KR100919299B1 - 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법 - Google Patents

만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법

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Abstract

본 발명은 재조합 대장균을 이용하여 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법은 (a) 갈조류를 포함하는 해조류를 전처리하는 단계; (b) 상기 전처리된 해조류를 당화시켜 만니톨을 함유하는 해조류 당화액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 해조류 당화액에 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균을 접종하고, 배양하여 에탄올을 생산하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법은 해조류의 종류에 구애받지 않고, 해조류로부터 에탄올을 생산할 수 있으므로, 해조류를 이용한 생물연료 생산에서 경제성을 향상시킬 수 있다.

Description

만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법 {Method for Preparing Ethanol from Algal Hydrolysate}
본 발명은 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재조합 대장균을 이용하여 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
바이오 연료는 바이오매스(biomass)를 원료로 하여 얻어지는 에너지를 통칭하는 것으로서, 직접 연소, 알코올 발효, 메탄 발효 등을 통해 얻어진다. 바이오 연료의 원료가 되는 물질인 바이오매스는 크게 당질계(사탕수수, 사탕무 등), 전분질계(옥수수, 감자, 고구마 등), 목질계(나무, 볏짚, 폐지 등)로 나누어지는데, 당질계의 경우 원료를 비교적 간단한 전처리 과정 후 이어지는 발효 공정을 통해 곧바로 바이오연료로 전환이 가능하지만, 전분질계와 목질계의 경우에는 적절한 전처리 과정과 당화 공정을 거친 당화액을 이용한 발효 공정을 통해 바이오 연료를 제조할 수 있다. 목질계는 도시 폐기물 형태의 폐목재나 삼림 곳곳에 흩어져 있는 임산 부산물을 원료로 이용할 수 있으며, 식량으로서 활용가치가 없어 원료 수급의 안정성은 확보될 수 있으나, 공정상 반드시 수반되어야 하는 리그닌 제거 전처리 공정으로 인한 공정비 상승과 함께, 목질계 셀룰로오스 기질의 특징인 수소결합으로 이루어진 crystalline 구조로 인해 당화 수율이 낮아 경제성이 낮은 단점이 있다.
그러나, 목질계를 제외하고는 현재 상용화된 바이오연료 생산 기술은 인간이 식량으로 사용할 수 있는 당질계 또는 전분질계 원료를 사용하므로 식량을 에너지원으로 사용한다는 문제뿐만 아니라, 앞으로 식량 수요가 늘어날 경우 원료 수급 문제가 발생할 수 있으며, 경제적인 측면에서도 곡물을 사용하는 것은 원료비용 측면에서 문제가 된다. 또한, 옥수수 재배는 상당량의 농약과 질소비료를 필요로 할 뿐 아니라 다른 작물에 비해 토양을 심하게 부식시키는 환경적인 단점도 존재한다.
한편, 해조류는 생육이 빠르고, 바다의 깊이에 따라 상층에 녹조류, 중층에 갈조류, 하층에 홍조류가 주로 자라기 때문에 복합 배양을 통해 육상 바이오매스 보다 높은 생산성을 가질 수 있다. 또한 해조류는 목질계 바이오매스에서 가지는 난분해성 리그닌이 없기 때문에 분해하기 쉬운 장점이 있다.
하지만 해조류는 수분함량이 80% 이상으로 높고, 염분농도가 건조중량의 20-30%를 차지하며, 구성하는 단백질(10-15%)과 지방(1-5%)의 함량이 높다. 또한, 건조중량의 25-50%를 차지하는 탄수화물 조성도 육지 식물과 큰 차이를 보여, 각각의 해조류에 적합한 전처리 방법, 당화방법 및 발효방법에 대한 연구가 필요하다.
예를 들어 갈조류는 다당체로 알긴산(alginate), 라미나란(laminaran), 셀룰로스(cellulose), 후코이단(fucoidan) 등으로 구성되며, 홍조류는 한천(agar), 셀룰로스(cellulose), 카라지난(carrageenan), 크실란(xylan), 매넌(mannan) 등으로 구성되고, 녹조류는 셀룰로스(cellulose), 크실란(xylan), 전분(starch), 후럭탄(fructan) 등으로 구성되어 있다. 해조류의 다당체가 단당으로 분해되면 갈조류는 만니톨(mannitol), 글루코스(glucose), 자일로스(xylose) 등으로, 홍조류는 갈락토오스(galactose), 자일로스, 만노스(mannose) 등으로, 녹조류는 글루코스, 자일로스, 프럭토스(fructose) 등으로 분해된다. 따라서, 해조류로부터 에탄올을 생물학적으로 생산하기 위해서는 이들 혼합당을 흡수하여 에탄올로 전환할 수 있는 미생물이 절대적으로 중요하다.
