CN107400673B - 一种集胞藻pcc6803的突变株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803突变株及其应用。乙醇耐受相关基因为slr0599，其碱基序列为SEQ ID No.7所示。突变株为PCC 6803△slr0599已于2017年8月4日保存在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC14333，分类学命名集胞藻Synechocystis sp.。本发明集胞藻突变株为耐受乙醇突变株，在1.5％(v/v)的乙醇胁迫下，该藻株的生长状态明显优于野生型藻株。本发明得到的乙醇耐受性藻株对利用集胞藻生产生物燃料乙醇具有重要的应用价值和借鉴意义，应用前景广泛。

Description

一种集胞藻PCC6803的突变株及其应用
技术领域
本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803突变株及其应用。
背景技术
随着传统能源日益枯竭等问题的出现，生物能源越来越受到人们的广泛关注。生物乙醇是一种优秀的可再生能源，具有污染小，价格低廉等特点，具有广阔的开发前景。目前，乙醇的生产基本直接以农作物为原料，随着乙醇产量、用量的不断增加，其消耗的农作物也越来越多，这将加剧世界粮食和土地资源短缺，进而引发一系列经济和伦理道德问题。其次，耕种粮食农作物并用于生产生物燃料的过程需要大量的水资源、肥料和农作物杀虫剂，这将加重环境的负担。
因此人们开始将目光聚焦到光合微藻上，利用其来生产生物能源乙醇。尤其是通过各种合成生物学手段将蓝藻改造成一个“自养微生物工厂”成为研究热点。将蓝藻作为细胞工厂生产乙醇，具有极大的优势，通过蓝藻来生产生物燃料，将太阳能和二氧化碳通过光合作用转化为生物能源，这样既环保又减少能源消耗；同时蓝藻具有光合作用效率高、生长周期短、资源依赖性低、不与粮食作物争夺生存空间、单位面积产量大等优点，有利于解决生物液体燃料发展所面临的资源问题。因此利用蓝藻作为底盘，生产乙醇具有很大的开发空间。
但是，如今利用蓝藻构建细胞工厂生产乙醇也存在一些问题。由于乙醇对于蓝藻具有较高的毒性，会抑制蓝藻的生长，导致其生物量下降，最终导致乙醇产量低。由此可见，蓝藻对乙醇的耐受性较低是影响利用蓝藻做底盘限制乙醇产量的关键因素。因此如何提高光合蓝细菌对乙醇的耐受性成了当前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803突变株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种乙醇耐受性限制基因，乙醇耐受性限制基因为slr0599，其碱基序列为SEQ IDNo.7所示。
所述基因为与SEQ ID No.7具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。
一种乙醇耐受性限制基因的应用，所述序列SEQ ID No.7所示的碱基序列slr0599在作为负调控乙醇的耐受性基因的应用。
一种集胞藻PCC6803的突变株，突变株为PCC 6803 △slr0599以于2017年8月4日保存在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC14333，分类学命名集胞藻Synechocystis sp.
所述集胞藻突变株是由野生型集胞藻PCC6803通过基因敲除slr0599基因，并通过抗生素卡那霉素筛选所得。
一种集胞藻PCC6803的突变株的应用，所述突变株作为对乙醇胁迫的耐受性的工程菌株中的应用。
一种集胞藻PCC6803的突变株的应用，所述突变株在生产生物燃料乙醇中的应用。
本发明所具有的优点：本发明利用同源重组技术敲除slr0599基因，得到集胞藻突变株，其在1.5％乙醇(v/v)的颜色、色素峰及相对含量均与正常生长条件下的野生株和突变株无显著性差异，明显优于该条件下野生株的颜色和色素相对含量，其生长状态优于该条件下野生株的生长状态，说明该突变株对乙醇的耐受性显著提高。
附图说明
图1是本发明实施例提供的集胞藻PCC6803野生型WT和突变株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的全细胞吸收图；WT代表野生株，△slr0599代表突变株，E代表添加乙醇
图2是本发明实施例提供的集胞藻PCC6803野生型WT和突变株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的藻液的颜色，图中藻为生长曲线中第4天的状态。
具体实施方式
以下结合实施例为本发明作进一步描述。
实施例1
PCC 6803△slr0599突变株的构建：
1)目的基因的体外扩增
基因敲除是通过同源重组实现的，本发明中用卡那霉素抗性基因替换slr0599基因，用slr0599上、下游基因片段做上下游同源臂用于同源重组。
采用CTAB法提取集胞藻6803基因组作为模板，SEQ ID No.1、SEQ ID No.2分别为抗性基因的上、下游引物；SEQ ID No.3、SEQ ID No.4分别为待敲除基因slr0599上游片段的上、下游引物；SEQ ID No.5、SEQ ID No.6分别为待敲除基因slr0599下游片段的上、下游引物，进行PCR扩增，得到卡那抗性基因，待敲除基因slr0599上游片段slr0599-up，下游片段slr0599-down，序列分别如SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10所示；以SEQ IDNo.3、SEQ ID No.6所示序列为上、下游引物，以上游片段slr0599-up、卡那霉素抗性片段、下游片段slr0599-down为模板进行融合PCR，得到目的基因片段。
