JP2015107088A - 酵母変異株を用いたエタノール製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明は当該酵母変異株を用いたエタノールの製造方法に関する。
近年、地球温暖化対策などの様々な要因から再生可能エネルギーの技術開発が求められている。バイオマスから製造されるバイオエタノールもその再生可能エネルギーの一つである。バイオエタノールは二酸化炭素の排出削減に直結することから自動車用のガソリン燃料への添加剤もしくはガソリン自体の代替燃料として期待されている。
stipitis)やシェフェルソマイセス・シェハタエ(Scheffersomyces shehatae)などのキシロースをエタノールに変換する能力を有するキシロース資化性酵母が必要になる。
本発明は以下の通りである。
(1)クロトリマゾール耐性を有するシェフェルソマイセス(Scheffersomyces)属のエタノール発酵性酵母変異株
(2)(1)に記載のエタノール発酵性酵母であって、エタノール耐性を有するエタノール発酵性酵母変異株
(3)(1)に記載のエタノール発酵性酵母であって、フルフラール耐性を有するエタノール発酵性酵母変異株。
(4)(1)に記載のエタノール発酵性酵母であって、バニリン耐性を有するエタノール発酵性酵母変異株。
(5)(1)〜(4)に記載の耐性を有することを特徴とする酵母変異株シェフェルソマイセス・スティピティス(Scheffersomyces
stipitis) CTM-2株(受託番号NITE P-1756)。
(6)(1)〜(5)のいずれか1項に記載のエタノール発酵性酵母変異株を使用するエタノール製造方法。
(7)(6)に記載のエタノール製造方法において、コーンスティープリカーを含む培地により増殖させた酵母細胞を用いてエタノールを製する造方法。
(8)(6)に記載のエタノール製造方法において、グルコースおよびキシロース混在下でエタノールを製造する方法。
(9)(6)に記載のエタノール製造方法において、バイオマスに由来する糖液でエタノールを製造する方法。
1.概要
本発明は、キシロースからのエタノール発酵、特にバイオマス原料より調製された糖化液に含まれるキシロースからのエタノール製造に適したシェフェルソマイセス・スティピティスに由来する酵母変異株に関する発明である。本発明の酵母は親株と比較してエタノールおよび発酵阻害物質に耐性が有り、効率良くエタノールを製造できるものである。
クロトリマゾール(CTZ)耐性を付与されたサッカロマイセス・セレビシエの変異株の中にエタノール耐性とエタノール生産性が上昇したものが高頻度で見られることが報告されている。また、CTZ耐性の付与により酵母変異株は複数の抗生物質といった薬剤に対して耐性を示すことが報告されている。CTZ耐性を付与することでシェフェルソマイセス・スティピティスにおいてもサッカロマイセス・セレビシエと同様にエタノール耐性、エタノール生産性および薬剤耐性の上昇が期待される。上昇する薬剤耐性の中には発酵阻害物質に対する耐性も含まれる可能性があると考えた。
そこで、親株を突然変異誘導処理に供与し、得られた酵母変異株の中からCTZ存在下で生育が可能なCTZ耐性変異株を取得した。CTZ耐性株をエタノールとCTZを含む培地で培養し、エタノール耐性の向上した株を選抜した。更に、選抜された酵母変異株を用いたエタノール発酵試験を行い、エタノール生産性の向上した酵母変異株の取得に成功した。得られたエタノール生産性向上株は一般的にエタノール発酵の発酵阻害物質と言われているフルフラールとバニリンに対して耐性を示し、リグノセルロース系バイオマスを原材料とする糖化液で高いエタノール生産性を保持することが可能であった。
シェフェルソマイセス・スティピティスのエタノール生産性は細胞の増殖条件に大きく影響されることが報告されている。その詳細はSlinngerらの報告に詳しい(Slininger PJ et al., Appl.
