KR101806201B1 - 바이오 화학물질 및 연료 생산 증진을 위한 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목질계 및 해조류 혼합 바이오매스 당화액에 관한 것으로, 해조류 바이오매스에 목질계 바이오매스를 혼합하여 당화액을 제조함으로써 목질계 바이오매스 유래 아세트산이 해조류 바이오매스 유래 만니톨의 전자 수용체로 작용하여 발효저해물질을 매우 적게 함유하면서도 높은 당 생산농도를 유지할 수 있다. 이에 본 발명은 목질계 바이오매스가 갖는 목질계 유래 발효 저해물질로 인한 발효효율 저하와 해조류 바이오매스가 갖는 장시간의 발효시간에도 불구하고 생산농도가 매우 낮다는 문제를 해결할 수 있어, 상기 본 발명에 따른 당화액을 온실가스 발생 저감형 바이오연료 및 화학원료 생산 산업에 적용하면 경제적인 바이오 연료의 생산이 가능하다.

Description

바이오 화학물질 및 연료 생산 증진을 위한 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액 및 그 제조방법{Hydrolysate of mixture of seaweed biomass and lignocellulosic biomass to improve biochemical and biofuel production, and preparation using the same}
본 발명은 바이오 화학물질 및 바이오 연료의 생산 효율을 증진시키기 위하여 해조류 및 목질계 바이오매스 이용 효율이 증가하고 발효저해물질이 감소된 바이오매스 당화액 및 그 제조방법에 관한 것이다.
화석 연료 사용으로 인한 환경오염과 온실가스 발생 및 석유자원 고갈 문제를 해결하기 위해 석유자원을 대체할 수 있는 바이오연료 생산에 관심이 높아짐에 따라 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
대체 에너지 생산에 사용되는 바이오매스는 크게 육상 바이오매스와 해상 바이오매스로 구분할 수 있다. 가장 널리 사용되는 바이오매스는 육상 바이오매스 중 하나인 목질계 바이오매스로, 바이오 연료 및 바이오 화학물질 생산에 널리 이용된다. 하지만, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 그리고 리그닌이 복잡하고 단단한 구조로 얽혀있기 때문에 전처리 및 당화 공정을 거쳐 발효가 가능한 당으로 전환하여야 한다. 또한, 가혹한 조건에서 전처리를 진행하기 때문에 당 과분해로 인한 퓨란계 물질과 아세트산, 그리고 리그닌으로부터 유래되는 페놀계 화합물들이 당과 함께 추출된다는 문제가 있다. 따라서, 효율적인 발효를 위해서는 독성물질의 제거 공정이나 무독화 공정이 반드시 필요하며, 이는 목질계 바이오매스 당화액을 이용하는데 있어서 단점이 된다.
해상 바이오매스 중 해조류는 3세대 바이오매스로써 비식량 자원이며, 국내에서는 갈조류가 가장 많이 생산된다. 갈조류와 같은 해조류 바이오매스는 리그닌이 없어서 발효저해물질 생산은 거의 없다. 다만, 해조류 바이오매스는 당화단계를 거치면서 글루코스 소량과 만니톨이 다량 생산되는데, 특히 만니톨은 목질계 바이오매스로부터 생산되는 육탄당 (글루코스), 오탄당 (자일로스, 아라비노즈 등)에 비하여 환원된 형태이기 때문에 대사과정동안 환원물질인 NADH를 더 많이 생산하게 된다. 이렇게 만니톨로부터 유래된 NADH의 높은 환원력으로 인해 미생물 대사에 있어 산화/환원 전위가 맞지 않아 만니톨 소모 및 발효가 저해되고 지연된다는 문제가 있다. 상기의 예로, 명지대학교(대한민국) 장덕진 교수팀은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) ATCC 25755를 이용하여 갈조류로부터 부티르산을 생산하였으나 상당히 긴 유도기(약 120시간)가 있음을 보고하였다(Song et al., 2011).
Song, J.-H., Ventura, J.-R., Lee, C.-H., Jahng, D. 2011. Butyric acid production from brown algae using Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(1), 42-49.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고 미생물 발효를 통해 바이오매스로부터 효율적인 바이오 연료 및 화학물질을 생산하기 위하여, 해조류 바이오매스와 목질계 바이오매스의 각 특성을 파악하고 발효과정에 결점이 되는 부분을 보완한, 발효성 탄소원뿐만 아니라 비발효성 탄소원을 같이 소모하며 미생물 성장이 증진되고 탄소원이 효과적으로 대사산물로 전환될 수 있는 우수한 발효효율을 갖는 신규 당화액을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 구현예들은, 미생물 발효에 사용되는 당화액으로, 상기 당화액은 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스가 혼합된 바이오매스의 당화액, 또는 해조류 바이오매스의 당화액 및 목질계 바이오매스의 당화액이 혼합된 당화액인, 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액을 제공한다.
본 발명에 따른 다른 구현예들은, 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액을 제조하는 방법으로, 상기 방법은, 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 혼합하는 혼합 단계, 및 상기 혼합된 바이오매스를 가수분해하는 당화 단계를 포함하거나, 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 각각 가수분해하는 하는 당화 단계, 및 상기 각각 당화된 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 혼합하는 혼합 단계를 포함하는, 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 구현예들은 상기 제조방법에 의해 제조된 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액에 미생물을 투입하고 배양하여 발효시키는 발효 단계를 포함하는 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액은 발효시 해조류 바이오매스 유래 만니톨이 목질계 바이오매스 유래 아세트산과 같이 소모되면서 만니톨을 효과적으로 소모할 수 있다. 이는 만니톨과 비발효성 탄소원인 목질계 바이오매스 유래 아세트산이 같이 소모됨으로써 미생물 내 산화/환원 전위가 균형을 이룬 것으로서, 즉 아세트산이 외부 전자수용체로 작용하여 환원력이 큰 만니톨을 효과적으로 발효시킬 수 있게 되는 것으로 사료된다. 따라서 본 발명에 의하면 목질계 바이오매스 유래 당과 아세트산과 해조류 바이오매스 유래 만니톨을 동시에 이용하여 발효가능하므로 높은 발효효율을 나타낼 수 있다. 동시에, 본 발명에 의한 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액은 목질계 바이오매스를 적게 함유하므로 발효저해물질의 생성을 감소시킬 수 있어 높은 발효효율을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 해조류 바이오매스가 갖는 장시간의 발효시간에도 불구하고 생산농도가 매우 낮다는 문제와 목질계 바이오매스가 갖는 목질계 유래 발효 저해물질로 인한 발효효율 저하 문제를 해결할 수 있다. 이로써, 상기 본 발명에 따른 당화액을 온실가스 발생 저감형 바이오연료 및 화학원료 생산 산업에 적용하면 경제적인 바이오 연료의 생산이 가능하다.