특히, 갈조류의 주요 구성물인 만니톨은 기존에 에탄올 생산에 널리 이용되는 효모(Saccharomyces)나 자이모모나스(Zymomonas)에 의해서는 에탄올로 전환되지 못한다 (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2000) 24, 51-57). 또한, 효모나 자이모모나스는 5탄당인 자일로스, 프럭토스, 아라비노스 등과 6탄당인 글루코스, 갈락토오스 등을 동시에 이용하지 못하는 문제점이 있다.
한편, 미국등록특허 제5,000,000호는 글루코스, 자일로스, 아라비노스(arabinose) 등의 목질계 바이오매스 유래 당들 각각을 에탄올로 전환할 수 있는 재조합 대장균을 개시한바 있으나, 상기 균주가 해조류 유래의 만니톨을 에탄올로 전환할 수 있다는 사실은 알지 못하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 만니톨을 함유하는 해조류 당화액에 자이모모나스 모빌리스로 부터 유도된 2개의 유전자(pdc, adh)를 포함하는 재조합 대장균을 첨가하고 배양할 경우, 에탄올을 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 재조합 대장균을 이용하여 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 갈조류를 포함하는 해조류를 전처리하는 단계; (b) 상기 전처리된 해조류를 당화시켜 만니톨을 함유하는 해조류 당화액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 해조류 당화액에 피루브산(pyruvate)으로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 합성하는 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균을 접종하고, 배양하여 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 대장균을 이용하여 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법은 해조류의 종류에 구애받지 않고, 해조류로부터 에탄올을 생산할 수 있으므로, 해조류를 이용한 생물연료 생산에서 경제성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 해조류로부터 에탄올을 생산하는 공정을 나타낸 도면이다.
도 2는 재조합 대장균의 만니톨로부터 에탄올 합성 경로에 대한 추측도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 전처리 및 당화된 해조류의 당 조성을 나타낸 그래프이다(Xyl: 자일로스(xylose), Ara: 아라비노스(arabinose), Gal: 갈락토오스(galactose)).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 전처리 및 당화된 해조류에 재조합 대장균을 접종하고 배양시켜 제조한 에탄올 농도 및 에탄올 수율 (= 생성된 에탄올 무게/초기 당 무게)을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 갈조류 당화액에 다량 함유되어 있는 만니톨을 에탄올로 전환시키기 위하여 해조류로부터 에탄올을 생산하는데 통상적으로 이용되는 효모(Saccharomyces)나 자이모모나스(Zymomonas) 대신에 재조합 미생물을 이용하고자 하였다.
일반적으로 대장균은 다양한 당을 이용할 수 있고, 당이나 당 유래 물질은 phosphoenolpyruvate-dependent group-translocation system (PTS)을 이용하여 세포 내로 들여오는 것으로 알려졌지만(Biochimica et Biophysica Acta, 1788, 581-586, 2009), 대장균이 만니톨을 에탄올로 전환할 수 있다는 사실은 보고되지 않았다.
따라서, 본 발명에서는 다양한 기질 이용 능력을 가진 대장균에 에탄올을 생성할 수 있도록 관련 유전자를 도입시킨 재조합 대장균을 이용하면 만니톨로부터 에탄올을 효율적으로 생산할 수 있을 것으로 예측하였다.
이를 확인하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는 만니톨을 함유하는 해조류 당화액에 피루브산(pyruvate)으로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 합성하는 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균을 접종시키고, 배양한 결과, 에탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 갈조류를 포함하는 해조류를 전처리하는 단계; (b) 상기 전처리된 해조류를 당화시켜 만니톨을 함유하는 해조류 당화액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 해조류 당화액에 피루브산(pyruvate)으로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 합성하는 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균을 접종하고, 배양하여 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 해조류로부터 에탄올을 생산하는 공정을 나타낸 도면이다.
본 발명에 따른 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법에서는 먼저, 갈조류를 포함하는 해조류를 전처리시키는 과정을 수행한다.
