JP6026026B1

JP6026026B1 - エタノールの製造方法

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Publication number: JP6026026B1
Application number: JP2016019048A
Authority: JP
Inventors: 崇文木内; 森田　健太郎; 健太郎森田; 吏古賀; 小川　健一; 健一小川; 菜月茗荷; 典子保谷; 大西　徹; 徹大西
Original assignee: Toyota Motor Corp; Nippon Steel Engineering Co Ltd
Current assignee: Toyota Motor Corp; Nippon Steel Engineering Co Ltd
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: WO2017134975A1; PH12018501629A1; PH12018501629B1; JP2017136016A

Abstract

【課題】発酵前の水処理、特に酸、アルカリ等による前処理により生成する単糖の過分解物及び副産物の有機酸等の発酵阻害物質の除去処理設備が必要ないリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法の提供。【解決手段】Ａ）前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する工程と、（Ｂ）工程（Ａ）で得られた糖化液及び糖化残渣に、酵母を植菌し、発酵する工程と、を備え、工程（Ｂ）の前に、（Ｍ）工程（Ａ）前の前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中又は工程（Ａ）で得られた糖化液中の発酵阻害物質の濃度に応じて、発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値以上の酵母の菌体濃度となる、予め設定された基準値となる様に、工程（Ｂ）における酵母の菌体濃度を決定する工程を備え、工程（Ｂ）において、工程（Ｍ）において決定された菌体濃度となる様に酵母を植菌する製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、エタノールの製造方法に関する。

近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く用いられている。しかしながら、これらの原料はもともと食料又は飼料として用いられており、長期的に工業用利用資源として活用することは、食料又は飼料用途との競合を引き起こし、原料価格の高騰を招く危険性がある。

従って、非食用バイオマスをエネルギー資源として活用する技術開発が進められている。非食用バイオマスとしては、地球上に最も多く存在するセルロースがあげられるが、その大部分は芳香族ポリマーのリグニンやヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロースとして存在する。

リグノセルロース系バイオマスから目的の化合物を製造する方法としては、水熱処理等の前処理を行う。このとき、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。前処理工程では、リグノセルロースを構成するヘミセルロースやリグニンといったポリマーを分解し、後工程におけるセルロースの反応性を向上させる。しかしながら、酸強度や温度条件が強すぎると、セルロースおよびヘミセルロースの分解で生成された単糖がさらに分解され、過分解物を生成してしまい、その後の発酵工程を阻害することが知られている。また、主にヘミセルロースが分解される際に副産物として、酢酸やギ酸などの有機酸が生成され、これらもその後の発酵工程を阻害することが知られている。

特許文献１には、木質系炭化物により処理することで発酵阻害物質を除去する方法が開示されている。また、特許文献２には、ポリスチレン系の樹脂に吸着又は保持させることで、発酵阻害物質を除去する方法が開示されている。

特開２００５−２７００５６号公報特開２０１１−７８３２７号公報

特許文献１では、発酵阻害物質を除去する為に木質系炭化物および除去処理のための設備が必要となる。特許文献２では、発酵阻害物質を除去する為にポリスチレン系樹脂および除去処理のための設備が必要となる。さらに、ポリスチレン系樹脂の脱着処理（再生処理）を行うための設備が必要となる。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、発酵阻害物質の存在下での、安定的で効率的なリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）エタノールの製造方法であって、
（Ａ）前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた糖化液及び糖化残渣に、酵母を植菌し、発酵する工程と、を備え、
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、
前記工程（Ａ）の前、又は、工程（Ａ）の後であって、工程（Ｂ）の前に、
（Ｍ）前記工程（Ａ）前の前記前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中、又は、前記工程（Ａ）で得られた糖化液中のフルフラールの濃度に応じて、予め設定された基準値となるように、前記工程（Ｂ）における酵母の菌体濃度を決定する工程を備え、
前記予め設定された基準値が、フルフラールの濃度に応じた発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値以上の酵母の菌体濃度であって、
前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｍ）において決定された前記菌体濃度となるように酵母を植菌することを特徴とする製造方法。
（２）前記予め設定された基準値が、前記臨界値の１．０〜３．０倍である（１）に記載のエタノールの製造方法。
（３）前記臨界値が酵母の菌体数を用いた濃度（ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇ
ｕｎｉｔ）／ｍＬ）で表され、
前記フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、前記臨界値がＹ（ＣＦＵ／ｍＬ）であるとき、前記Ｘ及び前記Ｙは下記数式［１］で表される関係である（１）又は（２）に記載のエタノールの製造方法。