反应体系如下:
Figure BDA0001418869660000031
将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：94℃2min 30s；94℃30s，58℃30s，68℃30s，共30个循环，68℃5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得待敲除基因△slr0599的上,下游片段及卡那抗性片段。
以SEQ ID No.3、SEQ ID No.6所示序列为上、下游引物，以上游片段slr0599-up、卡那抗性片段、下游片段slr0599-down为模板进行融合PCR，步骤为：各取上游片段、下游片段、卡那霉素抗性片段各1μL为模板，10xKOD buffer 2μL、dNTP(2mM each)2μL、Mg2SO4(25mM)0.8μL、SEQ ID No.3(10uM)1μL、SEQ ID No.6(10uM)1μL、KOD plus 0.5μL、H2O 9.7μL,在PCR管中混匀。将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：94℃2min 30s；94℃30s，58℃30s，68℃30s，共30个循环，68℃10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的基因片段(上游片段、卡那霉素抗性片段、下游片段融合PCR产物)；
2)同源重组载体的构建
将上述得到目的片段和载体pUC18分别进行酶切,反应体如下:
Figure BDA0001418869660000032
补H20到30μL，37℃反应1h，琼脂糖凝胶电泳回收，之后将载体和目的片段进行连接。
反应体系为
Figure BDA0001418869660000033
室温连接1h后进行转化，取10μL连接液加入100μL DH5α,冰浴30min,42℃热激1min,立即放回冰上静置2min，将上述混合物加入到800mL LB培养液中，37℃振荡复苏30min。取200μL菌液涂布于含有氨苄和卡那霉素的固体培养基上，37℃过夜。挑取平板上单菌落，放入加有抗生素的LB液体培养基中37℃振荡培养，待生长好后测序检验。
3)目的片段的转化
无菌条件下，挑取集胞藻PCC6803单藻落接种于液体BG11培养基中接种集胞藻6803菌液于液体培养基BG11中，放置于光照培养箱中培养，温度为30℃，光照强度为50μE·m-2·s-1，转速为150rpm，生长过程中用紫外分光光度计测藻液OD730，待其生长至对数期(OD730＝0.6-0.8)，取藻液10ml，4500g离心6min，去上清。加新鲜BG11悬浮藻细胞，使藻细胞OD730值为2.5左右。加入含目的片段的质粒10μg，低光照温育。6h后在含有卡那霉素抗生素抗性(50ng/μn)的BG11固体培养基上进行涂布筛选，在光照培养箱中培养，待阳性转化子长出后，提高平板上的抗生素浓度，进行传代培养，最终获得完全基因敲除的集胞藻6803突变株△slr0599。之后进行PCR和测序检测。
上述完全基因敲除的PCC6803 △slr0599突变株以于2017年8月4日保存在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC14333，分类学命名集胞藻Synechocystis sp.。
所述液体培养基BG11：NaNO31.5g，K2HPO43H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，EDTA0.001g，Na2CO30.02g，H3BO32.86g，MnCl2·nC2O 1.81g，ZnSO4·nS2O 0.222g，NaMoO4·Na2O0.390g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·Co2O 0.0494g，CaCl2·Ca2O 0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1L。
所述固体培养基BG11在上述基础上加入15g琼脂粉，3g硫代硫酸钠，1mL500mM葡萄糖，1mL 8MTES(pH＝8.0)。
SEQ ID No.1:TGCTCTGAGGCGGAAAGAAC
SEQ ID No.2:ATCCTCAGAAGAACTCGTCA
SEQ ID No.3:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCCCTTTCTCTGCCATGGTG
SEQ ID No.4:GTTCTTTCCGCCTCAGAGCAATGCCCTATGCTCCTA
SEQ ID No.5:TGACGAGTTCTTCTGAGGATTTATACTAAGAATAGA
SEQ ID No.6:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCACCTGGTTTAAACCTTTTTTC
SEQ ID No.7:
ATGGTTACCCCACTCAAACTACTCAACAATCGCTACAGAATTATTGAAACCCTGGGCAGGGGAGGATTTG