본 발명에 있어서, 상기 해조류의 전처리는 열적 처리, 물리적 처리 및 화학적 처리로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 전처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 열적 처리는 50~200℃ 온도에서 해조류를 가열하는 것으로, 열적 처리의 온도가 50℃ 미만인 경우, 해조류의 분해가 제대로 이루어지지 않으며, 200℃를 초과할 경우 특별한 처리장치 및 과도한 에너지 비용이 소모되는 문제가 있다.
상기 물리적 처리는 볼밀 또는 칼을 이용하여 해조류를 분쇄 또는 절단하는 것을 예시할 수 있으나, 해조류를 분쇄 또는 절단할 수 있는 것이라면 제한없이 이용될 수 있다. 상기 분쇄 또는 절단은 해조류를 가로 및 세로의 길이가 0.5㎝ 미만이 되도록 수행하는 것이 바람직하다.
상기 화학적 처리는 산을 해조류에 처리하는 것으로서, 산으로는 아세트산, 붕산, 탄산, 염산, 황산, 질산, 인산 등을 예시할 수 있으나, 염산, 황산, 질산, 인산 등의 강산을 처리하는 것이 바람직하다. 상기 강산은 0.01~0.3 노르말 농도인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 강산의 농도가 0.3 노르말 농도를 초과할 경우 전처리효과가 증가하지 않으며 처리후 중화를 위해 많은 양의 염기를 첨가해야 하는 문제가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전처리는 열적 처리, 물리적 처리 및 화학적 처리를 단독 또는 복합적으로 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해조류는 녹조류, 갈조류, 홍조류 등의 대형조류와 클로렐라, 스피루니나 등의 미세조류를 예시할 수 있다.
상기 녹조류로는 청태, 해캄, 파래, 청각, 구슬청각, 옥덩굴, 염주말 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 홍조류로는 우뭇가사리, 김, 코토니, 개도박, 둥근돌김, 개우무, 새발, 참풀가사리, 꼬시래기, 진두발, 참도박, 가시우무, 비단풀, 단박, 돌가사리, 석목, 지누아리 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 갈조류로는 미역, 다시마, 헛가지말, 민가지말, 패, 고리매, 미역쇠, 감태, 곰피, 대황, 쇠미역사촌, 모자반, 괭생이 모자반, 지충이, 톳 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 갈조류는 생육이 매우 빠르고 지구상에 널리 분포하여 생물연료의 대상이 되기에 적합하다.
갈조류의 주요 구성물은 알긴산과 라미나란 유래의 만니톨, 글루코스이다. 이중 알긴산은 세포내 흡수과정에서 에탄올 생산에 필요한 환원력을 제공하는 NADH의 생산이 이루어지지 않아 에탄올로 변환하기 어려운 것으로 알려져 있으나, 만니톨과 글루코스는 환원력을 제공할 수 있다. 대장균이 만니톨과 글루코스를 이용할 수 있는 것은 잘 알려져 있으나 만니톨을 에탄올로 전환할 수 있다는 것은 보고된 바가 없다.
다양한 방법에 의하여 해조류가 전처리되면, 전처리된 해조류를 당화시켜 만니톨을 함유하는 해조류 당화액을 제조하는 과정을 수행한다. 본 발명에 따른 만니톨을 함유하는 해조류 당화액을 제조하기 위해서는 갈조류를 포함하는 해조류를 전처리하고, 당화시켜야 한다.
상기 전처리된 해조류의 당화는 생물학적 당화법 또는 화학적 당화법에 의하여 수행될 수 있으며, 상기 생물학적 당화법은 곰팡이, 박테리아, 곰팡이 유래의 효소 및 박테리아 유래의 효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 전처리된 해조류에 단독 또는 복합적으로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 곰팡이로는 Aspergillus spp., Trichoderma spp. 등의 곰팡이를 예시할 수 있으며, 상기 곰팡이 유래 효소로는 Aspergillus oryzae 및 Trichoderma reesei 유래 셀룰라제(cellulase), Aspergillus aculeatus 유래의 베타글루카나제(beta-glucanase), Aspergillus niger 유래의 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase), Trichoderma reesei 유래의 엔도글루카나제(endo-glucanase) 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 박테리아는 갯벌 유래 박테리아 또는 전복 유래 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 화학적 당화법은 염산, 황산, 질산, 인산 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 10~50%의 농도의 강산을 20~80℃에서 전처리된 해조류에 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
만니톨을 함유하는 해조류 당화액이 제조되면, 이를 에탄올로 전환할 수 있는 재조합 미생물을 접종하고, 배양하는 과정을 수행한다.