（数式[１]中、ａは、１．０×１０^７以上４．０×１０^７以下の数であり、ｂは、２．０×１０^６である。）
（４）前記臨界値が酵母の乾燥菌体重量を用いた濃度（ｇ／Ｌ）で表され、
乾燥菌体１ｇ当たりに含まれる酵母の菌体数が１．５×１０^１０ＣＦＵであって、
前記フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、前記臨界値がＹ’（ｇ／Ｌ）であるとき、前記Ｘ及び前記Ｙ’は下記数式［２］で表される関係である（１）又は（２）に記載のエタノールの製造方法。

（数式[２]中、ｃは、０．５以上２．５以下の数であり、ｄは、０．１３である。）

本発明法によれば、発酵阻害物質の存在下において、安定的且つ効率的にリグノセルロース系バイオマス由来化合物の収率を向上させることができる。

酵母内でのフルフラールの無毒化の経路を示した概略図である。本実施形態におけるリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。実施例１における糖化工程及び発酵工程での（Ａ）グルコース濃度、（Ｂ）キシロース濃度、（Ｃ）フルフラール濃度及び（Ｄ）エタノール濃度の変化を示すグラフである。実施例２における発酵工程での発酵収率とフルフラール濃度の関係を示すグラフである。（Ａ）は、実施例２における上記の臨界値とフルフラール濃度の関係を示すグラフであり、（Ｂ）は、実施例２における酵母の菌体数に置き換えた上記の臨界値とフルフラール濃度の関係を示すグラフであり、（Ｃ）は、実施例２における酵母の乾燥重量に置き換えた上記の臨界値とフルフラール濃度の関係を示すグラフである。

本明細書において、リグノセルロース系バイオマスとしては、主に、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含有するものであり、例えば針葉樹、広葉樹、建築廃材、林地残材、剪定廃材、稲藁、籾殻、麦藁、木材チップ、木材繊維、化学パルプ、古紙、合板等の農林産物資源、サトウキビバガス、サトウキビ茎葉、コーンスト―バー等の農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織である。これらのリグノセルロース系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。

本明細書において、ヘミセルロースは、キシロースなどの５つの炭素を構成単位とする五炭糖とよばれるものやマンノース、アラビノース、ガラクツロン酸などの６つの炭素を構成単位とする六炭糖とよばれるもの、さらにグルコマンナンやグルクロノキシランなどのような複合多糖を有するので、加水分解を受けると、炭素５つからなる五炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された五炭糖のオリゴ糖、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖、五炭糖の単糖と六炭糖の単糖が複数個連結されたオリゴ糖を生ずる。
セルロースは、６つの炭素を構成単位として有するので、加水分解を受けると、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖を生ずる。一般に、単糖及び／またはオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いた農林産物資源、農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織の種類によって異なる。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する、なお、各図において、説明に関連しない部分は図示を省略する場合がある。

＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法＞
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、
（Ａ）前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた糖化液及び糖化残渣に、酵母を植菌し、発酵する工程と、を備え、
前記工程（Ａ）の前、又は、工程（Ａ）の後であって、工程（Ｂ）の前に、
（Ｍ）前記工程（Ａ）前の前記前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中、又は、前記工程（Ａ）で得られた糖化液中の発酵阻害物質の濃度に応じて、予め設定された基準値となるように、前記工程（Ｂ）における酵母の菌体濃度を決定する工程を備え、
前記予め設定された基準値が、発酵阻害物質の濃度に応じた発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値以上の酵母の菌体濃度であって、
前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｍ）において決定された前記菌体濃度となるように酵母を植菌するものである。

本実施形態の製造方法によれば、発酵阻害物質の存在下において、安定的且つ効率的にリグノセルロース系バイオマス由来化合物の収率を向上させることができる。

≪工程（Ａ）：糖化工程≫
本実施形態の製造方法において、まず、前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する。糖化温度は、４５℃〜７０℃が好ましく、４５℃〜５５℃がより好ましく、５０℃が特に好ましい。また、糖化時間は１２時間〜１２０時間が好ましく、２４時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜７２時間がさらに好ましい。

