CN104293803A - 一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982及用途 - Google Patents

一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982及用途 Download PDF

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陈磊
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Abstract

本发明公开了一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982及用途，该基因是用SEQ ID No.5所示。该基因的用途是通过用所述基因构建工程菌发酵产乙醇。本发明通过构建集胞藻6803突变株△slr0982鉴定出一种与乙醇耐受相关的基因，这对提高微生物乙醇耐受性具有重要的理论及实际意义，将在微生物发酵中发挥重要作用，应用前景广泛。

Description

一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982及用途
技术领域
本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982及用途。
背景技术
随着传统能源日益枯竭、温室效应逐渐严重、环境不断恶化等问题的出现，生物能源因其绿色环保可持续等特点越来越受到人们的广泛关注，开发利用可替代的新能源迫在眉睫。生物乙醇作为可再生能源，具有污染性小，容易运输和贮藏的特点，在价格上也可与汽油相竞争，它是最有可能取代石油的新能源，同时在一定程度上可缓解能源危机，具有巨大的发展前景。
目前生物乙醇的产量还相对较小，工业大规模生产还有一定差距，其中一个限制因素就是菌株的乙醇耐受性较低。集胞藻6803作为一种光合蓝藻，广泛应用于微生物发酵过程中。因此，利用集胞藻6803研究乙醇耐受性，对提高生物乙醇产量具有重大意义，为缓解能源危机提供了广泛前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982。
本发明的第二个目的是提供一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982，用SEQ ID No.5所示。
一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982的用途，通过用所述基因构建工程菌发酵产乙醇的用途。
集胞藻6803中Slr0982的编码基因，既可以是所述基因的cDNA序列，也可以是所述基因的基因组DNA序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。
本发明通过构建集胞藻6803突变株△slr0982鉴定出一种与乙醇耐受相关的基因，这对提高微生物乙醇耐受性具有重要的理论及实际意义，将在微生物发酵中发挥重要作用，应用前景广泛。
附图说明
图1为集胞藻6803的野生型WT与突变株△slr0982在正常培养基和含乙醇1.5％(v/v)培养基的生长曲线。
图2为集胞藻6803的野生型WT与突变株△slr0982在正常培养基和含乙醇1.8％(v/v)培养基的生长曲线。
最佳实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
集胞藻6803突变株△slr0982的构建：
(1)目的基因的体外扩增：
基因敲除是通过同源双交换实现的，在敲除基因的同时引入氯霉素抗性基因，抗性基因两侧是待敲除基因的上游和下游片段。采用细菌基因组提取试剂盒提取集胞藻6803基因组作为模板,SEQ ID No.1、SEQ ID No.2分别为待敲除基因△slr0982的上游的上、下游引物；SEQID No.3、SEQ ID No.4分别为待敲除基因△slr0982的下游的上、下游引物；进行PCR扩增，得到待敲除基因△slr0982的上游片段和下游片段；以SEQ ID No.1、SEQ ID No.4所示序列为上、下游引物，以上游片段、氯霉素抗性片段、下游片段为模板进行融合PCR。
步骤为：取集胞藻6803基因组溶液10ng，5×Phusion HF buffer4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM SEQ ID No.1 1μl、10μM SEQ ID No.2 1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，72℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，4℃ 5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得待敲除基因△slr0982的上游片段；
取集胞藻6803基因组溶液10ng，5×Phusion HF buffer 4μl，10μM的dNTP0.4μl，10μM SEQ ID No.3 1μl、10μM SEQ ID No.4 1μl，Phusion酶0.2μl，无菌水12.4μl，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，72℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，4℃ 5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得待敲除基因△slr0982的下游片段；
