KR102053330B1

KR102053330B1 - 글리세롤을 포함하는 미생물 발효용 조성물 및 이를 이용한 부티르산의 생산방법

Info

Publication number: KR102053330B1
Application number: KR1020180046602A
Authority: KR
Inventors: 엄영순; 이선미; 공경택; 이경민; 오현주; 김기연
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2019-12-06
Also published as: KR20190122995A

Abstract

본 명세서는 탄소공급원 및 글리세롤을 포함하는 미생물 발효용 당화액으로서, 상기 탄소공급원은 글루코스, 피루빈산, 아세트산 및 자일로스 중 하나 이상을 포함하는, 미생물 발효용 당화액, 및 이를 이용한 부티르산의 생산방법을 제공한다. 상기 당화액을 이용하여 부티르산을 매우 우수한 수율로 생산할 수 있다.

Description

글리세롤을 포함하는 미생물 발효용 조성물 및 이를 이용한 부티르산의 생산방법{COMPOSITION FOR MICROORGANISM FERMENTATION COMPRISING GLYCEROL AND METHOD FOR PRODUCING BUTYRIC ACID USING THE SAME}

본 명세서는 글리세롤을 포함하는 미생물 발효용 조성물과 이를 이용한 부티르산의 생산방법에 관하여 기술한다.

화석 연료 사용으로 인한 환경오염과 온실가스 발생 및 석유자원 고갈 문제를 해결하기 위해 석유자원을 대체할 수 있는 바이오매스를 이용한 바이오 연료의 생산에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 우리나라의 경우 제한된 경지 면적과 한정된 자원으로 인하여 바이오매스의 수급이 용이하지 않으며, 버려지는 폐자원을 이용하여 바이오 연료 및 바이오 화학물질을 생산하고자 하는 경우 미생물이 이용할 수 있는 당으로 전환하는 전처리 및 당화 공정이 까다롭기 때문에 투입되는 바이오매스 대비 최대 목표 생산물을 얻어낼 필요가 있다.

바이오 연료 및 바이오 화학물질은 미생물 발효를 통해 얻어지는 산물로써, 미생물이 다양한 대사경로를 갖고 있는 만큼 목적하는 생산물을 높은 수율로 얻어내기는 어렵다. 일 예로 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 경우 부티르산을 생산하기 위해 많은 연구가 되고 있는 미생물이지만, 탄소원을 이용하여 목표로 하는 부티르산 뿐만 아니라 아세트산 또한 생산한다(도 1). 따라서 높은 수율로 부티르산을 생산하기 위해서는 아세트산으로 흐르는 탄소의 대사 흐름을 제한할 필요가 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-0785997호 대한민국 등록특허공보 제10-1148255호

일 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미생물 발효용 조성물에 글리세롤을 포함하여 높은 수율로 부티르산을 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미생물의 부티르산 생산에 있어서 단독 탄소원으로 소모하지 못하는 글리세롤을 발효성 탄소원과 아세트산(또는 아세트산염)과 함께 공급함으로써 글리세롤을 소모할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기와 같은 글리세롤, 발효성 탄소원 및 아세트산(또는 아세트산염)의 소모를 통하여 부티르산 생산 수율을 높이고, 바이오디젤 부산물인 글리세롤을 부티르산으로 전환할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미생물의 발효를 위한 해당과정에서 NADH 생산량을 증가시켜 부티르산의 생산 수율을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미생물의 발효에 사용하는 미생물 발효용 조성물에 포함된 발효성 탄소원으로서의 당류 뿐 아니라, 저해물질로 알려진 아세트산(또는 아세트산염)을 전자 수용체로 이용하여 부티르산으로 전환할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미생물의 발효에 의한 부티르산의 생산에서 부산물로 생산되는 아세트산을 감소시키거나 모두 소모시키는 방법을 제공하는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 발효성 탄소원 및 글리세롤을 포함하는 미생물 발효용 조성물로서, 상기 발효성 탄소원은 글루코스를 포함하는, 미생물 발효용 조성물을 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 포함하는 배지에 글리세롤 및 발효성 탄소원을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는, 부티르산의 생산방법을 제공한다.