Microbiol. Biothecnol. 2006; 72: 1285-1296)。前培養での培地組成、特に炭素源(糖)と窒素源の比率が重要であり、培地組成を最適化することでエタノールの生成性を大きく向上させることができる。Sliningerらの報告では完全合成培地を用いているが、生産コストから考えて完全合成培地の使用は現実的ではない。本発明者らの検証により安価な窒素源として知られるコーンスティープリカーを前培養用培地へ添加することで酵母のエタノール生産性が向上することが示された。
本発明は上記知見により完成されたものである。
本発明は、キシロースからのエタノール発酵、特にバイオマス原料より調製された糖化液に含まれるキシロースからのエタノール製造に適したシェフェルソマイセス・スティピティスに由来する酵母変異株に関する発明である。酵母変異株の取得方法として突然変異誘導処理および馴化処理を行い、酵母変異株の選抜にエタノールおよびCTZを用いることを特徴とする。エタノールおよびCTZによる選抜を行うことで、エタノール耐性、エタノール生産性およびエタノール発酵阻害物質耐性の向上といった特性を持つシェフェルソマイセス・スティピティスに由来する酵母変異株の育種を効率的に行うことができる。
50mg/L、寒天20g/L)に塗布し、28℃で7日間培養した後、コロニーを形成した株を取得した。
stipitis)CTM-2株と命名した。本菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はNITE P-1756である。
本発明では発酵に供する酵母細胞はYTX液体培地(酵母エキス10g/L、ポリペプトン20g/L、キシロース20g/L)に窒素源を更に添加したものを用いて増殖させる。添加する窒素源に特に制限はないが、より安価なコーンスティープリカーなどを用いるのが望ましい。添加するコーンスティープリカーの濃度は例えば1〜5%であり、好ましくは1〜2%である。
窒素源の添加により酵母のエタノール生産性の向上が見られる。
上記で育種した酵母変異株を用いてエタノール発酵を行うことで糖化液から効率的にエタノール製造をすることができる。
エタノール製造における酵母の培養条件および発酵条件の詳細を以降に示す。
リグノセルロース系バイオマスの加水分解は、従来から公知の酸加水分解法やアルカリ加水分解法を用いることができる。最も好ましいのは、微粉砕されたリグノセルロースを酵素を使用して加水分解するのが良い。粉砕は、リグノセルロース系バイオマスを適切なサイズに粉砕する工程において、振動式ボールミルあるいはロッドミル,高衝撃力が付加できるミルを用いることにより100ミクロン以下、好ましくは50ミクロン以下まで微粉砕を行なう。
酵母変異株シェフェルソマイセス・スティピティス CTM-2株のエタノール生産性を最大限に発揮させるために、二段階の培養を行う。一段階目の培養(前々培養)ではCTZを含む培地でCTM-2株の細胞を増殖させ、二段階目の培養(前培養)ではコーンスティープリカーを含む培地に一段階目の培養液を添加して増殖させる。以下に詳細を示す。
・前々培養
40mg/LのCTZを含むYTX液体培地(酵母エキス10g/L、トリプトン20g/L、キシロース20g/L)100mlにCTM-2株の細胞を一白金耳添加し、20℃、80rpmの条件で3日間培養する。
・前培養
上記前々培養の菌液1mlを10g/LのコーンスティープリカーYTX液体培地(酵母エキス10g/L、トリプトン20g/L、キシロース20g/L)100mlに添加し、28℃、120rpmの条件で1日培養する。
本発明における糖化液の発酵は特許公開2009−296983明細書および特許公開2013−188156明細書に記載された方法(二段階発酵法)に準じて実施する。二段階発酵法はグルコースとキシロースをそれぞれ別の菌によりエタノールに変換する方法である。本発明では一次発酵工程には、高温発酵性酵母シゾサッカロマイセス・ジャポニカス(Schizosaccharomyces japonicas) SS4-5株(受託番号NITE
P-1197)を使用し、40℃、90rpmでの発酵を行う。二次発酵は、一次発酵で得られた発酵液を使用する。本発明程では、エタノール耐性、エタノール生産性および発酵阻害物質耐性が向上した酵母変異株CTM-2株を用いる。発酵阻害耐性能付与株を用いて糖化液でのアルコール発酵を行うことで、エタノールの生産性が向上する。
(1)「エタノール濃度測定」