도 1은 해조류 바이오매스를 이용하여 제조한 당화액을 이용한 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 경향을 분석한 도이다.
도 2는 목질계 바이오매스를 이용하여 제조한 당화액을 이용한 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 경향을 분석한 도이다.
도 3a 내지 도 3c는 해조류 바이오매스에서 유래하는 만니톨 발효에 있어서 아세트산 첨가에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 경향을 분석한 도이다(도 3a: 아세트산 미첨가, 도 3b: 아세트산 2.5g/L 첨가, 도 3c: 아세트산 5g/L 첨가).
도 4는 해조류 바이오매스 당화액의 아세트산 첨가에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 효율 증진정도를 분석한 도이다.
도 5a 내지 도 5c는 해조류와 목질계 바이오매스 혼합 중량비에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 효율 증진정도를 분석한 도이다(도 5a: 해조류:목질계=9:1, 도 5b: 해조류:목질계 =8:2, 도 5c: 해조류:목질계 =7:3).
도 6은 상기 도 1(해조류 단독 바이오매스 당화액) 및 도 2(목질계 단독 바이오매스 당화액)에 나타난 발효 48시간 후의 부티르산 생산량과 상기 도 5(b)(해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액)에 나타난 발효 48시간 후의 부티르산 생산량을 비교하여 나타낸 도이다.
도 7a와 도 7b는 해조류와 목질계 바이오매스 혼합 중량비에 따른 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 효율 증진정도를 분석한 도이다(도 7a: 해조류 당화액:목질계 당화액 = 9:1 부피비, 도 7b: 해조류 당화액:목질계 당화액 = 8.8:1.2 부피비).
본 명세서에서 "바이오매스(biomass)"라 함은 에너지원으로 이용되는 육상 식물, 해조류, 미세조류, 미생물 등의 생물체를 의미하며, "바이오 화학물질(biochemical)"이라 함은 상기 바이오매스를 열분해/화학분해시키거나 발효시켜 얻을 수 있는 모든 화학물질을 의미한다. 또한, "바이오연료(biofuel)"라 함은 상기 바이오매스로부터 얻는 연료를 의미하며, 바이오알코올 및 바이오 오일뿐만 아니라 화학적 생물학적 기술을 통해 연료로 전환될 수 있는 대사산물을 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 구현예들은, 미생물 발효에 사용되는 당화액으로 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스가 혼합된 바이오매스의 당화액을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 다른 구현예들은, 미생물 발효에 사용되는 당화액으로, 해조류 바이오매스의 당화액 및 목질계 바이오매스의 당화액이 혼합된 당화액을 제공한다. 이하에서는, 상기 두 바이오매스 당화액을 모두 "해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액"이라 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 목질계 바이오매스는 일반적으로 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌(lignin) 등으로 구성된 복합체인 리그노셀룰로오스(lignocellulose)로 이루어져 있는데, 구체적으로, 상기 목질계 바이오매스는 셀룰로오스가 33 내지 51 중량%, 헤미셀룰로오스가 19 내지 34 중량%, 리그닌이 21 내지 32 중량%, 재가 0 내지 2 중량%, 기타 성분이 나머지로 포함된다. 상기 목질계 바이오매스는 리그노셀룰로오스를 포함하는 생물학적 재료라면 침엽수와 활엽수, 수종, 수령 등에 제한되지 않으며, 예를 들면, 나무에서 유래한 연질 목재(softwood from trees), 연질 목재 칩(softwood chips), 연질 목재 나무의 가공으로부터 얻은 슬래쉬(slash) 또는 호그 연료(hog fuel), 숲 잔여물(forest residue), 볏짚(rice straw)과 같은 짚(straw), 왕겨(chaff), 곡물, 목초, 옥수수, 옥수수 껍질, 잡초, 수생 식물, 건초 등을 포함할 수 있다.
상기와 같이 목질계 바이오매스는 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 리그닌과 함께 복잡한 구조로 얽혀있어 미생물이 이용 가능한 단당으로 만들기 위해서는 반드시 가혹한 환경에서 전처리 및 당화과정을 거쳐야 한다. 이 과정에서 상기 셀룰로오스 및 상기 헤미셀룰로오스 성분은 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)를 포함하는 5탄당 또는 6탄당으로 가수분해 된다. 그러나 당 과분해로 인해 푸란(furan), 하이드록시메틸푸르푸랄(HMF), 푸르푸랄(furfural)과 같은 퓨란계 화합물 및 아세트산 등이 함께 생성된다. 상기 리그닌 성분은 가수분해될 경우 페룰산(ferulic acid), 쿠마르산(coumaric acid), 벤조산(benzoic acid), 시링산(syringic acid), 바닐산(vanilic acid), 바릴린(valilin), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde), 시링알데하이드(syringaldehyde) 등의 페놀계 화합물들이 생성된다.