GGGAAACTTTTTTGGCCCAGGACACCCACATGCCCTCCGCCCGGAAATGTGTGATCAAGCACCTCAAACC
AGTGCTGGAAAATCCAGAAATTCCCTCATGGTTGCGGGAAAGATTCCATCGGGAGGCGGCCACCCTAGAG
GAGTTGGGGGAGAACCATCCCCAGATTCCCCAACTGTATGCCTATTTCAGTGAAGGGGAAGATTTTTACC
TGGTGCAGGAGTGGATTCCTGGGCTGACCCTCACCCAAGCCCACGCCCAAAAGGGTAATTTTTCCAGTAC
AGCGGTGGAGGAATTATTGCTGGGGATTTTGCCTGTGTTGGAGTTTATCCATCAACGGCGCATTATCCAC
CGGGACATTAAGCCCGACAATATTATCCTGCGGGAAGCTGATGGTAAGCCTATTCTGATTGATTTCGGCA
TCATCAAAGAAACCATGGGCACGTTGGTTAATCCCGATGGCCGTAGTGCCTATTCTGTGGCGTTGGGTAC
CCCCGGTTACATGGCTTCGGAGCAAGCCGCTGGACGGCCAGTTTTTTCCAGCGATCTGTACAGTTTGGGA
CTAACGGCTATTTTTTTGCTCACCGGTAAAACCCCCCAATATCTAACCAGTGACAGCCGCACCGGAGAAA
TCCTTTGGCGACAGGGGGCTCCCCAAGTCAGTCCTACCCTAGCTAAGGTCATAGACCAAGCAGTGCGCTA
CCATCCCCGGGAAAGATTTAATTCCGCCACTGCCATGGCCCAGACCCTCCAGGGCAATTTCAGCAATGTG
CCCATGACCAAAGGCGATCGCCCGGGAAACACCGTTGCTAATGGCAAGACCAAATCTAATCACCAACCTA
CGGCCCCAACCCTAGTGGTGGGCACTCCCTACAACGCCAACGACACCCAAGCCACCAAGGTTTACACTCA
AGAGTTTACCGGATACACCGAAACCCAGGAGGGTTCACCATTGATGAAATGGGTTGTTATGCCCCTTGTC
GTACTGCTAGTGATTGGCGGCGGCATGGCGGCGGGATTTTGGGTTACCAGTCAACGGCGCAATAATCCTC
CCCCAGCGGTGGAAGAACCCACAGAGGAAACGCCCATTCCCCTGCCCTCCCTGGAGCCTAGACCCAATTT
ATTTGAAACTCCTAGCCCTATTCCCACTCCAGCAACCCCTAGCCCGGAACCCACCCCCAGCCCCAGTCCC
AGCCCGGAAACCACCTCTAGTCCAACAGAGGATACGATCACTCCCATGGAGCCGGAACCCAGTTTGGACG
AACCTGCCCCTATTCCTGAACCTAAACCCAGTCCATCCCCCACCATCAGTCCTCAACCATCACCCACTAT
TTCCATTCCTGTTACCCCAGCCCCTGTACCAAAACCTAGTCCTTCTCCCACCCCCAAGCCCACTGTTCCT
CCCCAGATTTCCCCTACTCCCCAGCCCAGCAATACGGTGCCTGTGATCCCACCACCGGAAAATCCCAGTG
CCGAGACTGAGCCCAATCTGCCGGCTCCCCCAGTAGGGGAAAAGCCCATCGACCCCGAGCAAAATTAG
SEQ ID No.8:
CTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC
ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA
SEQ ID No.9:
TCCCTTTCTCTGCCATGGTGATGGGCAAGGGCGACGTAATAGGGGGAGAAATCTAGCCCAGTTAATTTTGCTTCTGGGTAGCAGGCTTGCAAGGTAAAGCTACTCAAGCCCACGGTGCAATGTAAGTCCAGGATGGTTTGGGGCGCTTGGGGCAATTGAGCTAACAAAACATCGTGGTAACTACGTCGTAACTCGGCATCCCCTTGGGCCCCTGCTTCTGGGTAAAGGCTCGAATGGACAGCGTTGGCCGCCACTTCAAATTCAAAGGCTGCGTCCCAACACATGTGCCCCTGGTCATAGCCGTGGAAGGAGGCGTTGTAATAATCGGGATAGGTTAACTCTTCATCCACCACCGATCGCCAATGGCTTTGCCAGTCCTGCTGTTGATAATTTTTTACTGTTTCCCGCCAGGGGATCCCCAATCTTTCTGCCCGTTTGATCATCATGGAGCGGGCTTGCCATTTGGCCACGTTCCACAGGGGCTTGACGGCCAATAAACCATTGACGACCTGGCTCATGGCGGTGGGGGCAGGGGTGGCGGTGCTGACAGTCATGGAATGCTTTAATGGGACTAGGGAAAATTGTCGCTGAAAAATCCAAACCTGTCTAGGCATGGGTATCAAGCGGCGATCGCCTGGGGCAATTTCGGTGTTGAACCATGACCGGTAAACAGTTACACCAGTTGATTGTGGATAAATGGGGTTATTCTTTCGATGTGCAATTGCGACGCATCAAAGACCGCATTTTTCTACAGATTATGTGGCGGTACCTAGAACAGGCTTCCTTTCCCCTCTCGGAAGAGGATTATTTCGCTAATCTAGAGGCGATCGCCCAGTATCTCCAGGCCTGGGGAGGGGGGGAGCAGGTGCAACAGTTCATTGCCCAAACCAAAGAAAAACCCCGCCTAGGCAAAGCAGTTAGTATTCCCCTGGAACTTGGGGCCAGGGCCGCAGAATGGTTTATTTGAAAGCTGGACAAGCTAGGAGCATAGGGCATTGCTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC
SEQ ID No.10:
GGATTTATACTAAGAATAGAAACTTTGGATGAGCTAAAACCTAGCTCCGTATTTATTTGTCCATTTAGTTCTGTCATTAGTTAACCAATATTAAGCCGAGGAGAGGCCCCGTGAAATTATCCAGCAAAAATTTAGATGCCCGTCTCGACACGGTTTACGATGCCATCGTTTTAGGGGGAGGCATGGGGGGTTTGTCCGCCGCCATCTATTTAGCCCGCTATGGACTGAAATGTCTGGTGGTGGAAAAAGGGCGGGGCCGATCCTTCTGGATGCAGGATTTACGCAACTATGTGGGGCTAGATCCCGATACACCGGGGCGGGACATCATCACCCACAGCACCCAACAGGCTCTCCATTGGGGCGCAGATTTGTTGCGGGGTTATGTGGAAGATGTAACCGATGAGGGAGATACCCTTGCCGTGAAGGTGAAAGTGGGTAAGAAAGATAGTCTTTATCCGATTTTTCGGACTAAATATGTCATCGCCGCCACGGGCATTATCGACAATCTACCCCAGTTGGAGGATATGCAAAATGTTTATGACTATGCCGGTTACACTCTGCACGTTTGCATGATTTGTGACGGGTTTGATATGTGGGATCAAAAGGCTGTGTTGATTGCGGGCACCGAAGGACAAATTAATGCTGCCTTTGTTTTGAATTGGTTTACGCCCTACATTACTGTTTTGACCCATGGGCTTTGCACTGTCGGTGATGAAATGAAAGCTAAGTTAGCAGACCACGGTTATCCTCTCCACGAAGCGGCGATCACCAAATTTTTGGGAGAAGACCACAAAATGAGTGGGGTGGAATTGGTAGATGGCACTGTGGTGGAAGCCACAACGGGTTTGATCAACATGGGTTCTGTGTACCATAACCATTACCTCAAGGGCATTGAAGGTTTGGAATGGGACGGGGAAAATTTGGTCACCAATGACATGGCCCAAACCAGCCATCCCCGGATCTTTGCCCTGGGAGATTTGAAAAAAGGTTTAAACCAGGT
实施例2
PCC 6803 △slr0599突变株在乙醇胁迫下的生长状态分析
测定集胞藻PCC6803野生型和实施例1中得到的突变藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的全细胞吸收光谱：将上述两种生长至对数期的藻分别作为种子液，分别接种至含有50mLBG11培养基的250mL锥形瓶中，每瓶藻的起始OD730＝0.1。连续培养4天培养条件为30℃，150rpm，50μE·m-2·s-1连续光照。开始培养时，在野生株和突变株的培养基中分别加入乙醇，至终浓度为1.5％(v/v)，每24小时测一次全细胞吸收。实验组和对照组各三个平行。
取3mL生长曲线测定中培养至第4天的藻液，用普析Tu-1810紫外分光光度计进行波长扫描，扫描范围为400～800nm，扫描速度为快速。
测量前，先用BG11培养基进行基线校正。以波长为横坐标，以对应的OD值为纵坐标作图绘制全细胞吸收光谱图。各样品的全细胞吸收光谱图以730nm处的OD值进行归一化处理(参见图1)。
由图1可见集胞藻PCC6803野生型和PCC 6803△slr0599突变株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的全细胞吸收光谱图中WT代表野生型，slr0599代表突变株，E代表乙醇。在乙醇胁迫下野生株的叶绿素(675nm)、藻蓝蛋白(525nm)、类胡萝卜素(495nm)峰显著低于正常培养条件下野生株的峰，而乙醇胁迫下的突变株的色素峰的与正常培养条件下的突变株及野生株无明显差别，说明乙醇对突变株的光合作用的影响比野生型小。
同时在图2中藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下藻液的颜色，图中藻为第4天的状态，乙醇胁迫的野生藻株颜色乙醇胁迫的突变株差别较大，其颜色更浅。
综合图1、图2数据可以说明，突变株对乙醇胁迫的耐受性明显优于野生型。