상기 재조합 미생물은 도 2에 나타난 바와 같이, 아세틸코에이 (acetyl-CoA)로부터 아세트알데히드를 합성하는 아세트알데히드 탈수소화효소(acetaldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 증폭시킨 재조합 대장균을 이용하거나, 피루브산(pyruvate)으로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 합성하는 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균을 이용할 수 있다.
상기 유전자의 발현 또는 활성을 증폭하기 위한 방법으로는 외부 유전자 도입, 프로모터 치환, 관련 유전자의 치환, 결실 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클로스트리듐 속(Clostridium sp.) 등에서 유래된 것을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 대장균은 미국등록특허 제5,000,000호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 상기 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 알코올 탈수소화 효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 대장균이라면 제한없이 이용할 수 있다.
또한, 상기 재조합 대장균은 에탄올 내성 또는 염 내성이 추가적으로 향상된 것을 이용될 수 있다. 상기 에탄올 내성 또는 염 내성이 향상된 균주는 자연적으로 돌연변이되거나, 방사선 조사, 화학적 처리 등의 통상적인 돌연변이 유발방법으로 제조할 수 있다. 또한, 에탄올 내성 또는 염 내성 관련 유전자를 재조합 방법을 이용하여 추가, 결실시킴으로써 제조할 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 해조류의 화학적 전처리
해조류는 홍조류인 우뭇가사리, 녹조류인 파래, 갈조류인 다시마와 모자반을 대상으로 하였다. 먼저 볼밀(ball mill)을 이용하여 해조류를 가로 및 세로의 길이가 0.5㎝ 이하가 되도록 파쇄시켰다.
파쇄된 해조류에 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 염산, 황산을 농도별(0.05, 0,1, 0.15, 0.2, 0.3 노르말 농도)로 처리하고, 121℃에서 15분간 열처리하였다.
그 결과, 염기 처리된 우뭇가사리는 열처리 과정에서 겔화에 의해 엉겨붙어 염기처리는 우뭇가사리의 전처리방법으로 적절치 못한 것을 확인하였으며, 파래, 다시마, 모자반의 경우 염기처리는 분해에 큰 영향을 주지 못하는 것을 확인하였다.
산처리된 해조류의 전처리 효과는 Biorad Aminex HPX-87H column을 이용하여 HPLC로 정량함으로써 확인하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
강산 노르말 농도 건조중량 대비 당함량 (% w/w)
다시마 모자반 파래 우뭇가사리
황산 0 2.2 0.4 1.8 2.9
0.05 5.9 3.4 6.8 5.8
0.10 8.1 4.3 6.5 9.5
0.15 6.9 6.1 6.8 9.7
0.20 6.4 5.8 6.6 9.8
0.30 5.6 5.2 5.4 8.7
염산 0 2.2 0.4 1.8 2.9
0.05 6.8 3.8 7.8 5.5
0.10 9.4 5.3 7.1 11.6
0.15 7.8 7.1 6.9 10.9
0.20 7.3 6.6 7.9 11.0
0.30 6.7 5.5 6.8 9.7
표 1로부터, 황산과 염산을 해조류에 처리할 경우, 해조류가 분해되어 생성된 당의 함량이 증가하였으며, 특히 0.1~0.2 노르말 농도의 염산을 처리할 경우, 해조류 분해가 가장 활발하게 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 2: 해조류의 효소 당화
실시예 1과 동일한 방법으로 파쇄된 해조류(다시마, 모자반, 파래, 우뭇가사리)에 0.1 노르말 농도의 염산을 처리하고, 121℃에서 15분간 열처리하였다.