상기 목질계 바이오매스의 가수분해로 생성된 화합물 중 페놀계 화합물, 퓨란계 화합물 등은 미생물 발효시 생장과 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 생산 효율을 떨어뜨리는 발효저해물질로 작용한다. 특히, 10 중량% 이상의 목질계 바이오매스는 상기 발효저해물질로 인해 미생물 발효가 어려워 이를 제거 또는 감소시키는 공정이 추가로 반드시 필요하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 해조류 바이오매스는 육상 바이오매스에 비해 원료 생산주기가 짧고 단위면적당 원료 생산량이 월등히 높다. 또한 구조적으로 리그닌을 포함하지 않기 때문에 당화가 상대적으로 쉬운 장점을 갖고 있다. 상기 해조류 바이오매스는 예를 들어, 홍조류, 갈조류, 녹조류 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 해양에서 직접 채취하거나 양식하여 수득한 것을 모두 포함한다. 국내에서 수득량이 가장 많은 것으로 알려진 갈조류는 당화시 만니톨을 다량 생산할 수 있으며, 다시마(Laminaria japonica), 미역(Undaria pinnatifida), 톳(Hizikiafusiforme), 헛가지말(Analipus japonicus), 코르다리아(Chordaria flagelliformis), 패(Ishige okamurai), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 미역쇠(Endarachne binghamiae), 감태(Ecklonia cava), 곰피(Ecklonia stolonifera), 대황(Eisenia bicyclis), 쇠미역(Costaria costata), 모자반(Sargassum fulvellum), 괭생이 모자반(Sargassum horneri), 지충이(Sargassum thunbergii) 등을 예로 들 수 있다. 상기 홍조류는 예를 들어 우뭇가사리(Gelidium amansii), 김파래(Bangia atropurpurea), 둥근돌김(Porphyra suborbiculata), 방사무늬김(Porphyra yezoensis), 납작갈라가라(Galaxaura falcate), 외흐늘풀(Scinaia japonica), 애기우뭇가사리(Gelidium divaricatum), 왕우뭇가사리(Gelidium pacificum), 혹돌잎(Lithophylum okamurae), 낭과쩍(Lithothammion cystocarpideum), 넓은게발(Amphiroa anceps), 고리마디게발(Amphiroa beauvoisii), 참산호말(Corallina officinalis), 작은구슬산호말(Corallina pilulifera), 방황게발혹(Marginisporum aberrans), 부채까막살(Carpopeltis prolifera), 참지누아리(Grateloupia filicina), 참도박(Grateloupia elliptica), 개도박(Grateloupia lanceolanta), 미끌지누아리(Grateloupia turtuturu), 꿩꼬리풀(Phacelocarpus japonicus), 불등풀가사리(Gloiopeltis furcata), 참가시우무(Hypnea charoides), 갈고리가시우무(Hypnea japonitca), 사이다가시우무(Hypnea saidana), 주름진두발(Chondrus cripspus), 돌가사리(Chondracanthus tenellus), 잎꼬시래기(Gracilaria textorii), 마디잘록이(Lomentaria catenata), 엇가지풀(Heterosiphonia japonica), 개서실(Chondria crassicaulis), 참보라색우무(Symphyocladia latiuscula), 김(Porphyra yezoensis Ueda), 코토니(Cottonii), 개도박(Grateloupia lanceolata), 개우무(Pterocladia tenuis), 새발(Acanthopeltis japonica), 풀가사리(Gloiopeltis tenax), 뿔가사리(Irish moss), 도박(Pachymeniopsis elliptica), 비단풀(Ceramium kondoi), 단박(Ceramium boydenii), 돌가사리(Gigartina tenella), 석묵(Campylaephora hypnaeoides) 등이 있다. 상기 녹조류는 예를 들어, 파래(Enteromorpha), 갈파래(Ulva lactuca), 해캄(Spirogyra spp.), 청각(Codium fragile), 구슬청각(Codium minus), 옥덩굴(Caulerpa okamurai), 돌옷(Nostoc commune) 등이 있다.
상기 일 구현예에 따른 해조류 바이오매스는 알긴산, 라미나란과 같은 다당류와 만니톨을 탄수화물로 포함하고 있다. 만니톨은 2개의 환원물질인 NADH를 생산하는 글루코오스에 비해 환원된 형태의 당으로 해당과정을 거쳐 피루빈산으로 전환되었을 때 분자당 3개의 NADH를 생산하므로 환원력을 필요로 하는 바이오 알코올 및 화학물질의 생산에 이용될 수 있다면 도움이 될 수 있다. 또한, 구조적으로 리그닌이 없기 때문에 당화가 상대적으로 쉽고 또한 리그닌으로부터 유래되는 높은 독성을 갖는 페놀계 화합물이 당화액내에 존재하지 않기 때문에 목질계 바이오매스 당화액에 비해 독성이 낮다.
하지만, 해조류에 주로 존재하는 갈락토스 또는 만니톨과 같은 당을 분해하는 미생물이 상대적으로 적으며, 상기 글루코오스와 만니톨로부터 생산된 NADH를 효과적으로 소비할 수 없다면 높은 환원력으로 인해 미생물 대사에 있어 산화/환원 전위가 맞지 않아 미생물 성장과 발효가 지연된다는 문제가 있다.
이에 본 발명의 구현예들은 해조류 바이오매스를 당화시 목질계 바이오매스가 혼합하여 당화하거나, 해조류 바이오매스 당화액에 목질계 바이오매스 당화액을 혼합함으로써, 목질계 바이오매스 유래 아세트산을 해조류 바이오매스 유래 만니톨의 발효시 생성되는 전자(환원력)를 수용하는 외부전자 수용체로 이용하여 만니톨의 발효효율을 증가시키는 효과를 보여주었다. 이로써 본 발명에 따른 혼합 당화액은 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스 유래 발효성 탄소원뿐만 아니라 비발효성 탄소원인 아세트산도 부티르산과 같은 대사산물로 전환되는데 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 당화액은 해조류 바이오매스를 목질계 바이오매스와 함께 사용하므로, 목질계 바이오매스의 사용을 줄일 수 있다. 그 결과 상기 혼합 바이오매스 당화액은 당화액 전체 부피를 기준으로, 상기 당화액의 해조류 및 목질계 바이오매스의 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액 대비 50 중량% 이상 100 중량% 이하 발효저해물질이 감소된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액은 당화액 전체 부피를 기준으로, 상기 당화액의 해조류 및 목질계 바이오매스의 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액 대비 60 중량%, 70 중량%, 80 중량% 또는 85 중량% 이상, 100 중량% 이하 또는 90 중량% 이하 감소된 발효저해물질을 포함할 수 있다. 이때 상기 해조류 바이오매스의 중량은 건조중량이다.