本发明得到的PCC 6803 △slr0599突变株可以耐受1.5％的乙醇，相比野生藻株，该藻株对乙醇的耐受性明显提高。若将该藻株用于生产生物燃料乙醇，将改善蓝藻对于乙醇的耐受性低而导致的乙醇产量下降的问题，突破利用蓝藻做底盘生产乙醇的关键限制因素。由此可见，将该突变株应用于乙醇生产中具有一定的发展潜力。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 一种集胞藻 PCC6803的突变株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1606)
<400> 1
atggttaccc cactcaaact actcaacaat cgctacagaa ttattgaaac cctgggcagg 60
ggaggatttg gggaaacttt tttggcccag gacacccaca tgccctccgc ccggaaatgt 120
gtgatcaagc acctcaaacc agtgctggaa aatccagaaa ttccctcatg gttgcgggaa 180
agattccatc gggaggcggc caccctagag gagttggggg agaaccatcc ccagattccc 240
caactgtatg cctatttcag tgaaggggaa gatttttacc tggtgcagga gtggattcct 300
gggctgaccc tcacccaagc ccacgcccaa aagggtaatt tttccagtac agcggtggag 360
gaattattgc tggggatttt gcctgtgttg gagtttatcc atcaacggcg cattatccac 420
cgggacatta agcccgacaa tattatcctg cgggaagctg atggtaagcc tattctgatt 480
gatttcggca tcatcaaaga aaccatgggc acgttggtta atcccgatgg ccgtagtgcc 540
tattctgtgg cgttgggtac ccccggttac atggcttcgg agcaagccgc tggacggcca 600
gttttttcca gcgatctgta cagtttggga ctaacggcta tttttttgct caccggtaaa 660
accccccaat atctaaccag tgacagccgc accggagaaa tcctttggcg acagggggct 720
ccccaagtca gtcctaccct agctaaggtc atagaccaag cagtgcgcta ccatccccgg 780
gaaagattta attccgccac tgccatggcc cagaccctcc agggcaattt cagcaatgtg 840
cccatgacca aaggcgatcg cccgggaaac accgttgcta atggcaagac caaatctaat 900
caccaaccta cggccccaac cctagtggtg ggcactccct acaacgccaa cgacacccaa 960
gccaccaagg tttacactca agagtttacc ggatacaccg aaacccagga gggttcacca 1020
ttgatgaaat gggttgttat gccccttgtc gtactgctag tgattggcgg cggcatggcg 1080
gcgggatttt gggttaccag tcaacggcgc aataatcctc ccccagcggt ggaagaaccc 1140
acagaggaaa cgcccattcc cctgccctcc ctggagccta gacccaattt atttgaaact 1200
cctagcccta ttcccactcc agcaacccct agcccggaac ccacccccag ccccagtccc 1260
agcccggaaa ccacctctag tccaacagag gatacgatca ctcccatgga gccggaaccc 1320
agtttggacg aacctgcccc tattcctgaa cctaaaccca gtccatcccc caccatcagt 1380
cctcaaccat cacccactat ttccattcct gttaccccag cccctgtacc aaaacctagt 1440
ccttctccca cccccaagcc cactgttcct ccccagattt cccctactcc ccagcccagc 1500
aatacggtgc ctgtgatccc accaccggaa aatcccagtg ccgagactga gcccaatctg 1560
ccggctcccc cagtagggga aaagcccatc gaccccgagc aaaattag 1608

Claims (1)

1.一种集胞藻 PCC6803的突变株的应用，其特征在于：突变株作为对乙醇胁迫的耐受性的工程菌株中的应用；
突变株为PCC 6803 △slr0599已 于2017年8月4日保存在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC14333，分类学命名集胞藻Synechocystis sp.；
所述集胞藻突变株是由野生型集胞藻PCC6803 通过敲除slr0599基因，并通过抗生素卡那霉素筛选所得；
slr0599基因碱基序列为SEQ ID No.7所示。
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