일 관점에서, 본 발명은 미생물 발효용 조성물에 글리세롤을 포함하여 높은 수율로 부티르산을 생산할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미생물의 부티르산 생산에 있어서 단독 탄소원으로 소모하지 못하는 글리세롤을 발효성 탄소원과 아세트산(또는 아세트산염)과 함께 공급함으로써 글리세롤을 소모할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기와 같은 글리세롤, 발효성 탄소원 및 아세트산(또는 아세트산염)의 소모를 통하여 부티르산 생산 수율을 높이고, 바이오디젤 부산물인 글리세롤을 부티르산으로 전환할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미생물의 발효를 위한 해당과정에서 NADH 생산량을 증가시켜 부티르산의 생산 수율을 증진시키는 방법을 제공할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미생물의 발효에 사용하는 미생물 발효용 조성물에 포함된 발효성 탄소원으로서의 당류 뿐 아니라 발효 저해물질로 알려진 아세트산(또는 아세트산염)을 전자 수용체로 이용하여 부티르산으로 전환하여 고효율로 바이오 연료 및 화학물질을 생산할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미생물의 발효에 사용하는 당화액에 포함된 아세트산을 외부 전자 수용체로 이용할 수 있으므로 바이오 연료 및 화학물질의 생산과 동시에 당화액 내의 독성을 완화시킬 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 미생물의 발효에 의한 부티르산의 생산에서 부산물인 아세트산의 생산을 감소시키거나 전혀 생산하지 않는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 대사 경로를 도식화한 그림이다.
도 2는 아세트산을 첨가하지 않은 배지에서 글루코스를 단일 탄소원으로 사용하였을 때의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 유기산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 아세트산이 첨가된 배지에서 글루코스를 단일 탄소원으로 사용하였을 때의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 아세트산이 첨가된 배지에서 글리세롤을 단일 탄소원으로 사용하였을 때의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 글루코스 및 글리세롤을 동시에 탄소원으로 배지에 공급하였을 때 아세트산을 첨가한 경우의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 글루코스 및 글리세롤을 동시에 탄소원으로 배지에 공급하였을 때, 아세트산을 첨가하지 않은 경우의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 아세트산이 첨가된 배지에서 글루코스와 글리세롤을 7.5:2.5 비율로 하여 탄소원으로 사용하였을 때 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 아세트산이 첨가된 배지에서 글루코스와 글리세롤을 5:5 비율로 하여 탄소원으로 사용하였을 때 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 5c는 아세트산이 첨가된 배지에서 글루코스와 글리세롤을 2.5:7.5 비율로 하여 탄소원으로 사용하였을 때 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 발효 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 아세트산 0g/L 첨가시 글루코스와 글리세롤을 약 3:1로 포함한 배지에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 부티르산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 아세트산 0.25g/L 첨가시 글루코스와 글리세롤을 약 3:1로 포함한 배지에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 부티르산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 6c는 아세트산 0.5g/L 첨가시 글루코스와 글리세롤을 약 3:1로 포함한 배지에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 부티르산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 6d는 아세트산 1g/L 첨가시 글루코스와 글리세롤을 약 3:1로 포함한 배지에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 부티르산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 6e는 아세트산 2g/L 첨가시 글루코스와 글리세롤을 약 3:1로 포함한 배지에서의 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 부티르산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 7는 아세트산 소모 농도를 기준으로 한 적정 글리세롤 첨가 농도에 대한 검량선을 나타낸 것이다.
도 8a는 아세트산을 포함하고 있는 폐목재 당화액에 폐글리세롤 0g/L 첨가한 배지에서의 부티르산 생산 패턴을 나타낸 것이다.
도 8b는 아세트산을 포함하고 있는 폐목재 당화액에 폐글리세롤 1.9g/L 첨가한 배지에서의 부티르산 생산 패턴을 나타낸 것이다.
도 8c는 아세트산을 포함하고 있는 폐목재 당화액에 폐글리세롤 2.3g/L 첨가한 배지에서의 부티르산 생산 패턴을 나타낸 것이다.
도 8d는 아세트산을 포함하고 있는 폐목재 당화액에 폐글리세롤 2.8g/L 첨가한 배지에서의 부티르산 생산 패턴을 나타낸 것이다.
도 8e는 아세트산을 포함하고 있는 폐목재 당화액에 폐글리세롤 3.7g/L 첨가한 배지에서의 부티르산 생산 패턴을 나타낸 것이다.
도 8f는 아세트산을 포함하고 있는 폐목재 당화액에 폐글리세롤 5.4g/L 첨가한 배지에서의 부티르산 생산 패턴을 나타낸 것이다.
도 9은 모델당화액 (합성배지), 폐목재 당화액, 폐목재 당화액에 폐글리세롤을 첨가한 실험군 간의 부티르산 생산 수율을 비교한 그래프이다.
도 10a는 모델당화액(합성배지)와 발효조를 이용한 부티르산 생산에 있어서, 폐글리세롤 미첨가 시 배양시간에 따른 pH 및 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 생장을 나타낸 그래프이다.
도 10b는 모델당화액(합성배지)와 발효조를 이용한 부티르산 생산에 있어서, 폐글리세롤 미첨가 시 배양시간에 따른 글루코스 및 자일로스의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 10c는 모델당화액(합성배지)와 발효조를 이용한 부티르산 생산에 있어서, 폐글리세롤 미첨가 시 배양시간에 따른 아세트산 및 부티르산의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11a는 모델당화액(합성배지)와 발효조를 이용한 부티르산 생산에 있어서, 폐글리세롤 첨가 시 배양시간에 따른 pH 및 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 생장을 나타낸 그래프이다.
도 11b는 모델당화액(합성배지)와 발효조를 이용한 부티르산 생산에 있어서, 폐글리세롤 첨가 시 배양시간에 따른 글루코스 및 자일로스의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11c는 모델당화액(합성배지)와 발효조를 이용한 부티르산 생산에 있어서 폐글리세롤 첨가 시 배양시간에 따른 아세트산 및 부티르산의 농도를 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 또한, 설명의 편의를 위하여 구성요소의 일부만을 도시하기도 하였으나, 당업자라면 구성요소의 나머지 부분에 대하여도 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 "바이오매스(biomass)"라 함은 에너지원으로 이용되는 육상 식물, 해조류, 미세조류 등의 생물체를 의미하며, "바이오 화학물질(biochemical)"이라 함은 상기 바이오매스를 열분해/화학분해시키거나 발효시켜 얻을 수 있는 모든 화학물질을 의미한다. 또한, "바이오연료(biofuel)"라 함은 상기 바이오매스로부터 얻는 연료를 의미하며, 바이오알코올 및 바이오 오일뿐만 아니라 화학적 생물학적 기술을 통해 연료로 전환될 수 있는 대사산물을 모두 포함하는 최광의의 의미이다.

혐기성 발효를 하는 미생물은 자신의 성장에 필요한 ATP 생산을 위해 해당작용(glycolysis)을 하고, 이를 통해 생성된 환원력을 발효를 통해 제거한다. 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)은 혐기성 발효를 하는 미생물로 당화액에 포함된 글루코스를 해당과정을 통해 분해하며, ATP를 생산하여 생성된 환원력을 사용하여 부티르산 발효를 수행한다. 도 1에서 나타나는 바와 같이 클로스트리디움 타이로부티리쿰에 의해 부티르산이 생산될 때의 대략적인 대사경로를 살펴보면 1분자의 글루코스가 2분자의 피루빈산염(pyruvate)으로 전환되고 이때 2분자의 NADH가 생성된다. 2분자의 피루빈산염이 부티르산으로 전환될 때 2분자의 NADH를 이용한다. 따라서 본 발명자들은 글루코스보다 환원된 형태의 탄소원을 추가로 공급하고 클로스트리디움 타이로부티리쿰이 해당과정을 통해 고환원력의 탄소원을 대사할 때 생성되는 환원력(NADH)을 이용하여 부티르산의 선택성(selectivity)를 높이고자 하였다.

글리세롤은 고환원성을 갖는 탄소원으로 그 화학적 구조는 C3H8O3이다. 바이오디젤 생산 시 부산물로서 글리세롤의 생성 비율은 10%로 상당히 높다. 석유자원고갈 및 유가 상승 등으로 계속하여 바이오디젤 생산이 늘어가고 있는 상황이기 때문에 글리세롤의 생산 역시도 증가하고 있어 이와 같은 글리세롤을 환원력이 높은 탄소원으로서 이용하는 것은 환경 및 경제성에 있어서 유리할 수 있다.