일 구현예에 따른 상기 발효저해물질은 페놀계 화합물 및 퓨란계 화합물 중 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 발효저해물질은 페룰산(ferulic acid), 쿠마르산(coumaric acid), 벤조산(benzoic acid), 시링산(syringic acid), 바닐산(vanilic acid), 바릴린(valilin), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde) 및 시링알데하이드(syringaldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 페놀계 화합물; 및 퓨란(furan), 푸르푸랄(furfural) 및 5-하이드록시메틸 푸르푸랄(5-HMF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 퓨란계 화합물 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액은 당화액 전체 부피를 기준으로, 상기 당화액의 해조류 및 목질계 바이오매스의 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액 대비 75 중량% 이상 100 중량% 이하의 당을 포함할 수 있다. 상기 당은 글루코오스(glucose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단당류; 이당류인 셀로바이오스(cellobiose); 및 만니톨(mannitol), 알긴산(alginic acid) 및 라미나란(laminaran)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다당류; 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적인 예로서, 해조류 바이오매스가 다시마 또는 모자반 바이오매스인 상기 당화액은 만니톨 및 글루코오스를 포함할 수 있고, 해조류 바이오매스가 우뭇가사리 바이오매스 또는 갈파래 바이오매스인 상기 당화액은 만노스, 갈락토스, 자일로스 및 아라비노스를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 상기 혼합 바이오매스는 해조류 바이오매스와 목질계 바이오매스가 9:1 내지 1:9, 의 중량비로 혼합된 것일 수 있다. 또는 상기 해조류 바이오매스의 당화액 및 목질계 바이오매스의 당화액이 혼합된 당화액의 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스의 중량비는 9:1 내지 1:9일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 해조류 바이오매스와 목질계 바이오매스의 중량비는 9:1 내지 5:5, 또는 7.5~8.5:1.5~2.5일 수 있다.
상기와 같은 혼합 바이오매스는 페놀계 화합물 등에 의해 높은 독성을 갖는 목질계 바이오매스 자체 첨가량을 10%(w/v)에서 예를 들면, 1% 내지 3%로 낮추는 것이 가능하므로 목질계 바이오매스 유래 발효저해물질의 생산을 낮출 수 있고, 따라서 추가적인 발효저해물질 제거/무독화 공정이 필요없게 된다. 이와 동시에 목질계 바이오매스가 당화되면서 발생하는 아세트산을 해조류 바이오매스의 당화액에 포함된 만니톨의 발효에 요구되는 전자수용체로 이용할 수 있다. 즉, 해조류 바이오매스로부터 유래하는 만니톨은 대부분의 미생물들이 발효에 이용하는 글루코오스에 비해 높은 환원력을 갖는다. 그러므로, 해당과정을 통해 발생한 환원력을 효과적으로 내보낼 수 없으면 미생물의 생육이 원활하게 이루어질 수 없다. 그러나 본 발명의 구현예들에 따른 혼합 바이오매스 당화액은 목질계 바이오매스 유래 아세트산으로부터 해조류 바이오매스 유래 만니톨의 발효에 필요한 전자수용체의 공급이 가능하므로, 발효저해물질인 아세트산을 소모함과 동시에 만니톨을 효과적으로 발효시킬 수 있어, 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조 수율을 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 구현예들은 상기와 같은 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액을 제조하는 방법으로, 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 혼합하는 혼합 단계; 및 상기 혼합된 바이오매스를 가수분해하는 당화 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다. 또는, 본 발명의 다른 구현예들은 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 각각 가수분해하는 하는 당화 단계; 및 상기 각각 당화된 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 혼합하는 혼합 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 두 제조방법은 해조류 및 목질계 바이오매스의 혼합단계 및 당화단계의 순서만이 서로 뒤바뀐 것으로, 양 방법에 의해 제조된 혼합 바이오매스 당화액은 모두 동일한 구성 및 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 두 제조방법은 당화 단계 이전에 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 연화(softening)시키기 위해 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구현예로서, 상기 혼합된 바이오매스의 전처리 단계는, 목질계 바이오매스 내의 고분자 당을 미생물이 이용가능한 저분자 당으로 가수분해하기 전에 상기 가수분해를 용이하게 하도록 하기 위해 단단한 목질계 바이오매스의 연화(softening)하기 위한 것으로, 희황산 전처리를 예로 들 수 있는 산이나 염기 등을 처리하는 화학적 처리, 고온이 나 고압 등을 가하는 물리적 처리 및 효소나 미생물 등을 가하는 생물학적 처리 중 하나 이상의 처리를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 구현예들은 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 제조방법에 의해 제조된 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액에 미생물을 투입하고 배양하여 발효시키는 발효 단계를 포함하는 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법을 제공할 수 있다.
일 구현예로서 상기 당화 단계는 해조류 및 목질계 바이오매스로부터 당을 생산하면서, 상기 해조류 및 목질계 바이오매스의 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스의 단독 당화시와 대비하여 감소된 양의 발효저해물질을 생산할 수 있다. 상기 당화 단계는 해조류 바이오매스로부터 만니톨을 포함하는 당을 생산하고 목질계 바이오매스로부터 아세트산을 생산할 수 있으며, 상기 발효 단계는 상기 만니톨의 발효 중에 발생하는 전자의 수용체로 상기 아세트산을 이용할 수 있다.
일 구현예로서 상기 발효 단계는 당화액에 투입되는 미생물에 의해 이루어질 수 있으며, 상기 미생물은 당에 대한 발효능, 당화액에 잔류할 수 있는 발효 저해 물질에 대한 내성 등을 고려하여 선택할 수 있다.
상기 발효에 사용되는 미생물은 일반적인 발효에 이용되는 모든 미생물을 포함하며, 구체적으로 효모, 유산균, 클로스트리디움(Clostridium), 대장균 및 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 조합하거나, 상기 균주들을 단독으로 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 아나에로믹소박터 속( Anaeromyxobacter sp .), 알칼리게네스 속( Alcaligenes sp .), 박테로이데스 속( Bacteroides sp .), 바실러스 속( Bacillus sp .), 클로스트리디움 속( Clostridium sp.), 에스케리키아 속( Escherichia sp .), 락토바실러스 속( Lactobacillus sp .), 락토코커스 속( Lactococcus sp .), 피키아 속( Pichia sp .), 슈도모나스 속( Pseudomonas sp .), 랄스토니아 속( Ralstonia sp .), 로도코커스 속( Rhodococcus sp.), 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp .), 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.), 써머스 속( Thermus sp .), 써머토가 속( Thermotoga sp .), 써모아나에로박터 속( Thermoanaerobacter sp .) 및 자이모모나스 속( Zymomonas sp .)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 미생물은 클로스트리디움 베이어린키 ( Clostridium beijerinckii ), 클로스트리디움 아세토부티리쿰 ( Clostridium acetobutyricum ), 클로스트리디움 부티리쿰( Clostridium butyricum ), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰( Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 써모셀럼 ( Clostridium thermocellum ), 클로스트리디움 퍼프린젠스 ( Clostridium perfingens ), 클로스트리디움 스포로제네스( Clostridium sprorogenes ), 클로스트리디움 써모하이드로써퓨리쿰( Clostridium thermohydrosulfuricum), 클로스트리디움 클루이베리 ( Clostridium kluyveri ), 클로스트리디움 애시디톨러런스 ( Clostridium aciditolerans ), 클로스트리디움 파스테우리아눔( Clostridium pasteurianum ), 클로스트리디움 융다히( Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노제눔 ( Clostridium autoethanogenum ), 클로스트리디움 포미코아세티쿰 ( Clostridium formicoacticum ), 클로스트리디움 써모아세티쿰( Clostridium thermoaceticum ), 클로스트리디움 아세티쿰( Clostridium aceticum) 및 클로스트리디움 타이로부티리쿰( Clostridium tyrobutyricum )으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 일 구현예에 따라 상기 방법에 의해 제조되는 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 종류는 미생물의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 상기 바이오 화학물질은 지방산(fatty acid), 다이올(diol), 다이엔(diene) 및 유기산 중 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 유기산은 젖산(lactic acid), 아세트산(acetic acid), 부티르산(butyric acid), 핵사노익산(hexanoic acid) 등을 예로 들 수 있으며, 상기 바이오 연료는 아세톤(acetone), 에탄올(ethanol), 부탄올(butanol) 등을 예로 들 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
[실험예 1] 목질계 또는 해조류 단독 바이오매스 당화액의 유기산 발효 효율 분석
바이오매스 종류에 따른 당화액의 발효 적합성을 파악하기 위해 해조류 바이오매스와 목질계 바이오매스를 각각 전처리 및 당화하여 당화액을 준비하였다. 본 실험에서는 해조류 바이오매스로 다시마 바이오매스를, 목질계 바이오매스로 볏짚 바이오매스를 이용하였다.