本明細書において、酵素とは、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖単位に分解する酵素を意味し、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖にまで分解するものであればよく、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであればよい。
セルラーゼは、セルロースをグルコース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）の各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
同じくヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼの起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等のセルラーゼ及びヘミセルラーゼを用いることができる。

本明細書において、前処理済リグノセルロース系バイオマスとは、糖化反応を効率的に行うために事前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスを意味する。事前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、事前処理において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも工業利用には安価で手に入りやすい硫酸が特に好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等が挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。事前処理に用いる反応容器には特に限定はないが、耐酸性又は耐アルカリ性を有する加熱圧力容器、若しくは、耐酸性又は耐アルカリ性を有する容器をオートクレーブのような加熱圧力装置に入れて処理する形態が考えられる。

前処理済リグノセルロース系バイオマス中には、セルロース、ヘミセルロース、単糖及びオリゴ糖の少なくともいずれかの糖以外にも、種々の副生成物が含まれている。それら副生成物が後工程の糖化工程、発酵工程などに悪影響を及ぼさない物質であれば、最後の精製工程において除去すればよいので大きな問題とはならない。しかしながら、悪影響を及ぼす発酵阻害物質であれば、糖化工程又は発酵工程の前工程で、各工程に悪影響を及ぼさないようにする必要性が生じる。

本明細書において、発酵阻害物質とは、発酵工程で発酵反応を妨害する物質のことである。代表的な発酵阻害物質としては、糖の過分解物、リグニン又はリグニン由来の芳香族化合物、接着剤又は塗料由来の化合物が挙げられる。この中で、接着剤・塗料などの人工的な薬品に由来する化合物は、それらの処理が施されていない自然由来のリグノセルロース系バイオマスを使用することにより、ある程度回避可能である。しかし、リグノセルロース系バイオマスを原料とする限り、糖の過分解物やリグニン由来の芳香族化合物の生成は回避することが困難である。ここで、発酵阻害物質がリグニンのような不溶性固体であり、セルロース、ヘミセルロース、単糖及びオリゴ糖のうち少なくともいずれかが可溶性である場合には、通常の固液分離によって除去することが可能な場合もある。しかしながら、発酵阻害物質も有用物も可溶性である場合には、通常の固液分離が適用できないため、後述の発酵阻害物質の濃度に応じた酵母の菌体濃度を決定し、植菌する方法が好ましく適用される。すなわち、本実施形態において、主に処理対象とする発酵阻害物質は、実質的にセルロース、ヘミセルロース、単糖及びオリゴ糖の少なくともいずれかの糖との混合溶液を形成しているものであり、通常の固液分離では分離できない、又は、分離し難い状態のものを指す。そのような発酵阻害物質としては、例えば、酢酸、ギ酸、レブリン酸、糖の過分解物であるフルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）、リグニン由来の芳香族化合物であるバニリン、アセトバニリン、グアヤコールなどが挙げられる。これら発酵阻害物質のうち、代表的な発酵阻害物質はフルフラール及び５−ＨＭＦである。

上記のフルフラール又は５−ＨＭＦによる酵母の発酵阻害の機構について、以下に説明する。フルフラール又は５−ＨＭＦは、酵母の解糖系やアルコール脱水素（ＡＤＨ）を阻害することが知られている（Ａｌｅｍｅｉｄａｅｔａｌ．，ＪＣｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８２：３２０−３４９（２００７）．参照）。さらに、図１は、酵母内でのフルフラールの無毒化の経路を示した概略図である。好気条件下では、酸素、水によりカルボン酸の一種である２−フロイック酸に変化し、さらにＡＴＰにより２−フロリル−ＣｏＡに変化することでＴＣＡ回路において活用される。一方、嫌気条件下でフルフラールを無毒化するためには、ＮＡＤＨが必要である（下記式［３］参照）。フルフラールはＮＡＤＨによりフルフリルアルコールに還元され、さらにフルフリルアルコールを細胞外に排出されることが知られている（Ｎｉｅｃｅｓｅｔａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，Ｆｅｂ（２０１５）．参照）。
そのため、酵母はＮＡＤＨを合成するために、グルコースから酢酸の合成が優先的になされ（下記式［４］参照）、グルコースからエタノールの合成が抑制される。