본 발명 일 실시예에 따르면, 글리세롤을 탄소원으로서 이용할 수 있는 미생물 발효용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 조성물은 미생물 발효에 의한 부티르산 생산에 있어서, 단독으로는 탄소원으로서 이용될 수 없는 글리세롤을 부티르산 생산에 사용되도록 할 수 있다.

상기 조성물은 글루코스를 포함하는 발효성 탄소원과 글리세롤을 포함할 수 있다.

상기 발효성 탄소원은 클로스트리디움 타이로부티리쿰이 발효시켜 부티르산을 생산할 수 있는 것이라면 제한 없이 포함할 수 있으나, 예를 들어 글루코스(glucose)를 포함할 수 있다.

상기 발효성 탄소원은 글루코스 이외에, 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 프룩토스(fructose), 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose) 등과 같은 단당류; 셀로바이오스(cellobiose)와 같은 이당류; 및 만니톨(mannitol), 알긴산(alginic acid), 라미나란(laminaran) 등과 같은 다당류; 중에서 선택되는 하나 이상의 당류를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 아세트산 또는 아세트산염을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "아세트산"은 아세트산으로서 클로스트리디움 타이로부티리쿰이 소모할 수 있는 형태의 아세트산염을 포함하는 의미로 사용된다. 상기 아세트산은 외부 전자 수용체 역할을 수행하여 미생물의 발효 과정에서 발생하는 환원력, 즉 NADH를 이용하여 부티르산으로 전환될 수 있다.

상기 아세트산은 조성물에 별도로 첨가하거나, 바이오매스 당화액에 포함된 형태일 수 있으며, 클로스트리디움 타이로부티리쿰의 부티르산 생산 과정에서 부산물로서 생산되는 것일 수 있다.

글리세롤과 글루코스의 해당과정을 비교해 보았을 때, 2분자의 피루빈산염을 생산할 때 글루코스의 경우 2분자의 NADH를 생산하는 반면 글리세롤의 경우 그 2배인 4분자의 NADH를 생산한다. 따라서 클로스트리디움 타이로부티리쿰이 글리세롤을 해당과정을 거쳐 분해할때 발생하는 고환원력을 없애기 위해 NADH 소비적인 부티르산을 선택적으로 생산하게 된다. 나아가 리그노셀룰로스계 바이오매스 (목질계, 초본류) 당화액에는 글루코스와 자일로스뿐만 아니라 상당량의 아세트산이 부산물로 발생하여 존재하는데, 글리세롤을 소모하여 부티르산을 생산하고 남는 환원력을 아세트산을 부티르산으로 전환하여 제거할 수 있다.

일 예에서, 상기 발효성 탄소원은 바이오매스 당화액을 포함할 수 있다. 상기 바이오매스 당화액은 바이오매스를 미생물이 이용 가능한 당류로 만들기 위하여 당화과정을 거친 것이다.

상기 바이오매스는 리그노셀룰로스계 바이오매스 (목질계, 초본류 등) 및 해조류 바이오매스 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 리그노셀룰로스계 바이오매스 (목질계, 초본류 등)는 일반적으로 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌(lignin) 등으로 구성된 복합체인 리그노셀룰로오스(lignocellulose)를 포함한다. 예를 들어, 상기 리그노셀룰로스계 바이오매스는 셀룰로오스가 33 내지 51 중량%, 헤미셀룰로오스가 19 내지 34 중량%, 리그닌이 21 내지 32 중량%, 재가 0 내지 2 중량%, 기타 성분이 나머지로 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 리그노셀룰로스계 바이오매스는 리그노셀룰로오스를 포함하는 생물학적 재료라면 제한되지 않으며, 예를 들어 목질계, 초본류 등을 포함할 수 있고, 침엽수와 활엽수, 수종, 수령 등에 제한되지 않는다. 예를 들면, 나무에서 유래한 연질 목재(softwood from trees), 연질 목재 칩(softwood chips), 연질 목재 나무의 가공으로부터 얻은 슬래쉬(slash) 또는 호그 연료(hog fuel), 숲 잔여물(forest residue), 볏짚(rice straw)과 같은 짚(straw), 왕겨(chaff), 곡물, 목초, 옥수수, 옥수수 껍질, 잡초, 수생 식물, 건초 등을 포함할 수 있다.

상기 리그노셀룰로스계 바이오매스 당화액은 리그노셀룰로스계 바이오매스가 당화과정을 거쳐 분해된 산물을 의미한다. 상기 당화액은 당화과정 전에 전처리를 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 리그노셀룰로스계 바이오매스 당화액은 예를 들어 상기 셀룰로오스 및 상기 헤미셀룰로오스 성분이 가수분해된 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose) 등의 5탄당 또는 6탄당을 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 당화액은 당 과분해로 인해 생성되는 푸란(furan), 하이드록시메틸푸르푸랄(HMF), 푸르푸랄(furfural)과 같은 퓨란계 화합물 및 아세트산 등을 더 포함할 수 있다. 리그노셀룰로스계 바이오매스의 리그닌 성분은 가수분해될 경우 페룰산(ferulic acid), 쿠마르산(coumaric acid), 벤조산(benzoic acid), 시링산(syringic acid), 바닐산(vanilic acid), 바릴린(valilin), 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde), 시링알데하이드(syringaldehyde) 등의 페놀계 화합물들이 생성될 수 있으며, 상기 당화액은 이와 같은 페놀계 화합물을 더 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 리그노셀룰로스계 바이오매스 당화액은 당으로서 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단당류; 및 이당류인 셀로바이오스(cellobiose); 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 해조류 바이오매스는 셀루로스(글루칸)을 포함하며 알긴산, 라미나란과 같은 다당류와 만니톨을 포함할 수 있다. 만니톨은 2개의 환원물질인 NADH를 생산하는 글루코스에 비해 환원된 형태의 당으로 해당과정을 거쳐 피루빈산으로 전환되었을 때 분자당 3개의 NADH를 생산하므로 환원력을 필요로 하는 바이오 알코올 및 화학물질의 생산에 이용될 수 있다면 도움이 될 수 있다. 또한, 구조적으로 리그닌이 없기 때문에 당화가 상대적으로 쉽고 또한 리그닌으로부터 유래되는 높은 독성을 갖는 페놀계 화합물이 당화액내에 존재하지 않기 때문에 리그노셀룰로스계 바이오매스 당화액에 비해 독성이 낮을 수 있다.