구체적으로, 상기 각각의 바이오매스를 10%(w/v)의 농도로 1.5% 황산(w/v) 수용액에 첨가하여 121℃에서 30분간 전처리 하였다. 전처리가 완료된 바이오매스를 당화를 위해 수산화 칼슘을 이용하여 pH 5.0으로 보정하고, 셀룰라아제를 바이오매스 100 g당 1 ml의 농도로 첨가하여 50℃에서 2일간 효소 당화하여 당화액을 준비하였다. 이때, 바이오 화학물질의 일 구현예로 상기 당화액으로부터 부티르산을 발효하기 위한 기질로, 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection))를 이용하였다.
상기 해조류 바이오매스 당화액(비교예 1)에는 리터당 6.2 g의 글루코오스와 25.3 g의 만니톨, 0.2 g의 아세트산이 포함되어있다. 또한, 상기 제조된 목질계 바이오매스 당화액(비교예 2)에는 리터당 26.6 g의 글루코오스와 14.6 g의 자일로스, 1.02 g의 아세트산, 0.9 g의 페놀계 화합물이 포함되어있다.
부티르산 발효를 위하여 상기 제조한 각각의 해조류 바이오매스 당화액(비교예 1) 또는 목질계 바이오매스 당화액(비교예 2)에 리터당 5g의 효모 추출물, 0.2g의 황산마그네슘, 0.01g의 황산망간, 0.01g의 황산철, 0.01g의 염화나트륨, 0.5g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2g의 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하였다. 유기산 생산시 과도하게 pH가 떨어지는 것을 막기 위해 100 mM이 되도록 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 첨가한 후, 초기 pH를 6 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.8로 조정하였다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병(serum bottle)에 20 mL의 배지를 넣고 배지의 2.5%에 해당하는 배양액을 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 배양하였다.
배양이 완료된 각 배양물에 대해 각각 당 및 유기산의 농도를 측정하였다. 상기 농도는 액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph)로 분석하였다. 당과 부티르산은 굴절률 검출기로 분석하였고, Hi-Plex H 컬럼 (300×7.8 mm, Agilent)을 사용하였다. 미생물 생장은 분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU)로 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 1은 해조류 단독 바이오매스 당화액(비교예 1)에서 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 유기산 발효 경향을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다. 발효 24시간까지 균주의 성장 및 유기산 생산이 없는 것을 확인하였고, 그 이후가 되어서야 균주가 성장하며 유기산을 생산하는 것을 알 수 있다. 60시간 발효 시, 4 g/L의 글루코오스와 12.9 g/L의 만니톨을 이용하여 7 g/L의 부티르산을 생산하는 것을 확인하였다. 해조류 바이오매스를 이용하여 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 를 배양시 상당히 긴 유도기를 갖고, 발효 60시간에도 당화액에 포함되어 있는 당을 모두 이용하지 않기 때문에 발효 효율이 상당히 떨어지는 것을 알 수 있다.
도 2는 목질계 단독 바이오매스 당화액(비교예 2)에서 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 유기산 발효 경향을 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 목질계 바이오매스 당화액 이용시 미생물 발효 72시간까지 균주의 성장 및 유기산의 생산이 거의 없는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과는 상기 목질계 바이오매스의 당화로 생성된 화합물 중 페놀계 화합물, 약산 등은 미생물 발효시 생장 및 미생물을 이용한 유기산과 같은 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 생산 효율을 떨어뜨리는 발효저해물질로 작용하여, 이를 제거 또는 감소시키기 않는 이상 본 실험과 같이 10 중량% 이상의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액은 낮은 발효효율을 가짐을 의미한다. 또한, 해조류 바이오매스의 당화액은 발효시간이 길고 발효시 만니톨의 낮은 분해능으로 인해 유기산과 같은 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 생산 효율이 매우 낮음을 의미한다.
따라서, 해조류 또는 목질계 각각의 단독 바이오매스를 이용하여 제조된 당화액은 유기산 발효에 적합하지 않으며, 이로부터 다른 미생물 발효를 통한 바이오 연료 또는 바이오 화학물질의 생산시에도 낮은 생산 효율을 가질 것임을 예측할 수 있다.
[실험예 2] 아세트산 첨가에 의한 해조류 바이오매스 당화액의 발효 효율 분석
해조류 바이오매스 당화액에 외부 전자 수용체로서 아세트산 첨가여부에 따른 발효효율을 비교분석하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
먼저 유기산 발효에서의 만니톨의 소비양상을 분석하기 위하여, 리터당 27 g의 만니톨, 5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5 g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2g의 황산암모늄(ammonium sulfate)이 포함된 배지에 외부 전자 수용체로써 아세트산나트륨(sodium acetate)를 0, 2.5, 5 g/L의 농도로 각각 첨가하였다. 유기산 생산시 과도하게 pH가 떨어지는 것을 막기 위해 100 mM이 되도록 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 첨가한 후, 초기 pH를 1 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.8으로 조정하였다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병(serum bottle)에 20 mL의 배지를 넣고 배지의 2.5%에 해당하는 배양액을 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 배양하였다. 이때, 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection))를 부티르산 발효의 기질로 이용하였다.