本発明者らは、上記の発酵阻害機構に着目し、発酵阻害物質の濃度に応じた酵母量を植菌することにより、本発明に至った。

≪工程（Ｍ）：決定工程≫
続いて、前記工程（Ａ）前の前記前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中、又は、前記工程（Ａ）で得られた糖化液中の発酵阻害物質の濃度を測定する。測定された発酵阻害物質の濃度に応じて、予め設定された基準値となるように、後述の工程（Ｂ）における酵母の菌体濃度を決定する。
発酵阻害物質の濃度の測定方法としては、例えば、糖化装置で糖化が開始される前、糖化中又は糖化後に、液を抜き取り、高速液体クロマトグラフ又はニトロフェニルヒドラジン及びアルカリ溶液を用いた呈色反応（発酵阻害物質がフルフラールである場合）等により発酵阻害物質を測定する方法や、ライン上で事前処理の条件等により発酵阻害物質の濃度を算出する方法等が挙げられる。

本実施形態の製造方法において、基準値は、次のようにして予め設定する。
まず、スモールスケールにて、事前処理条件の異なる前処理済リグノセルロース系バイオマスを調製する。事前処理条件については、上述したとおり、事前処理方法、温度、時間、使用する触媒の種類及び濃度等を変えたものを準備する。続いて、前処理済リグノセルロース系バイオマスそれぞれと酵素とを混合し、糖化を行う。続いて、得られた糖化液中の発酵阻害物質の濃度を測定する。発酵阻害物質の濃度に対して、後述の実施例２に示すように、酵母の植菌量を変えて糖化液に含まれる酵母の菌体濃度が変わるように添加し、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率まで得られるか否かを評価する。

目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率まで得られた場合、このときの酵母の菌体濃度は、発酵阻害物質の濃度に応じた発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値と判断できる。予め設定された基準値は、上記の臨界値以上の酵母の菌体濃度とすればよく、例えば上記の臨界値の１．０倍〜３．０倍、好ましくは上記の臨界値の１．０倍〜２．５倍、さらに好ましくは上記の臨界値の１．０倍〜１．５倍を予め設定された基準値とする。

本実施形態の製造方法において、より具体的な例として、発酵阻害物質がフルフラールである場合の、上記の臨界値とフルフラール濃度の関係について、以下に説明する。

［臨界値：酵母の菌体数を用いた濃度］
本実施形態の製造方法において、
上記の臨界値が酵母の菌体数を用いた濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）で表され、
フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、上記の臨界値がＹ（ＣＦＵ／ｍＬ）であるとき、Ｘ及びＹは下記数式［１］で表される関係である。

（数式[１]中、ａは、１．０×１０^７以上４．０×１０^７以下の数であり、ｂは、２．０×１０^６である。）

後述の実施例２のとおり、フルフラールの濃度Ｘ及び上記の臨界値Ｙは、線形関係で表すことができる。

数式[１]中、傾きａは、１．０×１０^７以上４．０×１０^７以下であることが好ましく、１．５×１０^７以上３．５×１０^７以下であることがより好ましく、２．０×１０^７以上３．０×１０^７以下であることがさらに好ましい。傾きａが上記範囲内であることにより、フルフラール存在下において、効率的に目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率で得ることができる。

数式[１]中、切片ｂは、２．０×１０^６以上であればよい。上記の値は、糖化液中にフルフラールが含まれない場合に、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率まで得るために、必要な酵母の菌体数の最低値である。

［臨界値：酵母の乾燥菌体重量を用いた濃度］
本実施形態の製造方法において、
上記の臨界値が酵母の乾燥菌体重量を用いた濃度（ｇ／Ｌ）で表され、
乾燥菌体１ｇ当たりに含まれる酵母の菌体数が１．５×１０^１０ＣＦＵであって、
フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、上記の臨界値がＹ’（ｇ／Ｌ）であるとき、Ｘ及びＹ’は下記数式［２］で表される関係である。

上記の臨界値は、酵母の乾燥菌体重量で表してもよい。酵母の乾燥菌体１ｇに含まれる酵母の菌体数は、酵母の種類により若干変動するが、通常、０．７５×１０^１０〜３．０×１０^１０ＣＦＵであって、１．５×１０^１０ＣＦＵであることが好ましい。