상기 해조류 바이오매스는 예를 들어, 홍조류, 갈조류, 녹조류 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 해양에서 직접 채취하거나 양식하여 수득한 것을 모두 포함한다. 국내에서 수득량이 가장 많은 것으로 알려진 갈조류는 당화시 만니톨을 다량 생산할 수 있으며, 다시마(Laminaria japonica), 미역(Undaria pinnatifida), 톳(Hizikiafusiforme), 헛가지말(Analipus japonicus), 코르다리아(Chordaria flagelliformis), 패(Ishige okamurai), 고리매(Scytosiphon lomentaria), 미역쇠(Endarachne binghamiae), 감태(Ecklonia cava), 곰피(Ecklonia stolonifera), 대황(Eisenia bicyclis), 쇠미역(Costaria costata), 모자반(Sargassum fulvellum), 괭생이 모자반(Sargassum horneri), 지충이(Sargassum thunbergii) 등을 예로 들 수 있다. 상기 홍조류는 예를 들어 우뭇가사리(Gelidium amansii), 김파래(Bangia atropurpurea), 둥근돌김(Porphyra suborbiculata), 방사무늬김(Porphyra yezoensis), 납작갈라가라(Galaxaura falcate), 외흐늘풀(Scinaia japonica), 애기우뭇가사리(Gelidium divaricatum), 왕우뭇가사리(Gelidium pacificum), 혹돌잎(Lithophylum okamurae), 낭과쩍(Lithothammion cystocarpideum), 넓은게발(Amphiroa anceps), 고리마디게발(Amphiroa beauvoisii), 참산호말(Corallina officinalis), 작은구슬산호말(Corallina pilulifera), 방황게발혹(Marginisporum aberrans), 부채까막살(Carpopeltis prolifera), 참지누아리(Grateloupia filicina), 참도박(Grateloupia elliptica), 개도박(Grateloupia lanceolanta), 미끌지누아리(Grateloupia turtuturu), 꿩꼬리풀(Phacelocarpus japonicus), 불등풀가사리(Gloiopeltis furcata), 참가시우무(Hypnea charoides), 갈고리가시우무(Hypnea japonitca), 사이다가시우무(Hypnea saidana), 주름진두발(Chondrus cripspus), 돌가사리(Chondracanthus tenellus), 잎꼬시래기(Gracilaria textorii), 마디잘록이(Lomentaria catenata), 엇가지풀(Heterosiphonia japonica), 개서실(Chondria crassicaulis), 참보라색우무(Symphyocladia latiuscula), 김(Porphyra yezoensis Ueda), 코토니(Cottonii), 개도박(Grateloupia lanceolata), 개우무(Pterocladia tenuis), 새발(Acanthopeltis japonica), 풀가사리(Gloiopeltis tenax), 뿔가사리(Irish moss), 도박(Pachymeniopsis elliptica), 비단풀(Ceramium kondoi), 단박(Ceramium boydenii), 돌가사리(Gigartina tenella), 석묵(Campylaephora hypnaeoides) 등이 있다. 상기 녹조류는 예를 들어, 파래(Enteromorpha), 갈파래(Ulva lactuca), 해캄(Spirogyra spp.), 청각(Codium fragile), 구슬청각(Codium minus), 옥덩굴(Caulerpa okamurai), 돌옷(Nostoc commune) 등이 있다.

상기 해조류 바이오매스 당화액은 해조류 바이오매스가 당화과정을 거쳐 분해된 산물을 의미한다. 상기 당화액은 당화과정 전에 전처리를 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 해조류 바이오매스 당화액은 예를 들어 만니톨, 글루코스, 갈락토스, 자일로스 및 아라비노스, 만니톨(mannitol), 알긴산(alginic acid) 및 라미나란(laminaran)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 예에서 상기 미생물은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)일 수 있다. 예를 들어 상기 미생물은 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)일 수 있다. 상기 클로스트리디움 타이로부티리쿰은 탄소원으로부터 부티르산을 생산할 수 있다.

부티르산의 생산 수율을 보다 증진시키는 관점에서, 상기 글리세롤은 조성물 내의 글루코스에 대하여 글루코스 : 글리세롤의 중량비 1:99 ~ 99:1로 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 중량비는 1:1 ~ 10:1, 예를 들어 3:1 일 수 있다.

부티르산의 생산 수율을 보다 증진시키는 관점에서, 상기 아세트산과 글리세롤의 중량비는 1 : 99 내지 99 : 1로 포함할 수 있으며, 예를 들어 1 : 10 내지 1 : 1, 예를 들어 1:2일 수 있다.

본 발명 일 실시예에 따르면, 글리세롤을 이용하여 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 부티르산 생산을 증진시키는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명 일 실시예에 따르면, 부티르산의 생산방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 포함하는 배지에 글리세롤을 첨가하여 배양하는 것을 포함할 수 있다.

상기 배양은 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 생장 및 부티르산 생산이 가능한 조건이라면 제한 없이 수행할 수 있다. 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 균주 생장 조건은 당업계에 공지된 바에 따라 수행할 수 있다. 일 예에서 상기 배양은 혐기 조건에서 수행할 수 있다. 일 예에서, 상기 배양은 예를 들어 20 내지 50℃, pH 4 내지 7 에서 수행할 수 있으며, 예를 들어 20 내지 40℃, pH 4 내지 7에서 수행할 수 있다.

상기 배지는 상술한 본 발명 일 실시예에 따른 미생물 발효용 조성물에 포함되는 발효성 탄소원에 대하여는 반복 기술을 생략한다.

클로스트리디움 타이로부티리쿰의 배양에 있어서, 상기 글리세롤은 배지에 아세트산 또는 아세트산염이 존재하는 상태에서 첨가될 수 있다.

상기 아세트산 또는 아세트산염은 배지에 별도로 첨가되거나, 상기 발효성 탄소원으로서 포함되는 바이오매스 당화액에 포함된 상태로 첨가될 수 있으며, 또는 클로스트리디움 타이로부티리쿰의 부티르산 생산에 있어서 발생하는 부산물로서 생산되는 것일 수 있다.

상기 방법은 클로스트리디움 타이로부티리쿰의 부티르산 생산에서 발생하는 부산물인 아세트산 또는 아세트산염을 또다시 부티르산 생산에 사용하기 때문에 결과적으로 부티르산 생산에 있어서 부산물로서의 아세트산 생산을 감소시키거나 전혀 생산하지 않게 할 수 있다.