배양이 완료된 각 배양물에 대해 각각 만니톨 및 유기산의 농도를 측정하였다. 상기 농도는 액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph)로 분석하였다. 만니톨과 부티르산은 굴절률 검출기로 분석하였고, Hi-Plex H 컬럼 (300×7.8 mm, Agilent)을 사용하였다. 미생물 생장은 분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU)로 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 3(a)는 외부 전자 수용체로 아세트산나트륨을 넣지 않은 결과를 나타낸 그래프로, 72시간 동안 리터당 6.5 g의 만니톨을 소모하여 1.9 g의 부티르산을 생산한 것을 확인할 수 있다. 도 3(b)는 외부 전자 수용체로 아세트산나트륨을 리터당 2.5 g을 첨가한 배지에서의 균주의 성장과 유기산을 나타낸 그래프로, 72시간 동안 리터당 20.8 g의 만니톨을 이용하여 9.8 g의 부티르산을 생산하는 것을 확인할 수 있다. 배지 내의 아세트산을 다 소모한 24시간부터 만니톨의 소비 양상이 상당히 느려지는 것을 미루어 보아, 만니톨의 해당과정 중에 발생한 전자를 받아줄 아세트산이 필요함을 알 수 있다. 도 3(c)는 외부 전자 수용체로 아세트산나트륨을 리터당 5 g 첨가한 배지에서의 균주의 성장과 유기산을 나타낸 그래프로, 배지에 포함된 모든 만니톨 (26.5 g/L)을 소모하여 14.4 g/L의 부티르산을 생산하였음을 확인 할 수 있다.
상기 결과로부터 해조류 바이오매스 당화액에 포함된 만니톨의 효과적 발효에는 해당과정 중 발생하는 전자를 받아줄 아세트산과 같은 전자 수용체가 반드시 필요한 것을 알 수 있다.
상기 실험 결과를 실제 당화액에 적용하기 위하여, 해조류 바이오매스인 다시마 바이오매스를 10%(w/v)의 농도로 1.5% 황산(w/v) 수용액에 첨가하여 121℃에서 30분간 전처리 및 당화한 당화액을 준비하였다. 상기 해조류 바이오매스 당화액에는 리터당 28.4 g의 만니톨, 0.2 g의 아세트산이 포함되어있다.
상기 전처리가 완료된 바이오매스를 당화를 위해 수산화 칼슘을 이용하여 pH 6.5로 보정하고, 여기에 리터당 5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5 g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2g의 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 외부 전자 수용체로써 아세트산나트륨(sodium acetate)를 5 g을 첨가하였다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병(serum bottle)에 20 mL의 배지를 넣고 배지의 2.5%에 해당하는 배양액을 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 배양하였다. 이때, 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection))를 부티르산 발효의 기질로 이용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 해조류 바이오매스 당화액에 아세트산을 외부 전자수용체로서 첨가하여 발효한 경우 당화액 내에 있는 만니톨(27.7 g/L)과 아세트산(3.8 g/L)을 동시에 소모하며 부티르산(15 g/L)을 생산하는 것을 알 수 있다.
[실험예 3] 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 발효 적합성 분석 1
상기 실험예 1 및 2에서 확인한 바와 같이 목질계 바이오매스 당화액의 경우 발효저해물질로 인한 독성이 높기 때문에 이를 제거하지 않는 이상 미생물 발효에 이용할 수 없다. 또한 해조류 바이오 매스의 경우 효율적인 발효를 위해서는 아세트산과 같은 외부 전자수용체의 첨가가 필요하다.
이에, 하기에서는 본 발명의 일 실시예로서 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스의 혼합 바이오매스로 당화액을 제조함으로써 발효 적합성 향상효과를 분석하였다.
먼저, 해조류 바이오매스(다시마) 및 목질계 바이오매스(볏짚) 를 9:1, 8:2, 7:3의 중량비로 혼합한 혼합 바이오매스 10%(w/v)를 각각 황산 1.5% (w/v) 수용액에 첨가하여 121℃에서 30분간 전처리 하였다. 전처리가 완료된 바이오매스를 당화를 위해 수산화 칼슘을 이용하여 pH 5.0으로 보정하고, 셀룰라이제를 바이오매스 100 g당 1 ml의 농도로 첨가하여 50℃에서 2일간 효소 당화하여 당화액을 제조하였다. 제조된 각 당화액 조성은 하기 표 1에 정리하였다.
해조류 바이오매스,
%(w/v)		 목질계 바이오매스,
%(w/v)		 　 글루코오스
(glucose)		 자일로스
(xylose)		 만니톨
(mannitol)		 아세트산
(acetic acid)		 총 폐놀계 화합물
(phenolics)
비교예 1 10 0 conc. (g/L)
 6.16 0 25.3 0.22 N.D.
비교예 2 0 10 26.58 14.64 0 1.02 0.87
실시예 1 9 1 7.45 1.8 22.85 0.27 N.D.
실시예 2 8 2 8.97 2.68 20.59 0.45 0.19
실시예 3 7 3 10.5 3.45 17.54 0.56 0.24
상기 표 1에서 알 수 있듯이 목질계 바이오매스만을 이용하여 당화액을 제조한 비교예 2의 경우 발효저해물질인 0.87 g/L의 폐놀계 화합물이 되었지만, 목질계 바이오매스에 해조류 바이오매스를 혼합한 실시예 1 내지 3의 당화액에는 페놀계 화합물이 상당량 줄어든 것을 확인할 수 있다. 또한 실시예 1 내지 3의 당화액의 경우 해조류 바이오매스로부터 생산된 만니톨의 발효시 아세트산이 전자 수용체로 사용될 수 있어, 그 발효 효율이 단일 바이오매스로 제조한 당화액인 비교예 1 및 2에 비해 높을 것으로 사료된다.
다음으로, 상기 제조된 각각의 당화액에 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection))를 기질로 이용하여 발효를 진행하였다. 발효를 위해 각각의 당화액에 리터당 5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5 g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2g의 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하였고, 유기산 생산시 pH가 급격하게 떨어지는 것을 막기 위해 100 mM이 되도록 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 첨가한 후, 초기 pH를 6 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.8으로 조정하였다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병(serum bottle)에 20 mL의 배지를 넣고 배지의 2.5%에 해당하는 배양액을 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 배양하였다.