数式[２]中、傾きｃは、０．５以上２．５以下の数であることが好ましく、０．７５以上２．２５以下の数であることがより好ましく、１．０以上１．５以下の数であることがさらに好ましい。傾きｃが上記範囲内であることにより、フルフラール存在下において、効率的に目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率で得ることができる。

数式[２]中、切片ｄは、０．１３以上であればよい。上記の値は、糖化液中にフルフラールが含まれない場合に、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率まで得るために、必要な酵母の乾燥菌体重量の最低値である。

［臨界値：糖化液に対する使用する酵母を含む溶液の割合］
本実施形態の製造方法において、
上記の臨界値が糖化液に対する使用する酵母を含む溶液の割合で表され、
酵母を含む溶液中の酵母の菌体濃度が２．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬであって、
フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、上記の臨界値がＹ’ ’（ｇ／Ｌ）であるとき、Ｘ及びＹ’は下記数式［５］で表される関係である。

（数式[５]中、ｅは、４．５以上２０．０以下の数であり、ｆは、１．０である。）

上記の臨界値は、糖化液に対する使用する酵母を含む溶液の割合で表してもよい。酵母を含む溶液中の酵母の菌体濃度は、適宜調整してもかまわないが、通常、１×１０^８〜３×１０^８ＣＦＵ／ｍＬであって、２×１０^８ＣＦＵ／ｍＬであることが好ましい。

数式[５]中、傾きｅは、４．５以上２０．０以下の数であることが好ましく、５．０以上１５．０以下の数であることがより好ましく、７．５以上１０．０以下の数であることがさらに好ましい。傾きｅが上記範囲内であることにより、フルフラール存在下において、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率まで得ることができる。

数式[５]中、切片ｆは、１．０以上であればよい。上記の値は、糖化液中にフルフラールが含まれない場合に、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を目的の発酵収率まで得るために、必要な糖化液に対する使用する酵母を含む溶液の割合の最低値である。

≪工程（Ｂ）：発酵工程≫
続いて、上記の工程（Ａ）で得られた糖化液及び糖化残渣に、酵母を植菌し、発酵する。このとき、上記の工程（Ｍ）において決定された前記菌体濃度となるように酵母を植菌する。発酵温度は、２５℃〜５０℃が好ましく、２８℃〜３５℃がより好ましく、３２℃が特に好ましい。また、発酵時間は２４時間〜１２０時間が好ましく、２４時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜７２時間がさらに好ましい。

本実施形態の製造方法において、酵母としては、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成できるものであれば、特別な限定はない。植菌する酵母は、酵母を含む培養液をそのまま使用してもよく、又は、酵母を含む培養液を遠心分離により濃縮したもの、乾燥状態のもの等を適宜使用してよい。また、酵母の状態に合わせて、上記の臨界値と発酵阻害物質の関係から、植菌する量を算出すればよい。

工程（Ｂ）後の工程については、発酵液の活用方法によって、適宜選択できる。例えば、エタノールを得ることを目的とした場合は、発酵液を精製する工程として蒸留工程を設けることができる。

本実施形態において、リグノセルロース系バイオマス由来化合物とは、リグノセルロース系バイオマスを分解して得られた単糖及びオリゴ糖を、酵母が摂取することにより生成された化合物を意味する。例えば、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、乳酸など有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのジアミン化合物などが挙げられる。発酵によって得られた化合物が乳酸などのモノマーである場合は、重合によりポリマーに変換することもある。

＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置＞
図２は、本実施形態におけるリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置１０は、糖化装置１と発酵槽３との間に配管２が配設されている。
さらに、糖化装置１に、糖化液を一部抜き出すための配管４が配設されていてもよい。また、発酵槽３には、配管６を介して酵母を供給するための酵母供給槽５が配設されていてもよい。
また、図２において、糖化装置１と発酵槽３が別々に配設された態様を例示しているが、同時に糖化反応及び発酵反応を行う１つの糖化発酵槽としてもよい。

糖化装置１は、前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化を行うための装置であり、特別な限定はない。例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などを挙げることができる。
配管４は、糖化装置１から糖化液を一部抜き出し、糖化液中の発酵阻害物質の濃度を測定するための配管であって、特別な限定はない。また、糖化前或いは糖化発酵前の前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中の発酵阻害物質の濃度を測定する場合、又は、事前処理の条件等から含まれる発酵阻害物質の濃度が算出できる場合には、配管４を備えていなくてもよい。