클로스트리디움 타이로부티리쿰은 글리세롤을 단독 탄소원으로 사용하는 경우 생장 및 부티르산 생산이 불가능하나, 본 발명 일실시예에 따라 발효성 탄소원 과 아세트산 또는 아세트산염을 함께 포함하는 경우 글리세롤, 발효성 탄소원 및 아세트산 또는 아세트산염을 모두 소모하여 부티르산을 생산할 수 있다.

따라서, 상기 부티르산 생산 방법에서, 배양 중 상기 글리세롤, 발효성 탄소원, 아세트산 또는 아세트산염은 세가지가 모두 존재하는 조건을 유지하여 부티르산 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 예를 들어 상기 세가지 성분 중 소진되는 성분이 있을 경우 해당 성분을 추가로 첨가하는 것을 포함할 수 있다.

일 예에서, 부티르산의 생산 수율을 보다 증진시키는 관점에서 상기 배지는 글루코스와 글리세롤을 글루코스 : 글리세롤의 중량비는 1:99 ~ 99:1로 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 중량비는 1:1 ~ 10:1, 예를 들어 3:1 일 수 있다.

일 예에서, 부티르산의 생산 수율을 보다 증진시키는 관점에서, 상기 배지는 아세트산과 글리세롤을 1 : 99 내지 99 : 1의 중량비로 포함할 수 있으며, 예를 들어 1 : 10 내지 1 : 1, 예를 들어 1:2일 수 있다.

상기 방법은 글리세롤의 고환원력으로 인하여 클로스트리디움 타이로부티리쿰의 발효 대사 흐름이 아세트산이 아닌 부티르산으로 선택적으로 흐르게 되어 아세트산 생산을 저감시킬 수 있다. 또한 부산물로서 생성되는 아세트산은 높은 환원력으로 인하여 다시 부티르산으로 전환되므로 결과적으로 생성을 저감 또는 제거할 수 있다.

이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[실험 조건 및 분석 방법]

이하의 실험에서 아래와 같은 균주 및 실험 조건에 따라 진행하였다.

(1) 사용 균주

발효를 진행할 미생물로 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)를 사용하였다.

(2) 배지 조성 및 배양 조건

균주 배양에 사용한 기본 배지는 총 부피 1리터당 5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2.2 g의 암모늄아세테이트 (ammonium acetate)를 포함하는 배지를 사용하였다. 아세트산을 첨가하지 않은 배지의 경우 2.2 g의 암모늄아세테이트(ammonium acetate)을 빼고 2.2 g의 암모늄설페이트 (ammonium sulfate)를 넣었다. 또한, 배양에 따른 아세트산과 부티르산 생산에 의해 pH가 급격히 감소하면 미생물 생장에 저해를 주므로, 2-(N-모르홀리노)에탄설포닉산(2-(N-morholino) ethanesulfonic acid, MES) 버퍼를 100 mM 추가하였다. 배지의 초기 pH는 4 N 수산화칼륨 (KOH)으로 6.5으로 조정되었다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병 (serum bottle)에 20 mL의 배지를 넣고 아르곤 가스로 산소를 없애고 고무마개와 알루미늄 crimp seal로 밀봉한 후 멸균하여 혐기성 조건을 만들었다. 이후 상기 기본배지에서 24시간 배양한 미생물을 10% 접종하고 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 200 rpm의 회전 속도로 배양하면서 균주 생장 및 대사산물 분석을 수행하였다.

(3) 분석 방법

배양을 진행하면서 배양 시간에 따라 당, 글리세롤, 아세트산 및 부티르산의 농도를 액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph)를 사용하여 측정하였다.미생물 생장은 분광광도계 (UVmini-1240, SHIMAZU)로 600 nm에서의 흡광도로 측정하였다.

[시험예 1] 아세트산을 첨가하지 않은 배지에서 글루코스를 탄소원으로 사용할 때 미생물의 유기산 생산

상기 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)을 상기 아세트산 없는 기본 배지에 글루코스 10 g/L를 첨가하여 배양하고 균주의 생육을 관찰하였으며, 결과를 도 2에 나타낸다.

도 2의 결과에서, 약 10 g/L의 글루코스를 소모했을 때 0.77 g/L의 아세트산과 3.39 g/L의 부티르산을 생산하였으며, 아세트산과 부티르산의 생산 비율이 1:4.4 로 전체 생산된 유기산 중 아세트산의 비율이 약 20%로 상당히 높은 것을 확인하였다. 부티르산 수율은 당 기반 0.35 g/g 글루코스 였다.

[시험예 2] 아세트산을 첨가한 배지에서 글루코스와 글리세롤을 각각 탄소원으로 사용할 때 미생물의 발효 패턴 비교

글리세롤은 상당히 높게 환원된 형태의 탄소원으로써 대부분의 절대 혐기성 균주들은 이를 단일 탄소원으로 이용하지 못한다. 이에, 클로스트리디움 타이로부티리쿰이 단일 탄소원으로 글리세롤을 이용하는지 확인하기 위하여 이하의 실험을 진행하였다.

클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)을 상기 아세트산을 첨가한 배지에 각각 글루코스 10g/L 및 글리세롤 10g/L를 첨가한 배지에서 배양하고 균주의 생육과 대사산물을 비교하였다. 결과를 도 3a 및 3b에 나타낸다.

도 3a 및 3b의 결과에서, 글루코스만을 넣은 경우 14시간 만에 9.65 g/L의 글루코스를 소모하여 0.77 g/L의 아세트산과 3.39 g/L의 부티르산을 생산하였고 부티르산 생산 수율은 0.35 g/g 이었다 (도 3a). 그러나, 글리세롤을 단일 탄소원으로 넣은 경우 균주의 성장과 부티르산 생산은 매우 미미했다(도 3b). 이는 클로스트리디움 타이로부티리쿰이 글리세롤을 단일 탄소원으로 이용할 수 없으며, 이는 대사할 때 높은 환원력을 제거할 수 없기 때문에 발생하는 결과이다.