배양이 완료된 각 배양물에 대해 각각 당 및 유기산의 농도를 측정하였다. 상기 농도는 액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph)로 분석하였다. 당과 부티르산은 굴절률 검출기로 분석하였고, Hi-Plex H 컬럼 (300×7.8 mm, Agilent)을 사용하였다. 미생물 생장은 분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU)로 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 5(a)는 실시예 1(해조류:목질계=9:1)에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 생육을 나타낸 것이다. 발효 48시간 후 5.3 g/L의 글루코오스와 15.5 g/L의 만니톨을 이용하여 10.3 g/L의 부티르산을 생산하였다. 아세트산이 모두 소모된 36시간부터는 당의 이용과 유기산의 생산이 급격히 느려지는 것을 확인할 수 있다.
도 5(b)는 실시예 2(해조류:목질계=8:2)에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 생육을 나타낸 것이다. 발효 48시간 후 7.4 g/L의 글루코오스와 18.8 g/L의 만니톨을 이용하여 12.4 g/L의 부티르산을 생산하였다.
도 5(c)는 실시예 3(해조류:목질계=7:3)에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 생육을 나타낸 것이다. 발효 48시간 후 13.2 g/L의 글루코오스와 17.2 g/L의 만니톨을 이용하여 12.2 g/L의 부티르산을 생산하였다.
그리고 도 6은 상기 실험예 1의 도 1(비교예 1) 및 도 2(비교예 2)에 나타난 발효 48시간 후의 부티르산 생산량과 본 발명의 도 5(b)(실시예 2)에 나타난 발효 48시간 후의 부티르산 생산량을 비교하여 나타낸 그래프이다.
이로부터 본 발명은 부티르산 발효에 해조류 바이오매스와 목질계 바이오매스가 혼합된 바이오매스의 당화액을 이용함으로써 해조류 또는 목질계 단독 바이오매스의 당화액보다 월등히 향상된 발효효율을 나타냄을 알 수 있다.
이는 목질계 바이오매스를 해조류 바이오매스와 혼합한 바이오매스를 당화함으로써 목질계 바이오매스의 첨가량을 줄일 수 있어 목질계 바이오매스 유래 발효저해물질 발생량을 감소시킴과 동시에, 목질계 바이오매스 유래 아세트산을 높은 환원력을 갖는 해조류 바이오매스 유래 만니톨의 발효시 전자수용체로 이용하여 해조류 바이오매스만을 이용하였을 때의 긴 유도기를 단축시킬 수 있기 때문이다. 이로써 본 발명은 균주의 성장 및 유기산 생산능을 현저히 향상시켜, 우수한 발효적합성을 갖는 당화액을 제공할 수 있다.
[실험예 4] 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 발효 적합성 분석 2
하기에서는 본 발명의 일 실시예로서 해조류 바이오매스의 당화액과 목질계 바이오매스의 당화액을 혼합한 혼합 바이오매스 당화액을 제조하고, 이의 발효 적합성 향상효과를 분석하였다.
먼저, 30%(w/v)의 해조류 바이오매스(다시마)를 1.5%(w/v)의 황산수용액에 첨가하여 121℃에서 30분간 전처리하고 셀룰라아제 처리 없이 수산화 칼슘을 이용하여 pH 6.5로 보정하여 만니톨이 포함된 당화액(비교예 3)을 제조하였다. 30%(w/v)의 목질계 바이오매스(폐목재) 당화액은 70%(w/v)의 황산에 30분간 전처리 후, 황산의 농도를 25%(w/v)로 낮추어 산 가수분해 시켜 당화액(비교예 4)을 제조하고, 이를 수산화 칼슘을 이용하여 pH 6.5로 보정하였다.
그리고, 상기 제조된 해조류 바이오매스(다시마) 당화액과 목질계 바이오매스(폐목재) 당화액을 혼합하여 본 발명에 따른 혼합 바이오매스 당화액을 제조하였다. 이때 상기 해조류 당화액의 만니톨 농도는 회분식 발효를 하기에는 상당히 높기 때문에 4배 희석하였고, 이 희석된 해조류 바이오매스(다시마) 당화액과 목질계 바이오매스(폐목재) 당화액을 부피비 9:1(실시예 4), 8.8:1.2(실시예 5)로 각각 혼합하였다.
제조된 상기 당화액들의 조성은 하기 표 2에 정리하였다.
해조류 바이오매스,
%(w/v)		 목질계 바이오매스,
%(w/v)		 글루코오스
(glucose)		 자일로스
(xylose)		 만니톨
(mannitol)		 아세트산
(acetic acid)		 총 폐놀계 화합물
(phenolics)
비교예 3 30 0 conc. (g/L) 0 0 80 0 N.D.
비교예 4 0 30 80 30 0 6 0.62
실시예 4 9a 1b 7.12 0.75 15.46 0.32 N.D.
실시예 5 8.8a 1.2b 8.24 0.9 19.83 0.49 N.D.
(a: 1/4로 희석한 비교예 3을 이용한 부피비율
b: 비교예 4를 이용한 부피비율)
다음으로, 상기 제조된 각각의 당화액에 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755 (Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection))를 기질로 이용하여 발효를 진행하였다. 상기 각각의 당화액에 리터당 5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5 g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2g의 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하였고, 유기산 생산시 pH가 급격하게 떨어지는 것을 막기 위해 100 mM이 되도록 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 첨가한 후, 초기 pH를 6 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.8으로 조정하였다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병(serum bottle)에 20 mL의 혼합당화액 배지를 넣고 배지의 2.5%에 해당하는 배양액을 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 배양하였다.
배양이 완료된 각 배양물에 대해 각각 당 및 유기산의 농도를 측정하였다. 상기 농도는 액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph)로 분석하였다. 당과 부티르산은 굴절률 검출기로 분석하였고, Hi-Plex H 컬럼 (300×7.8 mm, Agilent)을 사용하였다. 미생물 생장은 분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU)로 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 7(a)는 실시예 4(해조류:목질계=9:1)에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 생육을 나타낸 것이다. 발효 36시간 후 5.3 g/L의 글루코오스와 15.5 g/L의 만니톨을 이용하여 10.3 g/L의 부티르산을 생산하였다. 아세트산이 모두 소모된 36시간부터는 당의 이용과 유기산의 생산이 급격히 느려지는 것을 확인할 수 있다.