以SEQ ID No.1、SEQ ID No.4所示序列为上、下游引物，以上游片段、氯霉素抗性片段(Cm片段)、下游片段为模板进行融合PCR，步骤为：各取上游片段、下游片段、Cm片段各10ng为模板，5×Phusion HF buffer 4μl，10μM的dNTP0.4μl，Phusion酶0.2μl，无菌水10.4μl，以10μM SEQ ID No.1 1μl、10μM SEQ ID No.41μl,在PCR管中混匀。将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，72℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，4℃ 5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、氯霉素抗性片段、下游片段融合PCR产物)；
(2)目的片段的转化
无菌条件下，接种集胞藻6803菌液于液体培养基BG11中，放置于光照培养箱中培养，温度为30℃，光照强度为2000Lux，转速为130rpm,UV-1750分光光度计测其藻密度，待藻液OD730nm值长到0.4-0.6时，取藻液1.5ml，3000g离心5min,去上清。将藻细胞收集后，加入200μl液体培养基BG11将藻细胞打散，使藻细胞OD730nm值为2.5-3.0左右。加入目的片段500ng，在恒温混匀器中30℃暗转化，6h后在含有抗性氯霉素(10ng/μl)的固体培养基BG11上进行涂布，在光照培养箱中培养，待10天左右阳性转化子长出后传代培养，获得纯净的集胞藻6803突变株△slr0982。
所述液体培养基BG11：NaNO31.5g，K2HPO4.3H2O0.04g，MgSO4·7H2O0.075g，EDTA0.001g，Na2CO30.02g，H3BO32.86g，MnCl2·4H2O1.81g，ZnSO4·7H2O0.222g，NaMoO4·5H2O0.390g，CuSO4·5H2O0.079g，Co(NO3)2·6H2O0.0494g，CaCl2·2H2O0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1L。
所述固体培养基BG11：NaNO31.5g，K2HPO4.3H2O0.04g，MgSO4·7H2O0.075g，EDTA0.001g，Na2CO30.02g，H3BO32.86g，MnCl2·4H2O1.81g，ZnSO4·7H2O0.222g，NaMoO4·5H2O0.390g，CuSO4·5H2O0.079g，Co(NO3)2·6H2O0.0494g，CaCl2·2H2O0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，琼脂15g，加水至1L。
实施例2
测定野生株WT和突变株在正常液体培养基BG11和含有乙醇1.5％(v/v)液体培养基BG11的生长曲线。
将集胞藻6803(野生株WT)与实施例1所得的集胞藻6803突变株△slr0982在正常液体培养基BG11和含有乙醇1.5％(v/v)的液体培养基BG11培养，摇床设置参数为光照强度2000Lux，转速130rpm，温度30℃。
步骤为：接种时取OD630nm为0.2的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为630nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制生长曲线(图1)。
从图1中可以观察到在正常液体培养基BG11中，野生株和突变株生长状况几乎一致，而在含有乙醇1.5％(v/v)的培养基中，突变株的生长状况明显差于野生株，这一结果表明基因的缺失影响了细胞对乙醇的耐受。
实施例3
测定野生株WT和突变株在正常液体培养基BG11和含有乙醇1.8％(v/v)液体培养基BG11的生长曲线。
将集胞藻6803(野生株WT)与实施例1所得的集胞藻6803突变株△slr0982在正常液体培养基BG11和含有乙醇1.8％(v/v)的液体培养基BG11培养，摇床设置参数为光照强度2000Lux，转速130rpm，温度30℃。
步骤为：接种时取OD630nm为0.2的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为630nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制生长曲线(图2)。
从图2中可以观察到在正常液体培养基BG11中，野生株和突变株生长状况几乎一致，而在含有乙醇1.8％(v/v)的培养基中，突变株的生长状况明显差于野生株，这一结果表明基因的缺失影响了细胞对乙醇的耐受。
实验证明，集胞藻6803slr0982与乙醇耐受相关，通过构建强表达该基因的菌株可以提高乙醇产量。

Claims (2)

1.一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982，其特征是用SEQ ID No.5所示。
2.权利要求1的一种集胞藻6803乙醇耐受相关基因slr0982的用途，其特征通过用所述基因构建工程菌发酵产乙醇的用途。
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