[시험예 3] 글루코스와 글리세롤을 동시에 탄소원으로 배지에 공급한 경우 아세트산 유무에 따른 미생물의 발효 패턴 비교

상기 시험예 2에서 확인한 바와 같이 클로스트리디움 타이로부티리쿰은 글리세롤을 단일 탄소원으로 이용할 수 없다. 이에, 글리세롤과 글루코스를 동시에 배지에 공급하는 경우 글리세롤이 소모되는지확인하기 위하여 본 실험을 진행하였다. 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)을 상기 아세트산을 포함하는 기본 배지에 15 g/L의 글루코스 및 3 g/L의 글리세롤을 첨가한 배지에서 배양하였다. 결과를 도 4a 에 나타낸다.

도 4a의 결과에서, 아세트산이 있는 경우 18시간 만에 15.18 g/L의 글루코스와 2.64 g/L의 글리세롤을 모두 이용하여 8.17 g/L의 부티르산을 생산하였다. 글리세롤은 12시간 안에 모두 소모되었으며, 글리세롤을 이용한 12시간까지는 첨가한 아세트산이 함께 소모되는 것이 관찰되었다. 또한 글리세롤을 다 소모한 12시간 이후부터는 아세트산이 다시 생산되는 것을 확인하였다. 글리세롤 소모는 기대치 않았던 결과이며, 특히 글리세롤이 소모되는 동안 아세트산이 생산되지않고 소모된 것은 더더욱 예상치 못한 결과이다. 부티르산 생산 수율은 0.538 g/g 글루코스이며, 이는 이론적 부티르산 생산 수율인 0.489 g/g 글루코스 이상이므로, 이로부터 글리세롤과 아세트산이 소모되어 부티르산 생산이 증가된 것을 유추할 수 있다.

도 4a 의 결과로부터 글리세롤 소모와 아세트산 소모가 관련이 있는 것으로 보아, 이에 아세트산이 없는 배지에서 배양을 수행하였다. 결과를 도 4b에 나타낸다. 아세트산을 추가로 배지에 첨가하지 않았지만, 접종시 seed 배양에서 소량 아세트산이 옮겨왔지만 매우 미미하다 (0.22 g/L 이하). 아세트산을 첨가하지 않은 경우 발효 48시간 까지 6.28 g/L와 1.5 g/L의 글리세롤만을 이용하였고 2.35 g/L의 부티르산 만을 생산하는 것을 확인하였다(도 4b). 아세트산의 농도는 초기 생산한 농도에 비해 크게 증가 또는 감소하지 않는 것으로 미루어 보아 글루코스를 이용하여 부티르산을 생산함과 동시에 아세트산을 함께 생산하고 글리세롤이 해당과정을 거치는 중에 발생하는 많은 양의 NADH를 생산한 아세트산을 부티르산으로 전환하는데 이용하며 제거한 것으로 추정된다.

상기 결과들로부터 글루코스와 글리세롤을 동시에 탄소원으로 이용하기 위해서는 대사과정에서 발생하는 환원력을 제거해줄 외부 전자 수용체(external electron acceptor)가 필요한 것을 확인하였다.

[시험예 4] 아세트산을 첨가한 배지에서 글루코스 및 글리세롤의 농도 비율에 따른 미생물의 발효 패턴 비교

상기 시험예 3 에서 확인한 바와 같이, 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)이 글루코스와 글리세롤을 동시에 배지에 탄소원으로 공급하는 경우, 글리세롤을 소모하기 위해서는 아세트산이 필요함을 알 수 있다. 이에, 상기 기본 배지에 글루코스와 글리세롤을 합한 총 농도를 약 10 g/L로 하고 다양한 비율(글루코스:글리세롤 = 7.5:2.5, 5:5, 2.5:7.5)로 첨가한 배지에서 배양하고 균주의 생육을 비교하였다. 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타낸다.

도 5a 의 결과에서, 글루코스와 글리세롤을 7.5:2.5의 비율로 첨가한 실험군의 경우 첨가한 모든 탄소원(7.31 g/L의 글루코스와 2.32 g/L의 글리세롤)을 이용하였으며, 4.72 g/L의 부티르산을 생산하였다(도 5a). 글리세롤의 해당 과정중 발생하는 NADH를 제거하기 위해 0.95 g/L의 아세트산을 소모하였으며 부티르산으로 전환되어 당 기반 부티르산 수율이 증가하는 것이 관찰되었다 (수율 0.64 g/g 글루코스). 이는 시험예 1에서의 수율인 0.35 g/g 글루코스 보다 높고, 글루코스 기반 부티르산 생산 이론 수율인 0.489 g/g 보다 높다. 이로서 글리세롤과 아세트산을 소모함으로써 부티르산 생산이 증가하였음을 알 수 있다. 글루코스와 글리세롤을 5:5의 비율로 첨가한 실험군의 경우 첨가한 글루코스 (4.93 g/L)는 모두 소모하였다(도 5b). 그러나 글리세롤은 첨가한 글루코스를 모두 소모한 시점인 11시간까지 2.64 g/L를 소모하다가 이후부터 이용되지 못하는 것이 관찰되었다. 수율은 0.89 g/g 글루코스 로서 글루코스 기반 부티르산 생산 이론 수율인 0.489 g/g 보다 높다. 글루코스와 글리세롤을 2.5:7.5의 비율로 첨가한 실험군의 경우 첨가한 글루코스 (2.64 g/L)가 다 소모된 8시간부터 글리세롤의 이용이 멈추는 것을 볼 수 있다(도 5c). 부티르산은 2.7 g/L 가 생산되었으며, 수율은 1.02 g/g 글루코스 이다.

클로스트리디움 타이로부티리쿰은 글리세롤을 이용하여 부티르산을 생산하기 위해 글루코스와 같은 다른 탄수화물이 필요하며, 글리세롤 이용 시 발생되는 높은 환원력을 이용하여 아세트산을 부티르산으로 전환하는 것을 확인하였다.

[시험예 5] 클로코스와 글리세롤을 약 3:1 로 포함한 배지에서 아세트산 농도에 따른 미생물의 발효 패턴 비교

클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)을 상기 기본 배지 조성에서 암모늄아세테이트(ammonium acetate)을 빼고 2.2 g의 암모늄설페이트 (ammonium sulfate)를 넣고, 7.5 g/L의 글루코스와 2.5 g/L의 글리세롤을 첨가하였다. 아세트산 농도를 각각 0, 0.25, 0.5, 1, 2 g/L로 되도록 소디움아세테이트 (CH3COONa)를 달리 추가하여 배양하였으며 발효패턴을 확인하였다.