도 7(b)는 실시예 5(해조류:목질계=8.8:1.2)에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755의 생육을 나타낸 것이다. 발효 36시간 후 7.4 g/L의 글루코오스와 19.8 g/L의 만니톨을 이용하여 12.9 g/L의 부티르산을 생산하였다.
이로부터 본 발명은 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 제조시, 해조류와 목질계 바이오매스를 혼합한 다음 당화하여 제조한 혼합 당화액 뿐만 아니라, 해조류 바이오매스 당화액 및 목질계 바이오매스 당화액을 각각 제조한 후 이를 혼합한 혼합 당화액의 경우에도 해조류 또는 목질계 단독 바이오매스의 당화액보다 월등히 향상된 발효효율을 나타냄을 알 수 있다.

Claims (18)

  1. 미생물 발효에 사용되는 당화액으로, 상기 당화액은,
    해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스가 9:1 내지 5:5의 중량비로 혼합된 바이오매스의 당화액; 또는
    해조류 바이오매스의 당화액 및 목질계 바이오매스의 당화액이 9:1 내지 5:5의 중량비로 혼합된 당화액이며,
    상기 당화액은 목질계 바이오매스 유래 아세트산을 포함하고, 발효시 해조류 바이오매스 유래 만니톨이 목질계 바이오매스 유래 아세트산과 같이 소모되는,
    해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 해조류 바이오매스는 갈조류 바이오매스인,
    해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 당화액은 당화액 전체 부피를 기준으로, 상기 당화액의 해조류 및 목질계 바이오매스의 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액 대비 50 중량% 이상 100 중량% 이하로 발효저해물질이 감소된 것이며, 상기 발효저해물질은 페놀계 화합물 및 퓨란계 화합물 중 하나 이상의 화합물을 포함하는,
    해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액은 당화액 전체 부피를 기준으로, 상기 당화액의 해조류 및 목질계 바이오매스 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액 대비 80 중량% 이상 100 중량% 이하 감소된 발효저해물질을 포함하는, 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 발효저해물질은,
    페룰산(ferulic acid), 쿠마르산(coumaric acid), 벤조산(benzoic acid), 시링산(syringic acid), 바닐산(vanilic acid), 바릴린(valilin), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde) 및 시링알데하이드(syringaldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 페놀계 화합물; 및
    퓨란(furan), 푸르푸랄(furfural) 및 5-하이드록시메틸 푸르푸랄(5-HMF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 퓨란계 화합물;
    중에서 선택된 하나 이상을 포함하는,
    해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액은 당화액 전체 부피를 기준으로, 상기 당화액의 해조류 및 목질계 바이오매스의 총 중량과 동량의 목질계 바이오매스가 당화된 당화액 대비 75 중량% 이상 100 중량% 이하의 당을 포함하는, 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 당화액은 당을 포함하며, 상기 당은,
    글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단당류; 이당류인 셀로바이오스(cellobiose); 및 만니톨(mannitol), 알긴산(alginic acid) 및 라미나란(laminaran)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다당류; 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는,
    해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액.
  10. 제 1 항 내지 제 2 항, 제 4항 및 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액을 제조하는 방법으로, 상기 방법은,
    해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 9:1 내지 5:5의 중량비로 혼합하는 혼합 단계, 및 상기 혼합된 바이오매스를 가수분해하는 당화 단계; 또는
    해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 각각 가수분해하는 당화 단계, 및 상기 각각 당화된 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 9:1 내지 5:5의 중량비로 혼합하는 혼합 단계;
    를 포함하는, 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 제조방법은,
    상기 당화 단계 이전에 해조류 바이오매스 및 목질계 바이오매스를 연화(softening)시키기 위해 전처리하는 단계를 더 포함하는,
    해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액의 제조방법.
  12. 제 10 항의 제조방법에 의해 제조된 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액에 미생물을 투입하고 배양하여 발효시키는 발효 단계를 포함하며,
    상기 당화 단계는 해조류 바이오매스로부터 만니톨을 생산하고 목질계 바이오매스로부터 아세트산을 생산하며,
    상기 발효 단계는 발효시 해조류 바이오매스 유래 만니톨이 목질계 바이오매스 유래 아세트산과 같이 소모되는, 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 미생물은 효모, 유산균, 클로스트리디움(Clostridium), 대장균 및 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리디움 베이어린키( Clostridium beijerinckii), 클로스트리디움 아세토부티리쿰 ( Clostridium acetobutyricum ), 클로스트리디움 부티리쿰 ( Clostridium butyricum ), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰( Clostridium cellulolyticum ), 클로스트리디움 써모셀럼( Clostridium thermocellum), 클로스트리디움 퍼프린젠스 ( Clostridium perfingens ), 클로스트리디움 스포로제네스 ( Clostridium sprorogenes ), 클로스트리디움 써모하이드로써퓨리쿰( Clostridium thermohydrosulfuricum ), 클로스트리디움 클루이베리( Clostridium kluyveri), 클로스트리디움 애시디톨러런스 ( Clostridium aciditolerans ), 클로스트리디움 파스테우리아눔 ( Clostridium pasteurianum ), 클로스트리디움 융다히( Clostridium ljungdahlii ), 클로스트리디움 오토에타노제눔( Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 포미코아세티쿰 ( Clostridium formicoacticum ), 클로스트리디움 써모아세티쿰 ( Clostridium thermoaceticum ), 클로스트리디움 아세티쿰( Clostridium aceticum ) 및 클로스트리디움 타이로부티리쿰( Clostridium tyrobutyricum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 바이오 화학물질은 지방산(fatty acid), 다이올(diol), 다이엔(diene) 및 유기산 중 하나 이상인, 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 유기산은 젖산(lactic acid), 아세트산(acetic acid), 부티르산(butyric acid) 또는 핵사노익산(hexanoic acid)인 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법.
  18. 제 12 항에 있어서, 상기 바이오 연료는 아세톤(acetone), 에탄올(ethanol) 또는 부탄올(butanol)인 것을 특징으로 하는 바이오 화학물질 또는 바이오 연료의 제조방법.
KR1020150050321A 2015-04-09 2015-04-09 바이오 화학물질 및 연료 생산 증진을 위한 해조류 및 목질계 혼합 바이오매스 당화액 및 그 제조방법 KR101806201B1 (ko)

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