以下の実施例において、エタノール濃度の測定は、アルコール分析器(アルコメイト:理研計器(株))を用いて測定した。
なお、測定値は、液量当たりの重量含量(g/L)で示した。
以下の実施例において、「培地中のキシロースの全てをエタノールに変換した場合の理論値(初発グルコースに0.51を乗じた値)」に対する「実際に発酵後に実測されたエタノールの値」の割合を、式(1)を用いて算出し、キシロースからのエタノール収率(%)とした。
以下の実施例において、グルコース濃度の測定は、JKインターナショナルFキットグルコースを用いた酵素法により測定した。また、キシロース濃度の測定は、メガザイム社キシロースキットを用いた酵素法により測定した。
また、これらの測定値は、液量当たりの重量含量(g/L)で示した。
CTM-2株の作出」
酵母細胞への突然変異誘導処理とCTZおよびエタノールに対する馴化処理によりCTZ耐性株を作出し、CTZ耐性株の中からエタノール耐性およびエタノール生産性が向上した酵母変異株の選抜を行う。
CTZ50mg/L )に塗布し、28℃で3日間培養した。YPX液体培地(酵母エキス10g/L、ポリペプトン20g/L、キシロース20g/L)へ生育したコロニーを一白金耳植菌し、28℃、120rpm、1日間の条件で培養した。増殖した細胞をYPX液体培地(酵母エキス5g/L、ポリペプトン10g/L、キシロース100g/L)でのエタノール生産試験に供与し、親株よりも高いエタノール生産性を持つ酵母変異株の選抜を行う。
更なる窒素源としてコーンスティープリカーを前培養培地に添加することによるエタノール生産性に及ぼす影響を検証する。
シェフェルソマイセス・スティピティス CTM-2株の特性を検証するために、MIC試験に供与し、薬剤耐性を調べた。
一般的に糖化液に含まれる発酵阻害物質として考えられているフルフラールとバニリンがシェフェルソマイセス・スティピティス CTM-2株のエタノール発酵に及ぼす影響を検証した。
以上の結果から、CTM-2株をフルフラールとバニリンによる発酵阻害に対する耐性がTT-E8株よりも強化されていることが示された。
グルコースとキシロースを含む培地でのシェフェルソマイセス・スティピティス CTM-2株によるエタノール生産試験を行い、グルコースの消費、キシロースの消費およびエタノール生成に関する検証を行った。
図2-(b)にあるように、24時間以内にグルコースを完全に消費し、キシロースも50時間には完全に消費した。エタノールの生産も50時間には完了した。この結果から、CTM-2株は糖の消費能力とエタノール生成速度も大きく改善していることが示された。
アンモニア処理ネピアグラス糖化液でのエタノール生産試験を行い、アンモニア処理ネピアグラス糖化液でのエタノール生産性を検証した。
図4にあるように、24時間以内にグルコースを完全に消費し、キシロースも50時間には完全に消費した。エタノールの生産も50時間には完了した。この結果から、CTM-2株は糖の消費能力とエタノール生成速度も大きく改善していることが示された。
Claims (9)
- クロトリマゾール耐性を有するシェフェルソマイセス(Scheffersomyces)属のエタノール発酵性酵母変異株
- 請求項1に記載のエタノール発酵性酵母であって、エタノール耐性を有するエタノール発酵性酵母変異株
- 請求項1に記載のエタノール発酵性酵母であって、フルフラール耐性を有するエタノール発酵性酵母変異株。
- 請求項1に記載のエタノール発酵性酵母であって、バニリン耐性を有するエタノール発酵性酵母変異株。
- 請求項1〜4に記載の耐性を有することを特徴とする酵母変異株シェフェルソマイセス・スティピティス (Scheffersomyces
stipitis) CTM-2株(受託番号NITE P-1756)。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のエタノール発酵性酵母変異株を使用するエタノール製造方法。
- 請求項6に記載のエタノール製造方法において、コーンスティープリカーを含む培地により増殖させた酵母細胞を用いてエタノールを製する造方法。
- 請求項6に記載のエタノール製造方法において、グルコースおよびキシロース混在下でエタノールを製造する方法。
- 請求項6に記載のエタノール製造方法において、バイオマスに由来する糖液でエタノールを製造する方法。
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