本実施形態の製造装置において、糖化前或いは糖化発酵前の前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中の発酵阻害物質の濃度を測定する場合において、糖化装置へ前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液を送液する配管に液を一部抜き出すための配管を備えていてもよい。これにより、発酵阻害物質の濃度を測定することができる。

配管２は、糖化装置１において得られた糖化液及び糖化残渣を発酵槽３へ送役するための配管であって、特別な限定はない。

発酵槽３は、糖化装置１で得られた糖化液及び糖化残渣に、酵母を植菌し、発酵するための槽であって、特別な限定はない。例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などを挙げることができる。
酵母供給槽５は、発酵槽３へ酵母を供給するための槽であって、特別な限定はない。また、乾燥状態の酵母を発酵槽３へ直接植菌する場合には、酵母供給槽５を備えていなくてもよい。

さらに、糖化装置１の前に、リグノセルロース系バイオマスを事前処理するための事前処理装置を有していてもよい。事前処理装置は、特に限定はなく、例えば、耐酸性又は耐アルカリ性を有する加熱圧力装置、若しくは、耐酸性又は耐アルカリ性を有する容器をオートグレーブのような加熱圧力装置に入れて処理する形態などが挙げられる。
また、発酵槽３の後に続く設備は、発酵液の用途に応じて、適宜選択することができる。

以下、具体的実施例により、本発明についてより詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

［実施例１］
（１）糖化工程
酵素の基質として前処理済リグノセルロース系バイオマス１０ｇ−ｄｒｙを使用して、水と、ｐＨ調整剤としてＮａＯＨ０．０４〜０．２ｇとを加え、前処理済バイオマス濃度が１０％質量％となるように希釈し、基質溶液を調製した（全量１００ｇ）。基質溶液にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ由来酵素を投入した。５０℃で４８時間振盪撹拌した。糖化工程開始直後、２４時間後、４８時間後にサンプルを１．０ｇずつ採取し、高速液体クロマトグラフ（島津製作所製ＬＣ−２０ＡＤ）を用いてフルフラール濃度及びエタノール濃度を測定した。また、糖化工程開始直後、２４時間後、４８時間後にサンプルを１．０ｇずつ採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、ＨＰＬＣ還元糖システム）およびＡｓａｈｉｐａｋＭＨ２ｐ−５０４Ｅカラム（ｓｈｏｄｅｘ社製）を用いて、グルコース濃度及びキシロース濃度を測定した。

（２）発酵工程
（１）で得られた糖化液に、酵母（トヨタ自動車製「サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｃｅｒｅｖｉｖｉａｅ）」）を糖化液に対して、１質量％、４．５質量％、１０質量％、２０質量％となるように添加し、３２℃で４８時間振盪撹拌した。なお、酵母は培養液の状態で添加した。培養液中の含まれる酵母の菌体数は２×１０^８ＣＦＵ／ｍＬであった。発酵工程開始から２４時間後、４８時間後にサンプルを１．０ｇずつ採取し、高速液体クロマトグラフ（島津製作所製ＬＣ−２０ＡＤ）を用いてフルフラール濃度及びエタノール濃度を測定した。また、発酵工程開始から２４時間後、４８時間後にサンプルを１．０ｇずつ採取し、高速液体クロマトグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、ＨＰＬＣ還元糖システム）およびＡｓａｈｉｐａｋＭＨ２ｐ−５０４Ｅカラム（ｓｈｏｄｅｘ社製）を用いて、グルコース濃度及びキシロース濃度を測定した。

（３）結果
糖化工程及び発酵工程でのグルコース濃度、キシロース濃度、フルフラール濃度及びエタノール濃度の変化を図３に示した。図３から、糖化液に対する使用する酵母を含む溶液の割合が２０％である場合では、フルフラール濃度が約１．３ｇ／Ｌであっても、安定的に発酵し、エタノールが得られることが明らかとなった。

［実施例２］
（１）糖化液の調製
あらかじめ、含まれるフルフラール濃度を０ｇ／Ｌ、０．４４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．５４ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．６２ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．１５ｇ／Ｌ、１．１９ｇ／Ｌ、１．３７ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌとなるように調製した糖化液を準備した。