도 6a의 결과에서, 아세트산이 없는 경우 발효가 진행되지 않는 것을 다시 한번 확인하였다(도 6a). 0.25 g/L의 아세트산을 첨가한 경우 아세트산이 다 소모되는 8시간 까지만 발효가 원활히 이루어지며, 아세트산이 다 소모된 이후에는 부티르산 생산이 멈추는 것을 확인하였으며(도 6b), 0.5g/L, 1 g/L의 아세트산을 첨가한 경우에서도 유사한 양상을 나타낸다(도 6c, 도 6d). 모든 실험군에서 아세트산을 모두 소모하고 글리세롤이 남아있는 경우, 클로스트리디움 타이로부티리쿰은 글루코스와 글리세롤을 거의 이용하지 않는 것이 확인되었다. 2 g/L의 아세트산을 첨가한 경우 모든 글리세롤(3.16 g/L)을 이용할 때까지 아세트산이 소량 남아 있으므로 글루코스와 글리세롤의 이용이 7.35 g/L와 3.16 g/L로 가장 높았고 부티르산의 생산도 6.06 g/L로 다른 실험군에 비해 많은 것을 확인하였다(도 6e). 수율은 0.824 g/g 글루코스 로서 이론적 수율인 0.489 g/g보다 높다.

상기 글루코스의 농도가 7~8 g/L이고 글루코스와 글리세롤의 비율이 약 3:1 인 경우의 결과들을 바탕으로 아세트산의 소모농도 대비 글리세롤의 소모농도에 대한 검량선을 만들었을 때 신뢰 가능한 값(R2=0.998)을 보이는 것을 관찰하였다 (도 7). 본 검량선을 통해 배지 또는 당화액 내 포함된 아세트산 농도를 알면 그에 비례해서 적절한 글리세롤 첨가량을 예측하는데 도움이 되지만, 당과 글리세롤과 아세트산 농도가 도 6a 내지 6e 실험군의 범위를 벗어나면 아세트산 소모와 글리세롤 소모 비율은 달라진다. 특히 당 농도가 높은 경우 생산되는 아세트산이 증가하므로, 글리세롤 소모량은 도 7의 검량선보다 높아진다. 다음의 시험예 6에서 그 예를 볼 수 있다.

[시험예 6] 폐목재 당화액과 폐글리세롤을 이용한 부티르산 생산 증진

폐목재 당화액에는 고농도의 당이 포함되어있기 때문에 회분식 배양을 통해 모든 당을 이용할 수 없으므로 1/4로 희석하여 배지 조성 첨가 후 발효를 진행하였다. 농황산 당화 공정을 거친 폐목재 당화액을 증류수로 1/4로 희석한 후 부피 1리터당, 5 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2.2 g의 암모늄설페이트(ammonium sulfate)를 첨가하고 0, 1.9, 2.3, 2.8, 3.7, 5.4 g/L의 전처리한 폐글리세롤을 첨가하여 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 배지로 이용하였다. 배지의 초기 pH는 4 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.5으로 조정되었다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 60 mL의 시료병(serum bottle)에 20 mL의 배지를 넣고 미생물을 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 24시간 배양하였다.

폐글리세롤은 미생물 생장에 저해를 주는 물질을 제거하기 위해 전처리 후 당화액에 혼합하였다. 구체적으로 폐글리세롤:증류수를 1:3 부피로 혼합하고, 2.6 N HCl로 pH 4로 조정한 후 정치시키고 원심분리 후, 저해물질이 포함되어있는 상층액(지방산 포함)을 버리고 남은 하층액을 수집하여 전처리한 폐글리세롤으로서 실험에 사용하였다. 전처리한 폐글리세롤을 다양한 농도로 첨가하여 폐당화액 발효 시 발효패턴을 확인하였다(도 8a 내지 도 8f).

다양한 농도의 전처리한 폐글리세롤을 첨가한 결과 12시간 대에서의 균주 성장(OD600)이 대조군인 OD600 6.05와 비교하여 각각 OD600 6.39, 6.13, 6.11, 6.47, 6.5로 폐목재 당화액에 폐글리세롤을 첨가하여도 균주의 성장에 저해를 받지 않는 것을 관찰하였다.

폐목재 당화액에서 역시 합성배지에서와 마찬가지로 당화액에 포함된 아세트산이 외부 전자 수용체 역할을 하기 때문에 3.7 g/L의 폐글리세롤 첨가부터 당화액내의 아세트산이 부족하여 발효 후반대인 24시간부터 글루코스의 소모 및 부티르산의 생산이 원활하게 진행되지 않는 것을 확인하였다(도8e). 이 때, 아세테이트의 소모는 1.05 g/L 이며 글리세롤 소모는 3.5 g/L 였다. 이는 도9에서 아세테이트 1.05 g/L 소모시 예측되는 글리세롤 소모 2.12 g/L 보다 많이 소모한 것으로서, 이는 도9에서의 당 농도 (7~8 g/L)보다 도 10e에서의 당 농도 (약 25 g/L)가 더 높기 때문이다.

2.8 g/L의 폐글리세롤을 첨가한 경우 아세트산을 추가적으로 생산하지 않으면서 당화액에 포함된 글루코스를 모두 소모하는 것을 관찰하였고 17.99 g/L의 글루코스와 4.44 g/L의 자일로스를 이용하여 11.19 g/L의 부티르산을 생산하였다 (도 8d). 첨가한 글리세롤 역시 모두 소모하였으며 추가적으로 당화액에 포함된 아세트산을 0.38 g/L 소모한 것을 확인하였다.

상기 폐목재 당화액만을 첨가한 실험군, 폐목재 당화액에 2.8 g/L의 전처리한 폐글리세롤 첨가한 실험군과, 모델 당화액(리터당 80 g의 글루코스, 30 g의 자일로스, 및 6 g의 아세트산이 포함된 당화액)의 부티르산 생산 수율을 비교하여 도 9에 나타낸다. 생산 수율은 아래 식에 따라 산출하였다.

<식 1>

부티르산 생산수율 = (부티르산 생산 중량(g))/(소모된 글루코스+자일로스+글리세롤 중량(g))

모델 당화액과 폐목재 당화액 첨가군의 경우 그 수율이 0.36과 0.37 로 거의 동일한 것을 확인하였다. 그러나 당화액에 폐글리세롤을 첨가한 경우, 부티르산의 수율이 0.45 g/g으로 높은 결과를 얻어냈다.

