡキット（ヒト）のプロトコルで、これに従って、ＥＬＩＳＡによって定量化する（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＨＧＨ１）。
株２３０にて評価した産生ｈＧＨタンパク質量は、株２１１にて得られたものよりも４０％多い。
＜５．２．サッカロマイセス・セレビシエにおける内在性ルシフェラーゼ活性の評価＞
蛍のルシフェラーゼ遺伝子をベクターｐＧＬ４（Ｐｒｏｍｅｇａ）から増幅して、以下のカセットに従って構成的プロモーターＴＥＦ１の下流にクローニングした。
表２３：発現カセット
表２４：発現ベクター
これらのプラスミドを、以前に記載された形質転換プロトコルに従って株ＣＥＮ．ＰＫ１６０５に共に形質転換した。株を合成培地（−ｌｅｕ−ｕｒａ）にて選択した。
表２５：プラスミド及び株
株２００、２１０及び２１１を、ＯＤ６００ｎｍでの０．７まで合成培地（−ｌｅｕ−ｕｒａ）にて増殖させた。細胞を採取し、１ｍｌの冷溶解バッファー（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＰＭＳＦ）で１度洗浄し、そして０．３ｍｌの同じバッファーに再懸濁した。再懸濁した細胞をガラスビーズと共に溶解した（Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ）。
粗溶解物の濃度をブラッドフォード法で測定し（ＢｉｏＲａｄ）、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、試料毎に５μｌの溶解物を用いて、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びルミノメーターで評価したルミネセンスで、ルシフェラーゼ活性を測定した。
活性は、全タンパク質量に対して標準化される。
株２１０にて評価されたルシフェラーゼ活性は、株２１１にて評価されたものより６０％高い。
＜５．３．サッカロマイセス・セレビシエにおける組換えセルラーゼ活性の評価＞
シャペロン改変は、プロモーターＴＥＦ２のもとで、タラロマイセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＬ８９５５３）のセロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）であるセルラーゼを発現するための改変に関連する。セルラーゼ活性の解析は、Ｙ．Ｉｔｏ等によって記載された（2015年、Combinatorial Screeningfor Transgenic Yeasts with High Cellulase Activities in Combination with aTunable Expression System. PLoS One. 2015 Dec 21;10(12)）ように行われた。
シャペロンの存在下でセルラーゼエンジニアリングを共発現する株について記録した活性は、セルラーゼエンジニアリング単独のみを発現する株よりも３７％高い活性をもたらす。
＜５．４．タンパク質産生の向上＞
サッカロマイセスについて上述されたタンパク質産生を向上するためのシャペロンの使用は、内在性又は異種性タンパク質の産出及び／又は活性を最適化するように、任意の目的の真核細胞、特にピキア及びヤロウィアにおいて容易に実施されることができる。本発明のシャペロンの組合せを発現する酵母を作製し、食品加工産業、医薬分野、バイオマス加水分解、エネルギーなどのために目的の種々のタンパク質を産生するために、当業者は以下の刊行物を特に参照するとよい。
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Claims (20)

  1. （ｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のフォールディングに関与するシャペロンＲｂｃＸをコードする配列を含む発現カセットと、
    （ｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＳをコードする配列を含む発現カセットと、
    （ｉｉｉ）適切なプロモーターの転写制御下において、細菌性一般シャペロンＧｒｏＥＬをコードする配列を含む発現カセットと、を含む形質転換真核細胞。
  2. 前記シャペロンＲｂｃＸはシアノバクテリアシャペロンである、請求項１に記載の真核細胞。
  3. 前記一般シャペロンＧｒｏＥＳ及び前記一般シャペロンＧｒｏＥＬの少なくとも１つは、シアノバクテリアにもＲｕＢｉｓＣＯ複合体を発現する他の細菌にも由来しない、請求項１又は請求項２に記載の真核細胞。
  4. ３つの前記発現カセットは遺伝子情報の連続的ブロックを形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真核細胞。
  5. ３つの前記シャペロンの前記発現カセットは、単一のエピソーム遺伝要素により保持される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の真核細胞。
  6. 前記シャペロン以外の異種性タンパク質のための少なくとも１つの発現カセットをさらに含む、又は内在性タンパク質の発現レベル及び／若しくは配列を変える配列改変を受けている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の真核細胞。
  7. 細菌性フォームＩＲｕＢｉｓＣＯ酵素のＲｂｃＬ又はＲｂｃＳサブユニットをコードする配列を含まない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の真核細胞。
  8. サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から好ましくは選択される酵母である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の真核細胞。
  9. 真核細胞の生理機能を向上させるための、シャペロンＲｂｃＸ並びにシャペロンＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬの発現を可能にする発現カセットの組合せの使用。
  10. 酵母株の生理機能を向上させるための請求項９に記載の使用。
  11. 前記シャペロン以外の異種性タンパク質のための少なくとも１つの発現カセットを含む、又は内在性タンパク質の発現レベル及び／若しくは配列を変える配列改変を受けている真核細胞の生理機能を向上させるための、請求項９又は請求項１０に記載の使用。
  12. 前記真核細胞の増殖速度を増加させるための請求項８〜１１のいずれか１項に記載の使用。
  13. 前記真核細胞の環境ストレスに対する抵抗性を増大させるための、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
  14. 前記環境ストレスは、前記真核細胞の培地に存在する要素の毒性によるものである、請求項１３に記載の使用。
  15. 前記真核細胞によって合成された化合物の毒性に対する前記細胞の抵抗性を増大させるための、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の使用。
  16. 組換えタンパク質の産生のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の真核細胞の使用。
  17. 化学分子及びタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を産生するための生物工学的プロセスであって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の真核細胞を、該真核細胞によるこの化合物の合成を可能にする条件下で培養するステップと、任意的に前記化合物を採取するステップと、を含むプロセス。
  18. 組換えタンパク質を産生するプロセスであって、（ｉ）前記タンパク質をコードする配列を、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ及びＧｒｏＥＬを発現する真核細胞に挿入すること、（ｉｉ）前記配列の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、並びに任意的に（ｉｉｉ）前記タンパク質を採取又は精製すること、を含むプロセス。
  19. 前記タンパク質は酵素である、請求項１７又は請求項１８に記載のプロセス。
  20. 前記タンパク質はホルモンである、請求項１７又は請求項１８に記載のプロセス。

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