（２）発酵工程
（１）で得られた糖化液それぞれに、酵母（トヨタ自動車製「サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｃｅｒｅｖｉｖｉａｅ）」）を糖化液に対して、１質量％、４．５質量％、１０質量％、２０質量％となるようにそれぞれ添加し、３２℃で４８時間振盪撹拌した。なお、酵母は培養液の状態で添加した。培養液中の含まれる酵母の菌体数は２×１０^８ＣＦＵ／ｍＬであった。実施例１の（２）と同様の方法により、フルフラール濃度及びエタノール濃度を測定した。

（３）結果
発酵工程での発酵収率とフルフラール濃度の関係を図４に示した。図４から、フルフラール濃度が０．５４ｇ／Ｌである場合、発酵阻害物質の濃度に応じた発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値は４．５％であり、フルフラール濃度が０．９８ｇ／Ｌである場合、上記の臨界値は１０％であり、フルフラール濃度が１．３７ｇ／Ｌである場合、上記の臨界値は２０％であった。

さらに、図５は、（Ａ）は上記の臨界値とフルフラール濃度の関係を示すグラフであり、（Ｂ）は酵母の菌体数に置き換えた上記の臨界値とフルフラール濃度の関係を示すグラフであり、（Ｃ）は酵母の乾燥重量に置き換えた上記の臨界値とフルフラール濃度の関係を示すグラフである。また、グラフは、臨界値０％、４．５％、１０％の３点を使用し、近似値としての線形関数のグラフを作成した。

以上のことから、糖化液に対する使用する酵母を含む溶液の割合（質量％）、酵母の菌体数（ＣＦＵ／ｍＬ）及び酵母の乾燥重量（ｇ／Ｌ）のうちいずれを使用しても上記の臨界値を表すことができる。
また、実際の臨界値とフルフラール濃度の関係は曲線のグラフであることから、誤差を鑑みて、図５のそれぞれの線形グラフの傾きが０．５倍〜２倍、好ましくは０．７５倍〜１．５倍であれば、発酵阻害物質の濃度に応じた発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値の範囲内であると考えられる。

本発明によれば、発酵阻害物質の存在下において、安定的且つ効率的にリグノセルロース系バイオマス由来化合物の収率を向上させることができる。

１…糖化装置、２，４，６…配管、３…発酵槽、５…酵母供給槽、１０…リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置。

Claims

エタノールの製造方法であって、
（Ａ）前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた糖化液及び糖化残渣に、酵母を植菌し、発酵する工程と、を備え、
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、
前記工程（Ａ）の前、又は、工程（Ａ）の後であって、工程（Ｂ）の前に、
（Ｍ）前記工程（Ａ）前の前記前処理済リグノセルロース系バイオマスを含む液中、又は、前記工程（Ａ）で得られた糖化液中のフルフラールの濃度に応じて、予め設定された基準値となるように、前記工程（Ｂ）における酵母の菌体濃度を決定する工程を備え、
前記予め設定された基準値が、フルフラールの濃度に応じた発酵阻害を受けない酵母の菌体濃度の臨界値以上の酵母の菌体濃度であって、
前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ｍ）において決定された前記菌体濃度となるように酵母を植菌することを特徴とする製造方法。
前記予め設定された基準値が、前記臨界値の１．０〜３．０倍である請求項１に記載のエタノールの製造方法。
前記臨界値が酵母の菌体数を用いた濃度（ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）／ｍＬ）で表され、
前記フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、前記臨界値がＹ（ＣＦＵ／ｍＬ）であるとき、前記Ｘ及び前記Ｙは下記数式［１］で表される関係である請求項１又は２に記載のエタノールの製造方法。

（数式[１]中、ａは、１．０×１０^７以上４．０×１０^７以下の数であり、ｂは、２．０×１０^６である。）
前記臨界値が酵母の乾燥菌体重量を用いた濃度（ｇ／Ｌ）で表され、
乾燥菌体１ｇ当たりに含まれる酵母の菌体数が１．５×１０^１０ＣＦＵであって、
前記フルフラールの濃度がＸ（ｇ／Ｌ）、前記臨界値がＹ’（ｇ／Ｌ）であるとき、前記Ｘ及び前記Ｙ’は下記数式［２］で表される関係である請求項１又は２に記載のエタノールの製造方法。

（数式[２]中、ｃは、０．５以上２．５以下の数であり、ｄは、０．１３である。）