[시험예 7] 발효조를 이용한 글리세롤의 부티르산 생산 증진 효과 확인

리터당 80 g의 글루코스, 30 g의 자일로스, 및 6 g의 아세트산이 포함된 모델 당화액에 P2 배지 성분 (리터당 25 g의 효모 추출물, 0.2 g의 황산마그네슘, 0.01 g의 황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g의 염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH2PO4), 0.5g의 제2 인산칼륨(K2HPO4), 2g의 황산암모늄(ammonium sulfate))을 첨가한 배지에서 클로스트리디움 타이로부티리쿰 ATCC 25755(Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755)의 발효 배지로 이용하여 폐글리세롤 첨가 유/무에 따른 부티르산 생산 변화를 관찰하였다. 폐글리세롤은 리터당 10 g을 첨가하여 발효 과정 중 모두 소진 시 추가로 첨가하였다.

배지의 pH는 6 N 수산화칼륨(KOH)으로 6.0으로 고정하여 발효를 진행하였다. 회분식 배양(batch culture)의 경우, 3 L의 발효조 (fermentor)에 1 L의 배지를 넣고 미생물을 5% 접종한 후 진탕 배양기에서 섭씨 37℃의 온도 및 200 rpm의 회전 속도로 56시간 배양하였다.

발효조를 이용하여 고농도 당이 포함된 모델 당화액에서 폐글리세롤의 첨가 유/무에 따른 균주의 성장과 부티르산 생산 특성을 확인 하였다(도 10a 내지 10c 및 도 11a 내지 11c).

균주 생육의 경우 두 실험군에서 큰 차이가 없으나(도 10a 및 도 11a), 부티르산 생산에 있어서는 글리세롤을 첨가한 경우 49.9 g/L로(도 11c) 글리세롤 미첨가 실험군 (35.5 g/L; 도 10c)과 비교하여 14.4 g/L의 생산 증진이 있었다. 발효 수율을 계산하면(부티르산 생산량 g/소모한 당 g), 글리세롤을 첨가한 경우 0.42이며, 글리세롤 미첨가 실험군의 경우 0.34로 수율에 있어서 상당한 증진된 것을 알 수 있다. 글리세롤을 첨가한 실험군의 경우, 발효 초기에는 아세트산이 소모되면서 농도가 줄어들다가, 약 15시간 이후에는 아세트산 농도가 증가하게 되는데, 이는 '글리세롤 소모에 따른 아세트산 소모 속도'보다 '당 소모에 따른 아세트산 생산 속도'가 더 빨라서 일어나는 현상이다. 20시간 이후 글리세롤을 다시 추가로 넣어준 이후에는 아세트산 생산속도보다 아세트산 소모 속도가 빨라져서 계속적으로 아세트산 농도는 줄어들고 거의 다 소모되는 것이 관찰되었다. 반면에, 글리세롤을 첨가하지 않은 실험군(도 10c)의 경우 초기 농도보다 9.3 g/L의 아세트산이 더 생산된 것이 관찰되었다. 상기 결과를 바탕으로 보아, 글리세롤을 첨가한 경우 당화액내의 발효성 탄소원 (글루코스 및 자일로스)의 흐름을 부티르산으로 집중시켜 부산물(아세트산) 발생을 감소하면서 부티르산 생성 수율을 현저하게 증진시킬 수 있으며, 이와 동시에 비발효성 탄소원 (아세트산) 역시 부티르산으로 전환시키는 것을 확인 할 수 있다.

Claims

글루코스 및 글리세롤을 포함하는 부티르산 생산 증진용 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 발효 첨가제 조성물이며,
상기 조성물은 아세트산 또는 아세트산염을 더 포함하는, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 발효 첨가제 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 리그노셀룰로스계 바이오매스 당화액 및 해조류 바이오매스 당화액 중 하나 이상을 포함하는, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 발효 첨가제 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 글루코스 이외에, 단당류, 이당류 및 다당류 중에서 선택되는 당류를 더 포함하는, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 발효 첨가제 조성물.
제5항에 있어서,
상기 당류는 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 프룩토스(fructose), 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 셀로바이오스(cellobiose), 만니톨(mannitol), 알긴산(alginic acid) 및 라미나란(laminaran) 중에서 선택되는, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 발효 첨가제 조성물.
제1항에 있어서,
상기 글루코스 : 글리세롤의 중량비는 1:99 ~ 99:1인, 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 발효 첨가제 조성물.
삭제
클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)을 포함하는 배지에 글리세롤 및 글루코스, 및 아세트산 또는 아세트산염을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는, 부티르산 생산 증진 방법.
삭제
제9항에 있어서,
상기 배지에 리그노셀룰로스계 바이오매스 당화액 및 해조류 바이오매스 당화액 중 하나 이상을 첨가하는 것을 포함하는, 부티르산 생산 증진 방법.
삭제
제9항에 있어서,
상기 배지는 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)의 배양을 통해 생산되는 아세트산 또는 아세트산염을 더 포함하는, 부티르산 생산 증진 방법.
제9항에 있어서,
상기 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)은 상기 글루코스; 아세트산 또는 아세트산염; 및 글리세롤을 발효하여 부티르산을 생산하는, 부티르산 생산 증진 방법.
제9항에 있어서,
상기 클로스트리디움 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum)은 상기 글루코스; 아세트산 또는 아세트산염; 및 글리세롤의 존재 하에 아세트산 또는 아세트산염; 및 글리세롤을 발효하여 부티르산을 생산하는, 부티르산 생산 증진 방법.
제9항에 있어서,
글루코스 : 글리세롤의 중량비 1:99 ~ 99:1로 첨가하는, 부티르산 생산 증진 방법.
제9항에 있어서,
상기 배지에 글루코스 이외에, 단당류, 이당류 및 다당류 중에서 선택되는 당류를 더 첨가하는 것을 포함하는, 부티르산 생산 증진 방법.
제17항에 있어서,
상기 당류는 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 램노스(rhamnose), 프룩토스(fructose), 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 셀로바이오스(cellobiose), 만니톨(mannitol), 알긴산(alginic acid) 및 라미나란(laminaran) 중에서 선택되는 하나 이상인, 부티르산 생산 증진 방법.
삭제
제9항에 있어서,
상기 방법은 아세트산 또는 아세트산염을 소모하여 부티르산을 생산하는, 부티르산 생산 증진 방법.