생물학적 처리를 추가적으로 수행하기 위하여 하기 표 2의 효소(Novozymes사)를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하고, 50℃, pH 5에서 150rpm으로 12시간동안 반응시켰다. 생물학적으로 처리된 해조류의 전처리 효과는 생성된 당을 Biorad Aminex HPX-87H column을 이용하여 HPLC로 정량함으로써 확인하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
효 소 상품명 유래 미생물 50g 해조류로부터 생성된 당 (g)
다시마 모자반 파래 우뭇가사리
셀룰라제(cellulase) Novoprime® B959 Trichoderma reesei 12.7 3.1 6.9 19.2
Novoprime® B969 Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae 18.8 4.1 9.7 28.3
베타글루카나제(beta-glucanase) Viscozyme® L Aspergillus aculeatus 7.5 2.0 3.9 11.5
아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) AMG® 300 L Aspergillus niger 4.1 2.4 3.2 5.7
엔도글루카나제(endo-glucanase) Celluclast® 1.5L Trichoderma reesei 16.2 4.8 9.2 27.1
표 2로부터, Novoprime® B 959, Novoprime® B 969 및 Celluclast® 1.5L의 해조류 분해활성이 우수하였다. 반면, Viscozyme® L 및 AMG® 300 L은 당화효과가 미미하였다. 사용된 효소는 엔도글루카나제 또는 셀룰라제를 주 활성으로 가지는 효소들이었으며 당화 효과가 우수한 효소는 공통적으로 Trichoderma 유래의 효소를 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 결론적으로 해조류를 산처리 후 Trichoderma 유래의 효소를 처리하는 것은 당화에 효과적이라는 것을 확인하였으며, 해조류 중 당 수율이 높은 것은 다시마와 우뭇가사리로 건조중량의 37.5%와 56.5%였다.
실시예 3: 갈조류의 미생물 분해
생육이 매우 빨라 생물연료 생산의 대상이 되기에 적합한 갈조류(다시마와 모자반)에 대한 전복유래 미생물의 생물학적 분해능을 확인하기 위하여, 살아있는 전복의 내장을 분리하였다. 분리된 내장은 인공해수에 희석 후 고형물을 제거하고, 원심분리하여 침전물을 회수함으로써 전복 내장 서식 미생물을 회수 하였다.
전복 내장 유래 미생물과 전복내장을 각각 다시 인공해수에 현탁시킨 후, 파쇄된 다시마 및 모자반을 각각 함유하는 용액(건조중량기준 100g/L) 100㎖에 5% 접종하였다. 접종된 갈조류 현탁액들은 50℃, 150 rpm에서 3일간 진탕배양 시켰고, 최종 현탁액을 원심분리한 후, 고형물의 건조 중량을 측정하여 분해능은 측정하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이때 아무것도 첨가하지 않은 해조류와 갯벌을 5% 첨가시킨 해조류를 대조군으로 하였다.
[표 3]
처리 방법 다시마 분해능 (%) 모자반 분해능 (%)
1일 2일 3일 1일 2일 3일
전복 내장 유래 박테리아 5% 62.2 76.9 82.1 55.0 74.4 78.0
전복 내장 5% 71.5 80.0 86.0 59.6 76.2 82.3
갯벌 5% 6.0 12.1 16.2 6.2 7.6 14.1
무처리 4.6 4.2 5.4 3.6 5.4 6.7
표 3으로부터, 다시마의 경우, 아무것도 첨가되지 않은 것, 갯벌이 첨가된 것, 전복유래 미생물이 첨가된 것은 각각 약 5%, 16%, 86%, 82%의 분해능을 갖는 것을 확인하였으며, 모자반의 경우, 아무것도 첨가되지 않은 것, 갯벌이 첨가된 것, 전복 내장 또는 전복유래 미생물이 첨가된 것은 각각 약 6%, 14%, 82%, 78%의 분해능을 갖는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 특히 다시마는 갯벌 유래 미생물에 의해 24시간 안에 급격히 분해되었음을 확인하였다.
실시예 4: 만니톨 및 글루코스로부터 에탄올 생산
피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균(ATCC 55124, KO11)을 ATCC로부터 분양받았다.
상기 재조합 대장균(KO11)의 만니톨로부터 에탄올 생성능을 확인하기 위하여, 약 20g/L의 만니톨과 글루코스를 혼합한 용액에 LB배지에서 자란 재조합 대장균(KO11) 종균배양액을 전체 부피의 10%로 접종한 후, 30℃, pH 7.0, 150 rpm의 조건에서 배양하면서 에탄올 생성을 확인하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
시간 글루코스 만니톨 에탄올 수율(%)
0 19.0 19.2 0.0 -
20 6.4 18.4 7.3 49
44 0.0 8.4 12.4 41
68 0.0 0.0 15.7 41
표 4로부터, 만니톨의 재조합대장균(KO11) 내 흡수는 글루코스의 흡수 후에 이루어지며 에탄올로의 전환 수율은 40% 이상으로 최대 이론 수율 51%의 80% 이상인 것을 확인할 수 있었다. 이것은 재조합대장균을 갈조류로부터 에탄올을 생산하는데 이용할 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 5: 혼합당으로부터 에탄올 생산
재조합 대장균(KO11)의 만니톨을 함유하는 혼합당으로부터 에탄올 생성능을 확인하기 위하여, 글루코스, 갈락토오스, 만니톨, 자일로스 및 아라비노스를 각각 5g/L씩 혼합시킨 당액에 LB배지에서 자란 재조합 대장균(KO11) 종균배양액을 전체 부피의 10%로 접종한 후, 30℃, pH 7.0, 150 rpm의 조건에서 배양하면서 에탄올 생성을 확인하였다.
확인 결과, 글루코스와 갈락토오스는 12시간 안에 소모되고, 만니톨은 24시간 안에, 자일로스와 아라비노제는 45시간 안에 소모되어 최종 10.5 g/L의 에탄올이 생산되었다. 상기 결과로부터 재조합 대장균(KO11)은 해조류의 단독 또는 혼합물로부터 에탄올을 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 해조류 당화액으로부터 에탄올 생산
실시예 1과 동일한 방법으로 건조중량 5g의 파래, 다시마, 모자반, 우뭇가사리에 0.1 노르말 농도의 염산액 50ml을 처리하고, 전처리된 해조류를 실시예 2와 동일한 방법으로 Trichoderma 유래의 효소(Cellulclast® 1.5L)로 당화시켰다. 당화된 해조류의 당 함량은 우뭇가사리가 56.5%로 가장 높았고, 다시마가 37.5%, 파래 19.4%, 모자반 8.1%였다.
다음으로 건조중량 기준 50g/L의 해조류를 포함하는 혼합 당화액에 10% 재조합 대장균(KO11)을 접종한 후, 30℃, pH 7.0, 150 rpm의 조건에서 배양하면서 에탄올 생성을 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4로부터, 재조합 대장균은 해조류로부터 얻어진 혼합당을 동시에 또는 차례로 흡수하여 에탄올로 생성된 당을 35%이상의 수율로 전환할 수 있으며, 이는 생성된 당을 최대 이론수율 (최대 51%)의 70% 이상으로 (이론수율의 퍼센트(%) = 에탄올 무게/당 무게/최대 이론 수율) 에탄올로 전환 할 수 있는 것임을 확인할 수 있었다.
결과적으로, 본 발명에 따른 해조류로부터 재조합 대장균을 이용한 에탄올 생산방법은 육지 식물과 다른 해조류의 탄수화물 조성을 극복하고 다양한 해조류 및 이들로부터 생산되는 다양한 당들을 에탄올로 전환할 수 있는 우수성을 가지고 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 다음 단계를 포함하는 만니톨을 함유하는 해조류 당화액으로부터 에탄올을 생산하는 방법:
    (a) 갈조류를 포함하는 해조류를 전처리하는 단계;
    (b) 상기 전처리된 해조류를 당화시켜 만니톨을 함유하는 해조류 당화액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 해조류 당화액에 피루브산(pyruvate)으로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 합성하는 피루브산 탈카르복실산 효소(pyruvate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(pdc) 및 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adh)가 도입된 재조합 대장균을 접종하고, 배양하여 에탄올을 생산하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 해조류의 전처리는 열적 처리, 물리적 처리 및 화학적 처리로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 전처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 열적 처리는 50~200℃ 온도에서 해조류를 가열하는 것이고, 상기 물리적 처리는 볼밀 또는 칼을 이용하여 해조류를 분쇄 또는 절단하는 것이며, 상기 화학적 처리는 염산, 황산, 질산, 인산 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 0.01~0.2 노르말 농도의 강산을 해조류에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전처리된 해조류의 당화는 생물학적 당화법 또는 화학적 당화법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생물학적 당화법은 곰팡이, 박테리아, 곰팡이 유래의 효소 및 박테리아 유래의 효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 전처리된 해조류에 단독 또는 복합적으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 곰팡이는 Aspergillus spp. 또는 Trichoderma spp. 이고, 상기 박테리아는 갯벌 유래 박테리아 또는 전복 유래 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 화학적 당화법은 전처리된 해조류를 염산, 황산, 질산, 인산 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 10~50%의 농도의 강산으로 20~80℃에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
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